Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Summary

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Abstract

Choroby sercowo-naczyniowe są główną przyczyną zgonów na świecie, a zwapnienie naczyń krwionośnych jest najważniejszym predyktorem zdarzeń sercowo-naczyniowych; jednak obecnie nie ma możliwości leczenia zwapnienia naczyń krwionośnych. Zwapnienie rozpoczyna się w wyspecjalizowanych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV), które służą jako ogniska zarodkowania poprzez agregację jonów wapnia i fosforanów. Protokół ten opisuje metody uzyskiwania i oceny zwapnienia w aortach mysich oraz analizy powiązanych wyekstrahowanych EV. Najpierw przeprowadza się grubą sekcję myszy w celu pobrania odpowiednich narządów, takich jak nerki, wątroba i płuca. Następnie mysia aorta jest izolowana i wycinana od korzenia aorty do tętnicy udowej. Dwie do trzech aort są następnie łączone i inkubowane w roztworze trawiennym przed poddaniem ultrawirowaniu w celu wyizolowania interesujących EV. Następnie określa się potencjał mineralizacji EV poprzez inkubację w roztworze o wysokiej zawartości fosforanów i pomiar absorbancji światła o długości fali 340 nm. Wreszcie, hydrożele kolagenowe są używane do obserwacji zwapniałych minerałów tworzących się i dojrzewających wytwarzanych przez EV in vitro.

Introduction

Zwapnienie jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na śmiertelność i zachorowalność z powodu chorób sercowo-naczyniowych¹. Zwapnienie zmienia mechanikę ściany tętnicy z powodu nagromadzenia minerałów wapniowych i fosforanowych². W miażdżycy zwapnienie może nasilać miejscowy stres i powodować pękanie blaszki miażdżycowej, która jest główną przyczyną zawałów serca. Zwapnienie przyśrodkowe - często wynikające z przewlekłej choroby nerek - jest bardziej rozpowszechnione i prowadzi do znacznego usztywnienia tętnic, dysfunkcji i przeciążenia serca^2,3. Obecnie nie ma możliwości terapeutycznych w leczeniu lub zapobieganiu zwapnieniu naczyń krwionośnych.

Komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) przyjmują fenotyp podobny do osteoblastu i uwalniają zwapniające pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), które zarodkują powstające minerały, powodując w ten sposób zwapnienie^4,5^,6. Proces ten przypomina fizjologiczną mineralizację osteoblastów w bone⁷. Chociaż punkt końcowy mineralizacji jest podobny w ścianie naczynia krwionośnego i macierzy kostnej, mechanizmy, dzięki którym powstają zwapnienia EV, różnią się w obu tkankach⁸. Istnieje wiele rodzajów modeli, które są używane do badania zwapnienia naczyń krwionośnych. In vitro modele hodowli komórkowych naśladują osteogenne przejście VSMC i późniejsze tworzenie minerałów za pomocą specjalistycznych pożywek.

Podczas badania zwapnienia in vivo, używany model zależy od rodzaju badanego zwapnienia. Mysie modele hiperlipidemiczne są często używane do badania zwapnienia miażdżycowego, które wydaje się bardziej ogniskowe w blaszkach bogatych w lipidy⁹. W przeciwieństwie do tego, zwapnienie przyśrodkowe jest bardziej rozpowszechnione w całym układzie naczyniowym i często jest badane przy użyciu modeli przewlekłej choroby nerek, które wykorzystują dietę bogatą w adeninę w celu wywołania niewydolności nerek lub techniki chirurgiczne w celu usunięcia znacznych części nerek^10,11. Agresywne modele zwapnienia naczyń krwionośnych wykorzystywały kombinację modeli hiperlipidemicznej i przewlekłej choroby nerek¹². Protokół ten zapewnia metodę oceny zwapnienia naczyń krwionośnych w aorcie mysim zarówno pod kątem zwapnienia przyśrodkowego, jak i miażdżycowego, ekstrakcji EV ze ściany aorty oraz obserwacji potencjału mineralizacji w EV uzyskanych z modeli hodowli komórkowych in vitro. Przyszłe badania mogą wykorzystywać te procedury w mechanistycznych analizach zwapnienia naczyń krwionośnych oraz do oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Protocol

Praca in vivo została zatwierdzona i nadzorowana przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Międzynarodowym Uniwersytecie Florydy i była zgodna z aktualnymi wytycznymi National Institutes of Health (NIH). W przypadku tego protokołu procedura nie różni się w zależności od szczepu, wagi, wieku i płci myszy. Rodzaj badanego zwapnienia, diety i leczenie mogą zmieniać czas trwania badania i wagę wykorzystanej myszy i mogą zależeć od określonego szczepu i płci myszy wykorzystanej w badaniu. Do tego protokołu wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy C57BL/6J, które karmiono dietą zwapnienia. Myszy zostały uśmiercone między 20 tygodniem a 24 tygodniem życia.

