Obecny protokół symulujący zespół centralnego rdzenia kręgowego (CCS) u myszy poprawił powtarzalność i zminimalizował uszkodzenia operacyjne zwierząt doświadczalnych, unikając nadmiernego naruszania struktury anatomicznej. Strategia zawarta w tym badaniu jest korzystna, ponieważ pozwala na badanie mechanizmów urazów poprzez uzyskanie spójnych wyników.
Artykuł metodologiczny
Opracowanie modelu zespołu rdzenia kręgowego u myszy C57BL/6J
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwierzęce modele zespołu centralnego rdzenia (CCS) mogłyby przynieść znaczne korzyści badaniom przedklinicznym. Identyfikowalne ścieżki anatomiczne mogą zapewnić minimalnie inwazyjne podejścia do ekspozycji i zmniejszyć dodatkowe obrażenia zwierząt doświadczalnych podczas operacji, umożliwiając utrzymanie spójnej i stabilnej morfologii anatomicznej podczas eksperymentów w celu zminimalizowania różnic behawioralnych i histologicznych między osobnikami w celu poprawy odtwarzalności eksperymentów. W tym badaniu rdzeń kręgowy na poziomie C6 został odsłonięty przy użyciu platformy koncentrycznej uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCICP) i kombinacji z techniką minimalnie inwazyjną. Za pomocą stabilizatora kręgów naprawiliśmy kręgi i ścisnęliśmy rdzeń kręgowy myszy C57BL / 6J za pomocą odważników 5 g / mm2 i 10 g / mm2 za pomocą SCICP, aby wywołać różne stopnie uszkodzenia rdzenia kręgowego C6. Zgodnie z poprzednim opisem CCS, wyniki pokazują, że zmiana w tym modelu jest skoncentrowana w istocie szarej wokół rdzenia centralnego, co umożliwia dalsze badania nad CCS. Na koniec wyniki histologiczne są dostarczane jako odniesienie dla czytelników.
Wprowadzenie
Ostatnie lata były świadkami stale rosnącej częstości występowania urazów rdzenia kręgowego (SCI), z większą liczbą urazów u starszych osób z mniej agresywnych tauma1. Urazy te częściej dotyczą odcinka szyjnego kręgosłupa i częściej prowadzą do niepełnej dysfunkcji neurologicznej2.
W XXI wieku, CCS jest najbardziej rozpowszechnionym typem niekompletnego SCI, stanowiąc ponad połowę wszystkich SCI. W porównaniu z konwencjonalnym niekompletnym SCI, CCS charakteryzuje się nieproporcjonalnie większym upośledzeniem kończyn górnych niż dolnych3. Charakteryzuje się głównie osłabieniem kończyn górnych z mniejszą dysfunkcją czucia i pęcherza moczowego. Uważa się, że CCS jest spowodowany pourazowym krwotokiem i obrzękiem w centralnej okolicy lub, jak ostatnio zaproponowano, zwyrodnieniem Wallera spowodowanym uciskiem rdzenia kręgowego w zwężeniu kanału kręgowego. Leczenie CCS nie ma dowodów wysokiego poziomu, które mogłyby być prowadzone, co wymaga wszechstronnego zrozumienia jego patofizjologii4. Nie zgłoszono jednak modeli CCS. Odpowiednie modele zwierzęce są niezbędne do zrozumienia patofizjologii, które mogą stanowić bazę badawczą dla badań klinicznych i przedklinicznych5,6,7,8,9,10.
W tym badaniu, model CCS u myszy został stworzony z platformą współosiową uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCICP) i minimalnie inwazyjnym planem operacyjnym, co pozwala na dalsze badania i zrozumienie CCS. Skuteczność modelu potwierdza się w toku procesu badawczego za pomocą analizy histologicznej, rezonansu magnetycznego (MRI) oraz immunofluorescencji.
