Artykuł metodologiczny

Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

DOI:

10.3791/65033

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do oznaczania chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) szczególnie na adipocytach za pomocą sortowania jąder z tkankami tłuszczowymi wyizolowanymi od transgenicznych myszy reporterowych z znakowaniem fluorescencji jądrowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to solidna technika, która umożliwia profilowanie dostępności chromatyny w całym genomie. Technika ta okazała się przydatna do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów w szeregu procesów biologicznych. Chociaż sekwencja ATAC została zmodyfikowana dla różnych typów próbek, nie przeprowadzono skutecznych modyfikacji metod sekwencjonowania ATAC dla tkanek tłuszczowych. Wyzwania związane z tkanką tłuszczową obejmują złożoną heterogeniczność komórkową, dużą zawartość lipidów i wysokie zanieczyszczenie mitochondriów. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy protokół, który umożliwia sekwencję ATAC specyficzną dla adipocytów poprzez zastosowanie sortowania jądra aktywowanego fluorescencją za pomocą tkanek tłuszczowych z transgenicznego reportera Nuclear tagging i Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Protokół ten generuje wysokiej jakości dane przy minimalnym marnotrawstwie odczytów sekwencjonowania, jednocześnie zmniejszając ilość danych wejściowych jądra i odczynników. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje krok po kroku dotyczące metody ATAC-seq zwalidowanej do stosowania jąder adipocytów wyizolowanych z mysich tkanek tłuszczowych. Protokół ten pomoże w badaniu dynamiki chromatyny w adipocytach po różnych stymulacjach biologicznych, co pozwoli na nowy wgląd biologiczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa, która specjalizuje się w magazynowaniu nadmiaru energii w postaci cząsteczek lipidów, jest kluczowym organem do regulacji metabolizmu. Ścisła kontrola tworzenia i utrzymywania adipocytów jest niezbędna dla funkcjonowania tkanki tłuszczowej i homeostazy energetycznej całego ciała1. Wiele regulatorów transkrypcji odgrywa kluczową rolę w kontroli różnicowania, plastyczności i funkcji adipocytów; Niektóre z tych regulatorów są związane z zaburzeniami metabolicznymi u ludzi2,3. Ostatnie postępy w wysokoprzepustowych technikach sekwencjonowania ekspresji genów i analizie epigenomicznej jeszcze bardziej ułatwiły odkrycie molekularnych regulatorów biologii adipocytów4. Badania profilowania molekularnego z wykorzystaniem tkanki tłuszczowej są trudne do przeprowadzenia ze względu na niejednorodność tych tkanek. Tkanka tłuszczowa składa się głównie z adipocytów, które są odpowiedzialne za magazynowanie tłuszczu, ale zawiera również różne inne typy komórek, takie jak fibroblasty, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe5. Ponadto skład komórkowy tkanki tłuszczowej ulega radykalnej zmianie w odpowiedzi na zmiany patofizjologiczne, takie jak temperatura i stan odżywienia6. Aby przezwyciężyć te problemy, wcześniej opracowaliśmy transgeniczną mysz reporterową o nazwie Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), która wytwarza rybosomy znakowane GFP i biotynylowane jądra znakowane mCherry w sposób zależny od rekombinazy Cre7. System podwójnego znakowania umożliwia przeprowadzanie specyficznych dla typu komórki analiz transkryptomicznych i epigenomicznych tkanek. Korzystając z myszy NuTRAP skrzyżowanych z specyficznymi dla adipocytów liniami adiponektyny-Cre (Adipoq-NuTRAP), wcześniej scharakteryzowaliśmy profile ekspresji genów i stany chromatyny z czystych populacji adipocytów in vivo i określiliśmy, w jaki sposób są one zmieniane podczas otyłości7,8. Wcześniej myszy NuTRAP skrzyżowane z brązowymi i beżowymi liniami Ucp1-Cre specyficznymi dla adipocytów (Ucp1-NuTRAP) pozwoliły nam scharakteryzować epigenomiczną przebudowę rzadkiej populacji adipocytów termogenicznych, adipocytów beżowych, w odpowiedzi na zmiany temperatury9.