1. Izolacja i wycięcie aorty

1. Markery fluorescencyjne
   1. Czterdzieści osiem godzin przed eutanazją wstrzyknij myszom 20 μM OsteoSense 680, środek do obrazowania fluorescencyjnego, w zalecanej dawce 100 μl na 25 g we wstrzyknięciu dożylnym.
   2. Pod wyciągiem umieść płytę styropianową z czterema kołkami teowymi, wiadro wyłożone ręcznikiem papierowym, probówkę o pojemności 50 ml wypełnioną ręcznikiem papierowym, probówkę do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml, narzędzia do preparowania (patrz tabela materiałów) i etanol w butelce z rozpylaczem. Umieść zlewki z PBS na lodzie.
2. Pobieranie krwi
   1. Dodaj 2 ml izofluranu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypchanej ręcznikiem papierowym. Umieść rurkę w wiadrze i zamknij ją pokrywką.
      UWAGA: Z izofluranem należy obchodzić się w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, bez recyrkulacji powietrza wywiewanego ze względu na toksyczność krótkotrwałego narażenia.
   2. Przenoś jedną mysz do wiadra na raz. Po uspokojeniu umieść mysz na ręczniku papierowym w pozycji grzbietowej. Trzymając mysz dłonią ręki niedominującej, odłóż uszy do tyłu za pomocą kciuka i palca wskazującego.
   3. Za pomocą pęsety wytnij jedno z oczu. Przytrzymaj mysz nad probówką o pojemności 1,5 ml, aby rozpocząć pobieranie krwi, podczas którego należy pobrać 1 ml krwi. Gdy krew przestanie odpływać, umieść mysz z powrotem w wiadrze w celu dalszego uspokojenia.
3. eutanazja
   1. Połóż ręcznik papierowy na macie preparacyjnej. Gdy mysz zostanie uspokojona, połóż ją na macie w pozycji leżącej. Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach za pomocą sworznia w kształcie litery t, aby przytrzymać każdą kończynę.
   2. Spryskaj brzuch myszy alkoholem. Za pomocą pęsety unieś skórę w okolicy klatki piersiowej. Nożyczkami przetnij linię przyśrodkową do jamy klatki piersiowej. Po przecięciu mostka pośrodku przetnij przeponę po obu stronach klatki piersiowej.
   3. W razie potrzeby odetnij przednią część klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca.
4. Usuwanie narządów
   1. Za pomocą pęsety unieś skórę i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej. Usuń nadmiar skóry lub tłuszczu. Usuń narządy rozrodcze i pęcherz moczowy, a także tłuszcz poza linią środkową.
   2. Przesuń narządy żołądkowo-jelitowe (GI) na prawą stronę i podążaj za jelitami w linii środkowej. Po znalezieniu podnieś linię środkową i wytnij przewód pokarmowy aż do żołądka.
   3. Wytnij nerki, odsuwając je od linii środkowej. Naciąć jak najbliżej nerki.
   4. Następnie rozpocznij usuwanie wątroby, podnosząc płaty i odcinając od linii środkowej.
   5. Perfuzja serca i aorty. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wstrzyknąć zimny PBS do prawej komory. Poczekaj, aż płuca napompują się i zmienią kolor na biały. Usuń płuca, a także nadmiar przepony lub klatki piersiowej.
5. Usuwanie kości
   1. Otwórz szeroko nożyczki i umieść je w dolnej części myszy nad ogonem. Cięcie w dół i zacznij podnosić kręgosłup ze skóry. Usuń tłuszcz z boków linii środkowej. Po oderwaniu skóry wytnij kręgosłup i nienaruszone narządy, przecinając je tuż nad sercem. W przypadku transportu do stereoskopu umieść kręgosłup i nienaruszone narządy w zlewce PBS w wiadrze z lodem.
