$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, która dotyka około 1 na 400 osób w ciągu ich życia. Choroba początkowo objawia się upośledzeniem górnego i dolnego neuronu ruchowego, a ostatecznie przechodzi w paraliż i śmierć w wyniku niewydolności oddechowej w ciągu 2–5 lat od wystąpienia objawów1. ALS może być dziedziczne, z ponad 30 różnymi mutacjami genetycznymi, ale tylko 4 warianty genów (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) stanowią około 55% rodzinnego ALS. Większość przypadków ALS, około 90%, to sporadyczne ALS, których główne przyczyny nie są jeszcze w pełni poznane2. Istnieje pilna potrzeba rozwikłania mechanizmów ALS przy użyciu odpowiednich narzędzi i organizmów modelowych. W tym zbiorze metod przedstawiamy przegląd najnowszych postępów w badaniach w zakresie naśladowania tej choroby i, miejmy nadzieję, ostatecznego znalezienia opcji leczenia. Na przykład zastosowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które mogą być różnicowane w neurony ruchowe lub astrocyty, oferuje humanizowany system modelowy 3,4,5. Dodatkowo, w tym zbiorze metod, przedstawiono modele zwierzęce, takie jak Drosophila do badania wychwytu glukozy i połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) in vivo 6,7, myszy do badania neuronów korowych8 oraz C. elegans lub zebrany do badania zaburzeń motorycznych 9,10 i pośmiertnych tkanek pacjenta11.
Larwy danio pręgowanego są przezroczyste, a ich neurony ruchowe są bezpośrednio widoczne, co czyni je doskonałym narzędziem do nieinwazyjnych badań in vivo . Asakawa i wsp. pokazują przemianę fazową optogenetycznie wyrażanego TDP-43 w pojedynczych rdzeniowych neuronach ruchowych9. Po napromieniowaniu można zaobserwować i przeanalizować cytoplazmatyczne przemieszczenie TDP-43. Agregacja cytoplazmatycznego TDP-43 jest cechą charakterystyczną degeneracji neuronów ruchowych w ALS. Metoda ta pozwala na funkcjonalne badanie i analizę białek związanych z ALS w subkomórkowy, czasowy sposób.
Wykorzystując superrozdzielczą mikroskopię oświetlenia strukturalnego (SIM), Coyne i Rothstein szczegółowo opisują protokół, który izoluje jądra i opisują, jak badać kompleksy nukleoporyn11. Kompleksy nukleoporynowe składają się z wielu kopii około 30 różnych białek nukleoporynowych (Nups). Wykazano, że upośledzenie transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT) i zmiany Nup są wczesnymi cechami charakterystycznymi wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym ALS. Poprzez ekstrakcję jąder możliwe jest zbadanie poszczególnych białek Nup w NPC i nukleoplazmie w 3D. Co ciekawe, można to zastosować nie tylko do komórek pochodzących z iPSC, ale także do tkanek pośmiertnych.
Currey i Liachko opisują dwa testy pozwalające na rozróżnienie łagodnego, umiarkowanego i ciężkiego upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans ALS10. W teście lokomocji radialnej mierzy się pełzanie po powierzchni, dzięki czemu jest to łatwe i opłacalne badanie. W drugiej metodzie, teście pływackim, ruchy rzucania można mierzyć za pomocą komputerowej metody śledzenia. Autorzy wykorzystują to do badania TDP-43 i tau.
Hayes i wsp. opisują również metodę badania NCT8. Stosują metodę przenikania do kultur neuronalnych. Wykorzystując pierwotne neurony korowe myszy, opisują metodę, która utrzymuje integralność błony jądrowej za pomocą hipotonicznej lizy w połączeniu z poduszką albuminy surowicy bydlęcej. W ten sposób import jądrowy nadal funkcjonuje w sposób zależny od energii, zapewniając w ten sposób platformę mikroskopii i analizy o wysokiej zawartości. Platforma ta będzie miała w przyszłości szerokie zastosowanie w badaniach nad pasywnym i aktywnym transportem jądrowym w neuronach pierwotnych.
Szybka ocena, w jaki sposób manipulacja, białka związane z chorobą lub RNA wpływają na procesy synaptyczne i czy leki terapeutyczne mogą przywrócić te funkcje, jest niezbędna dla badań nad ALS. Wykorzystując neurony ruchowe pochodzące z iPSC, a także neurony pierwotne myszy, Krishnamurthy i in. przedstawiają protokół, który umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych3. Autorzy wykazują, że transfekcja C9orf72-(GA)50 upośledza transmisję synaptyczną, podkreślając przydatność tych metod do wykrywania różnic w funkcji synaptycznej opartych na mutacjach.
