Artykuł metodologiczny

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 marca 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofluidyka jest szeroko stosowanym narzędziem do generowania kropelek i pęcherzyków różnego rodzaju w sposób kontrolowany i wysokoprzepustowy. Liposomy to uproszczone mimiki komórkowe składające się z wodnego wnętrza otoczonego dwuwarstwą lipidową; Są one cenne w projektowaniu komórek syntetycznych i zrozumieniu podstaw komórek biologicznych w warunkach in vitro, a także są ważne dla nauk stosowanych, takich jak dostarczanie ładunków do zastosowań terapeutycznych. W tym artykule opisano szczegółowy protokół pracy dla wbudowanej w układ techniki mikroprzepływowej, montażu liposomów wspomaganego oktanolem (OLA), w celu wytworzenia monorozproszonych, mikronowych, biokompatybilnych liposomów. OLA działa podobnie do wydmuchiwania pęcherzyków, w którym wewnętrzna faza wodna (IA) i otaczająca ją faza 1-oktanolowa przenosząca lipidy są ściskane przez zewnętrzne strumienie płynów zawierające środek powierzchniowo czynny. To łatwo generuje podwójne kropelki emulsji z wystającymi kieszeniami oktanolowymi. Gdy dwuwarstwa lipidowa gromadzi się na granicy kropel, kieszeń spontanicznie odłącza się, powodując powstanie jednowarstwowego liposomu, który jest gotowy do dalszej manipulacji i eksperymentów. OLA zapewnia kilka korzyści, takich jak stałe wytwarzanie liposomów (>10 Hz), wydajna enkapsulacja biomateriałów i monorozproszone populacje liposomów oraz wymaga bardzo małych objętości próbek (~50 μL), co może mieć kluczowe znaczenie podczas pracy z cennymi substancjami biologicznymi. Badanie zawiera szczegółowe informacje na temat mikrowytwarzania, miękkiej litografii i pasywacji powierzchni, które są potrzebne do wprowadzenia technologii OLA w laboratorium. Dowodem słuszności zasady jest również zastosowanie biologii syntetycznej poprzez indukowanie tworzenia kondensatów biomolekularnych wewnątrz liposomów za pomocą transbłonowego strumienia protonów. Oczekuje się, że ten towarzyszący protokół wideo ułatwi czytelnikom ustanowienie i rozwiązywanie problemów z OLA w ich laboratoriach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie komórki mają fizyczną granicę błony plazmatycznej, a ta błona jest zasadniczo rusztowaniem w postaci dwuwarstwy lipidowej utworzonej przez samoorganizację amfifilowych cząsteczek lipidowych. Liposomy są minimalnymi syntetycznymi odpowiednikami komórek biologicznych; Mają światło wody otoczone fosfolipidami, które tworzą dwuwarstwę lipidową, w której hydrofilowe grupy głów są skierowane w fazę wodną, a ogony hydrofobowe są zakopane do wewnątrz. Stabilność liposomów zależy od efektu hydrofobowego, a także hydrofilowości między grupami polarnymi, sił van der Waalsa między hydrofobowymi ogonami węglowymi oraz wiązań wodorowych między cząsteczkami wody a hydrofilowymi głowicami1,2. W zależności od liczby dwuwarstw lipidowych liposomy można podzielić na dwie główne kategorie, a mianowicie pęcherzyki jednowarstwowe składające się z jednej dwuwarstwy i pęcherzyki wielolamelarne zbudowane z wielu dwuwarstw. Pęcherzyki jednowarstwowe są dalej klasyfikowane na podstawie ich rozmiarów. Zazwyczaj kuliste w kształcie, mogą być produkowane w różnych rozmiarach, w tym małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV, średnica 30-100 nm), duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV, średnica 100-1000 nm) i wreszcie gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUV, średnica >1000 nm)3,4. Do produkcji liposomów opracowano różne techniki, które można podzielić na techniki masowe5 i techniki mikroprzepływowe6. Powszechnie praktykowane techniki masowe obejmują rehydratację filmu lipidowego, elektroformację, transfer odwróconej emulsji i wytłaczanie7,8,9,10. Techniki te są stosunkowo proste i skuteczne, i to są główne powody ich powszechnego stosowania w społeczności biologii syntetycznej. Jednocześnie jednak mają one poważne wady związane z polidyspersyjnością rozmiaru, brakiem kontroli nad blaszkowością i niską wydajnością enkapsulacji7,11. Techniki takie jak enkapsulacja przez ciągłe kropelki (cDICE)12 oraz wystrzeliwanie kropel i filtracja rozmiaru (DSSF)13 do pewnego stopnia przezwyciężają te ograniczenia.

Podejścia mikroprzepływowe zyskują na znaczeniu w ciągu ostatniej dekady. Technologia mikroprzepływowa zapewnia kontrolowane środowisko do manipulowania przepływami płynów w mikrokanałach zdefiniowanych przez użytkownika dzięki charakterystycznemu przepływowi laminarnemu i transferowi masy zdominowanemu przez dyfuzję. Powstałe w ten sposób urządzenia typu lab-on-a-chip oferują unikalne możliwości czasoprzestrzennej kontroli cząsteczek, ze znacznie zmniejszoną objętością próbki i możliwościami multipleksowania14. Opracowano liczne metody mikroprzepływowe do wytwarzania liposomów, w tym natryskiwanie impulsowe15, szablonowanie podwójnej emulsji16, przejściowy wyrzut z membrany17, transfer emulsji kropelkowej18 i ogniskowanie hydrodynamiczne19. Techniki te wytwarzają monorozproszone, jednolamelarne liposomy wielkości komórki o wysokiej skuteczności enkapsulacji i wysokiej przepustowości.

