Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Trójwymiarowa (3D) wizualizacja organelli jest najważniejszym zadaniem w nowoczesnej biologii komórki. Biorąc pod uwagę stosowane skale, od dziesiątek nanometrów w przypadku pęcherzyków wydzielniczych do wielu mikronów w jądrze komórkowym, trudno jest znaleźć jedną technikę mikroskopii, która pasowałaby do wszystkich zastosowań. Podczas gdy współczesna mikroskopia fluorescencyjna może objąć większość zakresu pod względem rozdzielczości, pojawiają się tylko znakowane cząsteczki. Teatr komórkowy pozostaje domeną mikroskopii elektronowej. Konwencjonalne metody chemicznego utrwalania, zatapiania tworzyw sztucznych i barwienia metalami ciężkimi są silnie inwazyjne, więc wyniki mogą zależeć od szczegółów przygotowania próbki. Z drugiej strony Cryo-EM jest ograniczony przez konieczność zeszklenia środowiska wodnego; Kryształki lodu, które się tworzą, załamują oświetlenie elektronowe, powodując artefakty kontrastu o wyższym kontraście niż materiał organiczny będący przedmiotem zainteresowania.

W ciągu ostatniej dekady nastąpił wzrost ilości technik obrazowania elektromagnetycznego opracowanych lub dostosowanych do badań komórkowych¹. Zamrażanie wysokociśnieniowe w połączeniu z iteracyjnym frezowaniem wiązką jonów (FIB) i seryjnym obrazowaniem powierzchni przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (tj. FIB-SEM) jest obecnie metodą z wyboru dla dużych próbek². Kriogeniczna miękka tomografia rentgenowska (cryo-SXT) jest odpowiednia dla próbek o wielkości kilku mikronów, ograniczonych charakterystyczną długością absorpcji miękkiego promieniowania rentgenowskiego w wodzie^3,4,5. Skala ta obejmuje wiele nienaruszonych typów komórek, a ilościowy charakter kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego dodaje aspekt pomiaru stężenia⁶ lub spektroskopia⁷. W połączeniu z uśrednianiem subtomogramowym, kriotransmisyjna tomografia elektronowa (cryo-ET), oparta na mikroskopii elektronowej transmisyjnej z kontrastem fazowym (TEM), oferuje najwyższą rozdzielczość dla makrocząsteczek lub kompleksów^8,9^,10. Jednak rzadko zdarza się, aby nienaruszone organelle były tak regularne, że można je uśrednić w całości. Co więcej, konwencjonalny tryb szerokokątnego TEM jest ograniczony dla grubości próbki do kilkuset nanometrów przez połączenie nieelastycznego rozpraszania (obejmującego utratę energii) w próbce i aberracji chromatycznej w magnetycznej soczewce obiektywu^11,12. Duże rozproszenie energii wymusza użycie filtra energetycznego w celu usunięcia powstałego nieostrego zamglenia, ale czuła próbka nadal ulega uszkodzeniom spowodowanym promieniowaniem, podczas gdy sygnał obrazu staje się wykładniczo słabszy wraz ze wzrostem grubości.

Alternatywny tryb obrazowania, skanowanie transmisji EM (STEM), omija potrzebę filtrowania energii i zachowuje nieelastycznie rozproszone elektrony do tworzenia obrazu, choć obecnie w niższej rozdzielczości niż dla tomografii TEM (Rysunek 1). W rzeczywistości nie powstaje żaden prawdziwy obraz. Zamiast tego, podobnie jak w skanowaniu EM, pomiary są wykonywane punkt po punkcie, a obraz jest montowany przez komputer. Powiększenie zależy tylko od wielkości kroków skanowania bez zmiany prądów obiektywu. Przy prawidłowym skonfigurowaniu użyteczny zakres grubości próbki do tomografii krio-STEM (CSTET) może osiągnąć 1,5 lub nawet 2 μm, chociaż strefa komfortu, w której użyteczne natężenie sygnału pozostaje znaczną częścią oświetlenia, wynosi około 600-900 nm^11,13. To wystarczy, aby zobaczyć dużą część cytoplazmy, a czasami krawędź jądra komórkowego. W praktyce okazuje się, że witryfikacja standardową metodą zanurzania w płynie kriogenicznym nakłada poważniejsze ograniczenie grubości niż obrazowanie STEM. Celem tego artykułu wideo jest ułatwienie włączenia CSTET do skrzynki narzędziowej do obrazowania komórek i organelli w laboratoriach badawczych i placówkach mikroskopowych.

Pierwszym wyzwaniem jest to, że operacje mikroskopowe w CSTET nie są jeszcze ustandaryzowane dla zastosowań w naukach przyrodniczych w taki sposób, jak były dla tomografii krio-TEM. Sprzęt STEM rzadko (jeśli w ogóle) był kierowany na rynek krio-EM. Jednak wraz z najnowszą generacją mikroskopów zmienia się to i wiele istniejących narzędzi można doposażyć. STEM jako technika wystartowała i w dużej mierze przejęła kontrolę nad materiałoznawstwem, gdzie rośnie również zainteresowanie metodami kriogenicznymi i niskodawkowymi^14,15. Literatura materiałoznawcza obfituje w akronimy BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM itp., które przyczyniają się do zamieszania. Proponujemy tutaj zalecany punkt wyjścia, który, zgodnie z naszym zbiorowym doświadczeniem w Instytucie Naukowym Weizmanna, zapewnia najbardziej ogólny protokół dla użytecznych wyników opartych na obrazowaniu STEM w jasnym polu (BF)¹⁶. W żaden sposób nie wyczerpuje ani nawet nie eksploruje wachlarza możliwości, ale posłuży jako podstawa do dalszych ulepszeń. Chociaż kładziemy nacisk na cryo-STEM, większość protokołu jest równie istotna dla tomografii STEM w temperaturze pokojowej sekcji osadzonych w tworzywie sztucznym.

