Specyficzny dla adipocytów ATAC-Seq z tkankami tłuszczowymi przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Tkanka tłuszczowa, która specjalizuje się w magazynowaniu nadmiaru energii w postaci cząsteczek lipidów, jest kluczowym organem do regulacji metabolizmu. Ścisła kontrola tworzenia i utrzymywania adipocytów jest niezbędna dla funkcjonowania tkanki tłuszczowej i homeostazy energetycznej całego ciała¹. Wiele regulatorów transkrypcji odgrywa kluczową rolę w kontroli różnicowania, plastyczności i funkcji adipocytów; Niektóre z tych regulatorów są związane z zaburzeniami metabolicznymi u ludzi^2,3. Ostatnie postępy w wysokoprzepustowych technikach sekwencjonowania ekspresji genów i analizie epigenomicznej jeszcze bardziej ułatwiły odkrycie molekularnych regulatorów biologii adipocytów⁴. Badania profilowania molekularnego z wykorzystaniem tkanki tłuszczowej są trudne do przeprowadzenia ze względu na niejednorodność tych tkanek. Tkanka tłuszczowa składa się głównie z adipocytów, które są odpowiedzialne za magazynowanie tłuszczu, ale zawiera również różne inne typy komórek, takie jak fibroblasty, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe⁵. Ponadto skład komórkowy tkanki tłuszczowej ulega radykalnej zmianie w odpowiedzi na zmiany patofizjologiczne, takie jak temperatura i stan odżywienia⁶. Aby przezwyciężyć te problemy, wcześniej opracowaliśmy transgeniczną mysz reporterową o nazwie Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), która wytwarza rybosomy znakowane GFP i biotynylowane jądra znakowane mCherry w sposób zależny od rekombinazy Cre⁷. System podwójnego znakowania umożliwia przeprowadzanie specyficznych dla typu komórki analiz transkryptomicznych i epigenomicznych tkanek. Korzystając z myszy NuTRAP skrzyżowanych z specyficznymi dla adipocytów liniami adiponektyny-Cre (Adipoq-NuTRAP), wcześniej scharakteryzowaliśmy profile ekspresji genów i stany chromatyny z czystych populacji adipocytów in vivo i określiliśmy, w jaki sposób są one zmieniane podczas otyłości7^,8. Wcześniej myszy NuTRAP skrzyżowane z brązowymi i beżowymi liniami Ucp1-Cre specyficznymi dla adipocytów (Ucp1-NuTRAP) pozwoliły nam scharakteryzować epigenomiczną przebudowę rzadkiej populacji adipocytów termogenicznych, adipocytów beżowych, w odpowiedzi na zmiany temperatury⁹.

ATAC-seq to szeroko stosowana metoda analityczna do oceny dostępności chromatyny w całym genomie. Hiperreaktywna transpozaza Tn5 zastosowana w ATAC-seq pozwala na identyfikację otwartych regionów chromatyny poprzez znakowanie adapterów sekwencjonowania w dostępnym dla chromatyny regionie jąder¹⁰. ATAC-seq jest prostą metodą, ale zapewnia solidne wyniki i jest bardzo wydajny nawet w przypadku próbek o niskim wkładzie wejściowym. Stała się ona zatem jedną z najpopularniejszych metod profilowania epigenomicznego i przyczyniła się do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych ekspresji genów w różnych kontekstach biologicznych. Od czasu powstania oryginalnego protokołu ATAC-seq różne techniki wywodzące się z ATAC-seq zostały dalej rozwinięte w celu modyfikacji i optymalizacji protokołu dla różnych typów próbek. Na przykład Fast-ATAC jest przeznaczony do analizy próbek krwinek¹¹, Omni-ATAC to zoptymalizowany protokół dla próbek tkanek mrożonych¹², a MiniATAC-seq jest skuteczny do analizy zarodków we wczesnym stadium¹³. Jednak zastosowanie metody ATAC-seq do adipocytów, zwłaszcza z próbek tkanek, jest nadal trudne. Oprócz niejednorodności tkanki tłuszczowej, jej wysoka zawartość lipidów może zakłócać sprawne reakcje rekombinacji przez transpozazę Tn5 nawet po izolacji jądra. Ponadto wysoka zawartość mitochondriów w adipocytach, szczególnie w adipocytach brązowych i beżowych, powoduje wysokie zanieczyszczenie mitochondrialnego DNA i marnotrawstwo odczytów sekwencjonowania. W tym artykule opisano protokół specyficznego dla adipocytów sekwencji ATAC przy użyciu myszy Adipoq-NuTRAP (Rysunek 1). Wykorzystując sortowanie jąder znakowanych fluorescencyjnie, protokół ten umożliwia zbieranie czystych populacji jąder adipocytów z dala od innych mylących typów komórek i skuteczne usuwanie lipidów, mitochondriów i resztek tkankowych. W związku z tym protokół ten może generować wysokiej jakości dane specyficzne dla typu komórki i minimalizować odpady z odczytów mitochondrialnych przy użyciu zmniejszonej ilości danych wejściowych i odczynników w porównaniu ze standardowym protokołem.