Protokół
Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Shandong Cheeloo College of Medicine (numer zatwierdzenia: 22021). Przeprowadzono je zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych wydanym przez National Institutes of Health (Publikacje NIH nr 85-23, poprawione w 1996 r.). Wszystkie myszy użyte w tym badaniu były 9-10 tygodniowymi samicami myszy C57BL/6J zakupionymi w Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Chiny). W sumie 9 myszy biorących udział w tym badaniu zostało równo losowo przydzielonych do grupy kontrolnej, łagodnej i ciężkiej. Po 7, 28 i 70 dniach od urazu jedna mysz z każdej grupy została złożona w ofierze.
1. Laminektomia C6 i odsłonięcie rdzenia kręgowego
UWAGA: Ekspozycja została przeprowadzona pod mikroskopem. Krwawienia można uniknąć, zwracając uwagę na dwa aspekty: (i) Należy unikać wszystkich naczyń krwionośnych. (ii) Mięśnie muszą być oddzielone w punkcie początkowym i końcowym mięśnia.
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne i SCICP.
UWAGA: Struktura SCICP została opisana w poprzednim badaniu11. Różnica w stosunku do poprzedniego badania polega na tym, że obecny protokół umożliwia uszkodzenie rdzenia kręgowego poprzez kompresję. Dwie różne gramatury (10,4 g i 20,8 g) tej platformy mogą powodować kompresję odpowiednio 5 g/mm2 i 10 g/mm2 (Rysunek 1). Etapy ekspozycji i kompresji rdzenia kręgowego są pokazane na Rysunek 2. - Izofluran należy podawać myszy wziewnie za pomocą stożka nosowego (indukcja: 3%-5%, utrzymanie: 1,5%-2%).
- Po zadziałaniu znieczulenia zbadaj małe wybrzuszenie na linii środkowej za szyją myszy, które jest wyrostkiem kolczystym drugiego kręgu piersiowego (T2).
- Ogol włosy wokół tego wybrzuszenia. Zdezynfekuj skórę za pomocą trzech naprzemiennych aplikacji roztworu jodoforu, a następnie środków antyseptycznych do skóry 75% etanolu.
- Ustaw mysz leżącą na stole operacyjnym. Nałóż maść do oczu, aby chronić oczy.
- Pod klatką piersiową należy umieścić podkładkę o grubości 3-4 mm, aby umożliwić łukowatą krzywiznę kręgosłupa szyjnego, ułatwiając odsłonięcie przestrzeni międzyblaszkowej i drożne drogi oddechowe podczas operacji. Wstrzyknąć buprenorfinę jako przedoperacyjne działanie przeciwbólowe (0,05-0,1 mg/kg, SQ). Wykonaj 1-1,5 cm podłużne nacięcie sterylnym skalpelem wyśrodkowanym na 2. wyrostku kolczystym kręgu piersiowego, aby odsłonić warstwę powięziową (Rysunek 2A).
- Usuń część tkanki tłuszczowej powyżej T2 za pomocą sterylnych mikronożyczek, aby znaleźć wyrostek kolczysty T2.
- Oddziel obustronne mięśnie czworoboczne i romboidalne od C5-T2 wzdłuż linii środkowej za pomocą mikronożyczek (Rysunek 2B).
- Oddziel mięśnie na blaszce kręgów C5-T2 za pomocą mikronożyczek i wycofaj warstwę mięśniową na boki za pomocą sterylnych mikro-retraktorów (Rysunek 2C).
- Przetnij mięśnie wielodzielne i szyjne kręgosłupa na powierzchni kręgów.
- Zlokalizuj T2 zgodnie z najwyższym punktem wyrostków kolczystych. Zbadaj wyrostki kolczyste kolejno w kierunku końca rostralnego od T2, aby zlokalizować C6 (Rysunek 3).
- Podnieś blaszkę C6 za pomocą kleszczy, odetnij blaszkę, a rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty (Rysunek 2D).
2. Uraz kompresyjny rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym
- Zacisnąć stawy fasetowe C6-7 za pomocą stabilizatora kręgów i zablokować go (Rysunek 2E).
- Skieruj sterylną końcówkę ciężarka na odsłonięty rdzeń kręgowy i upewnij się, że płaski spód końcówki jest ustawiony równolegle do grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego (Rysunek 2F).