Istotą STEM jest skanowanie próbki za pomocą skupionej sondy elektronowej (Rysunek 1), stożka iluminacyjnego, oraz rejestrowanie sygnałów z płaszczyzny dyfrakcyjnej (rozpraszającej) podczas transmisji, piksel po pikselu, w celu wytworzenia obrazów 2D^17,18. Próbki amorficzne, w tym większość materiałów komórkowych, będą wytwarzać rozproszony wzór rozpraszania podczas transmisji. Najprostszą praktyczną konfiguracją STEM jest umieszczenie okrągłego detektora do rejestrowania centralnego dysku (tj. oświetlenia sondy, które byłoby transmitowane bez próbki). Próbka rozprasza elektrony z dala od tego stożka oświetleniowego do tego stopnia, że sygnał maleje. W ten sposób powstaje obraz BF - próbka wydaje się ciemna na jasnym tle. Detektor pierścieniowy może być również (lub zamiast) używany do wykrywania rozpraszania od próbki poza stożkiem oświetleniowym. Po usunięciu próbki nie ma sygnału. Gdy próbka jest na miejscu, obiekty wydają się jasne na ciemnym tle na obrazie w ciemnym polu (DF). Nomenklatura STEM (BF, pierścieniowe ciemne pole [ADF], pierścieniowe ciemne pole o wysokim kącie [HAADF] itp.) odnosi się głównie do zakresów kątów zbierania dla detektorów.

Kąt zbieżności oświetlenia stanowi istotną adaptację STEM do tomografii komórkowej. Gdy najwyższym priorytetem jest wysoka rozdzielczość, kąt zbieżności powinien być jak największy. (Jest to podobne do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; rozdzielczość zależy od średnicy sondy, która skaluje się jako długość fali podzielona przez aperturę numeryczną. Zauważ, że dla EM, odnosimy się do kąta połówkowego lub półzbieżności). Z drugiej strony, gdy priorytetem jest głębia ostrości, kompromis w rozdzielczości daje ogromną przewagę, ponieważ skupiona wiązka pozostaje mniej więcej równoległa na odległość równą dwukrotności długości fali podzielonej przez półkąt do kwadratu. Idealnie byłoby, gdyby cała wolumin komórki pozostał w fokusie¹⁹. Na przykład przy 300 keV długość fali elektronu deBroglie'a wynosi 0,002 nm, więc zbieżność 1 mrad daje rozdzielczość 2 nm i głębię ostrości 4 mikrony. W tych warunkach tomografia może być wykonywana nawet bez ustawiania ostrości podczas procesu zbierania danych, ale tylko raz na początku akwizycji. Konwencjonalny STEM zdolny do tomografii może osiągnąć kąt półzbieżności 7 lub 8 mrad; W związku z tym w zasadzie moglibyśmy osiągnąć rozdzielczość rzędu 0,25 nm, ale wtedy o głębokości ogniskowej wynoszącej zaledwie 62 nm. Jest ona zdecydowanie zbyt cienka do obrazowania komórkowego. Bardziej zaawansowane mikroskopy z trzema soczewkami kondensatorowymi oferują ciągłą regulację kąta półzbieżności w znacznym zakresie. W bardziej tradycyjnej konfiguracji z dwoma kondensatorami zbieżność jest ustalana dyskretnie przez otwór kondensatora (C2).

Dla solidnych, osadzonych w plastiku próbek, można zarejestrować serię ogniskowych przy każdym nachyleniu i połączyć je w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości²⁰, ale dla próbek kriogenicznych budżet promieniowania jest zbyt mocno ograniczony. Wreszcie, rozważając zalety obrazowania BF lub DF, w przypadku grubych próbek, należy wziąć pod uwagę skutki wielokrotnego elastycznego rozpraszania w próbce. Sygnał BF jest mniej zniekształcony przez wielokrotne rozpraszanie i wykazuje wyższą rozdzielczość dla grubych próbek^16,21.

Przydatną zasadą było ustawienie kątów zbierania kilkakrotnie większych niż zbieżność. Im grubsza próbka, tym większy powinien być krążek zbiorczy. Zbyt mały dysk zapewni niską intensywność sygnału; Zbyt duży dysk spowoduje słaby kontrast obrazu, ponieważ przyczyni się do tego tylko rozpraszanie pod najwyższym kątem. Kąty pobierania powinny być zoptymalizowane dla danej próbki. Kąty detektora w funkcji długości kamery (dyfrakcyjnej) muszą być kalibrowane niezależnie. Mogą być one wygodnie wyświetlane przez oprogramowanie mikroskopu. W praktyce współczynnik od dwóch do pięciu w stosunku półkątów zbierania do oświetlenia, odpowiednio θ do α (Rysunek 1), jest zalecanym punktem wyjścia dla CSTET próbek komórkowych.