ATAC-seq to szeroko stosowana metoda analityczna do oceny dostępności chromatyny w całym genomie. Hiperreaktywna transpozaza Tn5 zastosowana w ATAC-seq pozwala na identyfikację otwartych regionów chromatyny poprzez znakowanie adapterów sekwencjonowania w dostępnym dla chromatyny regionie jąder10. ATAC-seq jest prostą metodą, ale zapewnia solidne wyniki i jest bardzo wydajny nawet w przypadku próbek o niskim wkładzie wejściowym. Stała się ona zatem jedną z najpopularniejszych metod profilowania epigenomicznego i przyczyniła się do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów w różnych kontekstach biologicznych. Od czasu powstania oryginalnego protokołu ATAC-seq różne techniki wywodzące się z ATAC-seq zostały dalej rozwinięte w celu modyfikacji i optymalizacji protokołu dla różnych typów próbek. Na przykład Fast-ATAC jest przeznaczony do analizy próbek krwinek11, Omni-ATAC to zoptymalizowany protokół dla próbek tkanek mrożonych12, a MiniATAC-seq jest skuteczny do analizy zarodków we wczesnym stadium13. Jednak zastosowanie metody ATAC-seq do adipocytów, zwłaszcza z próbek tkanek, jest nadal trudne. Oprócz niejednorodności tkanki tłuszczowej, jej wysoka zawartość lipidów może zakłócać sprawne reakcje rekombinacji przez transpozazę Tn5 nawet po izolacji jądra. Ponadto wysoka zawartość mitochondriów w adipocytach, szczególnie w adipocytach brązowych i beżowych, powoduje wysokie zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA i marnotrawstwo odczytów sekwencjonowania. W tym artykule opisano protokół specyficznego dla adipocytów sekwencji ATAC przy użyciu myszy Adipoq-NuTRAP (Rysunek 1). Wykorzystując sortowanie jąder znakowanych fluorescencyjnie, protokół ten umożliwia zbieranie czystych populacji jąder adipocytów z dala od innych mylących typów komórek i skuteczne usuwanie lipidów, mitochondriów i resztek tkankowych. W związku z tym protokół ten może generować wysokiej jakości dane specyficzne dla typu komórki i minimalizować odpady z odczytów mitochondrialnych przy użyciu zmniejszonej ilości danych wejściowych i odczynników w porównaniu ze standardowym protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Indiana University School of Medicine.

1. Przygotowania przed rozpoczęciem eksperymentu

  1. Przygotowanie tkanek
    1. W celu znakowania jądra adipocytów skrzyżuj myszy NuTRAP z liniami adiponektyny-Cre specyficznymi dla adipocytów (Adipoq-Cre), aby wygenerować myszy Adipoq-NuTRAP, które są hemizygotyczne zarówno dla Adipoq-Cre, jak i NuTRAP.
    2. Przeprowadź sekcję tkanki tłuszczowej interesującej nas myszy Adipoq-NuTRAP, jak opisano wcześniej14.
    3. Błyskawicznie zamrozić tkanki w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Każda poduszeczka tłuszczowa może być przechowywana jako całość, a zamrożone tkanki można później pokroić na suchym lodzie na mniejsze kawałki (~50 mg) do eksperymentów. Alternatywnie, tkanki tłuszczowe można pokroić, podzielić i zamrozić w probówkach do przechowywania (~ 50 mg na probówkę). Zamrożone próbki nigdy nie mogą się rozmrozić po zamrożeniu do momentu użycia.
  2. Przygotowanie buforu
    UWAGA: Utrzymuj na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
    1. Przygotować bufor do przygotowania jądra (NPB): 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 i 0,1% NP40. Przygotować 7 ml NPB na próbkę. Dodaj świeży 100-krotny koktajl inhibitorów proteazy (końcowy 1x), DTT (końcowy 1 mM) i Hoechst (końcowy 1 μg/ml) do NPB przed użyciem.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego NPB, ale można go przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    2. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,1% NP-40 (PBS-N).