- Wyreguluj rękaw tak, aby ciężar kompresował rdzeń kręgowy. Przestań regulować, gdy ciężar utrzymuje stałą pozycję względną z rdzeniem kręgowym (Rysunek 2G).
UWAGA: Nie rób tego procesu zbyt gwałtownie lub szybko, w przypadku, gdy ciężar wywiera siłę stłuczenia na rdzeń kręgowy. - Usuń ciężar i stabilizator kręgów po 5 minutowym uciskaniu.
- Obserwuj zmiany koloru rdzenia kręgowego po ucisku pod mikroskopem (Rysunek 2H).
- Spłucz sterylnym PBS i użyj ssania, aby oczyścić miejsce operacji.
- Zszyj mięśnie i skórę warstwami za pomocą niewchłanialnego szwu polipropylenowego (rozmiar: 6-0).
- Zdezynfekuj obszar operacyjny, umieść mysz na ciepłej podkładce, aż mysz odzyska pełną świadomość, a następnie wróć do klatki dla myszy.
- Buprenorfinę należy wstrzykiwać w celu znieczulenia (0,05-0,1 mg/kg, SQ) co 8-12 godzin przez 3 dni.
3. Analiza histologiczna
- Znieczulij mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1,25% tribromoetanolu (0,02 ml / g masy ciała) w 7, 28 lub 70 dniu po urazie. Przezsercowo podaj myszu 60 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 20 ml 4% paraformaldehydu11.
- Przeciąć rdzeń kręgowy w odległości 0,5 cm od centrum zmiany z obu stron za pomocą mikronożyczek i zachować odcinek o długości 1 cm.
- Zanurzyć zachowany odcinek rdzenia kręgowego w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C na 48 godzin.
- Zanurz tkanki w OCT, pokrój tkanki na odcinki o grubości 6 μm za pomocą kriotomu i zbierz skrawki na szkiełku podstawowym.
- Barwienie hematoksyliną i eozyną
- Przepłukać sekcje 6 μm 1x PBS przez 5 minut 3 razy, aby usunąć resztki OCT.
- Zanurz skrawki w hematoksylinie na 90 s. Umyj skrawki pod bieżącą wodą przez 3 min.
- Zanurz skrawki w eozynie na 4 minuty. Moczyć w 95% alkoholu przez 30 sekund, aby usunąć nadmiar eozyny.
- Na koniec odwadniaj szkiełka alkoholem (95% alkoholu i 100% alkoholu dwa razy, kolejno) przez 30 s i umieść szkiełka w kąpieli ksylenowej w celu oczyszczenia na 2 minuty. Następnie uszczelnij sekcje szkłem nakrywkowym i żelem żywicznym.
- Barwienie błękitu pruskiego
- Zanurz szkiełka na 20 minut w równej mieszaninie żelazocyjanku potasu (10%) i kwasu solnego (10%).
- Spłucz 3 razy wodą destylowaną i przeciwplamić przez 5 minut Nuclear Fast Red.
- Spłucz trzykrotnie wodą destylowaną, następnie raz spłucz 95% alkoholem i dwa razy spłucz 100% alkoholem przez 5 minut.
- Oczyść sekcje w ksylenie dwa razy przez 3 minuty każda, a następnie uszczelnij żelem żywicznym12.
- Barwienie immunofluorescencyjne
- Inkubować szkiełka z następującymi pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C: królicza antyjonizowana cząsteczka adaptera wiążącego wapń 1 (Iba-1) (1:500), która była regulowana w górę w mikrogleju po uszkodzeniu nerwów; mysie białko kwasowe fibrylarne przeciwglejowe (GFAP) (1:300), które ulega ekspresji w astrocytach w ośrodkowym układzie nerwowym; króliczy anty-neurofilament-200 (NF-200) (1:2000), który ulega ekspresji w neurofilamentzie.
- Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT): Alexa Fluor488 kozioł anty-mysz i Alexa Fluor594 kozioł anty-królik (1:1,000).
- Rób zdjęcia i kontynuuj analizę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego13.