Poniższy protokół opisuje działanie tomografii STEM przy użyciu popularnego oprogramowania SerialEM do sterowania mikroskopem^22,23. SerialEM nie jest powiązany z konkretnym producentem i jest szeroko stosowany w tomografii TEM. Większość czynności związanych z przygotowaniem do tomografii można przenieść bezpośrednio z TEM. Strategia SerialEM polega na modelowaniu systemu skanowania jako kamery. Umożliwia to proste przejście z TEM na STEM. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak powiększenie i binning są całkowicie sztuczne. Ważnymi parametrami są pole widzenia w mikronach, liczba pikseli w polu widzenia oraz czas naświetlania. Odstępy między pikselami lub próbkowanie to pole liniowe podzielone przez liczbę pikseli, podczas gdy czas przebywania to liczba pikseli podzielona przez czas ekspozycji.

Minimalna konfiguracja dla STEM i CSTET obejmuje trzy funkcje mikroskopu: generator skanów, detektor STEM i oprogramowanie sterujące tomografią. Protokół odnosi się do nomenklatury FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), ale pojęcia są ogólne. Własnościowe oprogramowanie TFS zostało opisane w JoVE dla TEM²⁴, a operacja STEM jest bardzo podobna.

Zakładamy, że mikroskop został wcześniej ustawiony przez zespół serwisowy lub doświadczony personel i że wyrównanie kolumny można wywołać poprzez wczytanie pliku. Drobne korekty nazywane są wyrównaniem bezpośrednim i mogą być przechowywane w tak zwanych rejestrach FEG (mikroskopy TFS). Wyrównania bezpośrednie obejmują środek obrotu, punkty obrotu, wyrównanie dyfrakcji i kompensację astygmatyzmu kondensatora. Korekty muszą być wykonywane iteracyjnie. Należy pamiętać, że mikroskopy TFS implementują odrębne tryby nanosondy (nP) i mikrosondy (μP); dla danej apertury kondensatora zapewniają one stosunkowo wąskie lub szerokie pole widzenia z równoległym oświetleniem w TEM i mniej lub bardziej zbieżną (ściśle zogniskowaną) wiązką elektronów w STEM, odpowiednio. Inni producenci stosują różne schematy, aby objąć zakres kątów zbieżności.

Przed rozpoczęciem należy wybrać pole widzenia, L, oraz próbkowanie (szerokość pikseli), l, w zależności od badanej próbki. Na przykład dla l = 1 nm/piksel należy wybrać obraz o wymiarach 4 000 x 4 000 pikseli, który pokryje pole widzenia 4 μm². Rozdzielczość będzie w najlepszym razie dwukrotnie większa niż próbkowanie przestrzenne, więc 2 nm i średnica sondy, d, powinny się do tego pasować. Kalibracja kąta sondy wykracza poza zakres tego protokołu, więc zakładamy, że dostępna jest tabela lub odczyt ekranu. Średnica sondy to w przybliżeniu długość fali elektronu podzielona przez kąt półzbieżności (w radianach): d = λ/θ. Długość fali λ wynosi 0,002 nm dla elektronów 300 keV i 0,0025 nm dla elektronów 200 keV, więc θ 1 mrad zapewni średnicę plamki odpowiednio 2 lub 2,5 nm.

Protokół jest przedstawiany w postępie o rosnącej złożoności. Pierwszym zadaniem jest wytworzenie obrazu STEM, który zależy od oprogramowania producenta mikroskopu, a następnie serii pochylenia, do której wykorzystujemy SerialEM. Wielu czytelników z pewnością zna SerialEM, więc bardziej skomplikowane zadania przyjdą naturalnie. Nie ma potrzeby ścisłego przestrzegania procedur. Osiągnięcia związane z automatyzacją mogą być wdrażane bezpośrednio w odniesieniu do STEM, jak również w odniesieniu do TEM. Doświadczeni użytkownicy prawdopodobnie odwrócą protokół, zaczynając od korelacyjnej rejestracji map fluorescencyjnych i kontynuując konfigurację tomografii wsadowej. Więcej szczegółów można znaleźć w obszernej dokumentacji i bibliotekach samouczków dla samego SerialEM, w tym w niedawnym artykule JoVE na temat najnowszych osiągnięć w automation²⁵.