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę montażu liposomów wspomaganych oktanolem (OLA), wbudowanej w układ metody mikroprzepływowej opartej na hydrodynamicznym mechanizmie szczypania i późniejszego odwadniania rozpuszczalnikiem20 (Rysunek 1). Działanie OLA można odnieść do procesu wydmuchiwania bańki. Złącze sześciodrożne skupia wewnętrzną fazę wodną (IA), dwa strumienie organiczne przenoszące lipidy (LO) i dwa zewnętrzne strumienie wodne (OA) zawierające środki powierzchniowo czynne (OA) w jednym miejscu. W ten sposób powstają podwójne kropelki emulsji woda w wodzie (lipidy + oktanol) w wodzie. Gdy kropelki te przepływają w dół, minimalizacja energii międzyfazowej, zewnętrzny przepływ ścinający i interakcja ze ściankami kanału prowadzą do powstania dwuwarstwy lipidowej na granicy faz, gdy kieszeń rozpuszczalnika ulega odłączeniu, tworząc w ten sposób liposomy jednowarstwowe. W zależności od wielkości kieszeni oktanolowej proces odwadniania może trwać od kilkudziesięciu sekund do kilku minut. Na końcu kanału wyjściowego mniej gęste kropelki oktanolu unoszą się na powierzchni, podczas gdy cięższe liposomy (ze względu na gęstszy zamknięty roztwór) opadają na dno komory wizualizacyjnej, gotowe do eksperymentowania. Jako reprezentatywny eksperyment przedstawiono proces separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) wewnątrz liposomów. W tym celu wymagane składniki są zamknięte w liposomach o kwaśnym pH, które zapobiega LLPS. Poprzez zewnętrzne wyzwalanie zmiany pH, a tym samym transbłonowego strumienia protonów, wewnątrz liposomów tworzą się oddzielone fazowo kropelki kondensatu. Podkreśla to skuteczne możliwości systemu OLA w zakresie enkapsulacji i manipulacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie płytki wzorcowej

  1. Weź czystą płytkę silikonową o średnicy 4 cali (10 cm) (patrz tabela materiałów). Wyczyść go dalej za pomocą sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie cząsteczki kurzu.
  2. Zamontuj wafel na powlekarce wirowej i delikatnie dozuj ~ 5 ml ujemnego fotorezystu (patrz Tabela materiałów) na środku płytki. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zakłócać dalszy proces drukowania płytki.
  3. Aby uzyskać warstwę fotorezystu o grubości 10 μm, należy wirować płytkę z prędkością 500 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 100 obr./min w celu wstępnego rozprowadzenia, a następnie wirować przez 60 s przy 3,000 obr./min z przyspieszeniem 500 obr./min. W przypadku, gdy pożądana jest inna grubość, zmień parametry wirowania zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Wafel pieczemy na płycie grzewczej przez 2 minuty w temperaturze 65 °C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  5. Gdy wafel ostygnie, zamontuj go w komorze drukowania maszyny do litografii optycznej do bezpośredniego zapisu (patrz Tabela materiałów) i wprowadź projekt OLA (Rysunek 2A, Dodatkowy plik kodowania 1) do oprogramowania.
    UWAGA: Projekt OLA zasadniczo składa się z dwóch kanałów OA, dwóch kanałów LO i jednego kanału IA, które łączą się, tworząc sześciokierunkowe złącze, które kontynuuje jako kanał postprodukcyjny i kończy się w studni eksperymentalnej (EW).
  6. Wydrukuj wzór(y) OLA na powlekanej płytce za pomocą lasera UV (patrz Tabela materiałów) o dawce 300 mJ/cm2.
  7. Po wydrukowaniu wzoru piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 1 minutę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.
  8. W tym momencie należy upewnić się, że kontur drukowanego urządzenia znajduje się na płytce i jest widoczny gołym okiem. Aby zmyć nieutwardzony fotorezyst, zanurz wafel w szklanej zlewce zawierającej roztwór wywoływacza (patrz tabela materiałów), aż nieutwardzony fotorezystor zostanie całkowicie usunięty.
    UWAGA: Nadmierne traktowanie wywoływacza może mieć wpływ na rozdzielczość projektu.
  9. Umyj płytkę kolejno acetonem, izopropanolem i wodą dejonizowaną (DI), a na koniec sprężonym powietrzem/N2 za pomocą pistoletu do przedmuchiwania.
  10. Piecz wafel na twardo w temperaturze 150 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że wydrukowany wzór jest mocno przymocowany do powierzchni wafla i nie odpada w dalszym procesie wytwarzania. Płytka wzorcowa jest następnie gotowa do dalszego użycia (Rysunek 2B).

2. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego

  1. Umieść wafel wzorcowy na kwadratowym kawałku aluminium i owiń folię aluminiową wokół wafla, tworząc strukturę przypominającą dobrze (Rysunek 2C).
  2. Odmierzyć 40 g polidimetylosiloksanu (PDMS) i 4 g utwardzacza (stosunek wagowy 10:1, patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i energicznie mieszać za pomocą szpatułki lub końcówki pipety przez 2-3 minuty.
  3. Energiczne mieszanie PDMS i utwardzacza zatrzymuje pęcherzyki powietrza wewnątrz mieszaniny. Wiruj probówkę o masie 100 x g przez 2-3 minuty, aby usunąć większość dużych pęcherzyków powietrza.
  4. Wlać około 15-20 g mieszaniny przygotowanej w kroku 2.3 na płytkę wzorcową i odgazować za pomocą eksykatora. Zachowaj nadmiar mieszanki, aby wykonać szkiełka szklane powlekane PDMS (krok 3).
  5. Inkubować zespół w piecu w temperaturze 70 °C przez co najmniej 2 godziny.
  6. Wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć. Aby usunąć zestalony blok PDMS, usuń folię aluminiową i ostrożnie oderwij blok PDMS od krawędzi wafla.
    UWAGA: Wafel jest delikatny i może pęknąć, dlatego ważne jest, aby wykonać ten proces ostrożnie.
  7. Po usunięciu bloku PDMS utrzymuj wzorzystą strukturę skierowaną do góry i za pomocą ostrego ostrza lub skalpela wytnij poszczególne bloki PDMS, z których każdy zawiera jedno urządzenie mikroprzepływowe.
  8. Umieść blok PDMS na ciemnej powierzchni i dostosuj kierunek światła (przydaje się do tego lampa stołowa) tak, aby wygrawerowane kanały były błyszczące, a co za tym idzie, widoczne. Wykonać otwory we wlotach i kanale wyjściowym za pomocą stempli biopsyjnych o średnicy odpowiednio 0,5 mm i 3 mm (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Użyj ostrego stempla do biopsji, aby uniknąć pęknięć w PDMS, które mogą później spowodować wyciek. Delikatnie przepchnij stempel biopsyjny przez blok PDMS i upewnij się, że przechodzi przez niego całkowicie. Aby usunąć stempel do biopsji, delikatnie go cofnij, obracając w naprzemiennych kierunkach. Blok PDMS z wygrawerowanym wzorem OLA jest teraz gotowy do oklejenia ze szkiełkiem pokrytym PDMS.

3. Wykonanie ślizgu ze szkła pokrytego PDMS

  1. Weź przezroczyste szklane szkiełko nakrywkowe, wlej około 0,5 ml PDMS (przygotowanego w nadmiarze w kroku 2.4) na środek szkiełka podstawowego i rozprowadź go na szkiełku nakrywkowym, delikatnie przechylając szkiełko podstawowe, zapewniając całkowite pokrycie szkiełka podstawowym metodą PDMS.
  2. Zamontuj szkiełko szklane na powlekarce wirowej, upewnij się, że jest umieszczone centralnie (tak, aby środek szkiełka zachodziło na środek wału dociskowego) i obracaj szkiełko z prędkością 500 obr./min przez 15 s (z krokiem 100 obr./min), a następnie z prędkością 1 000 obr./min przez 30 s (z przyrostem 500 obr./min).
  3. Umieść szkiełko pokryte PDMS (powlekaną stroną skierowaną do góry) na podniesionej platformie, takiej jak blok PDMS (1 cm x 1 cm) na przykrytej szalce Petriego i piecz w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.

4. Wiązanie urządzenia mikroprzepływowego

  1. Wyczyść blok PDMS (przygotowany w kroku 2), dwukrotnie przyklejając i usuwając dostępną w handlu taśmę klejącą (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że oczyszczona strona jest skierowana do góry do czasu użycia.
  2. Wyczyść szkiełko pokryte PDMS sprężonym powietrzem/N2 za pomocą pistoletu do przedmuchiwania i trzymaj czystą stronę skierowaną do góry.
  3. Umieść blok PDMS (grawerowane kanały skierowane do góry) i szkiełko pokryte PDMS (powlekaną stroną skierowaną do góry) w komorze próżniowej myjki plazmowej (patrz Tabela materiałów).
  4. Włącz próżnię i wystaw zawartość na działanie plazmy powietrznej o częstotliwości radiowej 12 MHz (wysoki tryb RF) przez 15 sekund, aby aktywować powierzchnie. Plazmę tlenową można zobaczyć w postaci różowawego odcienia.
  5. Bezpośrednio po obróbce plazmowej umieść szkiełko pokryte PDMS na czystej powierzchni stroną PDMS skierowaną do góry. Delikatnie umieść blok PDMS tak, aby wzór mikroprzepływowy był teraz skierowany w stronę szkiełka pokrytego PDMS, umożliwiając im połączenie (Rysunek 2D).
    UWAGA: Usunięcie powietrza uwięzionego w urządzeniu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnego klejenia.
  6. Piec połączone urządzenia w temperaturze 70 °C przez 2 godziny.

5. Funkcjonalizacja powierzchni urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Przed funkcjonalizacją powierzchni ważne jest, aby skalibrować pompę ciśnieniową zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów) i zmontować rurkę, aby podłączyć ją do urządzenia mikroprzepływowego.

