Artykuł metodologiczny

Monitorowanie peksofagii zależnej od Stub1

DOI:

10.3791/65010

⸱

12 maja 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarcza instrukcje dotyczące wyzwalania i monitorowania pexofagii za pośrednictwem Stub1 w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki ssaków mogą przewracać peroksysomy za pośrednictwem Stub1 pexofagii. Szlak potencjalnie umożliwia komórkową kontrolę ilości i jakości peroksysomów. Podczas tego procesu białko szoku cieplnego 70 i ligaza ubikwityny E3, Stub1, przemieszczają się do peroksysomów, które są odwracane w celu zainicjowania pekofagii. Aktywność ligazy Stub1 umożliwia akumulację ubikwityny i innych modułów związanych z autofagią na docelowych peroksysomach. Podniesienie poziomu reaktywnych form tlenu (ROS) w świetle peroksysomalnym może aktywować peksofagię, w której pośredniczy Stub1. Można zatem użyć wspomaganego barwnikiem generowania ROS do wyzwalania i monitorowania tej ścieżki. W artykule przedstawiono procedury stosowania dwóch klas barwników, białek fluorescencyjnych i syntetycznych fluoroforów, do inicjacji pekofagii w hodowlach komórek ssaków. Te wspomagane barwnikiem protokoły generowania ROS mogą być nie tylko wykorzystywane do celowania we wszystkie peroksysomy w populacji komórek na całym świecie, ale mogą również umożliwiać manipulowanie pojedynczymi peroksysomami w pojedynczych komórkach. Opisujemy również, w jaki sposób można śledzić pexofagię, w której pośredniczy Stub1, za pomocą mikroskopii żywych komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksysomy to organelle związane z pojedynczą błoną, obecne w większości komórek eukariotycznych. Peroksysomy są przedziałem metabolicznym niezbędnym do przeprowadzania beta-oksydacji bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, katabolizmu puryn oraz syntezy fosfolipidów eterowych i kwasów żółciowych1. Acetylo-CoA pochodzący z peroksysomów kontroluje homeostazę lipidów poprzez regulację centralnej sygnalizacji w metabolizmie2. Dlatego nie jest niespodzianką, że upośledzone funkcje peroksysomalne są implikowane w różnych chorobach, w tym zaburzeniach neurodegeneracyjnych, starzeniu się, nowotworach, otyłości i cukrzycy3,4,5. Niezbędnym procesem w utrzymaniu działania peroksysomalnego jest peksofagia. Peksofagia to kataboliczny proces selektywnej wymiany peroksysomów przez autofagię. Komórki wykorzystują pekofagię, aby pomóc kontrolować ilość i jakość peroksysomów, zapewniając w ten sposób prawidłową funkcję peroksysomów. Niedawne badanie wykazało, że utrata peroksysomów spowodowana mutacjami w czynnikach biogenezy peroksysomalnej PEX1 1 i 6 wynika z niekontrolowanej peksofagii 6. Warto zauważyć, że 65% wszystkich pacjentów z zaburzeniami biogenezy peroksysomów (PBD) ma niedobory peroksysomalnego kompleksu ATPaa AAA, składającego się z PEX1, PEX6 i PEX26 w komórkach ssaków7.

Do inicjowania i badania pexofagii można użyć wielu metod. U drożdży peksofagia jest wyzwalana, gdy dostarczane składniki odżywcze są przełączane ze źródeł węgla zależnych od peroksysomów na niezależne od peroksysomów źródła węgla (w celu obniżenia liczby peroksysomów komórkowych)8. Na przykład przeniesienie komórek Pichia pastoris wyhodowanych w metanolu z pożywki metanolowej na pożywkę glukozową i pożywkę etanolową indukuje odpowiednio mikropeksofagię i makropeksofagię8,9,10. Sekwestratory mikropeksofagiczne grupowały peroksysomy w celu degradacji poprzez przebudowę wakuoli w celu utworzenia przypominających miseczki błon sekwestracyjnych wakuolarnych i struktury przypominającej pokrywę, zwanej aparatem błonowym specyficznym dla mikropekofagii (MIPA). W makropeksofagii poszczególne peroksysomy są pochłaniane przez struktury o podwójnej błonie znane jako pekofagosomy, po których następuje fuzja z wakuolą w celu degradacji8,9,10. Fosforylacja receptorów pexofagii, takich jak Atg36p u Saccharomyces cerevisiae i Atg30p u Pichia pastoris, ma kluczowe znaczenie dla receptorów w celu rekrutacji rdzeniowej maszynerii autofagii i ułatwienia peroksysomalnego kierowania do autofagosomów8,11.

W komórkach ssaków pexofagia może być indukowana przez ubikwitynację. Znakowanie białek błony peroksysomalnej PMP34 lub PEX3 ubikwityną po stronie cytozolu indukuje pexofagię12. Nadekspresja PEX3 indukuje ubikwitynację peroksysomów i eliminację peroksysomów przez lizosomy13. Ponadto, fuzja PEX5 z C-końcowym EGFP upośledza eksport monoubikwitynowanego PEX5 i powoduje powstanie pexophagy14. Z drugiej strony, peksofagia może być również wywołana przez leczenieH2O2. Peroksysomy wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS); w szczególności enzym peroksysomalny Acox1, który katalizuje początkowy etap beta-oksydacji bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (> 22 atom węgla), wytwarza nie tylko acetylo-CoA, ale także peroksysomalny ROS. W odpowiedzi na podwyższone poziomy ROS w ramach leczeniaH2O2, komórki ssaków aktywują pekofagię, aby obniżyć produkcję ROS i złagodzić stres. Doniesiono, że leczenieH2O2napędza rekrutację zmutowanych ataksji-teleangiektazji (ATM) do peroksysomów. ATM następnie fosforyluje PEX5, aby promować obrót peroksysomalny przez pexofagię15.

Ponieważ peroksysomy są centrami generującymi ROS, są one również podatne na uszkodzenia ROS. Uszkodzenia peroksysomalne wywołane przez ROS zmuszają komórki do aktywacji peksofagii w celu zainicjowania szlaków kontroli jakości peroksysomów (usunięcie uszkodzonego peroksysomu przez autofagię). W tym miejscu przedstawiamy podejście do wyzwalania na żądanie uszkodzenia peroksysomalnego wywołanego przez ROS. Protokół wykorzystuje aktywowaną światłem produkcję ROS w organellach16,17,18,19,20 (Rysunek 1). Peroksysomy znakowane barwnikiem są oświetlane, co prowadzi do produkcji ROS w świetle peroksysomalnym, co w szczególności wywołuje uszkodzenie peroksysomalne. Za pomocą tego protokołu wykazano, że peroksysomy obciążone ROS są usuwane przez szlak degradacji zależny od ubikwityny. Peroksysomy zestresowane ROS rekrutują ligazę ubikwityny E3 Stub1, aby umożliwić ich wchłonięcie do autofagosomów w celu indywidualnego usunięcia przez pexofagię16. Można użyć tego protokołu do porównania losu uszkodzonych i zdrowych peroksysomów w tej samej komórce za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta może być również stosowana do globalnego uszkodzenia wszystkich peroksysomów (we wszystkich komórkach) na szalce hodowlanej, co pozwala na analizę biochemiczną szlaku pekofagii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek wyrażających diKillerRed lub białka samoznakujące (SLP) w świetle peroksysomów

  1. Wysiewaj pożądane komórki na szalkach do hodowli komórkowych ze szklanym dnem. Do tego eksperymentu wysiewamy 2 x 105 ludzkich komórek SHSY5Y w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM/F-12 uzupełnione 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) lub 6 x 104 mysich komórek NIH3T3 w 840 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełnione 10% surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) na szalce hodowlanej o średnicy 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm.
    UWAGA: Liczba wysianych komórek powinna być dostosowana proporcjonalnie do powierzchni szklanej mikrostudzienki w przypadku korzystania z naczyń ze szklanym dnem o innych specyfikacjach.
  2. Hoduj komórki w temperaturze poniżej 5% CO2/37 °C przez 24 godziny.
  3. Transfekować komórki pożądanymi plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji.
    1. Użyj PMP34-TagBFP, aby oznaczyć peroksysomy w żywych komórkach. Użyj ukierunkowanego na peroksysomy diKillerRed-VKSKL lub SLP-VKSKL (+ ligandy SLP znakowane barwnikiem) do generowania ROS w świetle peroksysomów (poprzez aktywowaną światłem produkcję ROS). W tym protokole używamy samoznakującego się białka HaloTag-VKSKL21. Do monitorowania translokacji Stub1 / Hsp70, akumulacji ubikwitynowanych białek i tworzenia autofagosomów na peroksysomach zestresowanych ROS, odpowiednio transfekcja EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub lub EGFP-LC3B. Aby sprawdzić generowanie ROS w świetle peroksysomalnym, należy wykonać transfekcję diKillerRed-VKSKL za pomocą fluorescencyjnej sondy redoks zlokalizowanej w peroksysomach roGFP2-VKSKL22.
    2. W przypadku transfekcji komórek SHSY5Y należy rozcieńczyć plazmidy w 55 μl DMEM/F-12 bez surowicy i rozcieńczyć 1 μl odczynnika do transfekcji w 55 μl DMEM/F12 bez surowicy. Połączyć rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem. Delikatnie wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać kompleks do 20-milimetrowej mikrostudzienki uprzednio pokrytej 100 μl pożywki hodowlanej dla SHSY5Y bez antybiotyków (DMEM/F-12 z 10% płodową surowicą bydlęcą). Delikatnie potrząśnij naczyniem w przód iw tył.
    4. W przypadku transfekcji komórek NIH3T3 należy zastąpić zredukowaną pożywkę surowicy wolnym od surowicy DMEM/F-12 w celu rozcieńczenia plazmidów i odczynnika do transfekcji. Zastąp pożywkę hodowlaną pożywką hodowlaną SHSY5Y pożywką hodowlaną dla komórek NIH3T3 bez antybiotyków (DMEM z 10% surowicą bydlęcą).
  4. Po 2 godzinach transfekcji usunąć pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej. Inkubować komórki NIH3T3 lub SHSY5Y w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 24 godziny
    UWAGA: Inne linie komórkowe mogą być również wykorzystywane do badania pekofagii, w której pośredniczy Stub1 (np. Komórki HeLa).