1. Konfiguracja STEM

1. Wstępne wyrównania: Załaduj plik wyrównania kolumny, a następnie otwórz okno Zawory kolumny. Jeśli używasz uchwytu kriogenicznego z bocznym wejściem, otwórz osłonę kriogeniczną. Uruchom w trybie TEM. Wiązka powinna pojawić się na ekranie. Jeśli nie, zmniejsz powiększenie.
2. Ustaw mikroskop w trybie eucentrycznym, naciskając przycisk na panelu sterowania.
3. Ustaw rozmiar plamki na wygodną wartość (np. 6) do wizualizacji ekranu fluorescencyjnego, bezpośrednio lub za pomocą wbudowanej kamery (w zależności od modelu mikroskopu).
4. Ustaw mikroskop w trybie STEM i sprawdź, czy ostrość wykorzystuje soczewki kondensora (intensywność), a nie obiektyw. Ustawianie fokusu eucentrycznego. Następnie wyjdź z trybu dyfrakcji w celu wstępnej regulacji.
5. Upewnij się, że wiązka nie jest zaślepiona. Zmniejsz powiększenie, aż wiązka pojawi się na ekranie. Dostosuj przesunięcie wiązki do środka i zwiększaj powiększenie w krokach do około 70kx, utrzymując wiązkę w środku.
6. Włóż żądany otwór kondensatora, zwykle 50 μm. Sprawdź wyśrodkowanie otworu. Podczas lekkiego obracania pokrętła ostrości do przodu ido tyłu, plamka powinna rozszerzać się i kurczyć, ale pozostać na miejscu, tak jakby samolot przecinał wyimaginowaną pionową klepsydrę. Jeśli przysłona nie jest wyśrodkowana, oświetlenie przesunie się na boki, tak jakby klepsydra była przechylona.
7. Ustaw wiązkę w pozycji ostrości i naciśnij Intensywność Lista ostrości (jeśli jest dostępna) na karcie wyrównania lub wróć do ostrości eucentrycznej, jak w 1.2. Ponownie dostosuj położenie belki do środka.
8. Dostosuj środek obrotu. Obróć pokrętło kroku ostrości do minimum lub o jeden stopień powyżej, tak aby wiązka delikatnie pulsowała, i upewnij się, że pozostaje nieruchoma, gdy ostrość porusza się w górę iw dół.
9. Wybierz punkty obrotu i zbliż je do siebie za pomocą regulacji X i Y.
   UWAGA: Jeśli płyta fazowa jest zainstalowana na przyrządzie TFS, należy używać tylko regulacji X.
10. Lekko skoncentruj wiązkę i wyreguluj stygmaty kondensatora, aby dysk był okrągły. Przechodź w górę iw dół przez ostrość, aby zoptymalizować; Nie powinno być tendencji do wydłużania się w jednym lub drugim kierunku podczas przechodzenia przez ostrość.
11. Normalizuj soczewki. Następnie stopniowo zwiększaj powiększenie do około 240kx, używając przesunięcia wiązki, aby utrzymać punkt wyśrodkowany, i powtórz regulację środka obrotu i punktu obrotu (kroki 1.6-1.8).
12. Wróć do trybu dyfrakcji. Wiązka powinna wyglądać jak jednolity dysk na ekranie fluorescencyjnym. Długość kamery (CL) teraz skutecznie kontroluje odległość optyczną do detektora, podobnie jak w krystalografii rentgenowskiej. Zmień go i obserwuj, jak dysk kurczy się i powiększa, tak jakby położenie ekranu przesuwało się w kierunku lub od próbki. Ten stożek reprezentuje oświetlenie BF.
    UWAGA: Dla każdego CL istnieje wyrównanie dyfrakcyjne, które należy wyregulować, aby doprowadzić rzutowaną belkę do osi środkowej. Zwykle nie ma potrzeby udoskonalania ich wszystkich, tylko jeden (lub kilka) ma być używany do wykrywania.
13. Włącz tryb STEM przy dużym powiększeniu.
    1. Jeśli dostępny jest detektor BF STEM, zacznij od niego. Przenieś stolik do obszaru z pustym otworem i dostosuj wyrównanie dyfrakcji, aby wyśrodkować wiązkę przy użyciu żądanego CL.
    2. Wiele mikroskopów jest wyposażonych tylko w detektor HAADF; istnieje sztuczka, aby użyć go jako detektora BF. Najpierw cofnij detektor, wyśrodkuj wiązkę jak powyżej w bezpośrednich wyrównaniach, włóż otwór obiektywu, zwykle mały, taki jak 20 μm, i dostosuj jego położenie, aby równomiernie otoczyć wiązkę. (Najprostszym sposobem, aby to zrobić, jest wstawienie próbki lub siatki testowej, aby zobaczyć aureolę wokół oświetlenia). Następnie użyj wyrównania dyfrakcyjnego, aby przesunąć wiązkę z osi na obszar detektora. Włóż i wsuń czujkę, obserwując wiązkę na ekranie, aby potwierdzić, że wiązka jest blokowana przez czujkę.
    3. Rozpocznij skanowanie w oprogramowaniu mikroskopu i dostosuj ustawienia jasności i kontrastu (B/C) tak, aby sygnał był bliski 0, gdy wiązka jest wygaszona, i bliski nasycenia, gdy pełne oświetlenie pada na detektor. Użyj wyświetlacza lunety, aby pomóc. Ustawienia mogą być sprzężone w nieoczekiwany sposób, dlatego regulacja powinna być kilkakrotnie powtarzana.
14. Przywróć mikroskop do stosunkowo niskiego powiększenia w rejestrze dużego powiększenia (tryb SA), bez przechodzenia w tryb niskiego powiększenia (LM).
15. Zanotuj bieżący ekran, aby móc się do niego później odnieść (patrz krok 3.1.1). Prąd można zmieniać za pomocą ustawień soczewki pistoletu i rozmiaru plamki, tak jak w TEM, przy czym rosnące liczby odpowiadają zmniejszonemu prądowi.
16. W tym momencie zapisz rejestr FEG, aby ułatwić powrót do wartości standardowych.
    UWAGA: Placówka może przygotować domyślny zestaw rejestrów FEG, dzięki czemu użytkownicy mogą rozpocząć pracę od działającej konfiguracji.