  1. Podłączenie urządzenia mikroprzepływowego do pomp ciśnieniowych
    1. Podłączyć ciśnieniowy regulator przepływu do zewnętrznego źródła ciśnienia (do 6 barów). Wymagane są co najmniej cztery niezależne kanały ciśnieniowe: trzy pojedyncze moduły 0-2 bar i jeden moduł -0,9-4 bar.
    2. Skalibrować pompę ciśnieniową zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
    3. Przetnij rurkę (1/16 cala średnicy zewnętrznej x 0,02 cala średnicy) na cztery równe kawałki o długości około 20 cm.
    4. Włóż łączniki 23 G ze stali nierdzewnej wygięte pod kątem pod kątem pod kątem (patrz tabela materiałów) na jednym końcu każdego elementu. Koniec ten jest następnie wkładany do trzech wlotów (OA, LO i IA) urządzenia mikroprzepływowego, a czwarty służy do usuwania nadmiaru roztworu (krok 5.2.5).
    5. Włóż drugi koniec rurki do stojaka zbiornika mikroprzepływowego i uszczelnij go za pomocą złączek mikroprzepływowych, upewniając się, że rurka jest wystarczająco długa, aby dotykać dna zbiornika (probówki 1.5 ml, patrz Tabela materiałów). Zapobiega to przedostawaniu się niepożądanych pęcherzyków powietrza do urządzenia mikroprzepływowego podczas obróbki PVA/produkcji liposomów.
  2. Obróbka PVA kanału wyjściowego
    UWAGA: Przed generacją liposomów ważne jest, aby urządzenie było częściowo hydrofilowe za złączem produkcyjnym. Odbywa się to poprzez traktowanie tych kanałów 5% (w/v) roztworem alkoholu poliwinylowego (PVA). Roztwór PVA przygotowuje się przez rozpuszczenie proszku PVA (patrz tabela materiałów) w wodzie o temperaturze 80 °C przez 3 godziny, ciągle mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Przefiltruj roztwór przed użyciem go do obróbki powierzchni. Bezpośrednio po połączeniu urządzenia, kanały mikroprzepływowe są hydrofilowe z powodu aktywacji powierzchni wywołanej plazmą i stopniowo stają się ponownie hydrofobowe. Zaleca się odczekanie 2 godzin po upieczeniu (krok 4.6) przed rozpoczęciem zabiegu PVA.
    1. Dozuj 200 μl 5% w/v roztworu PVA do probówki o pojemności 1,5 ml i podłącz ją do stojaka na zbiornik mikroprzepływowy. Włożyć rurkę (tę wymienioną w kroku 5.1.3) w taki sposób, aby jeden koniec był zanurzony w roztworze PVA, a drugi koniec był podłączony do wlotu kanału OA urządzenia mikroprzepływowego.
      UWAGA: Niższe stężenie PVA może prowadzić do niespełniającej norm funkcjonalności powierzchni.
    2. Powtórz powyższy krok bez PVA (pusta probówka 1.5 ml) i podłącz ją do kanałów LO i IA.
    3. Zwiększ ciśnienie fazy OA do 100 mbar, aby przepłynąć roztwór PVA w kanałach OA. Zwiększ ciśnienie faz IA i LO do 120 mbar, aby zapobiec cofaniu się roztworu PVA wewnątrz tych kanałów (Rysunek 2E).
      UWAGA: W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie w poszczególnych kanałach, aby menisk był stabilny na styku produkcyjnym.
    4. Roztwór PVA należy przepływać w ten sposób przez około 5 minut, zapewniając pełną funkcjonalizację kanału wyjściowego.
    5. Aby usunąć roztwór PVA, należy odłączyć rurkę od wlotu OA i natychmiast zwiększyć ciśnienie w kanałach LO i IA do 2 barów. Jednocześnie użyj rurki podłączonej do kanału podciśnieniowego (−900 mbar), usuń nadmiar PVA najpierw z kanału wyjściowego, a następnie z wlotu OA (Rysunek 2F).
    6. Piecz urządzenie w temperaturze 120 °C przez 15 minut i pozwól mu ostygnąć przed użyciem. Urządzenie może być przechowywane w warunkach otoczenia przez co najmniej 1 miesiąc.
      UWAGA: Zaleca się odczekanie 1 dnia (w temperaturze pokojowej) przed przystąpieniem do stosowania OLA, aby upewnić się, że nieleczony PDMS odzyska hydrofobowość po zabiegu plazmowym.