2. Barwienie peroksysomów znakowanymi barwnikiem ligandami SLP (do produkcji ROS aktywowanych światłem)

  1. Po 24 godzinach od transfekcji usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 100 μl liganda HaloTag TMR o długości 200 nM lub liganda HaloTag 200 nM Janelia Fluor 646 na szklaną mikrostudzienkę o średnicy 20 mm.
    UWAGA: Znakowane barwnikiem ligandy SLP należy rozcieńczyć odpowiednią pożywką hodowlaną dla każdej linii komórkowej. Wybór ligandów znakowanych Janelia Fluor 646 zwolni niebieskie, zielone i czerwone kanały do dalszego obrazowania fluorescencyjnego.
  2. Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37°C, 5% CO2 . Bejca na 1 godzinę. Po 1 godzinie dokładnie usunąć pożywkę barwiącą i dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej.

3. Stresowanie peroksysomów metodą ROS w laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym

  1. Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające żądane komórki na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w inkubator ze stopniem.
  2. Kliknij Tool Window, wybierz Ocular, a następnie kliknij przycisk DIA (Rysunek 2A), aby włączyć światło przechodzące. View czasza przez okular mikroskopu i ustaw ostrość komórek, obracając pokrętło ostrości.
  3. Wybierz LSM i kliknij przycisk Dye & Detector Select (Wybór barwnika i detektora) (Rysunek 2B). Kliknij dwukrotnie żądane barwniki w wyskakującym okienku, aby wybrać odpowiednie ustawienia lasera i filtra do obrazowania komórek (Rysunek 2C). Kliknij Livex4 w panelu Live, aby rozpocząć szybkie skanowanie laserowe w celu rozpoczęcia badania przesiewowego pod kątem sygnałów fluorescencyjnych komórek ( Rysunek 2D).
  4. Przesuń stolik za pomocą kontrolera joysticka i zlokalizuj średnie komórki eksprymujące diKillerRed-VKSKL lub SLP-VKSKL, aby zastosować stres ROS (na peroksysomach). Uzyskaj obraz żądanej komórki.
  5. Kliknij na Tool Window (Okno narzędzi) i wybierz Stymulacja LSM (Rysunek 2E). Kliknij przycisk elipsy i w oknie obrazu na żywo użyj myszy, aby narysować okrągły ROI o średnicy 15 μm (Rysunek 2F) zawierający pożądane peroksysomy uzyskane w kroku 3.4, do których zostanie zastosowany stres ROS (patrz Rysunek 3 dla przykładu).
  6. Aby zastosować stres ROS, użyj 561 nm dla komórek z ligandem SLP znakowanym diKillerRed-PTS1 lub TMR i użyj 640 nm dla komórek wybarwionych ligandem SLP znakowanym Janelia Fluor 646.
  7. Wybierz długość fali lasera do zastosowania naprężenia ROS. Wprowadź żądaną wartość procentową lasera i czas trwania ( Rysunek 2G).
  8. Kliknij na Acquire, a następnie kliknij na przycisk Stimulation (Rysunek 2H), aby rozpocząć skanowanie światłem 561/640 nm przez ROI przez 30 sekund każdy. Odpowiada to ustawieniu ~5% mocy lasera zarówno dla 561 nm, jak i 640 nm w zastosowanym tutaj mikroskopie konfokalnym. Ta operacja doprowadzi do produkcji ROS w peroksysomach.
    UWAGA: Można wybrać ROI o różnych rozmiarach. Należy proporcjonalnie dostosować czas oświetlenia dla każdego ROI w zależności od jego obszaru.
  9. Po 30 sekundach oświetlenia laserowego peroksysomy w ROI utracą swoje sygnały diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646. Ta utrata sygnału pozwala odróżnić oświetlone peroksysomy od nieoświetlonych (uszkodzonych i zdrowych) w komórce.