2. Umieszczanie próbki

1. W trybie LM TEM upewnij się, że siatka nie jest nieprzezroczysta. Znajdź kwadrat siatki, aby dokonać wstępnych korekt. Wygodnie jest znaleźć pusty obszar, dziurę lub rozdarty kwadrat siatki. Nagrywaj pozycje etapu, aby wygodnie do nich wracać.
2. Doprowadzić próbkę do wysokości eucentrycznej. Można to zrobić na kilka sposobów. Na przykład użyj woblera stolikowego, aby przechylić siatkę, jednocześnie przesuwając wysokość próbki wzdłuż osi Z, aż obraz przestanie przesuwać się na boki. Możesz też zaznaczyć niektóre funkcje na ekranie podglądu i przechylić stolik pod kątem 30°. Funkcja będzie się poruszać na boki. Dostosuj wysokość próbki, aby przywrócić ją do pierwotnej pozycji. Zwiększ powiększenie lub pochylenie stolika, aby udoskonalić. Wróć do pochylenia 0°.
3. Wróć do trybu STEM i włóż detektor STEM. Przejdź do trybu najmniejszego dużego powiększenia (SA). Upewnij się, że obraz jest obserwowany na ekranie komputera. Skanuj szybko, aby uniknąć niepotrzebnego narażenia; Typowy byłby 1 μs/piksel lub mniej. Zwróć uwagę, że obraz może wydawać się zniekształcony na lewej krawędzi, gdy skanowanie jest zbyt szybkie (patrz Rysunek 2).
4. Naciśnij przycisk Eucentric Focus (Ostrość eucentryczna), zwiększ powiększenie i popraw ostrość podczas skanowania. Wygodne jest korzystanie z lupy do ustawiania ostrości dostarczonej przez oprogramowanie mikroskopu.
5. Dostrój astygmatyzm kondensatora. Można to zrobić najdokładniej za pomocą metody Ronchigrama. Gdy wiązka znajduje się nad cienkim obszarem próbki, skup się na punkcie, w którym transmitowana wiązka wybucha, pomiędzy cieniami próbki po obu stronach. Następnie wyreguluj strojenie kondensatora, aby centralny dysk był okrągły. Wymaga to pewnej wprawy, zwłaszcza w przypadku próbek kriogenicznych.
   UWAGA: Alternatywą jest znalezienie cząsteczek złota (często używanych jako markery odniesienia do wyrównania w tomografii). Zwiększ powiększenie i skup się w górę iw dół, dostrajając astygmatyzm tak, aby cząstki pozostały okrągłe bez wydłużenia w żadnym kierunku.
6. Przejdź do trybu LM STEM i kontynuuj skanowanie, aby znaleźć interesujący obszar. W razie potrzeby dostosuj ustawienia B/C detektora (krok 1.13.3), mniej więcej w tym momencie.

3. Nagrywanie obrazu

1. Oszacuj dawkę do rejestrowania. Z reguły należy dążyć do 100-150 e^-/^{A 2} dla całego tomogramu. Należy sprawdzić tolerancję dawki dla każdej próbki. Prąd w amperach (A) podzielony przez ładunek na elektron reprezentuje liczbę e^-/s, którą mnoży się przez czas naświetlania, T, w sekundach i dzieli przez pole widzenia w A². Dla wygody wyraź prąd w nanoamperach (odczytywanych z ekranu), szerokość pola widzenia w mikrometrach, a czas naświetlania klatki w sekundach, z odpowiednimi współczynnikami:
   
   Liczbę tę należy pomnożyć przez liczbę pochyleń, aby uzyskać całkowitą ekspozycję w serii. Na przykład przy prądzie I = 0,04 nA, polu L = 4 μm i czasie naświetlania 12 s otrzymujemy 1,9 e^{-/Å 2} na pochylenie, czyli około 110 e^-/Ų dla serii 61 projekcji.
2. Przywróć stolik do otworu (lub schuj siatkę) i dostosuj prąd wiązki za pomocą rozmiaru plamki i/lub ustawień soczewki pistoletu, aby osiągnąć żądany prąd ekranu. Jeśli pomiar wskazuje 0, włóż większą aperturę C2, aby zwiększyć prąd. Następnie popraw dzieląc pomiar przez kwadrat stosunku średnic, a na koniec wróć do mniejszego otworu.
3. Dostosuj ustawienia B/C zgodnie z krokiem 1.13.3, a na koniec przywróć stolik do obszaru zainteresowania i ponownie sprawdź bezpośrednie wyrównanie i astygmatyzm w warunkach obrazowania.
4. Uzyskaj obraz testowy.