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Indiana University School of Medicine.

1. Przygotowania przed rozpoczęciem eksperymentu

1. Przygotowanie tkanek
   1. W celu znakowania jądra adipocytów skrzyżuj myszy NuTRAP z liniami adiponektyny-Cre specyficznymi dla adipocytów (Adipoq-Cre), aby wygenerować myszy Adipoq-NuTRAP, które są hemizygotyczne zarówno dla Adipoq-Cre, jak i NuTRAP.
   2. Przeprowadź sekcję tkanki tłuszczowej interesującej nas myszy Adipoq-NuTRAP, jak opisano wcześniej¹⁴.
   3. Błyskawicznie zamrozić tkanki w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Każda poduszeczka tłuszczowa może być przechowywana jako całość, a zamrożone tkanki można później pokroić na suchym lodzie na mniejsze kawałki (~50 mg) do eksperymentów. Alternatywnie, tkanki tłuszczowe można pokroić, podzielić i zamrozić w probówkach do przechowywania (~ 50 mg na probówkę). Zamrożone próbki nigdy nie mogą się rozmrozić po zamrożeniu do momentu użycia.
2. Przygotowanie buforu
   UWAGA: Utrzymuj na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu.
   1. Przygotować bufor do przygotowania jądra (NPB): 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ i 0,1% NP40. Przygotować 7 ml NPB na próbkę. Dodaj świeży 100-krotny koktajl inhibitorów proteazy (końcowy 1x), DTT (końcowy 1 mM) i Hoechst (końcowy 1 μg/ml) do NPB przed użyciem.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego NPB, ale można go przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
   2. Przygotować 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami z 0,1% NP-40 (PBS-N).

2. Izolacja jądra

1. Homogenizatory Dounce ze szkła chłodzącego, z jedną szklanką Dounce na próbkę, na lodzie. Następnie dodaj 7 ml mieszanki NPB do każdej szklanki Dounce.
   UWAGA: Zaleca się użycie do ośmiu próbek w każdym eksperymencie. Praca z więcej niż ośmioma próbkami znacznie opóźniłaby wszystkie etapy, a zwłaszcza mogłaby obniżyć jakość jądra podczas sortowania.
2. Zamrożoną tkankę tłuszczową (50-100 mg) umieść w szklance Dounce i natychmiast pokrój ją na kilka mniejszych kawałków za pomocą długich nożyczek. Uderz 10x luźnym tłuczkiem dla wszystkich próbek, a następnie 10x ciasnym tłuczkiem.
   UWAGA: Tkanki tłuszczowe są miękkie, więc pokrojenie ich na kilka małych kawałków powinno wystarczyć. W przypadku rzadkich próbek można użyć mniejszych fragmentów (10-20 mg), chociaż liczba pobranych jąder adipocytów może się różnić.
3. Przefiltruj przez sitko 100 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml. Przefiltrowane homogenaty przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml, wlewając. Wirować z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z uchylnym kubełkiem. Usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe.
   UWAGA: Najpierw zassać za pomocą podciśnienia, a następnie usunąć pozostałą objętość za pomocą mikropipety.
4. Zawiesić osad w 500 μl PBS-N, delikatnie, ale dokładnie stukając palcem.
   UWAGA: Należy unikać pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie jąder.
5. Przefiltrować przez sitko o średnicy 40 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą delikatnego pipetowania. Przepłukać sitko 250 μl PBS-N. Przefiltrowaną zawiesinę jądrową przenieść do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą mikropipety.
   UWAGA: Jeśli to możliwe, probówki i sitka do komórek mogą być używane do mniejszych objętości, aby zminimalizować straty próbki.