4. Rezonans magnetyczny
- Znieczulenie myszy po 7 dniach od urazu znieczuleniem izofluranem (1%-2% izofluranu, 20%-30%O2) podawanym przez mini maskę.
- Zeskanuj rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym w orientacji strzałkowej. Do obrazowania MRI należy użyć następujących ustawień: sekwencja echa spinowego (SE) w trybie wielorzędowym i z przeplotem z TR/TE = 2500/12 ms, matryca akwizycji = matryca 256 x 128 w polu widzenia (FOV) = 12 x 8 mm2, grubość warstwy = 1 mm i liczba wzbudzeń (NEX) = 2,
UWAGA: Utrzymuj tempo oddychania myszy na poziomie 10-15/min podczas skanowania, aby wyeliminować artefakty obrazu związane z oddychaniem14.
Wyniki
Przekrój strzałkowy barwiony HE sugeruje, że mimo większego obszaru uszkodzenia istoty szarej w grupie ciężkiej, zachowana była ciągłość istoty białej. Ponadto różnica w obszarze uszkodzonej istoty szarej między grupą ciężką a łagodną potwierdza zasadność doboru grup w protokole (Rycina 4).
Koronalne przekroje barwione HE wykazują, że zmiana występuje głównie w istocie szarej w obu grupach. W grupie ciężkiej struktura istoty białej otaczającej istotę szarą była bardziej narażona na uszkodzenia, jednak zarys istoty białej został zachowany (Rycina 5). Immunofluorescencja NF-200 sugeruje, że mimo zajęcia istoty białej otaczającej istotę szarą w grupie ciężkiej, istota biała pozostała stosunkowo nienaruszona. Wyniki te są zgodne z charakterystyką CCS opisaną w poprzednim badaniu4 (Rycina 6).
W strzałkowych przekrojach barwionych HE w 7. dniu po urazie nie stwierdzono obecności erytrocytów ani w grupie łagodnej, ani w grupie ciężkiej. Barwienie błękitem pruskim nie wykazało hemosyderynozy w grupie łagodnej, natomiast stwierdzono ją w grupie ciężkiej. Wyniki te wskazują, że wywołanie krwotoku może wymagać stosunkowo ciężkiego stopnia uszkodzenia (Rycina 7).
Immunofluorescencja ujawniła obszary podwyższonej ekspresji GFAP i Iba-1 zarówno w przypadku lekkiego, jak i ciężkiego urazu, co sugeruje odpowiedź zapalną oraz tworzenie się blizny glejowej w obrębie zmiany. Ponadto w grupie z ciężkim urazem stwierdzono większy obszar zmiany niż w grupie z lekkim urazem (Rysunek 8).
MRI jest relatywnie małoinwazyjną metodą obserwacji rdzenia kręgowego. Wyniki sugerują, że zarówno w grupie z łagodnym, jak i ciężkim przebiegiem, w obrębie zmiany występuje zmiana sygnału na hipointensywny z wysokim obrysem sygnału. W grupie z ciężkim przebiegiem stwierdzono istotnie większy obszar sygnału hipointensywnego (Rysunek 9). Sygnał hipointensywny sugeruje obecność osadu z lizatu retikulocytów w tym obszarze, a otaczający go sygnał hiperintensywny wskazuje na odpowiedź zapalną. W naszym poprzednim badaniu przeprowadziliśmy kilka testów behawioralnych. Na przykład, test siły chwytu przednich kończyn wykazał istotną różnicę15.