4. Monitorowanie pexofagii w żywych komórkach za pomocą obrazowania poklatkowego

  1. Śledź translokację znakowanych EGFP Stub1, Hsp70, Ub, p62 lub LC3B na oświetlone/zestresowane ROS peroksysomy poprzez obrazowanie poklatkowe z użyciem 10-minutowych odstępów między klatkami (dla przykładów, patrz rysunki 3-7).
    UWAGA: Sygnały EGFP-Stub1 lub EGFP-Hsp70 zaczynają pojawiać się 10-20 minut po oświetleniu i pozostają na wszystkich uszkodzonych peroksysomach do ~ 40 minut po oświetleniu. Sygnały EGFP-Ub pojawiają się po 30 minutach od oświetlenia i trwają przez 2-3 godziny. Translokacja EGFP-p62 pojawia się po 60 minutach od oświetlenia, a sygnały EGFP-LC3B stają się widoczne ~3 godziny po rozświetleniu.
  2. Określ ilościowo sygnały EGFP na uszkodzonych peroksysomach (z Stub1, Ub, p62 lub LC3B) za pomocą ImageJ. Wykonaj następujące czynności, aby użyć ImageJ do ilościowego określenia obrazu trzykanałowego (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Otwórz obraz i zastosuj zaznaczenia eliptyczne lub odręczne, aby zamknąć obszar zawierający wszystkie podświetlone peroksysomy (sygnał dodatni PMP34-TagBFP i sygnał liganda HaloTag wybielony; Rysunek 8A).
    2. Kliknij na Duplikuj, aby wybrać kanał PMP34-TagBFP (Rysunek 8A). Ustaw próg za pomocą menu rozwijanego Obraz > Dostosuj próg>, aby oznaczyć peroksysomy ( Rysunek 8B).
    3. Wybierz Analizuj > Analizuj cząstki, aby określić dokładne obszary oświetlonych peroksysomów. ImageJ rejestruje te obszary zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI (Rysunek 8C).
    4. Kliknij Duplikuj, aby wybrać kanał EGFP do analizy sygnału fluorescencji z Ub, p62 lub LC3B sprzężonego z EGFP (Rysunek 8D). Wybierz wszystkie ROI w Menedżerze ROI (Rysunek 8E).
    5. Zastosuj pomiar w Menedżerze zwrotu z inwestycji, aby zmierzyć sygnały EGFP na peroksysomach ( Rysunek 8E). Znajdź wartość obszaru i gęstości zintegrowanej (suma wszystkich intensywności pikseli) dla każdego ROI w tabeli wyników (Rysunek 8E).
    6. Aby uzyskać średnią intensywność fluorescencji EGFP w różnych punktach czasowych po naświetleniu, należy podzielić zintegrowaną intensywność EGFP przez całkowitą powierzchnię oświetlonych peroksysomów (obszary dodatnie sygnału PMP34-TagBFP i ujemne obszary sygnału ligandu HaloTag). Aby uzyskać skumulowany sygnał na peroksysomach, odejmij uśrednioną intensywność w punkcie czasowym przez uśrednioną intensywność w czasie = 0, a następnie znormalizuj przez uśrednioną intensywność w czasie = 0.