3. Sortowanie jąder

1. Przygotowanie probówki zbiorczej
   1. Dodaj 500 μl PBS-N do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć kilka razy, aby zwilżyć wszystkie wewnętrzne powierzchnie buforem.
   2. Krótko zakręć rurkami, aby spuścić cały płyn, a następnie schłódź je na lodzie do momentu sortowania.
2. FACS (Rysunek 2)
   1. Użyj bramki FSC-A/FSC-H do podkoszulki i FSC-A/SSC-A do usuwania małych lub dużych zanieczyszczeń.
   2. Bramka dla populacji jądra adipocytów mCherry/GFP-dodatnich.
   3. Zbierz 10 000 jąder w każdej z probówek pobraniowych przygotowanych w kroku 3.1.
3. Przygotowanie jądra po sortowaniu
   1. Dodaj 500 μl PBS-N do każdej probówki zbiorczej i odwróć kilka razy do wymieszania.
   2. Obracać probówki zbiorcze z prędkością 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z odchylanym wiadrem. Całkowicie usunąć supernatant.
      UWAGA: Najpierw użyj odkurzacza, aby usunąć pęcherzyki, odlej supernatant i użyj chusteczek papierowych, aby całkowicie usunąć pozostały płyn. Śrut jest w tym momencie niewidoczny. Przygotować mieszaninę wzorcową Tn5 podczas etapu wirowania, jak opisano poniżej.

4. Tagmentacja Tn5 (Tabela 1)

1. Aby przygotować 25 μl głównej mieszaniny Tn5, wymieszaj 12,5 μl 2x buforu DNA do znakowania (bufor TD), 1,25 μl transpozazy Tn5 (enzym TDE I) i 11,25 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Dodać 25 μl mieszaniny głównej Tn5 do każdego osadu jądra i ponownie zawiesić przez delikatne pipetowanie. Inkubować przy 600 obr./min przez 30 min w temperaturze 37 °C przy użyciu termomiksera.

5. Oczyszczanie DNA

UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje zestaw do oczyszczania PCR wymieniony w Tabeli Materiałów. Można zastosować wszelkie inne podobne metody oczyszczania DNA.

1. Dodać 25 μl wody wolnej od nukleaz do 25 μl mieszaniny zawiesiny jądra Tn5 otrzymanej po kroku 4.2. Ostateczna objętość wynosi 50 μl na próbkę.
2. Dodać 250 μl buforu PB.
3. Dodać 5 μl 3 M octanu sodu (NaOAc) (pH 5,2).
4. Przenieść mieszaninę do kolumny (dostarczonej z zestawem referencyjnym) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT).
5. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Dodać 750 μl buforu PE zawierającego absolutny etanol (EtOH) i odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
6. Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić probówkę zbiorczą z przepływem.
7. Aby wymyć fragmenty DNA, wyposażyć kolumnę w nową probówkę o pojemności 1,5 ml, dodać 10 μl buforu EB i pozostawić w temperaturze pokojowej na 3 minuty. Wirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze RT.
   UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub w temperaturze -20 °C przez tygodnie.