   2. Przenieś kręgosłup i narządy do naczynia preparacyjnego. Napełnij lodowatym PBS. Przypnij kręgosłup i klatkę piersiową za pomocą igieł.
   3. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj pęsety, aby ostrożnie podnieść serce i zacznij ciąć powyżej kręgosłupa i pod aortą. Kontynuuj to, aż dojdziesz do dolnej części kręgosłupa. Usuń grzbiet z naczynia preparacyjnego i przygwoźdź serce oraz wszelkie obce tłuszcze lub mięśnie.
6. Mikrodysekcja
   1. Zaczynając od obszaru tuż pod sercem, zidentyfikuj trzy struktury rurkowe: przełyk, żyłę główną i aortę. Usuń przełyk i żyłę główną, aby mieć czyste pole widzenia aorty.
   2. Za pomocą kleszczyków i nożyczek do mikrodysekcji zacznij podnosić tkankę tłuszczową i ciąć jak najbliżej aorty. Pamiętaj, aby nie przecinać aorty. Kontynuuj to wzdłuż linii przyśrodkowej, aż cała aorta oraz tętnice udowe zostaną odsłonięte.
   3. W sercu usuń całą tkankę tłuszczową, odsłaniając trzy gałęzie na łuku aorty. Usuń korzeń aorty z lewej komory, wkładając nożyczki do mikrodysekcji do lewej komory i przecinając mięsień otaczający aortę.
   4. Po wyizolowaniu i oczyszczeniu aorty zobrazuj ją za pomocą skanera bliskiej podczerwieni, aby uwidocznić zwapnienie naczyń krwionośnych.
   5. Użyj niestandardowego skryptu MATLAB (plik uzupełniający 1), aby określić ilościowo całkowity sygnał znacznika wapnia, który jest znormalizowany do całkowitego zeskanowanego obszaru aorty. Skrypt MATLAB działa przy użyciu dodatku Bioinformatics toolbox. MATLAB jest najpierw kierowany do lokalizacji plików TIFF ze skanowania aort w bliskiej podczerwieni, następnie otwierane są poszczególne pliki, a wartości intensywności pikseli są wyodrębniane z plików TIFF.
      1. Po zaprezentowaniu użytkownikowi obrazu z kolorową mapą, jako maksimum skali wybierz aortę o największym zwapnieniu.
      2. Gdy MATLAB zapyta "Ile próbek znajduje się na obrazie?" w oknie poleceń wprowadź liczbę aort na bieżącym obrazie i wybierz każdą aortę jeden po drugim. Po wybraniu aorty MATLAB utworzy obraz binarny z maską całkowitego obszaru aorty i inny obraz binarny z maską zwapniałego obszaru aorty. Wartości z tych zamaskowanych obrazów są następnie wykorzystywane do określenia całkowitego obszaru zwapniałego, całkowitego obszaru aorty, procentowego obszaru dodatniego dla zwapnienia oraz średniej intensywności zwapniałego obszaru.
      3. Aby wybrać aortę, utwórz ramkę wokół interesującej ją aorty na najnowszej figurze na ekranie, zaznaczając cztery rogi jednym lewym przyciskiem myszy i tworząc ramkę wokół obrazu. Aby zamknąć pole, kliknij dwukrotnie pierwszy róg.
         UWAGA: Próg może się różnić w zależności od zastosowanego modelu zwapnienia. To od użytkownika zależy, jaka wartość określa dodatni sygnał do zwapnienia naczyń krwionośnych. Po ustawieniu progu dla eksperymentu musi on pozostać taki sam przez cały czas trwania eksperymentu.
   6. Po wyodrębnieniu danych ilościowych wykonaj jednokierunkową ANOVA za pomocą testu post-hoc Tukeya, aby pokazać istotność między grupami.