6. Zespół liposomów wspomagany oktanolem (OLA)

  1. Przygotowanie zapasu lipidów
    UWAGA: W tym przypadku jako przykład stosuje się mieszaninę lipidów 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(lisaminy rodaminy B sulfonylu) (Liss Rhod PE) (patrz tabela materiałów); W podobny sposób użytkownicy powinni przygotować potrzebną kompozycję lipidową.
    1. Dozować 76 μl DOPC (25 mg/ml) i 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) do kolby okrągłodennej za pomocą oddzielnych szklanych strzykawek.
    2. Trzymaj kolbę okrągłodenną w pozycji pionowej i użyj sprężonego pistoletu do przedmuchiwaniaN2, aby uzyskać delikatny strumień azotu w celu odparowania chloroformu i utworzenia wysuszonego filmu lipidowego na dnie kolby.
    3. Umieścić kolbę w eksykatorze na co najmniej 2 godziny w ciągłym podciśnieniu w celu usunięcia pozostałego chloroformu.
    4. Dodać 100 μl etanolu do kolby okrągłodennej, a następnie delikatnie pipetować lub wstrząsać, aby upewnić się, że lipidy rozpuściły się, tworząc 10% (w/v) zapas lipidów.
      UWAGA: W przypadku, gdy dana kompozycja lipidowa nie jest całkowicie rozpuszczalna w etanolu, należy użyć mieszaniny etanolu i chloroformu, utrzymując objętość chloroformu tak mało, jak to możliwe.
    5. Odpipetować roztwór do fiolki z ciemnego szkła. Delikatnie przepłukać fiolkę azotem za pomocą pistoletu do przedmuchiwania, aby zastąpić powietrze atmosferą obojętną. Uszczelnij pokrywkę folią parafinową i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Roztwór podstawowy może być używany przez okres do kilku miesięcy. Za każdym razem, gdy fiolka jest otwierana, delikatnie zastąp powietrze azotem i ponownie zamknij pokrywką z folią parafinową.
  2. Przygotowanie roztworów OLA
    1. Sporządzić roztwory podstawowe niezbędnych składników: 20 mM dekstranu (Mw 6 000), 60% (v/v) glicerolu; bufor z wyboru. W tym przypadku przygotowano 5x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na2HPO4, 9 mM KH2PO4; pH 7,4) (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Ponieważ czysty glicerol ma dużą lepkość, zaleca się wycięcie małego kawałka na końcu końcówki pipety w kierunku skośnym w celu skutecznego pipetowania.
    2. Przygotować 100 μl próbek IA, OA i roztworu wyjściowego (ES, pożądany roztwór do wypełnienia EW). Dla ułatwienia wizualizacji, w tym konkretnym przypadku do roztworu IA dodano żółte białko fluorescencyjne (YFP). Sprawdź równowagę osmotyczną między IA i OA, obliczając osmolarność zamkniętych składników i dodając odpowiednią ilość cukru lub soli do OA, jeśli to konieczne. Odbywa się to w celu zapobieżenia pękaniu lub kurczeniu się liposomów podczas produkcji.
      UWAGA: Końcowe kompozycje trzech faz są następujące:
      IA: 15% glicerol, 5 mM dekstran (Mw 6,000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glicerol, 5% F68 środek powierzchniowo czynny, 1x PBS
      ES: 15% glicerol, 1x PBS
      Niższe stężenie surfaktantu F68 negatywnie wpływa na wytwarzanie podwójnych emulsji.
    3. Przygotować 80 μl fazy LO, pipetując 4 μl podstawowego lipidu do 76 μl 1-oktanolu (patrz tabela materiałów). Końcowe stężenie DOPC wynosi 5 mg/ml.
    4. Odwirować próbki przy 700 x g przez 60 s w celu usunięcia wszelkich dużych agregatów przed przystąpieniem do eksperymentów mikroprzepływowych. Zapobiega to przedostawaniu się do układu mikroprzepływowego jakichkolwiek oczywistych czynników zatykających.
  3. Produkcja liposomów
    1. Dozować roztwory (IA, LO, OA) do trzech probówek o pojemności 1,5 ml, zmontować je (jak wspomniano w kroku 5.1) i podłączyć do chipa mikroprzepływowego poddanego działaniu PVA (krok 5.2.6).
    2. Zastosuj nadciśnienie na trzech kanałach: ~100 mbar na kanałach IA i LO oraz ~200 mbar na kanale OA.
      UWAGA: Ponieważ ciśnienie w OA jest wyższe niż w przypadku innych, rozwiązanie OA będzie pierwszym, które dotrze do EW; Jest to wysoce zalecane.
    3. Gdy roztwór OA dotrze do EW, zmniejsz ciśnienie OA do 100 mbar i zwiększ LO do 200 mbar. Roztwór LO docierający do węzła produkcyjnego prawdopodobnie spowoduje powstawanie pęcherzyków powietrza z powodu wypierania powietrza z kanałów LO. Po dozowaniu pęcherzyków powietrza do EW wyreguluj ciśnienie LO na 100 mbar. Na koniec zwiększ ciśnienie IA do 200 mbar i poczekaj, aż całe powietrze w kanale IA zostanie usunięte. Idealna sekwencja dotarcia do skrzyżowania trzech faz to zatem OA, LO i IA.
    4. Po usunięciu powietrza z trzech kanałów należy wyregulować ciśnienie wszystkich kanałów do 50 mbar i odpipetować 10 μl ES do komory wyjściowej. Po odpipetowaniu ES umieścić szkiełko zakrywające w otworze wyjściowym, aby uniknąć parowania. W przypadku, gdy LO zostanie odepchnięty, stopniowo zwiększaj ciśnienie LO w krokach co 1 mbar, aż zacznie płynąć do złącza.
    5. Gdy wszystkie trzy fazy zaczną współpłynąć na skrzyżowaniu, upewnij się, że rozpoczyna się podwójna produkcja emulsji i dostosuj ją do jej jakości (Rysunek 3A-C). Zmieniaj ciśnienie stopniowo (co 0,1-1 mbar), a nie gwałtownie, chyba że ciśnienie jest zmieniane w celu wyeliminowania niepożądanego zatkania kanału.
      UWAGA: Kanały do regulacji zależą od tego, co dzieje się na skrzyżowaniu. Na przykład IA należy zmniejszyć, jeśli emulsje są zbyt duże; choroba zwyrodnieniowa stawów musi być zwiększona, jeśli tworzą się podwójne emulsje, które pękają, a nie zostają ściśnięte; a LO należy zmniejszyć, jeśli kieszeń oktanolu jest zbyt duża.
    6. Sprawdź, czy kropelki podwójnej emulsji przepływają w dół do EW. W miarę przepływu, kieszenie oktanolowe stają się coraz bardziej widoczne i w końcu zostają ściśnięte, tworząc liposomy (Ryc. 3D-F). Upewnij się, że kanał postprodukcyjny jest wystarczająco długi, a migracja podwójnych emulsji jest wystarczająco powolna, aby można było je odwilżyć.
      UWAGA: W ciągu kilku minut po przyzwoitej produkcji liposomy i kropelki oktanolu opuszczą kanał postprodukcyjny i trafią do EW. W rezultacie, będąc mniej gęste niż woda, kropelki oktanolu unoszą się na powierzchni ES. Ze względu na dodatek dekstranu do IA, liposomy są cięższe niż ich otoczenie i trafiają na dno komory gotowe do obserwacji i dalszej manipulacji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie pokazuje tworzenie bezmembranowych kondensatów poprzez proces separacji fazy ciecz-ciecz (LLPS) wewnątrz liposomów jako reprezentatywny eksperyment.