4. Tomografia z SerialEM

1. Uruchom serwer SerialEM na komputerze mikroskopu (SerialEM jest zwykle instalowany na innym). Następnie otwórz SerialEM. STEM pojawia się w SerialEM jak kamera, z tym samym interfejsem. Upewnij się, że komunikacja przebiega prawidłowo dla konfiguracji. Na przykład zakładka mikroskopu powinna wyświetlać prawidłowe powiększenie. Jeśli to nie zadziała, zatrzymaj się tutaj i rozwiąż problem.
2. Znajdź kartę kamery i skryptu, a następnie otwórz Konfiguracja. Upewnij się, że wybrano kamerę STEM, a dla każdego trybu wybierz odpowiednie czasy grupowania i zatrzymania. Upewnij się, że odpowiedni detektor (lub detektory) pojawia się w polu "kanały do pobrania" w lewym dolnym rogu. Naciśnij Acquire na dole, aby przetestować. Ponownie, nie kontynuuj, jeśli nic się nie dzieje lub jeśli wiązka nie zostanie usunięta. Zatrzymaj się i sprawdź komunikację.
   UWAGA: Tryby są używane w podobny sposób jak tomografia TEM. Binning to sztuczka zapewniająca kompatybilność z TEM. Ważnym parametrem jest liczba pikseli; Różne systemy mikroskopowe używają różnych kategoryzacji, aby osiągnąć tę samą liczbę.
   1. Wyświetlanie i wyszukiwanie powinno być szybkimi skanami ze stosunkowo niewielką liczbą pikseli (np. 512 x 512 pikseli w ciągu 1 s).
   2. Ostrość to na ogół mały obszar z szybkim nagrywaniem. Dlatego w trybie niskiej dawki wybierz Ostrość, aby mieć inne powiększenie niż tryb nagrywania, co może pomóc w dokładności. Pozostaw rozmiar plamki bez zmian.
   3. W trybie nagrywania użyj parametrów wybranych powyżej w szacowaniu ekspozycji. Jeśli to możliwe, wybierz także opcję Dynamiczne ustawianie ostrości, która koryguje ostrość linia po linii na pochylonym obrazie.
   4. Dla późniejszej wygody wybierz kategoryzację dla podglądu, która będzie identyczna z tą dla widoku (zobacz Ulepszenie #1, krok 5.5). Rozmiar obrazu (liczba pikseli) nie musi być taki sam.
   5. Użyj trybu próbnego, aby obszar rekordu był wyśrodkowany podczas pozyskiwania. Może być podobny do Widoku, ale należy pamiętać, aby po lewej stronie ramki nie było widocznych zniekształceń skanowania (zobacz Rysunek 2 dla przykładu). Ponownie, w trybie niskiej dawki, próba może mieć inne powiększenie niż w trybie nagrywania.
   6. Użyj trybu montażu natychmiast do skanowania siatki. Powinien być wystarczająco gęsty od pikseli, aby znaleźć obszary zainteresowania; Zalecana rozdzielczość: 512 x 512 lub 1024 x 1024. Upewnij się, że obraz jest dobry, z przyzwoitym zakresem dynamicznym (widocznym w kontrolkach wyświetlania obrazu), ponieważ ten tryb jest używany do znajdowania obszarów próbki.
   7. Zapisz plik ustawień, aby te opcje były zachowywane jako domyślne dla następnej sesji (co może nastąpić wkrótce w przypadku awarii programu).
3. Przetestuj kalibracje przesunięcia obrazu i przesunięcia stolika. W trybie mikrosondy (lub nanosondy) kliknij Wyświetl obraz, najedź na niego myszką, przytrzymaj przycisk i przeciągnij po przekątnej o około jedną czwartą pola widzenia. Następnie weź inny widok. Obrazy powinny idealnie na siebie nakładać. Powtórz tę czynność, ponownie przeciągając, trzymając wciśnięty Shift (aby wymusić ruch na scenie). Obrazy powinny dobrze się pokrywać, choć może mniej precyzyjnie.
4. Przejdź do trybu LM i przetestuj przesunięcie sceny. Jeśli te testy zakończą się niepowodzeniem, zatrzymaj się i rozwiąż problemy. Reszta nie zadziała.
5. Zrób mapę montażu LM całej siatki. Można to również zrobić w TEM.
   1. Przejdź do trybu STEM o najniższym powiększeniu, w którym obraz nie jest blokowany przez przysłony, zwykle około 185x.
   2. Kliknij menu Nawigator > Otwórz. Następnie kliknij menu Nawigator > Opcje nawigacji > usuń zaznaczenie opcji Konwertuj mapy na bajty.
   3. Wybierz menu Nawigator > Montaż i siatki > Skonfiguruj pełny montaż. Otworzy się menu. Opcje, które należy sprawdzić, to: Przesuń scenę zamiast przesuwania obrazu, Utwórz mapę z każdego montażu, jeśli Nawigator jest otwarty, oraz Użyj mapowania montażu, a nie Rejestruj parametry. Siatka obrazu powinna mieć wymiary około 6 x 6 lub 7 x 7. Poszukaj całkowitego obszaru, który ma zostać zarejestrowany. Jeśli wymaganych jest zbyt wiele obrazów, powiększenie może nie zostać poprawnie odczytane z mikroskopu (Rysunek 3). Zatrzymaj się i sprawdź.