Zmieniony wychwyt glukozy jest jedną z patobiologicznych cech ALS. W tym modelu Drosophila Loganathan i in. opisują metodę opartą na FRET do pomiaru wewnątrzkomórkowych zmian w wychwytie glukozy w określonych komórkach6. Korzystając z genetycznie kodowanego czujnika glukozy FRET, zwalidowali swoją metodę z neuronami ekspresyjnymi TDP-43, które wykazują wyższy wychwyt glukozy. W linii zmutowanej TDP-43G298S zwiększony wychwyt glukozy jest wykrywalny dopiero po stymulacji glukozy. Metoda ta stanowi ważne narzędzie do badania glikolizy nie tylko w ALS, ale także ogólnie w odniesieniu do regeneracji neuronów ruchowych.
Techniki preparacji zachowujące architekturę NMJ mają ogromne znaczenie dla badania zmian w neuronach ruchowych wzdłuż nogi Drosophila w czasie. Stilwell i Agudelo wykorzystują technikę, która pozwala na scharakteryzowanie NMJ do identyfikacji altan neuronów ruchowych za pomocą immunocytochemii7. Co ciekawe, dorosłe neurony są obecne przez całe życie muchy, czyli około 90 dni. Porównując mutację SOD1H71Y z mutacją typu dzikiego, autorzy wykazują różne markery zależnego od wieku obrzęku bouton, agregatów białkowych i powiększonych mitochondriów.
Innowacja polegająca na naśladowaniu NMJ przy użyciu systemu kohodowli zaspokaja pilną potrzebę zbadania dysocjacji między neuronami ruchowymi a miotubami. Jeśli chodzi o tę metodę, Stoklund Dittlau i in. opisują, jak hodować ludzkie neurony ruchowe pochodzące z iPSC i ludzkie pierwotne miorurki pochodzące z mezoangioblastów w celu utworzenia funkcjonalnie aktywnych NMJ4. Autorzy wykazują ich funkcjonalność poprzez aktywację neuronów ruchowych wraz z chlorkiem potasu i napływem wapnia w miotubach znakowanych Fluo-4, co zostało zniesione przez podanie blokerów NMJ.
Ostatnio coraz większą uwagę cieszą się systemami kokultur. Badanie nie tylko jednego, ale wielu typów komórek w naczyniu ma tę zaletę, że lepiej naśladuje warunki fizjologiczne niż metody wykorzystujące komórki monokulturowe. Przy użyciu tego podejścia można badać patobiologię związaną z ALS, taką jak toksyczność za pośrednictwem astrocytów i nadpobudliwość neuronów. W filmie autorstwa Taga i wsp. pokazano wytwarzanie neuronów korowych i astrocytów w kokulturze w połączeniu z konfiguracją wieloelektrodową (MEA) w celu monitorowania elektrofizjologii5. Aktywność funkcjonalną można monitorować w czasie, co pozwala na elastyczność w zakresie składu komórkowego, a także różnych warunków hodowli. Stanowi to dodatkowo platformę do testowania potencjału terapeutycznego leków i ich wpływu na aktywność funkcjonalną.
Obecnie istnieją tylko trzy zatwierdzone przez FDA metody leczenia ALS, wszystkie o ograniczonym potencjale aplikacyjnym. Aby znaleźć bardziej obiecujące metody leczenia, przyszłe badania muszą lepiej zrozumieć patobiologię poprzez zastosowanie wielu systemów i podejść modelowych. Bez wątpienia modele pochodzące z ludzkiego iPSC będą stanowić interesującą platformę do badania mechanizmów molekularnych leżących u ich podstaw. To, w połączeniu z systemami modelowymi, takimi jak danio pręgowany, C. elegans, Drosophila lub gryzonie, doprowadzi do postępu w tej dziedzinie. Miejmy nadzieję, że przyszłe badania epidemiologiczne dostarczą więcej informacji na temat tego, jaką rolę odgrywają czynniki środowiskowe w rozwoju ALS12. Wraz z rozszerzającymi się zbiorami danych i rozwijającą się w szybkim tempie bioinformatyką, w przyszłości łatwiej będzie odkryć wspólne mianowniki chorób neurodegeneracyjnych. Doprowadzi to do powstania nowych dróg terapii, a nawet profilaktyki.