Rycina 1: Tuleja i odważniki SCICP. Powierzchnia końcówki została zaprojektowana na 1.3 mm x 1.6 mm na podstawie powierzchni odsłoniętej rdzenia kręgowego zmierzonej po laminektomii C6. Odważnik jest pokryty PTFE, co skutecznie zmniejsza tarcie między wewnętrzną ścianką tulei a odważnikiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: odsłonięcie i kompresja rdzenia kręgowego. (A) Nacięcie podłużne skóry; (B) Oddzielenie mięśni w kierunku rostralnym od wyrostka kolczystego T2; (C) Oddzielenie mięśni nad blaszkami łukowatymi; (D) Laminektomia C6; (E) Unieruchomienie trzonu kręgu; (F) Wyznaczenie miejsca kompresji; (G) Kompresja rdzenia kręgowego; (H) Brak istotnych uszkodzeń istoty białej powyżej rdzenia kręgowego po kompresji rdzenia kręgowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Anatomia szkieletu szyjnego myszy. Miejsce wskazane strzałką to wyrostek kolczysty T2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 4: Przekroje strzałkowe barwione HE. (A) Przekrój strzałkowy szyjnego rdzenia kręgowego. (B,C) W grupie ciężkiej (Severe) zaobserwowano poważniejsze uszkodzenia niż w grupie lekkiej (Mild), jednak w obu przypadkach koncentrowały się one w istoci szarej wokół centralnej części rdzenia. Obrazy z dni 7, 28 i 70 dpi sugerują brak istotnych różnic w przejawach urazu w obrębie tej samej grupy w różnych okresach oraz wskazują, że zachowana jest ciągłość istoci białej w górnym i dolnym odcinku rdzenia kręgowego. Pasek skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Przekroje czołowe rdzenia kręgowego szyjnego po urazie, barwione HE. (A-C) Uraz dotyczy głównie istoty szarej otaczającej centralną część rdzenia, co widać na panelach B i C. Grupa z ciężkim urazem wykazuje szerszy zakres uszkodzeń niż grupa z łagodnym urazem, w której uszkodzenia częściej obejmują istotę białą. Pasek skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Koronalna immunofluorescencja NF-200 po urazie. Odpowiedź NF-200 bez istotnych różnic w obrębie zarysu istoty białej. Pasek skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 7: Barwienie błękitem pruskim. (A-C) Hemosyderozę zaobserwowano w grupie ciężkiej, ale nie w grupie łagodnej. Pasek skali: 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 8: Sagitalna immunofluorescencja GFAP i Iba-1 po urazie. (A-C) Wraz ze wzrostem stopnia urazu zwiększa się obszar odpowiedzi GFAP i Iba-1. Pasek skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 9: Sagitalne MRI po urazie szyjnego rdzenia kręgowego (obrazy T2-zależne). Obszar urazu objawiał się jako sygnał hipointensywny w grupach z łagodnym i ciężkim urazem, przy czym w grupie z ciężkim urazem obszar sygnału hipointensywnego był znacznie szerszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Spośród wielu rodzajów urazów rdzenia kręgowego, CCS jest jednym z najbardziej potencjalnie uleczalnych rodzajów urazów 3,4. Ze względu na brak laboratoryjnych modeli badawczych, badania nad CCS z lat 50. koncentrowały się na badaniach klinicznych i badaniach sekcji zwłok 3,16,17. Niniejsze badanie pokazuje użycie kompatybilnych narzędzi i minimalnie inwazyjnych procedur w celu ustalenia modelu CCS myszy. Z technicznego punktu widzenia platforma ta charakteryzuje się dużą operatywnością i dobrą odtwarzalnością. Biorąc pod uwagę, że wyniki eksperymentu wykazują trafność, nasza technika ustalenia modelu najbliższego standardowi zdefiniowanemu w poprzednich badaniach dla CCS4.