6. Amplifikacja PCR (Tabela 2)

UWAGA: Startery użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 3.

1. Aby amplifikować transponowane fragmenty DNA, przygotuj główną mieszaninę PCR bez dodawania unikalnego startera do kodów kreskowych Ad2.n (starter #2). Na próbkę należy użyć 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR: 11 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 25 μM Ad1_noMX startera (starter #1) i 25 μl 2x PCR Master Mix.
2. Dodać 38 μl mieszaniny wzorcowej PCR do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.
3. Dodać 10 μl eluowanych fragmentów DNA z kroku 5.7.
4. Dodaj 2 μl 25 μM startera #2, który musi być specyficzny dla każdej próbki.
5. Przeprowadzić PCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 2.

7. Ilościowy test PCR (qPCR) w czasie rzeczywistym (Tabela 4)

UWAGA: Ten krok ma na celu określenie dodatkowych cykli potrzebnych do amplifikacji DNA. Jest to opcjonalne, ale wysoce zalecane, szczególnie w przypadku nowych eksperymentów.

1. Przygotować główną mieszaninę qPCR bez dodawania startera #2. Na próbkę należy użyć 9,975 μl mieszaniny głównej qPCR: 4,41 μl wody wolnej od nukleaz, 0,25 μl startera 25 μM #1, 5 μl 2x PCR Master Mix i 0,09 μL 100x SYBR Green I.
   UWAGA: Aby przygotować 100x SYBR Green I, rozcieńczyć 10 000x zapas wodą bez nukleaz. Ponieważ objętość 100x SYBR Green I użytego do mieszaniny głównej qPCR jest znikoma, łatwiej jest wykonać dodatkową mieszaninę wzorcową rozcieńczonej 100x SYBR Green I (np. dla 8-10 próbek).
2. Dodać 9,975 μl mieszaniny wzorcowej qPCR do każdego dołka płytki qPCR.
3. Dodaj 0,25 μl 25 μM startera #2 do każdej studzienki.
   UWAGA: Pamiętaj, aby dodać ten sam podkład #2, aby dopasować go do tego, który został dodany do każdej konkretnej próbki w kroku 6.4.
4. Dodać 5 μl reakcji PCR otrzymanej po amplifikacji PCR w kroku 6.5 i wymieszać pipetując.
   UWAGA: Pozostałe 45 μL reakcji PCR zostanie wykorzystane do drugiej amplifikacji PCR.
5. Przeprowadzić qPCR zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w tabeli 5.
6. Sprawdź krzywe amplifikacji i zidentyfikuj liczbę dodatkowych cykli PCR, które są potrzebne, szacując liczbę cykli, które osiągnęły ~35% maksimum (Rysunek 3A).
   UWAGA: Zazwyczaj 10 000 jąder wymaga od pięciu do ośmiu dodatkowych cykli PCR.

8. Dodatkowa amplifikacja PCR

1. Przeprowadzić PCR, używając wszystkich pozostałych 45 μl reakcji PCR zgodnie z obliczeniami z kroku 7.6 (Tabela 6).
   UWAGA: Każda próbka może wymagać innej liczby cykli amplifikacji.

9. Drugie oczyszczanie DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR

1. Zastosować te same procedury, co w punkcie 5, ale wymyć amplifikowane fragmenty DNA za pomocą 20 μl buforu EB.

10. Wybór rozmiaru fragmentu DNA

UWAGA: Użyj odwracalnych koralików unieruchamiających w fazie stałej, jak opisano poniżej. Wszelkie inne podobne kulki oczyszczające DNA mogą być używane zgodnie z instrukcjami producenta. Zawiesina perełkowa SPRI powinna być całkowicie ponownie zawieszona i zrównoważona w temperaturze pokojowej z obrotem przed użyciem.

1. Przenieś eluowane DNA do nowej probówki PCR i dodaj 80 μl buforu EB, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.
2. Dodać 55 μl kulek SPRI (0,55x objętość próbki) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielić na mini stojaku magnetycznym do 8-probówek do PCR przez 5 minut.
3. Przenieść 150 μl supernatantu do nowej probówki do PCR. Dodać 95 μl kulek SPRI i wymieszać pipetując.
   UWAGA: Supernatant zawiera DNA o masie około 500 pz lub mniejszej.
4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie oddzielać na mini stojaku magnetycznym przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant.
5. Umyj kulki przez 1 minutę 200 μl 70% EtOH. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
   UWAGA: Nie przesuwaj probówek PCR ze stojaka magnetycznego podczas prania.
6. Po ostatnim płukaniu odwirować probówki o masie 1 000 × g przez 1 minutę i odpipetować pozostały EtOH. Suszyć granulki z otwartą pokrywką w temperaturze 37 °C przez 2 minuty na maszynie do PCR.
   UWAGA: Po wyschnięciu granulki koralików powinny wykazywać tylko drobne pęknięcia. Unikaj przesuszenia.
7. Zawiesić osad z 20 μl buforu EB przez pipetowanie i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej stężenia. Oddzielić na mini podstawce magnetycznej na 5 minut, a następnie przenieść 18 μl supernatantu zawierającego ostateczną bibliotekę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA Biblioteka może być przechowywana w temperaturze -20 °C podczas przeprowadzania kontroli jakości.

11. Kwantyfikacja DNA za pomocą fluorometru

1. Aby przygotować mieszaninę główną, rozcieńczyć 200x odczynnik dsDNA o wysokiej czułości (HS) z buforem dsDNA HS do końcowego stężenia 1x.
2. W przypadku wzorców dodać 190 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 10 μl wzorca 1 lub wzorca 2 do probówki fluorometru.
   UWAGA: Przed rozpoczęciem kwantyfikacji należy zrównoważyć wzorce w RT w ciemności.
3. W przypadku próbek z biblioteki dodać 198 μl 1x mieszaniny wzorcowej i 2 μl każdej próbki do oddzielnej probówki fluorometru.
   UWAGA: Jeśli ilości próbki są ograniczone, objętość próbki można zmniejszyć do 1 μl, a objętość 1x mieszaniny głównej można zwiększyć do 199 μl.
4. Odwiruj lub potrząśnij rurkami fluorometru i pozwól im siedzieć przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Zmierzyć stężenie DNA za pomocą testu dsDNA HS fluorometru.

12. Kontrola jakości biblioteki za pomocą systemów elektroforezy o wysokiej czułości

1. Weź bibliotekę ATAC-seq i rozcieńcz wodą wolną od nukleaz do końcowego stężenia 1-5 ng / μL.
2. Analizuj rozkład rozmiarów bibliotek ATAC-seq przy użyciu zautomatyzowanych systemów elektroforezy o wysokiej czułości zgodnie z protokołami producenta.

13. Kontrola jakości biblioteki ATAC-seq za pomocą ukierunkowanego qPCR

1. Weź 5-10 ng z biblioteki ATAC-seq i rozcieńcz 50 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Przeprowadzić qPCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na promotory i wzmacniacze, o których wiadomo, że są aktywne w adipocytach, zgodnie z warunkami cyklicznymi wskazanymi w Tabeli 7.
3. Należy stosować startery kontroli ujemnej ukierunkowane na zamknięte/ciche regiony genomu (Tabela 7).
4. Obliczyć wzbogacenie promotora/wzmacniaczy w stosunku do kontroli ujemnych (tabela 8).
   UWAGA: Oczekuje się, że zobaczymy ≥10-20-krotne wzbogacenie z udanymi próbkami.

14. Sekwencjonowanie

1. Prześlij biblioteki ATAC-seq do sekwencjonowania. Użyj sekwencjonowania sparowanych końców (2 x 34 pz, 2 x 50 pz lub dłużej) ze średnią liczbą odczytów 10-30 milionów odczytów na próbkę.

