$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Jeszcze przed przyznaniem Nagrody Nobla w 2017 r. za mikroskopię krioelektronową (cryoEM) cząsteczek biologicznych, dziedzina ta wzbudzała emocje. Rewolucja w zakresie rozdzielczości była w toku, a biologia strukturalna szukała krioEM jako metody charakteryzacji zbliżającej się do złotego standardu krystalografii rentgenowskiej1. Na początku dziedzina krioEM obejmowała przede wszystkim dane generowane przez kriotransmisyjne mikroskopy elektronowe (cryoTEM). Obecnie, wraz z rozwojem mikroskopów, przyrządów do przygotowywania próbek i metod ich przygotowywania, rodzaje generowanych danych stały się bardziej zróżnicowane. CryoEM nie jest już zarezerwowany do charakteryzowania białek za pomocą cryoTEM. Dziedzina ta rozrosła się i obecnie obejmuje dane generowane za pomocą krioskaningowych mikroskopów elektronowych i skupionej wiązki jonów (cryoSEM/FIB). Wpływ ten jest szerzej odczuwalny w wielu dyscyplinach, w tym w badaniach obrazowych nad cząsteczkami, komórkami, tkankami i materiałami syntetycznymi, takimi jak hydrożele.
Postępy w zakresie możliwości obrazowania były siłą napędową rozwoju krioEM. Ulepszenia w zakresie kamer, detektorów i przetwarzania obrazu utorowały drogę do obrazowania przy mniejszym nakładzie energii, co pozwala delikatnym próbkom biologicznym przetrwać proces obrazowania. W przypadku TEM ekspozycja na wiązkę o niskiej dawce przełożyła się na zastosowanie tomografii, w której pojedyncza próbka jest wielokrotnie obrazowana pod różnymi kątami w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D 2,3. Postępy w dziedzinie SEM/FIB zaowocowały również poprawą rozdzielczości przy mniejszym zużyciu energii. Co ważne, doprowadziło to do poprawy obrazowania próbek nieprzewodzących, co przekłada się na lepsze obrazowanie objętościowe w SEM/FIBs 4,5. Ulepszenia te przyczyniły się do postępu w obrazowaniu w biologicznej mikroskopii elektronowej, ale szczególnie poprawiły obrazowanie kriogeniczne, w którym próbki są delikatne i nie zawierają dodatkowych metali ciężkich w celu poprawy kontrastu.
Wraz z rozwojem możliwości obrazowania rozwinęły się również przyrządy do przygotowywania próbek. W przygotowaniu próbek krioEM pierwszym krokiem jest pomyślna witryfikacja próbek. Uwodnione próbki są zamrażane w celu utworzenia amorficznego lodu, unikając w ten sposób uszkodzeń spowodowanych tworzeniem się kryształków lodu. Wiodące strategie to zamrażanie wgłębne w ciekłym etanie w przypadku cząsteczek i małych komórek lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF) w przypadku większych próbek o grubości do kilkuset mikronów. Postępy w technologii zamrażania wgłębnego pozwalają na lepsze wychwytywanie cząsteczek we wszystkich orientacjach poprzez zmniejszenie samoorganizacji wzdłuż granicy faz powietrze/woda6. Dodatkowo, postęp w technologii HPF pozwala na lekką i elektryczną stymulację próbek na chwilę przed zamrożeniem7. Ostatnio opracowano nową technologię HPF, która może współpracować z mikroskopem fluorescencyjnym, co pozwala na krótkie opóźnienie czasowe (<2 s) między obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek a zamrożeniem HPF8.
Powyższe postępy pobudziły dziedzinę krioEM i zainspirowały rozwój nowych metod. Nastąpiło również ożywienie uznanych technik. W tym miejscu przedstawiamy zbiór metod skoncentrowanych na rozwoju krioEM w celu rozpowszechnienia tych strategii w szybko rozwijającej się dziedzinie badań.