Wcześniejsze badania nad urazami kompresyjnymi wykorzystywały głównie klipsy do tętniaka, balony i kalibrowane kleszcze 9,10,18. Ponadto większość urazów wystąpiła na poziomie piersiowego rdzenia kręgowego18. Rdzeń kręgowy na poziomie C6 został wybrany jako uszkodzony segment w tym badaniu w celu zbadania charakterystyki CCS. Warto zwrócić uwagę na fakt, że wskaźnik przeżycia modelu CCS jest również istotnym czynnikiem zapewniającym spójność eksperymentalną. Niniejsze badanie donosi o powodowaniu obustronnego urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego szyjnego myszy, podczas gdy uraz rdzenia kręgowego wysokiego poziomu, zwłaszcza uraz obustronny, może być śmiertelny dla zwierząt doświadczalnych, jeśli jest zbyt poważny. Według El-Bohy'ego, rdzeń kręgowy C4/5 z większym prawdopodobieństwem wpływa na zstępujący przewód opuszkowo-rdzeniowy i neurony ruchowe związane z oddychaniem, co prowadzi zwierzęta doświadczalne do depresji oddechowej i śmierci 18,19,20,21,22,23., W tym badaniu myszy o różnym stopniu ucisku na rdzeń kręgowy szyjny C6 mają znacznie zróżnicowane cechy urazu sugerowane przez testy histologiczne. Chociaż istniały znaczące różnice behawioralne i histologiczne w mysim modelu zaciskania rdzenia kręgowego w szyjce macicy zgłoszonym przez Forgione, przerwanie szypułek, wyrostków stawowych, blaszek, a nawet korzeni nerwowych było konieczne do zaciśnięcia rdzenia kręgowego za pomocą zmodyfikowanych zacisków, co miało znaczący wpływ na stabilność struktur szyjki macicy24. W innym badaniu dotyczącym urazów szyjki macicy wykazano użycie wyrostka poprzecznego jako miejsca mocowania5. Mimo że procesy stawowe zostały zapobieżone uszkodzeniu, nadmierny rozpad tkanki mięśniowej może również prowadzić do wpływu na stabilność rdzenia kręgowego. W niniejszym badaniu wycięto tylko 6. blaszkęszyjną w celu utrzymania stabilności rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym, z zachowaniem przyległych stawów stawowych i uniknięciem nadmiernego uszkodzenia mięśni. Jednocześnie ucisk znad rdzenia kręgowego zapobiega uszkodzeniom korzeni nerwowych.
Wyniki HE sugerują, że obszar uszkodzenia szyjnego rdzenia kręgowego myszy w każdej grupie znajdował się głównie w istocie szarej w pobliżu rdzenia centralnego, co charakteryzowało CCS, ze znacznymi różnicami w zakresie urazu między różnymi grupami. Warto zauważyć, że patologiczne skrawki, które wyświetliliśmy, mogły złagodzić objawy urazu, ponieważ próbki zostały pobrane kilka dni po urazie. Immunofluorescencja (NF-200) wykazała mniejsze uszkodzenia dróg nerwowych w obszarze istoty białej rdzenia kręgowego, co również potwierdziło, że uszkodzenie w CCS było skoncentrowane głównie wokół rdzenia centralnego. Wynik immunofluorescencji został spotęgowany wcześniejszymi wynikami histologicznymi patologii. Wcześniejsze badania wykazały, że CCS prowadzi do obrzęku w pobliżu rdzenia centralnego, co prowadzi do krwiaka i ostatecznie dysfunkcji w przyśrodkowej części bocznego odcinka korowo-rdzeniowego3. Krwotok został opisany jako typowy składnik CCS, ale rzadko występuje w późniejszych badaniach obrazowych i autopsyjnych17. W tym badaniu wyniki HE po 7 dniach od urazu sugerowały oznaki obrzęku tkanek we wszystkich grupach; Jednak w obszarze urazu nie znaleziono żadnych szczątkowych czerwonych krwinek. W związku z tym błękit pruski został użyty do zbadania obszaru urazu pod kątem krwotoku, a wyniki odpowiadały hemozyderozie obserwowanej w obszarze urazu w grupie ciężkiego urazu 7 dni po urazie, podczas gdy grupa łagodna nie. Obrazy MRI T2 wykazały, że zarówno łagodne, jak i ciężkie urazy miały obszary o niskim sygnale w uszkodzonym obszarze urazu po 7 dniach od urazu, wskazujące na osadzanie się lizatu retikulocytów w tym miejscu. Wyniki te dostarczają poszlak wskazujących na to, że rozbieżność między wcześniej zgłoszonymi wynikami wynika prawdopodobnie z tego, że test MRI jest potencjalnie bardziej czuły niż test histologiczny14, a także z ciężkości urazu, który może również wpływać na wielkość krwotoku w obszarze urazu. GFAP był również szeroko wyrażany w uszkodzonym obszarze. W tym samym czasie ekspresję Iba-1 zaobserwowano również w nienaruszonych obszarach, co sugeruje utrzymywanie się odpowiedzi zapalnej, zgodnej z wynikami MRI, gdzie pierścień hiperintensywnego sygnału wokół hipointensywnego obszaru sygnału w zmianie sugeruje obecność odpowiedzi zapalnej. Ostatecznie, w oparciu o wyniki niniejszego badania, obszar uszkodzenia w modelu skoncentrowano się na istocie szarej wokół rdzenia centralnego, co jest zasadniczo zgodne z opisami podawanymi wcześniej13. Niestety, nie wykonywaliśmy rezonansu magnetycznego w sposób powtarzalny u każdego zwierzęcia doświadczalnego, aby pokazać, jak miejsce urazu dynamicznie zmienia się w czasie. Przyszli badacze mogą uwzględnić tę kwestię w swoich pracach na rzecz lepszego zbadania CCS. W badaniu można również uwzględnić znakowanie immunologiczne za pomocą markerów neuronalnych, takich jak NeuN, które definiują istotę szarą.