Aby przeanalizować tkankę tłuszczową za pomocą tego protokołu ATAC-seq, wygenerowaliśmy myszy Adipoq-NuTRAP, które były karmione dietą żywieniową; następnie wyizolowaliśmy jądra adipocytów z białej tkanki tłuszczowej najądrza (eWAT), pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (iWAT) i brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) za pomocą cytometrii przepływowej. Wyizolowane jądra wykorzystano do znakowania, a następnie do oczyszczania DNA, amplifikacji PCR, etapów kontroli jakości, sekwencjonowania i analizy danych, jak opisano powyżej. Celem tego reprezentatywnego eksperymentu było sprofilowanie dostępności chromatyny w czystych populacjach adipocytów wyizolowanych z różnych magazynów tłuszczu.

Zaobserwowaliśmy, że jądra adipocytów znakowane mCherry i GFP były wyraźnie odróżnialne od jąder innych typów komórek wyizolowanych z tkanki tłuszczowej myszy Adipoq-NuTRAP za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2A-C). Stwierdzono różnice we frakcjach adipocytów w zależności od rodzaju magazynu tłuszczowego: ~50% w eWAT, ~30% w iWAT i ~65% w BAT (Rysunek 2D)7. W ciągu 2-10 minut na próbkę zebraliśmy 10 000 jąder i wykorzystaliśmy je do procedur ATAC-seq. Przeprowadziliśmy w sumie 10-13 cykli PCR (pięć cykli pierwszego PCR i pięć do ośmiu cykli drugiego PCR, figura 3A). Jeśli próbki wymagają więcej niż łącznie 15 cykli PCR, może to wskazywać na próbki niskiej jakości (Rysunek 3B). Analiza rozkładu wielkości bibliotek ATAC-seq wykazała wiele pików odpowiadających regionowi wolnemu od nukleosomów (NFR) oraz mono, di i multinukleosomom (Rysunek 4A-C), przy średnich rozmiarach ~ 500-800 pz. Próbki o niskiej jakości zazwyczaj wykazywały głównie NFR bez pików nukleosomalnych lub z niewielką liczbą pików nukleosomalnych (Rysunek 4D). Testy kontroli jakości za pomocą analizy qRT-PCR wykazały 10-20-krotne wzbogacenie w dodatnie elementy genomu w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Fabp4, Plin1 i Pnpla2, podczas gdy nie wykazano wzbogacenia w kontroli negatywnej (Ryc. 5). Zaobserwowaliśmy również wzbogacenie w termogeniczny gen Ucp1 szczególnie w BAT, ale nie w eWAT lub iWAT (Rysunek 5).

Po sekwencjonowaniu i analizie, zidentyfikowaliśmy ~55 000 pików połączonych z trzech różnych magazynów tłuszczu (eWAT, iWAT i BAT). Odczyty mitochondrialne wynosiły <2%, a frakcja pod pikami wynosiła ~18%-44% (Rysunek 6A, B). Próbki o niskiej jakości mogą mieć znacznie wyższe odczyty mitochondriów i/lub niższy odsetek odczytów w regionach szczytowych. Oględziny ścieżek biblioteki ATAC-seq ujawniły wiele silnych pików o wysokim stosunku sygnału do szumu w pobliżu genów markerów adipocytów, takich jak Adipoq, Plin1 i Fabp4, ze wszystkich magazynów tkanki tłuszczowej (Figura 7A-C). Zaobserwowaliśmy również silne piki ATAC-seq w locus Ucp1 brązowego producenta adipocytów w próbce BAT, ale tych pików nie zaobserwowano w próbkach eWAT lub iWAT (Rysunek 7D). Wszystkie te dane wskazują na udane dane ATAC-seq wygenerowane z jąder adipocytów.

