Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ten protokół opisuje izolację Fotosystemu I (PSI) - Kompleksu Zbierania Światła I (LHCI) z tkanek roślinnych. PSI wraz z PSII jest odpowiedzialny za konwersję światła na energię chemiczną w tlenowych fotoautotrofach i ma wydajność kwantową ~1, co czyni go celem do badania transferu energii napędzanego światłem.
Ta metoda jest używana do izolowania Fotosystemu I (PSI) wraz z Kompleksem Zbierania Światła I (LHCI), jego natywną anteną, od roślin. PSI-LHCI to duży błonowy kompleks białkowy koordynujący setki czynników zbierających światło i transportujących elektrony i jest najbardziej wydajnym systemem zbierania światła występującym w przyrodzie. Fotony pochłonięte przez cztery białka anteny LHCA, które tworzą LHCI, są przenoszone poprzez oddziaływanie ekscytoniczne do centrum reakcji rdzenia PSI i są wykorzystywane do ułatwienia separacji ładunków napędzanych światłem przez błonę tylakoidów, zapewniając moc redukcyjną i energię do wiązania węgla w organizmach fotoautotroficznych. Wysoka wydajność kwantowa PSI sprawia, że kompleks ten jest doskonałym modelem do badania transferu energii sterowanego światłem. W tym protokole tkanka roślinna jest mechanicznie homogenizowana, a chloroplasty są oddzielane od masowych resztek komórkowych przez filtrację i odwirowanie. Wyizolowane chloroplasty są następnie poddawane lizie osmotycznej, a błony tylakoidów są odzyskiwane przez wirowanie i rozpuszczane przy użyciu detergentu n-dodecyl-beta-maltozydu. Rozpuszczony materiał jest ładowany do kolumny wymiany anionów w celu zebrania większości kompleksów zawierających chlorofil. Większe kompleksy są wytrącane z roztworu, ponownie zawieszane w małej objętości i ładowane na gradientach sacharozy w celu oddzielenia głównych kompleksów zawierających chlorofil. Otrzymane frakcje gradientu sacharozy scharakteryzowano w celu zidentyfikowania pasma zainteresowania zawierającego PSI-LHCI. Protokół ten jest bardzo podobny do protokołu stosowanego w krystalizacji roślin PSI-LHCI, z pewnymi uproszczeniami i opiera się na metodach opracowanych przez lata w laboratorium Nathana Nelsona.
Fotosynteza oksygeniczna jest jedną z najważniejszych reakcji chemicznych na naszej planecie. Przekształcanie energii świetlnej w energię chemiczną zachodzi w centrach reakcji dwóch fotosystemów: fotosystemu I (PSI) i fotosystemu II (PSII)1 (Rycina 1A). PSI to duży, wysoce konserwatywny, wielopodjednostkowy kompleks pigmentowo-białkowy, który ewoluował ponad 3,5 miliarda lat temu2,3. Kompleks ten, zawierający około 100 cząsteczek chlorofilu i około 20 karotenoidów, ułatwia transport elektronów przez błonę tylakoidów z plastocyjaniny do ferredoksyny, która p....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie błon tylakoidowych z liści szpinaku
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejszy protokół służy do izolacji i charakterystyki aktywnego kompleksu PSI-LHCI z tkanek roślinnych w ciągu trzech dni. Oczyszczanie PSI-LHCI polega najpierw na izolacji błon tylakoidowych roślin, które następnie są solubilizowane za pomocą β-DDM. Typowe wydajności na etapie przygotowania błon wynoszą 200 mg chlorofilu z 500 g liści. Wartość ta może się różnić w zależności od rodzaju użytego materiału wyjściowego.
Drugiego i trzeciego dnia eksperymentu wykorzystuje się chromatografię wymia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Za pomocą tego protokołu kompleks PSI-LHCI z tkanek roślinnych może zostać oczyszczony w stanie aktywnym. Stosowano tu liście szpinaku, ale metody te można stosować do preparatów z różnych roślin 23,40. We wszystkich przypadkach podczas wykonywania tego protokołu należy zachować ostrożność, aby chronić kompleks przed uszkodzeniem. Przygotowanie to powinno odbywać się w ciemności lub pod zielonym światłem, na lodzie ze wstępnie schłodzonymi, a wszystkie etapy pono.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Y.M. dziękuje za wsparcie ze strony Narodowej Fundacji Nauki w ramach Nagrody nr 2034021 oraz U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, Division of Chemical Sciences, Geosciences, and Biosciences pod numerem nagrody. DE-SC0022956. C.G. jest wspierany przez National Science Foundation w ramach Nagrody nr 00036806.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml probówka Falcon | VWR | 62406-200 | Służy do przechowywania tylakoidów |
| Bio rad Econo-Column 1,5 X 30 cm | biorad | 7374153 | |
| Gaza klasa 50, 100% bawełna | Arkwright LLC | B07D1FZZMB | Z Amazon |
| Pręty szklane | Millipore Sigma | BR135825 | Wystarczy każda podobna wędka |
| Niskoprofilowy blender | vitamix o pojemności 64 uncjiVitamix | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Probówki do wirowania poliallomerów z otwartym górnym | Seton Scientific | 5030 | |
| Optima XE Ultrawirówka | Beckman Coulter | A94471 | |
| Glikol polietylenowy 6,000 | Hampton Research | HR2-533 | |
| Młynek do tkanek Potter-Elvehjen, 30 ml. | WHEATON | 358049 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| SW 40 Ti | Beckman Coulter | 331301 | |
| TOYOPEARL DEAE-650C | Tosoh Bioscience | 7988 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| β-DDM | Glycon - Biochemicals GmbH | D97002 | Przechowywany jako 10% zapasów w temperaturze -20 ° Z |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny