Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowe systemy ekspresji: metody produkcji i stosowania

28 lipca 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. System bezkomórkowy OnePot PURE. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy autoindukcji. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja bakteryjnego lizatu bezkomórkowego. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Szybka charakterystyka części genetycznych z systemami bezkomórkowymi. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Chromatografia cieczowa sprzężona z wykrywaniem indeksu refrakcji lub spektrometrii mas do profilowania metabolitów w systemach bezkomórkowych opartych na lizatach. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Badanie projektowe do wdrożenia w celu opracowania i walidacji pacjentów w zakresie diagnostyki przełącznika na papierze w formie papierowej. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Artykuł redakcyjny

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy ekspresji bezkomórkowej (CFE) to zestaw narzędzi, które odtwarzają kluczowe procesy komórkowe transkrypcji, translacji i metabolizmu poza granicami komórki1. Takie metody szybko zyskały na popularności, oferując uproszczone eksperymenty poprzez usunięcie błon komórkowych i zmniejszoną złożoność poprzez usunięcie genomowego DNA i odpowiadającą mu złożoność interakcji między konstruktem genetycznym a gospodarzem. Systemy CFE są obecnie wykorzystywane w badaniach podstawowych, wykrywaniu, bioprodukcji i edukacji. W tym zbiorze metod przedstawiono dziewięć przykładów nowych sposobów produkcji i wykorzystania systemów bezkomórkowych.

Trzy z tych metod koncentrują się na zwiększeniu dostępności produkcji systemów bezkomórkowych. Grasemann i wsp. opisują łatwiejszy sposób na stworzenie systemu PURE, systemu CFE, który odtwarza wszystkie składniki wymagane do transkrypcji i translacji, zamiast używać lizatów komórkowych2. Zamiast wyrażać i oczyszczać każdy z 36 składników białka, autorzy łączą szczepy ekspresji, oferując produkcję funkcjonalnego systemu PURE w ciągu tygodnia. Smith i in. proponują uproszczony proces produkcji systemów CFE opartych na lizacie przy użyciu uproszczonego podejścia do hodowli, które skraca całkowity przepływ pracy do 24 godzin, co można osiągnąć w normalnych godzinach pracy3. Cooper i wsp. opisują metodę wykorzystującą zmodyfikowany szczep E. coli , który umożliwia lizę komórek poprzez zamrażanie i rozmrażanie, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu wymaganego przez inne metody4. Wszystkie te metody wpisują się w trend dążący do tego, aby produkcja systemów bezkomórkowych była osiągalna dla laboratoriów dysponujących mniejszą infrastrukturą i wiedzą specjalistyczną w zakresie skomplikowanych tradycyjnych protokołów. Dzięki dostępności konkurencyjnych zestawów komercyjnych, coraz więcej laboratoriów może badać zalety systemów CFE przy niewielkim ryzyku. Dzięki metodom takim jak te przedstawione tutaj, laboratoria te mogą następnie zdecydować się na tworzenie własnych systemów CFE, które są dostosowane do ich potrzeb, bez ogromnych inwestycji w sprzęt lub czas.

Dwie metody koncentrują się na zaletach szybkiego i wysokowydajnego eksperymentowania możliwego do przeprowadzenia za pomocą systemów CFE. Dopp i wsp. przedstawiają metodę amplifikacji liniowych matryc DNA w celu szybkiego badania przesiewowego konstruktów genetycznych5. Dzięki ich podejściu, projekty genetyczne można zamawiać w firmach zajmujących się syntezą DNA, a następnie amplifikować i przesiewać w ciągu 24 godzin. McManus i wsp. opisują podobne podejście, w którym gen reporterowy jest amplifikowany różnymi starterami kodującymi różne składniki regulatorowe6. Niski koszt oligonukleotydów w połączeniu z systemami CFE umożliwia szybkie i ekonomiczne badania przesiewowe składników, takich jak promotory. Obie metody podkreślają potencjał systemów CFE w zakresie szybkich eksperymentów, skracając czas projektowania i testowania konstrukcji z tygodni przy użyciu tradycyjnego klonowania do dni, a nawet godzin.