2. Izolacja jądra

  1. Homogenizatory Dounce ze szkła chłodzącego, z jedną szklanką Dounce na próbkę, na lodzie. Następnie dodaj 7 ml mieszanki NPB do każdej szklanki Dounce.
    UWAGA: Zaleca się użycie do ośmiu próbek w każdym eksperymencie. Praca z więcej niż ośmioma próbkami znacznie opóźniłaby wszystkie etapy, a zwłaszcza mogłaby obniżyć jakość jądra podczas sortowania.
  2. Zamrożoną tkankę tłuszczową (50-100 mg) umieść w szklance Dounce i natychmiast pokrój ją na kilka mniejszych kawałków za pomocą długich nożyczek. Uderz 10x luźnym tłuczkiem dla wszystkich próbek, a następnie 10x ciasnym tłuczkiem.
    UWAGA: Tkanki tłuszczowe są miękkie, więc pokrojenie ich na kilka małych kawałków powinno wystarczyć. W przypadku rzadkich próbek można użyć mniejszych fragmentów (10-20 mg), chociaż liczba pobranych jąder adipocytów może się różnić.
  3. Przefiltruj przez sitko 100 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Przefiltrowane homogenaty przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml, wlewając. Wirować z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z uchylnym kubełkiem. Usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe.
    UWAGA: Najpierw zassać za pomocą podciśnienia, a następnie usunąć pozostałą objętość za pomocą mikropipety.
  4. Zawiesić osad w 500 μl PBS-N, delikatnie, ale dokładnie stukając palcem.
    UWAGA: Należy unikać pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie jąder.
  5. Przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą delikatnego pipetowania. Przepłukać sitko 250 μl PBS-N. Przefiltrowaną zawiesinę jądrową przenieść do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą mikropipety.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, probówki i sitka do komórek mogą być używane do mniejszych objętości, aby zminimalizować straty próbki.

3. Sortowanie jąder

  1. Przygotowanie probówki zbiorczej
    1. Dodaj 500 μl PBS-N do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć kilka razy, aby zwilżyć wszystkie wewnętrzne powierzchnie buforem.
    2. Krótko zakręć rurkami, aby spuścić cały płyn, a następnie schłódź je na lodzie do momentu sortowania.
  2. FACS (Rysunek 2)
    1. Użyj bramki FSC-A/FSC-H do podkoszulki i FSC-A/SSC-A do usuwania małych lub dużych zanieczyszczeń.
    2. Bramka dla populacji jądra adipocytów mCherry/GFP-dodatnich.
    3. Zbierz 10 000 jąder w każdej z probówek pobraniowych przygotowanych w kroku 3.1.
  3. Przygotowanie jądra po sortowaniu
    1. Dodaj 500 μl PBS-N do każdej probówki zbiorczej i odwróć kilka razy do wymieszania.
    2. Obracać probówki zbiorcze z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym wiadrem. Całkowicie usunąć supernatant.
      UWAGA: Najpierw użyj odkurzacza, aby usunąć pęcherzyki, odlej supernatant i użyj chusteczek papierowych, aby całkowicie usunąć pozostały płyn. Śrut jest w tym momencie niewidoczny. Przygotować mieszaninę wzorcową Tn5 podczas etapu wirowania, jak opisano poniżej.

4. Tagmentacja Tn5 (Tabela 1)

  1. Aby przygotować 25 μl głównej mieszaniny Tn5, wymieszaj 12,5 μl 2x buforu DNA do znakowania (bufor TD), 1,25 μl transpozazy Tn5 (enzym TDE I) i 11,25 μl wody wolnej od nukleaz.
  2. Dodać 25 μl mieszaniny głównej Tn5 do każdego osadu jądra i ponownie zawiesić przez delikatne pipetowanie. Inkubować przy 600 obr./min przez 30 min w temperaturze 37 °C przy użyciu termomiksera.

