$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zwierzęta to bardzo złożone systemy składające się z setek różnych typów komórek zorganizowanych w dziesiątki różnych tkanek i narządów. Badanie, w jaki sposób grupy komórek oddziałują na siebie nawzajem i ich środowisko podczas rozwoju embrionalnego, nie tylko pozwala nam lepiej zrozumieć, jak zbudowane są dorosłe ciała, ale może również ujawnić molekularne i komórkowe podstawy chorób i wad wrodzonych. Niektóre systemy modelowe są lepiej przystosowane do rozwiązywania konkretnych problemów biologicznych niż inne, a naukowcy wykorzystują szeroką gamę gatunków i technik eksperymentalnych do badania pełnej różnorodności biologii organizmów. Na przykład dany eksperyment z zakresu biologii rozwojowej może obejmować inżynierię genetyczną, sekcje zwierząt, biologię molekularną, biochemię i mikroskopię o wysokiej rozdzielczości. Takie metody mogą być trudne do odtworzenia na podstawie samych pisemnych opisów i rycin, dlatego ważne jest, aby udokumentować je w formie wideo, aby sprzyjać rozpowszechnianiu właściwej techniki i metod analizy.
Związek między mechanizmami rozwojowymi a regeneracją, szczególnie w układzie nerwowym, jest obszarem intensywnego zainteresowania, a danio pręgowany, Danio rerio, stał się kluczowym modelem w tej dziedzinie ze względu na swój trwający całe życie wzrost i zdolności regeneracyjne. Warto zauważyć, że istnieje złożona interakcja między komórkami w siatkówce a tektum nerwu wzrokowego, a ta interakcja jest niezbędna do ustanowienia prawidłowych połączeń, gdy nowe neurony są dodawane do oczu i mózgu1. Hagen i wsp. opisują technikę charakteryzowania, w jaki sposób na wzrost i rozwój neuronów wpływa odnerwienie po usunięciu oka w żywych zarodkach danio pręgowanego2. Szczegółowo opisują, jak 1) przeprowadzić operację usunięcia oka, 2) hodować larwy po operacji, 3) naprawiać, preparować i przechowywać próbki mózgu, 4) przeprowadzać immunofluorescencję oraz 5) prawidłowo montować i obrazować próbki. Technika ta może być stosowana do badania szerokiej gamy procesów neurorozwojowych w utrwalonych tkankach, a także może być modyfikowana do eksperymentów na żywych zarodkach.
Komórki grzebienia nerwowego (NCC) reprezentują ważną linię rozwojową, która daje początek komórkom barwnikowym, chrząstkom, kościom, mięśniom gładkim, neuronom i glejowi, a komórki te są zaangażowane w wiele rodzajów wad wrodzonych3. Oprócz imponującej pluripotencji, NCC przechodzą również przejście od nabłonka do mezenchymalnego, po którym następuje rozległa migracja podczas rozwoju, co czyni je fascynującym paradygmatem do zrozumienia wzajemnych zależności między losem komórki a morfologią4. Zarodki piskląt są potężnym systemem do badania biologii NCC, ponieważ NCC mogą być wizualizowane in vivo i hodowane ex vivo, co pozwala na wiele rodzajów leczenia molekularnego, które są trudne w przypadku innych systemów. Jacques-Fricke i wsp. opisują elastyczną metodę hodowli fałdów nerwowych czaszki w celu wygenerowania pierwotnych kultur NCC na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, po których można następnie przeprowadzić eksperymenty z obrazowaniem stałym lub na żywo5. Opisują, jak 1) inkubować i izolować zarodki, 2) preparować i pokrywać fałdy nerwowe, 3) naprawiać i barwić NCC oraz 4) określać ilościowo i analizować morfologię NCC.
Błona podstawna - macierz zewnątrzkomórkowa generowana wzdłuż podstawowej powierzchni komórek nabłonkowych - ma kluczowe znaczenie dla ustalenia morfologii tkanek i funkcji narządów u zwierząt6. Nabłonek pęcherzykowy Drosophila , który otacza formującą się komórkę jajową, jest doskonałym modelem do badania, w jaki sposób powstają błony podstawne, ponieważ wydziela wszystkie główne konserwatywne składniki błony podstawnej7, a matryca jest zorientowana "na zewnątrz" komory jajowej, ułatwiając w ten sposób analizy mikroskopowe8. Shah i Devergne opisują zastosowanie jednego z najpopularniejszych rodzajów mikroskopii superrozdzielczej - Airyscan - do zbadania, w jaki sposób transport pęcherzykowy wpływa na tworzenie błony podstawnej9. Pokazują one, jak 1) zbierać i naprawiać jajniki Drosophila , 2) przeprowadzać immunofluorescencję, 3) prawidłowo montować próbki i 4) przechwytywać wysokiej jakości zestawy danych o wysokiej rozdzielczości do analizy trójwymiarowej. Zwracamy uwagę, że ten artykuł zawiera niezwykle przydatny i zwięzły samouczek dotyczący prawidłowego pozyskiwania nienasyconych, trójwymiarowych zestawów danych konfokalnych, który powinien być ogólnie interesujący dla każdego, kto chce określić ilościowo obrazy fluorescencji.
Chociaż technologie superrozdzielcze oparte na mikroskopach (np. STED, SIM i Airyscan)10 stają się coraz bardziej powszechne, są one droższe niż standardowe mikroskopy konfokalne i nie są dostępne dla wszystkich badaczy. Alternatywną techniką uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości jest mikroskopia ekspansywacyjna (ExM), która polega na fizycznym powiększeniu próbki biologicznej w trzech wymiarach poprzez zatopienie i związanie jej z pęczniejącym hydrożelem11. Rozszerzone próbki można następnie wizualizować za pomocą standardowego mikroskopu konfokalnego w celu generowania obrazów z rozdzielczością boczną rzędu dziesiątek nanometrów, rywalizując z innymi typami mikroskopii superrozdzielczej12. Nasza grupa opisuje, jak zaimplementować ExM w całych zarodkach Drosophila , aby ujawnić subkomórkowe cechy cytoszkieletu aktomiozyny i sieci mitochondrialnych, które nie są wykrywalne za pomocą standardowej mikroskopii konfokalnej13. Opisujemy, jak 1) wybrać odpowiednio zaawansowane zarodki, 2) przeprowadzić immunofluorescencję, 3) przygotować i zamontować zarodki do ekspansji, 3) trawić i namnażać zarodki oraz 4) zbierać zestawy danych o wysokiej rozdzielczości. Technika ta powinna być modyfikowalna dla szerokiej gamy próbek biologicznych rzędu 1 mm, dzięki czemu będzie dostępna dla szerokiego grona laboratoriów biologicznych.
Biologia rozwojowa jest z konieczności wysoce pomysłową i interdyscyplinarną dziedziną, która czerpie z technik z różnych dziedzin naukowych w celu ilościowego określenia biologii komórki zachodzącej u zwierzęcia. W tym miejscu zwracamy uwagę na cztery metody biologii rozwojowej u danio pręgowanego, pisklęcia i muszki owocowej, które obejmują zarówno klasyczne, jak i najnowocześniejsze techniki badania morfologii komórek i lokalizacji białek subkomórkowych podczas rozwoju zwierząt. Obecnie dziedzina ta koncentruje się na łączeniu ilościowych analiz morfologii i zachowania komórek z eksperymentami transkryptomicznymi i proteomicznymi, aby ujawnić pełną różnorodność cząsteczek i sił biomechanicznych, które kontrolują rozwój zwierząt.