2. Izolowanie i ekstrakcja EV z aort

UWAGA: Po wyizolowaniu i usunięciu aort, EV mogą być ekstrahowane z tkanki. Korzystając z roztworu trawiennego i wielu cykli wirowania, EV mogą być zbierane i wykorzystywane do wielu różnych technik, w tym testów zwapnienia, elektroforezy żelowej i immunoblottingu¹³. Protokół izolacji i ekstrakcji EV jest następujący:

1. Natychmiast po zeskanowaniu aort połącz dwie do trzech aort, aby uzyskać wystarczające stężenie białka.
2. Przygotuj roztwór trawienny zawierający 0,25 M sacharozy, 0,12 M chlorku sodu (NaCl), 0,01 M chlorku potasu (KCl), 0,02 M chlorowodorku trisu i 600 U/ml kolagenazy¹³.
3. Inkubować dwie lub trzy zebrane aorty w 1,5 ml roztworu trawiennego przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać roztwór. Odwirować roztwór o stężeniu 1 000 × g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórek.
4. Odwirować supernatant przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 33 000 × g w celu usunięcia mikropęcherzyków. Zebrać i ocenić supernatant pod kątem potencjału zwapnienia (patrz sekcja 3).
   UWAGA: Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami, jeśli ma być wykonana elektroforeza żelowa i immunoblotting białek EV.
5. Ultraodwirować supernatant w stężeniu 100 000 × g przez 1 godzinę, aby wyizolować interesujące nas EV.
6. Podczas gdy supernatant jest poddawany ultrawirowaniu, należy przygotować bufor do lizy i ekstrakcji RIPA (patrz tabela materiałów), dodając inhibitor proteazy i wirując aż do rozpuszczenia.
7. Po zakończeniu ultrawirowania odessać supernatant, pozostawiając osad, który zawiera EV. Zawiesić osad w przygotowanej mieszaninie inhibitorów lizy i proteazy RIPA. Próbki są gotowe do elektroforezy żelowej i western bloting.

3. Ocena potencjału zwapnienia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z absorbancją rozpraszania światła

UWAGA: Aby zmierzyć tworzenie się minerałów w czasie rzeczywistym przez EV, użyliśmy pierwotnie opracowanego testu do badania tworzenia się minerałów z chrząstek EV płytki wzrostu z hodowli komórkowych¹⁴. Ponieważ osadzanie się fosforanu wapnia jest cechą charakterystyczną zwapnienia, wzrost absorbancji rozpraszania światła w wyniku tworzenia się związków fosforanu wapnia wskazuje na potencjał zwapnienia¹⁴. Metody in vitro Modele VSMC są wygodne do pomiaru potencjału zwapnienia pojazdów elektrycznych. W tej technice czytnik płytek z filtrem o krótkiej długości fali może określić ilościowo zwapnienie EV in vitro. Odczyt chłonności jest rejestrowany przy 340 nm, a wyższa absorbancja wskazuje na większe tworzenie się minerałów fosforanu wapnia. Protokół oznaczania absorbancji rozpraszania światła jest następujący:

1. Odwirować kondycjonowane zebrane podłoże VSMC o stężeniu 1,000 × g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek¹⁴.
2. Odwirować supernatant w stężeniu 33 000 × g przez 30 minut, zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.
   UWAGA: Obecność EV w pobranym supernatancie można potwierdzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) lub analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
3. Przygotować sterylny roztwór jednozasadowy (NaH_{, 2}PO_{, 4}) fosforanu sodu o stężeniu 300 mM. W razie potrzeby przefiltrować roztwór, aby zapewnić sterylne warunki.
4. Dodać 1% (v/v) z 300 mM NaH₂PO₄ do próbek EV i delikatnie pipetować roztwór, aby dobrze wymieszać. Przenieść 200 μl roztworu mieszaniny na płytkę 96-dołkową. Inkubować 96-dołkową płytkę w czytniku mikropłytek w temperaturze 37 °C.
5. Ustaw czytnik płytek tak, aby rejestrował absorbancję przy długości fali 340 nm co 1 minutę.

4. Ocena mineralnego formowania zwapnień pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą hydrożeli kolagenowych

UWAGA: Agregacja EV i powstawanie mikrozwapnień są obserwowane za pomocą hydrożeli kolagenowych. Te hydrożele działają jak rusztowanie, które naśladuje gęstość kolagenu obserwowaną in vivo¹⁵. Pokazuje to wpływ kolagenu na wzrost zwapnienia. Protokół oceny tworzenia się minerałów EV w hydrożelach jest następujący:

1. Dzień 1
   1. Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 2,5 mg/ml w DMEM. Powoli dodawaj 5 M wodorotlenku sodu do mieszaniny kolagen/DMEM, aż kolor zmieni się na czerwony. Sprawdzić, czy pH roztworu wynosi około 7,
      UWAGA: Jeśli roztwór zmieni kolor na fioletowy i stanie się zbyt podstawowy, uruchom ponownie proces.
   2. Odpipetować 300 μl roztworu kolagenu o pH 2,5 mg/ml o pH 7 do każdej studzienki szklanej komory 8-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i kontrolowanej wilgotności 5% CO₂ przez 72 godziny.
2. Dzień 4
   1. Dodaj 300 μl DMEM jako kontrolę do studzienek.
   2. Dodać 300 μl próbek pożywki EV pobranych wcześniej do pozostałych studzienek.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C i kontrolowanej wilgotności 5% CO₂ przez 6 dni.
3. Dzień 10
   1. Przygotować 2,5 μl Osteosense 680EX z 22,5 μl DMEM.
   2. Odpipetować 2,5 μl mieszaniny Osteosense i DMEM do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C i wilgotności kontrolowanej 5% CO₂ przez 24 godziny.
4. Dzień 11
   1. Zobrazuj hydrożele z filtrami odpowiednimi dla fluorescencji Osteosense. Zobrazuj je przez dno komory ze szkła nakrywkowego za pomocą odwróconego mikroskopu lub od góry za pomocą obiektywu o dużej odległości roboczej.
   2. Oceń liczbę zwapnień i rozmiar zwapnienia na zebranych obrazach, korzystając z opcji analizy cząstek dostępnych w ImageJ.
      1. Korzystanie z punktu menu Obraz | Dostosuj | Polecenie threshold w celu binaryzacji obrazów w taki sposób, aby tylko sygnał Osteosense był biały. Korzystanie z punktu menu Analiza | Polecenie Analizuj cząstki, aby uzyskać informacje o każdym zwapnieniu na obrazie. Pamiętaj, aby użyć tych samych parametrów progowych dla każdego analizowanego obrazu w celu zapewnienia spójności.

Results

Po usunięciu aort, obrazowanie za pomocą skanera optycznego bliskiej podczerwieni pokazuje wizualną reprezentację aorty, jak również zwapnienie naczyń krwionośnych (Rysunek 1). Wartości intensywności pikseli na zeskanowanym obrazie fluorescencyjnym reprezentują rozkład zwapnienia i są pokazane za pomocą kolorowej mapy cieplnej. Metody kwantyfikacji obejmują identyfikację dodatniego progu i podanie procentowej powierzchni aorty z wartościami większymi niż ta wartość progowa i/lub podanie średniej inten...

Discussion

Podczas wykonywania protokołu ważne jest, aby zwrócić uwagę na kluczowe kroki w celu uzyskania pomyślnych wyników. Podczas izolacji aorty mysiej ważne jest, aby perfuzja została wykonana prawidłowo. Podczas wstrzykiwania PBS należy uważać, aby nie przebić prawej komory. Spowodowałoby to, że płyn wyciekałby bezpośrednio z komory i nie krążyłby w płucach, pozostawiając krew w aorcie. Po prawidłowym przeprowadzeniu perfuzji i rozpoczęciu mikrodysekcji, cała tkanka tłuszczowa i tłuszczowa musi zostać usunięta z aorty przed z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-dołkowa komora nakrywkowa	Thermo Scientific	155409PK
10 ml strzykawka	BD	302995
20 G 1-calowa igła	BD	305175
kolagen, wysoka koncentracja, ogon szczura	Corning	354249
kolagenaza	Worthington Biochemiczne	LS004174
zakrzywione kleszcze	Roboz Instrument chirurgiczny	RS-8254
Naczynie preparacyjne	Żywe systemy Oprzyrządowanie	DD-90-S
Patelnia preparcyjna i wosk	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
nożyczki preparacyjne (ostrze 24 mm)	Instrument chirurgiczny Roboz	RS-5913
nożyczki preparacyjne (ostrze 13 mm)	Instrument chirurgiczny Roboz	RS-5677
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (ostrze 5 mm)	Instrument chirurgiczny	Roboz RS-5600
Mikro pęseta preparcyjna (końcówka 0,10 x 0,06 mm)	Instrument chirurgiczny Roboz	RS-4976
Ultrawirówka	Optima MAX-TLBeckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Inhibitor proteazy Pierce'a	Thermo Scientific	A32963
Chlorek potasu	Fischer Chemical	P217
Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA	G Biosciences	786-489
Chlorek sodu	Fischer Chemical	BP358
Wodorotlenek sodu	Thermo Scientific	A4782602
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	S0751
Sacharoza	Sigma	S7903
Synergy HTX Czytnik wielomodowy	Agilent
Płytka do hodowli tkankowych, 96-dołkowa	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Chlorowodorek	Fischera Chemiczny	BP153