5. Oczyszczanie DNA

UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje zestaw do oczyszczania PCR wymieniony w Tabeli Materiałów. Można zastosować wszelkie inne podobne metody oczyszczania DNA.

  1. Dodać 25 μl wody wolnej od nukleaz do 25 μl mieszaniny zawiesiny jądra Tn5 otrzymanej po kroku 4.2. Ostateczna objętość wynosi 50 μl na próbkę.
  2. Dodać 250 μl buforu PB.
  3. Dodać 5 μl 3 M octanu sodu (NaOAc) (pH 5,2).
  4. Przenieść mieszaninę do kolumny (dostarczonej z zestawem referencyjnym) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Dodać 750 μl buforu PE zawierającego absolutny etanol (EtOH) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić probówkę zbiorczą z przepływem.
  7. Aby wymyć fragmenty DNA, wyposażyć kolumnę w nową probówkę o pojemności 1,5 ml, dodać 10 μl buforu EB i pozostawić w temperaturze pokojowej na 3 minuty. Wirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze RT.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub w temperaturze -20 °C przez tygodnie.

6. Amplifikacja PCR (Tabela 2)

UWAGA: Startery użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 3.

  1. Aby amplifikować transponowane fragmenty DNA, przygotuj główną mieszaninę PCR bez dodawania unikalnego startera do kodów kreskowych Ad2.n (starter #2). Na próbkę należy użyć 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR: 11 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 25 μM Ad1_noMX startera (starter #1) i 25 μl 2x PCR Master Mix.
  2. Dodać 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
  3. Dodać 10 μl eluowanych fragmentów DNA z kroku 5.7.
  4. Dodaj 2 μl 25 μM startera #2, który musi być specyficzny dla każdej próbki.
  5. Przeprowadzić PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 2.

7. Ilościowy test PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym (Tabela 4)

UWAGA: Ten krok ma na celu określenie dodatkowych cykli potrzebnych do amplifikacji DNA. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane, szczególnie w przypadku nowych eksperymentów.

  1. Przygotować główną mieszaninę qPCR bez dodawania startera #2. Na próbkę należy użyć 9,975 μl mieszaniny głównej qPCR: 4,41 μl wody wolnej od nukleaz, 0,25 μl startera 25 μM #1, 5 μl 2x PCR Master Mix i 0,09 μL 100x SYBR Green I.
    UWAGA: Aby przygotować 100x SYBR Green I, rozcieńczyć 10 000x zapas wodą bez nukleaz. Ponieważ objętość 100x SYBR Green I użytego do mieszaniny głównej qPCR jest znikoma, łatwiej jest wykonać dodatkową mieszaninę wzorcową rozcieńczonej 100x SYBR Green I (np. dla 8-10 próbek).
  2. Dodać 9,975 μl mieszaniny wzorcowej qPCR do każdego dołka płytki qPCR.
  3. Dodaj 0,25 μl 25 μM startera #2 do każdej studzienki.
    UWAGA: Pamiętaj, aby dodać ten sam podkład #2, aby dopasować go do tego, który został dodany do każdej konkretnej próbki w kroku 6.4.
  4. Dodać 5 μl reakcji PCR otrzymanej po amplifikacji PCR w kroku 6.5 i wymieszać pipetując.
    UWAGA: Pozostałe 45 μL reakcji PCR zostanie wykorzystane do drugiej amplifikacji PCR.
  5. Przeprowadzić qPCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 5.
  6. Sprawdź krzywe amplifikacji i zidentyfikuj liczbę dodatkowych cykli PCR, które są potrzebne, szacując liczbę cykli, które osiągnęły ~35% maksimum (Rysunek 3A).
    UWAGA: Zazwyczaj 10 000 jąder wymaga od pięciu do ośmiu dodatkowych cykli PCR.

8. Dodatkowa amplifikacja PCR

  1. Przeprowadzić PCR, używając wszystkich pozostałych 45 μl reakcji PCR zgodnie z obliczeniami z kroku 7.6 (Tabela 6).
    UWAGA: Każda próbka może wymagać innej liczby cykli amplifikacji.