Rysunek 1: Schematyczny schemat sekwencyjny ATAC-seq specyficzny dla adipocytów przy użyciu myszy NuTRAP. Kroki unikalne dla tego protokołu są wyróżnione czerwonymi zacienionymi polami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne bramkowanie FACS ilustrujące izolację jąder adipocytów oznaczonych mCherry/GFP z tkanek tłuszczowych myszy Adipoq-NuTRAP. (A-C) Analiza cytometrii przepływowej izolowanych jąder z eWAT, iWAT i BAT myszy Adipoq-NuTRAP. (D) Analiza ilościowa jąder z adipocytów i nieadipocytów w eWAT, iWAT i BAT myszy Adipoq-NuTRAP. Dane są średnie ± SEM (n = 3). Te dane dotyczące liczby jąder pochodzą z Roh et al.7. Skróty: FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją; GFP = białko zielonej fluorescencji; eWAT = biała tkanka tłuszczowa najądrza; iWAT = pachwinowa biała tkanka tłuszczowa; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa; NuTRAP = znakowanie jądrowe i translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów; Adipoq-NuTRAP = Mysz NuTRAP skrzyżowana ze specyficzną dla adipocytów linią adiponektyny-Cre; FSC-A = obszar piku rozproszenia do przodu; FSC-H = wysokość piku rozproszenia do przodu; SSC-A = obszar piku bocznego rozproszenia; FITC-A = powierzchnia piku izotiocyjanianu fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne krzywe amplifikacji z qRT-PCR. (A) Próbka dobrej jakości, która wymaga siedmiu dodatkowych cykli amplifikacji. (B) Próbka złej jakości, która wymaga ≥15 dodatkowych cykli. Skrót: qRT-PCR = ilościowa odwrotna transkrypcja PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Profile rozkładu rozmiarów bibliotek ATAC-seq. (A-C) Biblioteki dobrej jakości i (D) niskiej jakości są pokazane jako reprezentatywne wyniki. Skróty: ATAC-seq = test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości; FU = jednostki fluorescencji; bp = pary zasad; NFR = region wolny od nukleosomów; eWAT = biała tkanka tłuszczowa najądrza; iWAT = pachwinowa biała tkanka tłuszczowa; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Kontrola jakości qPCR bibliotek ATAC-seq. Wzbogacenia w promotory i wzmacniacze w pobliżu ogólnych markerów adipocytów Adipoq, Fabp4, Plin1 i Pnpla2 lub brązowego markera adipocytów Ucp1. Skróty: ATAC-seq = test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości; NC = kontrola ujemna; eWAT = biała tkanka tłuszczowa najądrza; iWAT = pachwinowa biała tkanka tłuszczowa; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa. Dane są średnie ± SEM (n = 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Mitochondria odczytują i frakcje poniżej pików bibliotek ATAC-seq. (A) Mitochondria odczytują (%) i (B) frakcje poniżej pików (%) z eWAT, iWAT i BAT. Skróty: ATAC-seq = test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości; eWAT = biała tkanka tłuszczowa najądrza; iWAT = pachwinowa biała tkanka tłuszczowa; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Sygnał ATAC-seq śledzi w loci reprezentatywnych genów. (A-C) Ogólne geny markerów adipocytów. (B) Brązowy marker specyficzny dla adipocytów. Skróty: ATAC-seq = test chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości; eWAT = biała tkanka tłuszczowa najądrza; iWAT = pachwinowa biała tkanka tłuszczowa; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składniki głównej mieszanki Tn5. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Składniki głównej mieszaniny PCR i początkowe warunki cyklu PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Lista starterów z kodami kreskowymi do amplifikacji PCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Składniki głównej mieszaniny qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: warunki cykliczne qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Warunki drugiego cyklu PCR dla dodatkowego wzmocnienia. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 7: Sekwencje starterów i ukierunkowane warunki cykliczne qPCR do kontroli jakości biblioteki ATAC-seq. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 8: Analiza wyników qPCR do kontroli jakości. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych istotnych ani istotnych interesów finansowych związanych z badaniami opisanymi w niniejszym artykule.