Kolejne trzy metody dostarczają narzędzi do specjalistycznych zastosowań systemów CFE. Toh i wsp. proponują metodę tworzenia systemów CFE ze Streptomyces venezuelae7. Większość protokołów CFE opiera się na E. coli, w tym wszystkie inne metody z tej kolekcji. Ta nowa metoda dla S. venezuelae przynosi korzyści płynące z systemów CFE organizmowi o szerokim znaczeniu dla produkcji produktów naturalnych. Dinglasan i wsp. podają sposób pomiaru stężeń metabolitów w reakcjach bezkomórkowych8. Takie pomiary mają kluczowe znaczenie dla zastosowań w bezkomórkowej inżynierii metabolicznej, w której nienaruszony metabolizm systemów CFE jest wykorzystywany do wytwarzania interesujących produktów niebiałkowych. Po trzecie, Drachuk i wsp. prezentują mikrokapsułkowanie DNA w celu dodania do reakcji CFE9. Podejście to jest reprezentatywne dla zestawu technik, które umożliwiają racjonalne ponowne wprowadzenie zalet kompartmentacji do systemów CFE po usunięciu naturalnych membran podczas produkcji systemów CFE. Każda z tych metod różnicuje zakres zastosowań, do których można zastosować systemy CFE.

Na koniec Jaenes i wsp. opisują metody tworzenia rzeczywistej diagnostyki wirusa Zika w oparciu o systemy CFE10. Testy i oprzyrządowanie są tanie w porównaniu z konkurencyjnymi technologiami, takimi jak PCR, a autorzy z powodzeniem przetestowali swoją diagnostykę na próbkach pacjentów w wielu krajach. Praca ta jest dobrym przykładem zastosowań czujników w miejscu potrzeby, które są być może obszarem, w którym systemy CFE są gotowe do wywarcia najbardziej natychmiastowego wpływu na świat rzeczywisty.

Jako zbiór tych metod, obejmują reprezentatywny zakres głównych obszarów aktywnych badań nad systemami CFE w ostatnich latach. Metody, które usprawniają produkcję systemów CFE i umożliwiają eksperymenty o wysokiej przepustowości, są dobrze reprezentowane, a przykłady wielu bardziej szczegółowych zastosowań systemów CFE są obecne. Inne obszary zainteresowań obejmują produkcję złożonych białek do zastosowań medycznych, włączanie aminokwasów niekanonicznych, optymalizację długoterminowego przechowywania oraz rozwój sztucznych komórek. Przewidujemy, że wdrażanie systemów CFE będzie nadal przyspieszać, biorąc pod uwagę zmniejszoną barierę wejścia, potencjał do szybkich eksperymentów i szerszy zakres możliwości, a wszystko to możliwe dzięki metodom takim jak te przedstawione w tej kolekcji. Pozostałe wyzwania zależą od przestrzeni aplikacji. W przypadku bioprodukcji kluczowe znaczenie będzie miało obniżenie kosztów na dużą skalę poprzez przejście na tańsze podłoża i lepszy recykling. W zakresie wykrywania potrzebne są znaczące prace oparte na przykładzie Jaenes i wsp., aby wykazać solidną wydajność w różnych zastosowaniach w miejscu zapotrzebowania. Ogólnie rzecz biorąc, dziedzina ta musi nadal udoskonalać podstawowe techniki, jednocześnie poszerzając repertuar tego, co można zrobić za pomocą systemów CFE.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują programowi Biura Sekretarza Obrony ds. Badań Stosowanych na rzecz Rozwoju Priorytetów Nauki i Techniki za wsparcie współpracy, która doprowadziła do powstania tej kolekcji.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

Powiązane artykuły