Podsumowując, charakterystyka wyników badań patologicznych i rezonansu magnetycznego jest bardzo podobna do tych opisanych dla CCS w poprzednich badaniach4. Obecny protokół umożliwiający modelowanie CCS umożliwia dalsze badania i zrozumienie CCS.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez National Key Research and Development Project of Stem Cell and Transformation Research (2019YFA0112100) oraz State Key Program of National Natural Science of China (81930070).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% roztwór utrwalający | Solarbio | P1110 | 4% |
| Przeciwciało przeciw neurofilamentom ciężkiego polipeptydu | Abcam | ab8135 | Stosunek rozcieńczenia (1:2000) |
| Roztwór do barwienia eozyny (rozpuszczalny w wodzie) | Biosharp | BL727B | |
| Odczynnik | Fuyu | ||
| Mikroskop fluorescencyjny | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Mrożona krajalnica | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mysz mAb | TECHNOLOGIA Sygnalizacji Komórkowej | #3670 | Współczynnik rozcieńczenia (1:600) |
| Kozioł anty-mysie IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Stosunek rozcieńczenia (1:1000) |
| Kozia anty-królicza IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Stosunek rozcieńczenia (1:1000) |
| Hematoksylina Roztwór do barwienia | Biosharp | BL702A | |
| Myszy | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Aparatura mikrochirurgiczna | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Wszystkie instrumenty chirurgiczne to wykonane na zamówienie | nożyczki okulistyczne, kleszczyki do mikrokomarów, kleszcze mikrochirurgiczne, mikronożyczki |
| Normalna surowica owcza do blokowania (roztwór roboczy) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | roztwór roboczy |
| Związek O.C.T. | SAKURA | 4583 | |
| Roztwór buforowany fosforanem (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7,2– 7.4 |
| Zestaw bejc z błękitnego żelaza pruskiego (z eozyną) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratoryjna wziewna stacja anestezjologiczna | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| System obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo dla małych zwierząt | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Platforma koncentryczna do uszkodzenia rdzenia kręgowego | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Wykonane na zamówienie (standard Fenga) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7 ~ < br / > 1 ~ b0yRFKOq & alg_id= 0& slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId& components_ style_layout =1& reft=1659409105184& spm= g.930111970_f.81386274& alias= 367x5ovgn69q18g& from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba& sf=qq_sm& is_share= 1& shopAutoEnter=1& share_cmpt =native_wechat& is_silence_auth=1 |
| Mikroskop chirurgiczny | Zumax Medycyna Co., Sp. z o.o. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buforowana sól fizjologiczna+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Stosunek rozcieńczenia (1:19) |
| Odczynnik | Ksylen Fuyu |
Bibliografia
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223(2020).
- Brooks, N. P. Central cord syndrome. Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J. Central cord syndrome redefined. Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832(2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381(2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H. Acute spinal cord compression. The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538(2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305(2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283(2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604(2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604(2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751(2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
Przedruki i uprawnienia
