Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1

Summary

Ten protokół dostarcza instrukcje dotyczące wyzwalania i monitorowania pexofagii za pośrednictwem Stub1 w żywych komórkach.

Abstract

Komórki ssaków mogą przewracać peroksysomy za pośrednictwem Stub1 pexofagii. Szlak potencjalnie umożliwia komórkową kontrolę ilości i jakości peroksysomów. Podczas tego procesu białko szoku cieplnego 70 i ligaza ubikwityny E3, Stub1, przemieszczają się do peroksysomów, które są odwracane w celu zainicjowania pekofagii. Aktywność ligazy Stub1 umożliwia akumulację ubikwityny i innych modułów związanych z autofagią na docelowych peroksysomach. Podniesienie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w świetle peroksysomalnym może aktywować peksofagię, w której pośredniczy Stub1. Można zatem użyć wspomaganego barwnikiem generowania ROS do wyzwalania i monitorowania tej ścieżki. W artykule przedstawiono procedury stosowania dwóch klas barwników, białek fluorescencyjnych i syntetycznych fluoroforów, do inicjacji pekofagii w hodowlach komórek ssaków. Te wspomagane barwnikiem protokoły generowania ROS mogą być nie tylko wykorzystywane do celowania we wszystkie peroksysomy w populacji komórek na całym świecie, ale mogą również umożliwiać manipulowanie pojedynczymi peroksysomami w pojedynczych komórkach. Opisujemy również, w jaki sposób można śledzić pexofagię, w której pośredniczy Stub1, za pomocą mikroskopii żywych komórek.

Introduction

Peroksysomy to organelle związane z pojedynczą błoną, obecne w większości komórek eukariotycznych. Peroksysomy są przedziałem metabolicznym niezbędnym do przeprowadzania beta-oksydacji bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, katabolizmu puryn oraz syntezy fosfolipidów eterowych i kwasów żółciowych¹. Acetylo-CoA pochodzący z peroksysomów kontroluje homeostazę lipidów poprzez regulację centralnej sygnalizacji w metabolizmie². Dlatego nie jest niespodzianką, że upośledzone funkcje peroksysomalne są implikowane w różnych chorobach, w tym zaburzeniach neurodegeneracyjnych, starzeniu się, nowotworac....

Protocol

1. Przygotowanie komórek wyrażających diKillerRed lub białka samoznakujące (SLP) w świetle peroksysomów

1. Wysiewaj pożądane komórki na szalkach do hodowli komórkowych ze szklanym dnem. Do tego eksperymentu wysiewamy 2 x 10⁵ ludzkich komórek SHSY5Y w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM/F-12 uzupełnione 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) lub 6 x 10⁴ mysich komórek NIH3T3 w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnione 10% surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) na szalce hodowlanej o średnicy 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm.
   UWAGA: Liczba wysianych komórek powinna być ....

Results

Pokazany tutaj schemat indukcji pexofagii za pośrednictwem Stub1 wykorzystuje wspomagane barwnikiem wytwarzanie ROS w świetle peroksysomu. Ta operacja wymaga minimalnego natężenia światła. Peroksysomy zawierające białka fluorescencyjne lub barwniki można zatem oświetlać za pomocą standardowych laserowo-skaningowych mikroskopów konfokalnych. Oświetlenie ogniskowe prowadzi do natychmiastowej i zlokalizowanej produkcji ROS w poszczególnych peroksysomach, jak wskazuje fluorescencyjny reporter roGFP2-VKSKL (

Discussion

Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób wywołać pekofagię za pośrednictwem Stub1 w hodowlach komórkowych poprzez podniesienie poziomu peroksysomalnych ROS za pomocą światła. Ponieważ protokół opiera się na wytwarzaniu ROS wspomaganym barwnikiem, należy zapewnić wystarczającą ekspresję barwienia ligandem diKillerRed-VKSKL lub znakowanym barwnikiem ligandem SLP w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę, że różne typy komórek lub komórki o różnym pochodzeniu genetycznym mogą zawierać peroksy.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naczynie hodowlane 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
surowica bydlęca	ThermoFisher Scientific	16170060
Inkubator do hodowli komórkowych	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		wykonany przez dołączenie dimeru tandemowego KillerRed do PTS1 (VKSKL)
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	Szkielet EGFP-C1 został użyty do klonowania EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-HSP70	Academia Sinica		Gen Hsp70 (HSPA1A) PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany do EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generowany przez wprowadzenie ludzkiego genu SQSTM1 (poprzez amplifikację PCR cDNA komórki HeLa) do EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generowany przez wprowadzenie mysiego genu Stub1 (poprzez amplifikację PCR całkowitego cDNA nerki myszy) do EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
płodowa surowica bydlęca	ThermoFisher Scientific	10437028
Ligand HaloTag TMR	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 dołączony i sklonowany do szkieletu EGFP-C1
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Odwrócony mikroskop konfokalny	Mikroskop Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  z inkubatorem komorowym TOKAI HIT i nasadką do czaszy UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofektamina 2000	ThermoFisher Scientific	11668	odczynnik do transfekcji
NIH3T3 komórka	ATCC	CRL-1658	przylegający
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	zredukowana pożywka w surowicy
penicylina/streptomycyna	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany wtoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generowane przez dołączenie eroGFP (pobranego z plazmidu Addgene 20131) z sekwencją aminokwasową VKSKL i sklonowane do komórki EGFP-C1
SHSY5Y	ATCC	CRL-2266	przylegającej