Oko zawiera przezroczyste media, które nie mają naczyń krwionośnych, w tym rogówki, soczewki oka i ciała szklistego. Światło musi przejść przez te media, zanim dotrze do fotoreceptorów z tyłu siatkówki. W szczególności rogówka, soczewka oka i ciało szkliste nie mają naczyń krwionośnych, aby uniknąć absorpcji światła i zniekształcenia obrazów1. Naczynia krwionośne siatkówki są zorganizowane w trzy warstwy: warstwę powierzchowną, która rozciąga się od tarczy nerwu wzrokowego do obwodu w warstwie włókien nerwowych; warstwa środkowa, która znajduje się w wewnętrznej warstwie splotowanej; i głęboką warstwę, która jest rozprowadzana przez zewnętrzną warstwę splotowatą. Ta sieć naczyniowa dostarcza krew do wewnętrznej siatkówki, podczas gdy fotoreceptory są zaopatrywane przez dyfuzję z naczyniówek krwionośnych. Odżywianie wewnętrznej i zewnętrznej siatkówki jest ściśle kontrolowane przez wewnętrzną i zewnętrzną barierę krew-siatkówka (BRB). Komórki śródbłonka siatkówki, perycyty i komórki glejowe tworzą wewnętrzny BRB. Z drugiej strony komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), komórki śródbłonka naczyniówki i błona Brucha tworzą zewnętrzny BRB. Patologiczne zmiany w naczyniach krwionośnych siatkówki są cechami charakterystycznymi wielu chorób siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem i retinopatia wcześniaków. Te patologiczne zmiany obejmują między innymi zapalenie naczyń krwionośnych, rozpad BRB, zwyrodnienie naczyń włosowatych, zmiany w przepływie krwi w siatkówce i patologiczną neowaskularyzację siatkówki (RNV)2,3,4. Dlatego ważne jest opracowanie skutecznych metod badania tych zmian zarówno in vivo na zwierzętach doświadczalnych, jak i in vitro poprzez hodowlę różnych komórek siatkówki w warunkach zbliżonych do środowiska biologicznego i biochemicznego w chorobach człowieka. Naukowcy mogą wykorzystać kilka podejść eksperymentalnych do analizy mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw chorób naczyniowych siatkówki. Celem tego zbioru metod jest podzielenie się z innymi badaczami wiedzą naukowców zajmujących się wzrokiem i okulistami w zakresie metod badania prawidłowego rozwoju naczyń i nieprawidłowości naczyniowych w różnych chorobach siatkówki.
Artykuł Damsgaarda i wsp. przedstawia metodę ultrasonograficzną ze wzmocnionym przepływem, która pozwala badaczom obrazować naczynia krwionośne oka w trzech wymiarach bez użycia środków kontrastowych5. Metoda ta pokonuje ograniczenia innych metod ze względu na stabilność w obrazowaniu oka za pigmentowaną siatkówką. Chociaż metoda została zademonstrowana na złotych rybkach, można ją zastosować do wszystkich innych gatunków eksperymentalnych z jądrzastymi czerwonymi krwinkami. Ta metoda jest cenna do wizualizacji naczyń krwionośnych oka w normalnych i patologicznych warunkach i może być pomocna w badaniu przepływu krwi w oku. Jednak metoda ta jest ograniczona przez brak jądrzastych czerwonych krwinek u ssaków. Tak więc, w porównaniu z gatunkami z jądrzastymi czerwonymi krwinkami, ultradźwięki o zwiększonym przepływie wytwarzają kontrast przepływu krwi tylko u ssaków. Co więcej, metoda ta jest wrażliwa na szumy ruchu, takie jak ruchy oddechowe, które mogą powodować rozmyte obrazy i artefakty. Ten szum ruchu można regulować za pomocą bramkowania prospektywnego lub retrospektywnego. Zarówno w przypadku akwizycji 2D, jak i 3D kluczowe znaczenie ma ograniczenie artefaktów ruchowych spowodowanych przez zwierzę poruszające się z powodu nieodpowiedniego znieczulenia lub niestabilnej konfiguracji przetwornika. Rozwój tej techniki toruje drogę do nieinwazyjnego badania in vivo głębokich sieci naczyniowych oka u zdecydowanej większości kręgowców posiadających jądrzaste erytrocyty.
Metoda przedstawiona przez Macouzet-Romero i wsp. ocenia względny udział naczyń siatkówki w gęstości perfuzji plamki żółtej za pomocą optycznej angiografii koherentnej tomografii (OCT)6. Metoda ta charakteryzuje proporcję obszaru z krążeniem z rozszerzonych naczyń. Warto zauważyć, że rozszerzenie naczyń krwionośnych może być odpowiedzią na stany patologiczne. Takie podejście może pośrednio nakreślić rozszerzenie naczyń krwionośnych i pośrednio zidentyfikować niskie natlenienie w chorobach naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR), niedrożność żył centralnych lub zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Stosując tę metodę, główne odkrycia Macouzet-Romero i wsp.6 polegały na tym, że udział naczyń większych niż naczynia włosowate siatkówki w krążeniu siatkówki wynosił 18,2% u zdrowych ochotników. W związku z tym odsetek ten można wykorzystać jako odniesienie do identyfikacji wczesnych zmian gęstości perfuzji spowodowanych chorobami naczyniowymi siatkówki. Na przykład procentowy udział wynosił 2,6% u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym i 16,4% u pacjentów z cukrzycą, co sugeruje, że metoda ta może być potencjalnie wykorzystana do oceny postępu chorób siatkówki związanych z nieprawidłowościami naczyniowymi.