5. Globalne uszkodzenie wszystkich peroksysomów (w każdej komórce) na szalce hodowlanej

  1. Wykonaj etap 1 (przygotowanie komórek wykazujących ekspresję diKillerRed ukierunkowanego na peroksysomy [diKillerRed-VKSKL] lub SLP [SLP-VKSKL]) i etap 2 (barwienie peroksysomów ligandem SLP [do produkcji ROS aktywowanych światłem]).
  2. Po 1 godzinie barwienia ligandem znakowanym TMR usunąć pożywkę barwiącą i dodać 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; inhibitor katalazy).
    UWAGA: Katalaza jest zmiataczem ROS ulegającym ekspresji w świetle peroksysomów, więc leczenie 3-AT pomaga zwiększyć wywołane światłem uszkodzenia oksydacyjne peroksysomów.
  3. Umieść naczynie hodowlane nad diodą LED (555-570 nm). Oświetl wszystkie komórki o gęstości mocy 1,8 W/cm2 przez 9 godzin w inkubatorze.
    UWAGA: Aby wykonać ten krok na zewnątrz inkubatora, umieść naczynie hodowlane na płycie grzewczej o temperaturze 37°C. Dodaj 20 mM HEPES do pożywki zawierającej 3-AT i przykryj naczynie hodowlane przezroczystą folią, aby zminimalizować wymianę gazową. HEPES jest środkiem buforującym, który utrzymuje fizjologiczne pH w hodowli komórkowej poza inkubatorem CO2 podczas oświetlenia LED.
  4. Zweryfikuj powodzenie uszkodzeń wywołanych przez diody LED, obrazując sygnały EGFP-Ub, EGFP-p62 lub EGFP-LC3B na peroksysomach. Korzystając z warunków oświetlenia opisanych powyżej, 82% komórek SHSY5Y stabilnie eksprymujących HaloTag-VKSKL wykazywało pexofagię za pośrednictwem Stub1.
  5. Zbierz komórki do dalszej analizy biochemicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazany tutaj schemat indukcji pexofagii za pośrednictwem Stub1 wykorzystuje wspomagane barwnikiem wytwarzanie ROS w świetle peroksysomu. Ta operacja wymaga minimalnego natężenia światła. Peroksysomy zawierające białka fluorescencyjne lub barwniki można zatem oświetlać za pomocą standardowych laserowo-skaningowych mikroskopów konfokalnych. Oświetlenie ogniskowe prowadzi do natychmiastowej i zlokalizowanej produkcji ROS w poszczególnych peroksysomach, jak wskazuje fluorescencyjny reporter roGFP2-VKSKL (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób wywołać pekofagię za pośrednictwem Stub1 w hodowlach komórkowych poprzez podniesienie poziomu peroksysomalnych ROS za pomocą światła. Ponieważ protokół opiera się na wytwarzaniu ROS wspomaganym barwnikiem, należy zapewnić wystarczającą ekspresję barwienia ligandem diKillerRed-VKSKL lub znakowanym barwnikiem ligandem SLP w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Biorąc pod uwagę, że różne typy komórek lub komórki o różnym pochodzeniu genetycznym mogą zawierać peroksy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant badawczy MOST 111-2311-B-001-019-MY3 od Narodowej Rady Nauki i Technologii na Tajwanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane 35 mm ze szklaną mikrostudzienką o średnicy 20 mm MatTekP35G-1.5-20-C20 mm
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)Sigma AldrichA8056
surowica bydlęcaThermoFisher Scientific16170060
Inkubator do hodowli komórkowychNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicawykonany przez dołączenie dimeru tandemowego KillerRed do PTS1 (VKSKL)
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1Szkielet EGFP-C1 został użyty do klonowania EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-HSP70Academia SinicaGen Hsp70 (HSPA1A) PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany do EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerowany przez wprowadzenie ludzkiego genu SQSTM1 (poprzez amplifikację PCR cDNA komórki HeLa) do EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerowany przez wprowadzenie mysiego genu Stub1 (poprzez amplifikację PCR całkowitego cDNA nerki myszy) do EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
płodowa surowica bydlęcaThermoFisher Scientific10437028
Ligand HaloTag TMR PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 dołączony i sklonowany do szkieletu EGFP-C1
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Odwrócony mikroskop konfokalny Mikroskop OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  z inkubatorem komorowym TOKAI HIT i nasadką do czaszy UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofektamina 2000 ThermoFisher Scientific11668odczynnik do transfekcji
NIH3T3 komórkaATCCCRL-1658przylegający
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850zredukowana pożywka w surowicy
penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplifikowany z cDNA HeLa i klonowany wtoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerowane przez dołączenie eroGFP (pobranego z plazmidu Addgene 20131) z sekwencją aminokwasową VKSKL i sklonowane do komórki EGFP-C1
SHSY5YATCCCRL-2266przylegającej
ze szklanym dnem Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle firmy Dulbecco

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428(2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

Powiązane artykuły