Przygotowanie próbki
IA, OA, ES i roztwór paszowy (FS) przygotowuje się w następujący sposób:

IA: 12% glicerol, 5 mM dekstran, 150 mM KCl, 5 mg/ml poli-L-lizyny (PLL), 0,05 mg/ml poli-L-lizyny znakowanej FITC (PLL-FITC), 8 mM trifosforanu adenozyny (ATP), 15 mM cytrynian-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glicerol, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM cytrynian-HCl (pH 4)

ES: 12% glicerol, 150 mM KCl, 15 mM cytrynian-HCl (pH 4)

FS: 12% glicerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Tworzenie się kondensatu wewnątrz liposomów
Wybrano prosty test wrażliwego na pH złożonego koacerwacji dodatnio naładowanej poli-L-lizyny (PLL) i ujemnie naładowanego wielowartościowego adenozynotrifosforanu (ATP) w celu zademonstrowania zjawiska LLPS w liposomach. Aby zapobiec separacji faz polilizyny i ATP podczas enkapsulacji, pH roztworu utrzymywano na poziomie 4, przy którym ATP jest obojętne. Zwiększenie pH ES poprzez dodanie FS (buforu o pH 9) ostatecznie zwiększyło pH wewnątrz liposomów z powodu transbłonowego strumienia protonów, powodując ładunek ATP ujemnie i wyzwalając jego separację faz z dodatnio naładowanym PLL21 (Rysunek 4A). Po około 2 godzinach wytwarzania liposomów ciśnienie IA i LO zostało wyłączone. Ciśnienie w kanale OA utrzymywano na poziomie 100 mbar, aby pozostałe liposomy powoli przepływały do komory obserwacyjnej. Gdy wszystkie liposomy w kanale zostały odzyskane w EW, ciśnienie zostało wyłączone, aby zatrzymać przepływ i zapobiec ruchowi liposomów. Liposomy wytworzone przy niższym pH wykazywały jednorodną fluorescencję (z kapsułkowanego fluorescencyjnego PLL-FITC) w swoim świetle (Rysunek 4B,D). Kropelki oktanolu unoszące się na powierzchni zostały usunięte poprzez ostrożne odpipetowanie 5 μl roztworu od góry, aby zapobiec ich wpływowi na dalsze etapy pipetowania. Następnie do EW dodano 10 μl buforu FS, co wywołało separację faz zamkniętego PLL i ATP. Jednorodna fluorescencja FITC z każdego liposomu stopniowo przekształcała się w odrębne fluorescencyjne kropelki kondensatu. Ostatecznie pojedyncze kropelki połączyły się w jedną większą kroplę kondensatu, która swobodnie dyfundowała w liposomach (Rysunek 4C, E-G).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający montaż i działanie OLA. Regulator ciśnienia jest podłączony do zbiorników zawierających zewnętrzne roztwory wodne, lipidy w oktanolu i wewnętrzne roztwory wodne. Rurki włożone do zbiorników są podłączone do odpowiednich wlotów urządzenia OLA. Odpowiednie przepływy w trzech kanałach prowadzą do powstawania podwójnych emulsji woda w wodzie (lipid w oktanolu) w wodzie. Powstałe podwójne emulsje migrują do studni wyjściowej, podczas której kieszenie oktanolu odrywają się, tworząc liposomy. Uformowane liposomy są zbierane na dnie studni w celu wizualizacji i dalszych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przygotowanie chipa OLA (fotolitografia, mikrofabrykacja, obróbka powierzchni). (A) Cyfrowy projekt pokazujący kluczowe cechy projektu OLA, w tym trzy wloty, wylot i sześciokierunkowe złącze produkcyjne. (B) Schemat płytki wzorcowej przedstawiający wiele wzorów OLA wytworzonych przy użyciu litografii UV. (C) Elastomer PDMS odlany na płytce wzorcowej, umieszczony w studzience utworzonej z folii aluminiowej i utwardzony przez wypalanie w temperaturze 70 °C przez 2 godziny. (D) Urządzenie mikroprzepływowe połączone za pomocą plazmy tlenowej, w którym blok PDMS zawierający wzór OLA jest przymocowany do szkiełka podstawowego pokrytego PDMS. (E) Funkcjonalizacja powierzchni wyprodukowanego chipa w celu uczynienia urządzenia częściowo hydrofilowym. Odbywa się to poprzez przepływ 5% w/v PVA przez 5 minut z zewnętrznego kanału wodnego w kierunku kanału wyjściowego. Dodatnie ciśnienie powietrza w innych kanałach zapobiega przedostawaniu się roztworu PVA do tych kanałów. (F) PVA usuwa się poprzez zastosowanie podciśnienia w kanale wyjściowym. Urządzenie piecze się w temperaturze 120 °C przez 15 minut, a następnie jest gotowe do użycia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Demonstracja OLA efektywnie