   4. Aby rozpocząć pobieranie montażu, naciśnij przycisk Start w elementach sterujących montażem lub w obszarze Kamera i skrypt. Otworzy się kolejne menu, w którym można wybrać parametry pliku: mrc, przechowywać jako liczby całkowite, a w jeszcze innym oknie dialogowym wybrać nazwę pliku do przechowywania. Upewnij się, że przechowujesz dane w odpowiednim obszarze danych, a nie w ustawieniach użytkownika SerialEM. Zaleca się, aby nie przechowywać dużych ilości danych na dysku C, na którym znajduje się system.
   5. Po zakończeniu akwizycji montaż pojawi się w głównym oknie (Rysunek 4). Można teraz poruszać się po siatce za pomocą znacznika i punktów w Nawigatorze, tak jak w TEM.
6. Sprawdź ponownie korekcję astygmatyzmu. Zwykle wystarczy szybko zeskanować mały obszar i dostosować go wraz z ostrością, tak aby punktowe elementy, takie jak nanocząstki złota, pozostały całkowicie okrągłe, gdy przechodzą i tracą ostrość (jak w SEM) przy dużym powiększeniu. Bardziej konserwatywnie można powtórzyć bezpośrednie wyrównania kroków 1,5-1,8 przed ustaleniem astygmatyzmu.
7. Dopasuj obrazowanie w dużym powiększeniu do montażu LM.
   1. Przejdź do pozycji na montażu LM z łatwo rozpoznawalną funkcją. Dodaj punkt, kliknij okno Nawigatora > Dodaj punkty, a następnie kliknij obiekt. Naciśnij ponownie (przestań dodawać), aby dezaktywować.
   2. Zrób zdjęcie widokowe lub próbne przy najmniejszym powiększeniu dużego powiększenia (HM) i znajdź wskazany przedmiot. Umieść tam znacznik (zielony krzyżyk) i z odpowiednim punktem podświetlonym w oknie Nawigatora, w menu Nawigator > Shift do Marker..., w oknie dialogowym, które zostanie otwarte, wybierz Wszystkie mapy i Zapisz przesunięcie, jak pokazano w Rysunek 5.
   3. Przetestuj, przesuwając stolik w inne pozycje i sprawdzając, czy obraz HM jest wyśrodkowany w tych samych miejscach, które zostały wybrane w montażu LM. Jeśli funkcja nie jest widoczna na obrazie HM, przesunięcie między trybami LM i HM może być zbyt duże. W takim przypadku należy wykonać montaż wielokąta na większym obszarze. Kliknij okno Nawigatora > Dodaj wielokąt, wybierz kilka punktów, a następnie ponownie kliknij Dodaj wielokąt, aby zamknąć. Kliknij menu Nawigator > Montaż i siatki > Konfiguracja montażu wielokątów i Elementy sterujące montażem > Start. Następnie znajdź odpowiednie punkty, jak powyżej i kliknij Shift do znacznika....
8. Ustaw tryb niskiej dawki.
   1. Otwórz kartę Low Dose Control (Kontrola niskiej dawki) i zaznacz pole Low Dose Mode (Tryb niskiej dawki).
   2. Zaznacz opcję Ciągła aktualizacja i przejdź do pozycji Widok. Wybierz powiększenie mikroskopu dla tego trybu, zazwyczaj najmniejsze lub prawie najmniejsze. Wybierz każdy z kolejnych trybów i ustaw odpowiednie powiększenie. Nagrywanie powinno być ustawione tak, aby osiągnąć żądany rozmiar piksela, a powiększenie ostrości powinno być na tyle wysokie, aby znaczniki odniesienia lub inne funkcje o wysokim kontraście do ustawiania ostrości były wyraźnie rozdzielone. Następnie natychmiast odznacz opcję Ciągła aktualizacja.
      UWAGA: Tryb próbny może być ustawiony podobnie do Nagrywania, w którym to przypadku obszar śledzenia będzie musiał zostać przesunięty z obszaru nagrywania, aby zminimalizować ekspozycję, lub do małego powiększenia, obejmującego większość otoczenia.
   3. Wykonaj zdjęcie Wyświetl i ustaw pozycję Próba za pomocą opcji Zdefiniuj pozycję obszaru: Trial.
      UWAGA: Rekomendacja #1: Biorąc pod uwagę zmianę w próbkowanym obszarze i czasie, dodatkowa ekspozycja dla próby o niskiej jasności może być minimalna. Dopóki pasek siatki nie wchodzi w pole widzenia, ta metoda śledzenia jest zazwyczaj bardziej niezawodna. Zalecenie #2: Możliwa jest również aktualizacja rozmiaru plamki w celu dostosowania dawki do różnych trybów, takich jak Focus. Aby zapewnić stabilność ustawień optyki mikroskopu, zalecamy, aby tego nie robić, ale raczej pozostawić rozmiar plamki zgodnie z tym, co jest odpowiednie dla Nagrywania, a następnie, jeśli to konieczne, dostosować czas naświetlania w szybszych trybach skanowania.
   4. Kliknij zakładkę Low Dose Control > przejdź do: Rec., a następnie kliknij menu Nawigator > Otwórz stany obrazowania > Dodaj bieżący stan. Nadaj mu nazwę, aby można go było łatwo przywołać (np. μP STEM dla mikrosondy STEM). Dla różnych zadań mogą być zdefiniowane różne stany.
9. Przenieś stolik w miejsce interesujące dla tomografii (więcej informacji na temat korzystania z Nawigatora poniżej).
