$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Glikogen, rozgałęziony polimer glukozy, odgrywa ważną rolę w metabolizmie energetycznym u prokariontów i eukariontów. W warunkach ograniczenia składników odżywczych bakterie i drożdże wykorzystują glikogen do przetrwania komórek1. U ssaków glikogen pełni role specyficzne dla tkanki, w tym miejscowe zastosowanie w mięśniach w celu napędzania skurczu oraz w wątrobie w celu regulacji poziomu glukozy we krwi2. Synteza glikogenu jest katalizowana przez syntazę glikogenu, która łączy reszty glukozy za pośrednictwem wiązań alfa 1,4 oraz enzym rozgałęziający, który tworzy wiązania alfa 1,6, tworząc w ten sposób rozgałęzienia w makrocząsteczce glikogenu. Wykorzystanie tego magazynu energii jest ułatwione przez fosforylazę glikogenu w połączeniu z enzymem rozgałęziającym, co powoduje przebudowę glikogenu i uwolnienie glukozy-1-P. Struktura glikogenu, w tym wielkość cząstek i rozgałęzienia, są interesujące częściowo dlatego, że rozgałęzienie wpływa na rozpuszczalność glikogenu, wielkość cząstek glikogenu wpływa na szybkość ich degradacji, a niestabilność strukturalna glikogenu jest związana z cukrzycą. Co więcej, badanie subkomórkowej lokalizacji glikogenu jest ważne w tkankach takich jak mięśnie, aby uzyskać informacje o roli tego paliwa podczas ćwiczeń.
Akumulacja glikogenu jest kontrolowana przez względną aktywność enzymów syntetyzujących glikogen i tych, które degradują makrocząsteczkę. Wilson3 opisuje techniki pomiaru aktywności enzymatycznej syntazy glikogenu, fosforylazy glikogenu, enzymu rozgałęziającego i enzymu rozgałęziającego. Te metody biochemiczne mierzą produkcję lub zużycie NADH/NADPH lub zmiany kolorymetrycznej za pomocą spektrofotometru. Są to skalowalne podejścia, które pozwalają obejść wysokie koszty, specjalistyczny sprzęt i obciążenia regulacyjne związane z bardziej czułą metodą wykorzystującą izotopy promieniotwórcze. Opisane metody są najbardziej odpowiednie do pomiaru aktywności enzymów za pomocą oczyszczonych enzymów, chociaż przy wystarczającym rozcieńczeniu homogenatu i odpowiednich kontrolach zastosowano je z próbkami tkanek. Wilson3 opisuje również prosty test kolorymetryczny do pomiaru rozgałęzień glikogenu. Chociaż metoda ta dostarcza mniej informacji na temat drobnej struktury glikogenu niż bardziej pracochłonne techniki rozdzielania, zapewnia prosty i szybki pomiar względnego stopnia rozgałęzienia.
Fermont i wsp.4 opisują zastosowanie elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE), metody określania rozkładu długości łańcucha (CLD), który jest odzwierciedleniem wielkości cząstek glikogenu i procentu rozgałęzień. Struktura glikogenu wpływa na zdolność bakterii do przetrwania głodu, a nieprawidłowy glikogen gromadzi się w kilku chorobach spichrzeniowych glikogenu, podkreślając w ten sposób znaczenie metod badania wielkości i rozgałęzień tego źródła paliwa. FACE polega na redukcyjnej aminacji grupy półacetalowej za pomocą kwasu 8-amino-1,3,6 pirenotrisulfonowego (APTS). Oprócz dostarczania informacji na temat CLD, FACE jest przydatny do pomiaru właściwości katalitycznych enzymów rozgałęziających się z różnych źródeł. Podstawowa konkurencyjna technika, HPAEC-PAD, ma tę zaletę, że nie wymaga końcówek nieredukcyjnych, ale ta technika ma problem z odchyleniem masy.
Stopień rozgałęzienia i wielkość cząstek glikogenu są ważnymi cechami polimeru glukozy. Za pomocą mikroskopii elektronowej zaobserwowano, że glikogen występuje w trzech strukturach: sferycznych cząstkach beta (~20 nm), które zawierają kilka cząstek gamma (3 nm) oraz większych cząstkach alfa w kształcie rozety (~300 nm) złożonych z cząstek beta5. Tradycyjne metody izolowania glikogenu są wystarczające do pomiaru stężenia glikogenu, ale naruszają delikatną strukturę glikogenu, co oznacza, że konieczne jest opracowanie łagodniejszej techniki. Ekstrakcja zimną wodą przy użyciu wirowania w gradicynie gęstości sacharozy została opisana do stosowania u bakterii przez Wang, Wang i wsp.6. Technika ta jest lepsza od innych metod w zachowywaniu zarówno większych cząsteczek glikogenu, mierzonych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC), jak i dłuższych łańcuchów, mierzonych za pomocą elektroforezy kapilarnej wspomaganej fluoroforem (FACE)6. Wang, Liu i wsp.7 również stosują podobną metodę do wątroby. O tym, jak ważne jest zrozumienie struktury glikogenu, świadczy niedawny raport pokazujący, że w cukrzycy cząstki alfa glikogenu wątrobowego są "kruche", co powoduje szybszą degradację w porównaniu ze stabilnymi cząstkami alfa, co może wpływać na kontrolę poziomu glukozy we krwi. Ograniczenia tych metod izolacji opartych na gradiencie sacharozy obejmują utratę glikogenu w supernatancie, która może być złagodzona przez niższe stężenie sacharozy, oraz enzymatyczną degradację części glikogenu spowodowaną zastosowanymi łagodnymi warunkami. Ten ostatni jest łagodzony przez krótki etap wrzenia, chociaż zakłóca to powiązane białka.
Wreszcie, Jensen i wsp.8 opisują zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do obrazowania subkomórkowego rozkładu glikogenu i wielkości cząstek w pojedynczych włóknach mięśni szkieletowych. Ta metoda jest jedyną dostępną do badania pul glikogenu podsarkolemmalnego, międzymiofibrylarnego i wewnątrzmiofibrylarnego i była stosowana na tkankach mięśniowych różnych zwierząt. Ponieważ niektóre procesy subkomórkowe preferencyjnie wykorzystują glikogen jako paliwo, ważne jest, aby scharakteryzować lokalizację tych zapasów paliwa. Ponadto metoda ta daje możliwość zbadania metabolizmu glikogenu w różnych typach włókien mięśniowych, co jest ważne w ćwiczeniach, gdzie zmęczenie jest zależne od glikogenu tylko w wybranych włóknach. Jednym z ograniczeń metody TEM jest niezdolność do wykrycia małych cząstek glikogenu, co jest szczególnie niepokojące w warunkach, w których glikogen ulega degradacji, na przykład podczas skurczu mięśni.
Podsumowując, ten zbiór metod dostarcza próbki technik stosowanych do badania struktury glikogenu i enzymów regulujących anabolizm i katabolizm tej makrocząsteczki. Metody te będą miały zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia metabolizmu glikogenu zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.