wytwarzającej monorozproszone podwójne emulsje i ostatecznie liposomy z doskonałą enkapsulacją. (A) Obraz w jasnym polu pokazujący szybkie wytwarzanie kropelek podwójnej emulsji. (B) Fluorescencyjny kanał lipidowy wykazuje tworzenie się kieszeni oktanolowej w wyniku częściowego odwilżania. Faza lipid-w-oktanolu zawierała mieszaninę DOPC (5 mg/mL) i Lis Rhod PE w stosunku 1,000:1. (C) Wewnętrzny kanał wodny wykazujący enkapsulację białka żółtej fluorescencji (YFP). Wstawki w (A-C) pokazują reprezentatywne widoki w powiększeniu odpowiednich paneli (podziałka liniowa = 10 μm). (D-F) Odwilżanie kieszeni oktanolu w kanale wyjściowym, która tworzy liposom. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wywołana pH separacja fazy ciecz-ciecz pLL/ATP w liposomach. (A) Schemat zależnego od pH przejścia jednorodnego roztworu pLL i ATP zamkniętego w liposomie (po lewej) do rozdzielanych fazowo koacerwatów pLL/ATP (po prawej). Początkowe kwaśne środowisko w liposomie sprawia, że ładunek molekularny ATP jest obojętny, hamując koacerwację. Kiedy pH wewnątrz liposomów równoważy się ze wzrostem pH zastosowanym zewnętrznie, ATP zyskuje ładunek ujemny, wywołując koacerwację. (B-C) Wykresy liniowe (odpowiadające liniom przerywanym w panelach [D] i [G] odpowiednio) przedstawiające rozkład przestrzenny pLL (kanał zielony) i membrany (kanał czerwony). (D-G) Zdjęcia poklatkowe pokazujące tworzenie się koacerwatów pLL/ATP w liposomach. Zewnętrzne dodanie buforu zasadowego podnosi poziom pH wewnątrz liposomów w ciągu kilku minut i inicjuje koacerwację. t = 0 min odnosi się do czasu tuż przed wystąpieniem pierwszego zdarzenia koacerwacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy plik kodowania 1: plik CAD projektu OLA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność komórkowa sprawia, że niezwykle trudno jest zrozumieć żywe komórki, gdy są badane jako całość. Zmniejszenie redundancji i wzajemnych połączeń komórek poprzez odtworzenie kluczowych składników in vitro jest niezbędne do pogłębienia naszego zrozumienia systemów biologicznych i stworzenia sztucznych mimik komórkowych do zastosowań biotechnologicznych 22,23,24. Liposomy służą jako doskonały minimalny system do zrozumienia zjawisk komórkowych. Niewyczerpująca lista tych zjawisk obejmuje dynamikę cytoszkieletu i wynikające z niej deformacje błony25,26, czasoprzestrzenną regulację kondensatów biomolekularnych27,28 i ich interakcję z błoną29, enkapsulację szerokiej gamy biomolekuł, w tym bezkomórkowych systemów transkrypcyjno-translacyjnych30, bezkomórkową syntezę lipidów31 i ewolucję białek32, Lokal mieszkalny 33,34. Liposomy są również szeroko stosowane jako nośniki do dostarczania leków i zostały zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz Europejską Agencję Leków (EMA) do użytku klinicznego11. Liposomy i nanocząstki na bazie lipidów są wykorzystywane jako nośniki do dostarczania leków, w tym szczepionek mRNA, takich jak niedawna szczepionka COVID-1935.

W badaniu tym opisano szczegółowy protokół dotyczący fotolitografii, montażu mikroprzepływowego i funkcjonalizacji powierzchni w celu wykonania techniki OLA w celu wygenerowania liposomów na chipie (rysunek 1 i rysunek 3). Liposomy wytwarzane za pomocą OLA są monorozproszone (współczynnik zmienności: 4%-11% średniej) i znajdują się w biologicznym zakresie wielkości komórki (zwykle o średnicy 5-50 μm) i mogą być dostrojone za pomocą odpowiednich prędkości przepływu wewnętrznych i zewnętrznych kanałów wodnych36. Na przykład populacja liposomów widoczna na rysunku 1 ma rozkład wielkości 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Przy typowej szybkości produkcji 10-30 Hz, utworzone liposomy są jednopłytkowe, co wcześniej potwierdzono przez wprowadzenie do błony pojedynczego dwuwarstwowego białka transbłonowego, alfa-hemolizyny36, a także za pomocą testu bielenia ditionianu37. OLA jest również kompatybilna z szeroką gamą kompozycji lipidowych, oferując użytkownikowi elastyczność w doborze lipidów. Co ważne, początkowo zastosowana kompozycja lipidowa znajduje odzwierciedlenie w finalnym składzie liposomowym38.

