$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Podejścia proteomiczne mogą obejmować wykrywanie i kwantyfikację peptydów, białek i specyficznych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) obecnych w określonym stanie komórkowym, a także białek łączących się w określone organelle lub wielkocząsteczkowe kompleksy białkowe. Proteomika to zróżnicowana dziedzina, którą można podzielić na ogólne i ilościowe przepływy pracy. Proteomika ilościowa koncentruje się na określeniu ilości białka lub białka PTM w próbce. Kwestia biologiczna powinna być rozważona przed wykonaniem jakiegokolwiek eksperymentu proteomicznego w celu określenia najbardziej odpowiedniej metody przygotowania próbki, sekwencjonowania i analizy danych niezbędnych do udzielenia odpowiedzi na pytanie. Białka są bardzo dynamiczne, a spektrometry mas są wrażliwe na sekwencjonowanie białek o wyższej liczebności w porównaniu z białkami o niższej obfitości; W związku z tym wybór procesów przygotowania próbek i sekwencjonowania ma kluczowe znaczenie. Ten zbiór metod opisuje podejścia do ilościowego oznaczania niektórych typów białek przy użyciu najnowocześniejszych metod MS i zapewnia przepływ pracy analizy danych dla sieci białkowych.
Peptydomika to badanie peptydów naturalnie wytwarzanych podczas normalnych procesów komórkowych, a także w warunkach chorobowych, a podejście to było historycznie ograniczone do kwantyfikacji opartej na przeciwciałach, dopóki chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas i procesy ekstrakcji peptydów nie posunęły się do ich obecnego stanu1. Postępy te, wraz z zastosowaniem inaktywacji termicznej endogennych proteaz, umożliwiają obecnie identyfikację i kwantyfikację setek peptydów wewnątrzkomórkowych. W Correa i wsp.2 autorzy opisują proces przygotowania próbki, który obejmuje inaktywację cieplną, ekstrakcję peptydów w łagodnych warunkach w celu zachowania wiązań peptydowych oraz względną kwantyfikację poprzez znakowanie izotopów stabilnych amin. Autorzy opracowali niedrogie podejście, które może umożliwić identyfikację i kwantyfikację natywnych i biologicznie aktywnych peptydów z hodowli komórkowych i próbek tkanek. Podejście to może zostać wykorzystane do odkrycia specyficznych dla choroby biomarkerów peptydowych, peptydów przeciwdrobnoustrojowych lub celów dla przyszłych prac terapeutycznych.
Postępy w spektrometrii mas i bioinformatyce umożliwiają obecnie szczegółową charakterystykę proteomów z różnych źródeł materiału biologicznego3. Rozszyfrowanie biologicznego znaczenia proteomicznych wzorców ekspresji w tych złożonych próbkach pozostaje poważnym wyzwaniem w tej dziedzinie. Aby sprostać temu wyzwaniu, Vanderwall i in. wprowadzają JUMPn, program biologii systemowej i związany z nim przepływ pracy, który organizuje dane proteomiczne w moduły (tj. kompleksy białkowe), które łączą klastry koekspresji białek z powiązanymi węzłami sieci interakcji białko-białko (PPI)4. Autorzy oceniają skuteczność tego narzędzia, wykorzystując istniejące zestawy danych proteomicznych, a także dane symulowane, i pokazują jego przydatność w ułatwianiu biologicznej interpretacji złożonych zestawów danych proteomów. Ich wyniki pokazują, że podejście to może być wykorzystane do pomiaru czynnika transkrypcyjnego i aktywacji kaskady kinazy, demonstrując jego użyteczność w identyfikacji czynników powodujących choroby u ludzi oraz w innych badaniach próbujących określić mechanizmy biologiczne na podstawie głębokich danych proteomowych.
Pirofosforany inozytolu (PP-InsPs) znajdują się we wszystkich komórkach eukariotycznych, gdzie działają jako metaboliczne cząsteczki sygnałowe i regulują różne procesy5. Historycznie, ze względu na właściwości fizyczne i niską liczebność PP-InsP, analiza ograniczała się do stosowania znaczników promieniotwórczych, które są drogie i wymagają specjalnej pielęgnacji i przechowywania. Jako alternatywę, Qiu i in. opracowali protokół umożliwiający wysokoprzepustowe, bezwzględne oznaczanie ilościowe pirofosforanów inozytolu z hodowli komórkowych lub materiału źródłowego tkanek za pomocą spektrometrii mas z elektrorozpylaniem sprzężonym z elektrorozpylaniem (CE-ESI-MS)6. W swoim raporcie pokazują, w jaki sposób podejście to można wykorzystać do profilowania wszystkich PP-InsP obecnych w próbce, rozróżniania gatunków i identyfikacji regioizomerów w celu identyfikacji zmian przestrzennych i czasowych w różnych warunkach i stanach chorobowych.
Duża część procesów komórkowych jest kontrolowana przez fosforylację białek, a błędy w tych szlakach sygnałowych są związane z wieloma różnymi stanami chorobowymi7. Jednak nadal istnieją znaczne luki w zrozumieniu wszystkich mechanizmów, które regulują fosfatazy i kinazy białkowe w różnych typach komórek i w różnych warunkach. Aby wypełnić te luki w zrozumieniu, Smolen i in. wprowadzają nowatorski przepływ pracy wykorzystujący kulki inhibitora fosfatazy w połączeniu ze spektrometrią mas (PIB-MS)8. Korzystając z nieselektywnego inhibitora fosfatazy fosfoproteinowej, mikrocystyny-LR, sprzężonego z kulkami tosefalozy, autorzy są w stanie wzbogacić te docelowe białka. Dodatkowo, dzięki zastosowaniu łagodnych warunków mycia w celu usunięcia niespecyficznych zabezpieczeń, byli również w stanie wychwycić interakcje białkowe. Pokazują one, w jaki sposób podejście to można wykorzystać do identyfikacji i ilościowego określenia fosfataz fosfoproteinowych, ich statusu fosforylacji oraz potencjalnych interakcji białko-białko zarówno w hodowli komórkowej, jak i w tkance.
Postępy w metodach przygotowywania próbek, takie jak strategie ilościowego oznaczania endogennych peptydów, wzbogacanie fosfataz i kinaz, interakcje białek i pirofosforany inozytolu, poszerzają bazę wiedzy na temat dynamiki białek w procesach biologicznych. Postęp spektrometrów masowych, takich jak akwizycja niezależna od danych, w przeciwieństwie do akwizycji zależnej od danych, pozwala na większą głębokość sekwencjonowania w celu identyfikacji peptydów w taki sposób, że peptydy o wyższej obfitości nie maskują peptydów o niższej obfitości podczas zbierania danych, co pozwala na identyfikację innych klas białek. Spektrometry masowe timsTOF pomogą w rozwoju przyszłości poprzez włączenie mobilności jonów oprócz chromatografii cieczowej jako dodatkowej separacji peptydów, aby umożliwić jeszcze głębsze sekwencjonowanie i większą szansę na wykrycie peptydów ze strategii przygotowania próbek opisanych w tej kolekcji. Dziedzina proteomiki będzie nadal się rozwijać w oparciu o nowe metodologie przygotowywania próbek, postęp w spektrometrach mas do pozyskiwania danych oraz narzędzia do analizy bioinformatycznej, takie jak JUMPn, w celu zrozumienia złożoności i funkcji biologicznych.