9. Drugie oczyszczanie DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR

  1. Zastosować te same procedury, co w punkcie 5, ale wymyć amplifikowane fragmenty DNA za pomocą 20 μl buforu EB.

10. Wybór rozmiaru fragmentu DNA

UWAGA: Użyj odwracalnych koralików unieruchamiających w fazie stałej, jak opisano poniżej. Wszelkie inne podobne kulki oczyszczające DNA mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesina perełkowa SPRI powinna być całkowicie ponownie zawieszona i zrównoważona w temperaturze pokojowej z obrotem przed użyciem.

  1. Przenieś eluowane DNA do nowej probówki PCR i dodaj 80 μl buforu EB, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.
  2. Dodać 55 μl kulek SPRI (0,55x objętość próbki) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielić na mini stojaku magnetycznym do 8-probówek do PCR przez 5 minut.
  3. Przenieść 150 μl supernatantu do nowej probówki do PCR. Dodać 95 μl kulek SPRI i wymieszać pipetując.
    UWAGA: Supernatant zawiera DNA o masie około 500 pz lub mniejszej.
  4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielać na mini stojaku magnetycznym przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
  5. Umyj kulki przez 1 minutę 200 μl 70% EtOH. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
    UWAGA: Nie przesuwaj probówek PCR ze stojaka magnetycznego podczas prania.
  6. Po ostatnim płukaniu odwirować probówki o masie 1 000 × g przez 1 minutę i odpipetować pozostały EtOH. Suszyć granulki z otwartą pokrywką w temperaturze 37 °C przez 2 minuty na maszynie do PCR.
    UWAGA: Po wyschnięciu granulki koralików powinny wykazywać tylko drobne pęknięcia. Unikaj przesuszenia.
  7. Zawiesić osad z 20 μl buforu EB przez pipetowanie i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Oddzielić na mini podstawce magnetycznej na 5 minut, a następnie przenieść 18 μl supernatantu zawierającego ostateczną bibliotekę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA Biblioteka może być przechowywana w temperaturze -20 °C podczas przeprowadzania kontroli jakości.

11. Kwantyfikacja DNA za pomocą fluorometru

  1. Aby przygotować mieszaninę główną, rozcieńczyć 200x odczynnik dsDNA o wysokiej czułości (HS) z buforem dsDNA HS do końcowego stężenia 1x.
  2. W przypadku wzorców dodać 190 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 10 μl wzorca 1 lub wzorca 2 do probówki fluorometru.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem kwantyfikacji należy zrównoważyć wzorce w RT w ciemności.
  3. W przypadku próbek z biblioteki dodać 198 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 2 μl każdej próbki do oddzielnej probówki fluorometru.
    UWAGA: Jeśli ilości próbki są ograniczone, objętość próbki można zmniejszyć do 1 μl, a objętość 1x mieszaniny głównej można zwiększyć do 199 μl.
  4. Odwiruj lub potrząśnij rurkami fluorometru i pozwól im siedzieć przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą testu dsDNA HS fluorometru.

12. Kontrola jakości biblioteki za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej czułości

  1. Weź bibliotekę ATAC-seq i rozcieńcz wodą wolną od nukleaz do końcowego stężenia 1-5 ng / μL.
  2. Analizuj rozkład rozmiarów bibliotek ATAC-seq przy użyciu zautomatyzowanych systemów elektroforezy o wysokiej czułości zgodnie z protokołami producenta.

13. Kontrola jakości biblioteki ATAC-seq za pomocą ukierunkowanego qPCR

  1. Weź 5-10 ng z biblioteki ATAC-seq i rozcieńcz 50 μl wody wolnej od nukleaz.
  2. Przeprowadzić qPCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na promotory i wzmacniacze, o których wiadomo, że są aktywne w adipocytach, zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w Tabeli 7.
  3. Należy stosować startery kontroli ujemnej ukierunkowane na zamknięte/ciche regiony genomu (Tabela 7).
  4. Obliczyć wzbogacenie promotora/wzmacniaczy w stosunku do kontroli ujemnych (tabela 8).
    UWAGA: Oczekuje się, że zobaczymy ≥10-20-krotne wzbogacenie z udanymi próbkami.