Ze względu na to, że jest to stosunkowo nowa technologia, istnieje wiele możliwości ulepszenia OLA. Na przykład funkcjonalizacja powierzchni za pomocą PVA jest kluczowa, ale żmudna do wykonania. Łatwiejszy i prostszy sposób na funkcjonalizację powierzchniową urządzenia znacznie skróciłby czas produkcji chipów, a także zmienność między chipami. Środek powierzchniowo czynny Pluronic F68 jest ważnym składnikiem zewnętrznej fazy wodnej w celu wstępnej stabilizacji podwójnych emulsji; Niemniej jednak jego użycie może być w niektórych przypadkach restrykcyjne. Zastąpienie Pluronic F68 bardziej biokompatybilnym środkiem powierzchniowo czynnym lub całkowite usunięcie środka powierzchniowo czynnego może poprawić wszechstronność systemu. Podczas migracji wytworzonych podwójnych emulsji w kanale wyjściowym mogą one pęknąć pod wpływem ścinania. Ulepszenie konstrukcji OLA w celu poprawy stabilności podwójnej emulsji i separacji kieszeni oktanolowych może w ten sposób zwiększyć przepustowość. Niemniej jednak OLA ma kilka zalet, do których należą przede wszystkim skuteczna enkapsulacja, liposomy monorozproszone i jednolamelarne oraz kontrolowane eksperymenty na chipie.

OLA została zastosowana i zaadaptowana w różnorodnym zakresie badań, w tym we wzroście i podziale liposomów39, badaniu procesu separacji faz ciecz-ciecz27 i jego interakcji z błoną21 oraz zrozumieniu tworzenia bioproduktów wzrostu bakterii w liposomach40. Wysokoprzepustowe testy oparte na OLA są również wykorzystywane do zrozumienia transportu jonów przez błonę41 i przepuszczalności leków przez dwuwarstwę lipidową37, jako system dostarczania leków do celów terapeutycznych42, do badania wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych na błonę43 oraz jako narzędzie do kapsułkowania ciekłych kryształów44. Oprócz szerokiego zakresu zastosowań technologii OLA, opracowywane są zmodyfikowane wersje OLA dostosowane do konkretnych celów 45,46,47,48,49,50. Ogólnie rzecz biorąc, biorąc pod uwagę zalety i wady, jesteśmy głęboko przekonani, że OLA jest wszechstronną platformą dla biologii syntetycznej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dolf Weijers, Verze Gorelova i Markowi Roosjenowi za uprzejme udostępnienie nam YFP. S.D. dziękuje za wsparcie finansowe od Holenderskiej Rady ds. Badań Naukowych (numer grantu: OCENW. KLEIN.465).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-OctanolSigma-Aldrichnr 297887
probówki 1,5 mlFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Polipropylenowe probówki do mikrowirówek
ATPSigma-Aldrichnr A2383
Stempel biopsyjnyDarwin mikrofluidykaPT-T983-05o średnicy 0,5 mm i 3 mm
Cytrynian-bazaSigma-Aldrichnr 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
Maszyna do litografii optycznej z bezpośrednim zapisemDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Konfiguracja i oprogramowanie dla dzieci
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Szkiełko nakrywkoweCorning#1, 24 x 40 mm
GlycerolSigma-AldrichNo. G2025
Kwas solnyThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE lipidAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Środek do czyszczenia plazmowegoHarrick plasmaPDC-32G
PolydimethylsiloxaneDowSylgard 184PDMS i utwardzacz
Poly-L-lizynaSigma-AldrichNr P7890
Poli-L-lizyna– FITC OznaczoneSigma-Aldrichnr P3543
Alkohol poliwinylowySigma-Aldrichnr P8136masa cząsteczkowa 30 000– 70 000, 87%– 90% hydrolizowany
regulator ciśnieniaElveflow OBK1 Mk3 +Regulator przepływu
Taśma klejącaMagiczna taśma Niewidoczna taśma
Wafel silikonowyMateriały silikonowe0620R16002
Powlekarka wirowa Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
Stal nierdzewna 90° Gięte łączniki PDMSMikrofluidyka DarwinPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tygon rurkiDarwin microfluidics1/16" OD x 0,02" ID
Laser UV Długość fali 365 nm
matowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459(2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543(2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851(2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876(2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188(2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459(2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800(2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317(2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969(2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359(2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48(2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100(2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005(2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169(2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281(2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrofluidyczne generowanie liposom wbiologia syntetycznadwuwarstwa lipidowakrople podw jnej emulsjikondensaty biomolekularnepasywacja powierzchnimi kka litografiawydajno enkapsulacjimimetyki kom rkowe

Powiązane artykuły