Podczas gdy ulepszenia w zakresie możliwości obrazowania i przyrządów do przygotowywania próbek były główną siłą napędową postępu w dziedzinie krioEM, główną przeszkodą w tych badaniach nadal jest praktyczne przygotowanie próbek. Truong i wsp.9 prezentują metodę, która wykorzystuje tworzenie się monowarstwy lipidowej na granicy faz powietrze/woda. Warstwa lipidowa tworzy się na siatce TEM i działa jak rusztowanie dla interesujących białek błonowych. W przypadku próbek z membraną wielopłytkową lub ułożoną w stos, Johnson i wsp.10 przedstawiają strategię "odklejania" nadmiaru warstw, pozostawiając pojedynczą warstwę na siatce, która jest odpowiednia do obrazowania TEM. W innym artykule Chang i wsp.11 uznają, że niektóre białka są zależne od temperatury i że odpowiednia struktura jest obserwowana w podwyższonych temperaturach. Opisują one zmodyfikowaną metodę zamrażania wgłębnego, która umożliwia nakładanie próbek na siatkę w podwyższonych temperaturach, przy jednoczesnym uzyskaniu szklistego lodu po zamrożeniu wgłębnym. Aby dokładniej kontrolować proces przygotowania siatki kriogenicznej, Kang i wsp.12 prezentują wysokoprzepustową metodę wytwarzania mikrowzorów chipów dla siatek TEM, w których pory mają kontrolowaną głębokość. Ta metoda może dostarczyć kolejnej zmiennej do kontrolowania grubości lodu amorficznego podczas przygotowywania siatki.
Korelacja wielu metod obrazowania jest znacząca. Bieber i wsp.13 opisują przepływ pracy kriogenicznej, w którym zamrożona siatka jest obrazowana w mikroskopie kriofluorescencyjnym w celu zlokalizowania interesującego obszaru fluorescencyjnego. Siatka jest następnie przenoszona do cryoSEM/FIB, gdzie fiducials są używane do wyrównania obrazu fluorescencyjnego z obrazem SEM, umożliwiając w ten sposób ukierunkowanie obszaru fluorescencyjnego na mielenie FIB. Obszar docelowy jest rozcieńczany do kilkuset nanometrów, a następnie siatka jest przenoszona do cryoTEM w celu tomografii w rozcieńczonej lokalizacji docelowej. DiCecco i wsp.14 wykazują korelację między ciekłym TEM a cryoTEM, przybliżając się w ten sposób do celu, jakim jest sprzężenie danych krioTEM o wysokiej rozdzielczości z danymi TEM cząsteczek w ruchu dynamicznym.
Obszarem zainteresowań jest również zautomatyzowane pozyskiwanie dużych zbiorów danych. Cenny czas poświęcony na urządzenia musi zostać zmaksymalizowany, a automatyzacja jest kluczowym krokiem. Kumar i wsp.15 opisują konfigurację typu "klik po kliknięciu" oprogramowania do automatycznego gromadzenia danych do obrazowania cryoTEM.
Wraz z dalszym rozwojem dziedziny krioEM, dalsze postępy będą widoczne w przygotowywaniu próbek, a wpływ cryoEM będzie szeroko odczuwalny w większej liczbie dyscyplin. Niektóre postępy będą polegały nie na nowych technikach, ale na wzmocnieniu istniejących technik. Techniki będą szybsze, łatwiejsze i bardziej niezawodne, z większą przepustowością. Ponieważ automatyzacja zwiększa wydajność danych, kluczowymi obszarami rozwoju będą analiza obrazu i przetwarzanie danych. Ponadto sztuczna inteligencja będzie odgrywać ważną rolę. Powinniśmy spodziewać się zmniejszenia kosztów oprzyrządowania i zajmowanej powierzchni, co pozwoli na szersze udostępnienie tej technologii, chociaż zmiany te mogą być wolniejsze.