14. Sekwencjonowanie

  1. Prześlij biblioteki ATAC-seq do sekwencjonowania. Użyj sekwencjonowania sparowanych końców (2 x 34 pz, 2 x 50 pz lub dłużej) ze średnią liczbą odczytów 10-30 milionów odczytów na próbkę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować tkankę tłuszczową za pomocą tego protokołu ATAC-seq, wygenerowaliśmy myszy Adipoq-NuTRAP, które były karmione dietą żywieniową; następnie wyizolowaliśmy jądra adipocytów z białej tkanki tłuszczowej najądrza (eWAT), pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (iWAT) i brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) za pomocą cytometrii przepływowej. Wyizolowane jądra wykorzystano do znakowania, a następnie do oczyszczania DNA, amplifikacji PCR, etapów kontroli jakości, sekwencjonowania i analizy danych, jak opisano powyżej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy zoptymalizowany protokół sekwencyjny ATAC do oceny dostępności chromatyny specyficznej dla adipocytów in vivo. Ten protokół ATAC-seq wykorzystujący mysz Adipoq-NuTRAP z powodzeniem wygenerował profile dostępności chromatyny specyficzne dla adipocytów. Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanych i powtarzalnych eksperymentach ATAC-seq jest jakość jądra. Bardzo ważne jest, aby natychmiast zamrozić rozcięte tkanki tłuszczowe w ciekłym azocie i przechowywać je bezpiecznie w tempera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych istotnych ani istotnych interesów finansowych związanych z badaniami opisanymi w niniejszym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez IUSM Showalter Research Trust Fund (dla H.C.R.), grant pilotażowy i wykonalności IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases (dla H.C.R.), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 dla H.C.R.) oraz American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 dla H.C.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz Animals
Adiponectin-CreJackson Laboratory28020
NuTRAP LaboratoriumJacksona29899
Odczynniki i odczynniki Materiały
1,5 mL probówki DNA-LoBindEppendorf86-923
100 µ m sitko komórkoweFalcon352-360
Probówki 15 mlVWR525-1071
2x bufor TDIllumina15027866
384-dołkowa płytka PCRZastosowany biosystem4483285
40 i mikro; m sitko do komórekFalcon352-340
Probówki 50 mlVWR525-1077
AMPure XP (kulki SPRI)Zestaw bioanalizatora Beckman CoulterA63881
wysokiej czułości DNAAgilent Technologies5067-4626
Przezroczysta folia samoprzylepnaZastosowana biosystem4306311
Woda destylowana bez DNaz/RNazInvitrogen10977015
Młynek do tkanek DounceDWK Nauki przyrodnicze357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 magnes boczny listwowyThermo Fishers12027
Rurki FACSFalcon 
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
Stojak do separacji magnetycznej do PCR 8-probówkowepaski EpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
Zestaw do oczyszczania MinElute PCRQiagen28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mixBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8-tubowy pasekscientific1402-4708
Koktajl inhibitorów proteazy (100x)Thermo Fishers78439
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851
SacharozaSigmaS0389-1KG
SYBR Green I (10 000x)InvitrogenS7563
TDE Ienzym Illumina15027865
Instruments
Cytometr przepływowyBD BiosciencesFACSAria Fusion
Fluorometr kubitowyInvitrogenQ33226
System PCR w czasie rzeczywistymThermo FishersQuantStudio?5
Mysz Odczynnik o 28719128 USA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507(2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215(2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086(2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619(2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805(2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ATAC SeqAdipocyte NucleiAdipose TissueChromatin AccessibilityNucleus IsolationFluorescence Activated SortingTransgenic Reporter MiceMitochondrial ContaminationAdipocyte Marker GenesNucleosome Profiling

Powiązane artykuły