Metoda przedstawiona przez Subirada i wsp. ocenia różne parametry zmian naczyniowych (stopień zwyrodnienia naczyń włosowatych [obszary jałowe], patologiczna neowaskularyzacja siatkówki [obszary neowaskularne], poszerzenie i krętość tętniczek siatkówki) w eksperymentalnych modelach retinopatii niedokrwiennych, takich jak retinopatia indukowana tlenem (OIR) i eksperymentalna cukrzyca7. Warto zauważyć, że OIR odtwarza retinopatię wcześniaków i niektóre aspekty proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. Zdolność do ilościowego określenia zakresu neowaskularyzacji siatkówki (RNV) lub zwyrodnienia naczyń włosowatych w modelach eksperymentalnych ma kluczowe znaczenie dla badania podstawowych mechanizmów molekularnych i komórkowych, a także dla testowania możliwych efektów terapeutycznych interwencji farmakologicznych lub molekularnych. Podsumowując, w artykule przedstawiono klasyczne, ugruntowane i powtarzalne techniki ilościowego określania niektórych z najistotniejszych parametrów naczyniowych branych pod uwagę w praktyce klinicznej.
W artykule Vaglienti i wsp. przedstawiono metody pomiaru poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach glejowych Müllera8. Rola stresu oksydacyjnego w dysfunkcji mikronaczyniowej siatkówki w retinopatiach niedokrwiennych została ustalona, co zachęciło naukowców do zbadania zakresu, w jakim reaktywne formy tlenu (ROS) przyczyniają się do rozkładu BRB i RNV zarówno in vivo, jak i in vitro 9,10,11,12. Vaglienti i wsp. używają dioctanu 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFD) do oceny poziomów wewnątrzkomórkowego wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS). Metoda ta opiera się na dyfuzji DCFD do komórki, a następnie utlenianiu DCFD przez ROS do 2', 7' –dichlorofluoresceiny (DCF). DCF jest wysoce fluorescencyjny i można go wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może obrazować i mierzyć poziomy wytwarzania ROS zarówno w komórkach siatkówki, jak i tkankach.
Artykuł Tomaszewskiego i wsp. przedstawia izolację i wzrost komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy (RPE)13. Komórki RPE przyczyniają się do zewnętrznego BRB i odgrywają istotną rolę w hemostazie i integralności fotoreceptorów. Dysfunkcja komórek RPE jest cechą charakterystyczną różnych chorób siatkówki, w tym między innymi AMD i DR. Dlatego badania in vitro nad funkcją komórek RPE w zdrowiu i chorobie mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych kilku naczyniowych chorób siatkówki. W tym celu pierwotna izolacja komórek RPE może być ważnym narzędziem do badania mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób oczu, a także do proponowania nowych zastosowań terapeutycznych dla tych chorób. Technika ta umożliwia badanie zmian w strukturze i funkcji komórek RPE oraz ich wpływu na zewnętrzny BRB w AMD i DR. Co więcej, technika ta może być stosowana do badania zmian w komórkach RPE wyizolowanych od myszy C57BL6 typu dzikiego i różnych myszy zmodyfikowanych genetycznie oraz do testowania różnych związków farmakologicznych jako celów terapeutycznych dla AMD14.
Artykuł Elmasry'ego i wsp. przedstawia model eksperymentalny ex vivo, który można wykorzystać do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki poprzez hodowlę eksplantatów siatkówki przez dłuższy okres15. W tym systemie ex vivo eksplantaty siatkówki prezentują nienaruszone sieci naczyniowe i glejowe oraz neurony siatkówki przez okres do 2 tygodni w hodowli. Organotypowe eksplantaty siatkówki okazały się wiarygodnym narzędziem do badania chorób siatkówki, takich jak DR i choroby zwyrodnieniowe siatkówki16,17. W porównaniu z innymi istniejącymi technikami, zastosowanie eksplantatów siatkówki wspiera zarówno hodowle komórek siatkówki in vitro, jak i modele zwierzęce in vivo, dodając unikalną cechę, która pozwala na badanie przesłuchów między różnymi komórkami siatkówki (np. komórkami naczyniowymi, glejowymi i neuronalnymi) przy tych samych parametrach biochemicznych i niezależnie od zmiennych ogólnoustrojowych. Hodowle eksplantatów utrzymują różne komórki siatkówki razem w tym samym środowisku i zachowują międzykomórkowe interakcje fizyczne i molekularne. Co więcej, badania wykazały, że eksplantaty siatkówki mogą zachować strukturę morfologiczną i funkcjonalność hodowanych komórek siatkówki. Podsumowując, eksplantaty siatkówki mogą stanowić odpowiednią platformę do badania wzajemnych oddziaływań między różnymi komórkami siatkówki w odpowiedzi na zmiany biochemiczne, takie jak hiperglikemia i niedotlenienie, podobne do tych obserwowanych w retinopatii cukrzycowej (DR) lub retinopatii wcześniaków (ROP). Podejście to pozwala również na testowanie interwencji terapeutycznych w ograniczonym środowisku biochemicznym. Posiew eksplantatów siatkówki stanowi kontrolowaną technikę i bardzo elastyczny model eksperymentalny, który umożliwia liczne manipulacje farmakologiczne i może odkryć kilka mechanizmów molekularnych chorób siatkówki.