   1. Dodaj punkt w Nawigatorze, klikając okno Nawigator > Dodaj punkty.
   2. Dostosuj wysokość eucentryczną, wybierając opcję Zadania > Eucentryczność > Przybliżona. Okno Nawigatora > Aktualizacja Z.
   3. Ustaw obszary dla opcji Fokus i Próba. Najpierw zrób zdjęcie widoku. Następnie na karcie Low Dose Control (Kontrola niskiej dawki) w obszarze Define position of area (Definiuj położenie obszaru) wybierz opcję Focus (Ostrość) lub Trial (Próba). Dostosuj pozycje dla dwóch obszarów wzdłuż osi pochylenia. Fokus nie powinien nachodzić na obszar nagrywania.
      UWAGA: Należy pamiętać, że występuje pewne przeregulowanie, szczególnie przy lewej krawędzi, więc żadne z nich nie powinno znajdować się bezpośrednio w pobliżu obszaru nagrywania. Zakres przeregulowania można ocenić na obszarze testowym, wielokrotnie skanując przy powiększeniu Record, a następnie zmniejszając powiększenie, aby uzyskać szerszy widok.
10. Dla dobra miary (opcjonalnie z doświadczeniem) przechyl stół montażowy do +60°, a następnie -60°, za każdym razem wykonując obraz Widok lub Podgląd, aby upewnić się, że pasek siatki nie wchodzi w pole widzenia obszaru nagrywania pokazane na zielono.
11. Skonfiguruj serię pochylenia.
    1. Otwórz nowy plik, aby zapisać dane, klikając Plik > Otwórz nowy i wybierz nazwę pliku. Wybierz menu Tilt Series > Tilt Series Setup (Konfiguracja serii pochylania) (Rysunek 6). Rozwiązywanie problemów: Jeśli przycisk Otwórz nowy jest szary, sprawdź, czy poprzednia seria przechyłu została zakończona. Jeśli nie, zakończ pracę, klikając przycisk Tilt Series > Zakończ.
    2. Ustaw ekstremalne kąty nachylenia w polach Pochyl do i Zakończ na, zwykle odpowiednio -60° i +60°, a także przyrost, zwykle 2°.
    3. W przypadku trybu symetrycznego dawki (zalecane - upewnij się, że tryb niskiej dawki jest nadal aktywny), zaznacz opcję Uruchom serię w dwóch kierunkach od ___. Ślepa próba wynosi zwykle 0, ale może być używana do kompensacji wstępnie nachylonych lameli FIB (np. pod kątem 20°).
    4. Dla uproszczenia sprawdź Utrzymuj stały czas ekspozycji. Zmiana tego stanu rzeczy wymaga pewnego przerobienia obliczeń ekspozycji i może również zakłócać rekonstrukcje algebraiczne (np. ART/SART/SIRT), które porównują przewidywane intensywności z oryginalnymi danymi (patrz krok 7.1).
    5. Zaznacz opcję Pomiń autofokus. Mały kąt półzbieżności, taki jak 1 mrad, oznacza tak dużą głębię ostrości, że ustawianie ostrości może nie być konieczne. W ramach testu ustaw ostrość na 0°, przechyl do 60° lub -60° i naciśnij przycisk nagrywania. Utrzymanie ostrości to przede wszystkim kwestia precyzyjnej wysokości eucentrycznej. W przypadku większej zbieżności może być konieczne ustawienie ostrości podczas serii. W takim przypadku należy przyjrzeć się widokowi i na karcie Low Dose Control (Kontrola niskiej dawki) zdefiniować położenie obszaru i ostrości, a następnie dostosować obszar ostrości.
    6. Czynności początkowe i końcowe: Jeśli eucentryczna regulacja wysokości została wykonana dokładnie, nie ma potrzeby jej powtarzania. Usuń zaznaczenie opcji Zamknij zawory kolumny na końcu serii, chyba że istnieje dobry powód, aby tego nie robić.
    7. Do śledzenia parametrów sterowania istnieje wiele opcji. W przypadku nienadzorowanego zbierania danych najwyższym priorytetem jest uniknięcie zatrzymywania się programu w celu wprowadzenia danych przez użytkownika. Użyj zalecanych ustawień: powtórz Rekord, jeśli procent utraconych pól jest większy niż 5. Następnie śledź po i zaznacz opcję Wyrównaj z podglądem przed uzyskaniem nowego odniesienia do ścieżki i Uzyskaj nowe odniesienie do ścieżki, jeśli wyrównanie rekordu różni się o 2%. W przypadku nadzorowanego zbierania danych należy zastosować bardziej rygorystyczne parametry, aby uniknąć ryzyka utraty godzin czasu pracy urządzenia.
    8. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia, naciśnij GO u dołu okna. Na końcu wybierz Tilt Series > Endate.

5. Pobieranie partii w wielu punktach za pomocą Nawigatora (Ulepszenie #1)

UWAGA: Protokół jest prymitywny, ponieważ a) jest identyczny z TEM i b) dostępne są nowe narzędzia, które prawdopodobnie spowodują, że pełny opis stanie się przestarzały.

1. Załaduj pełny montaż siatki do okna głównego.
2. Wybierz kilka obszarów, które wyglądają obiecująco. Kliknij Dodaj punkty i dodaj do środka wybrane kwadraty siatki. Kliknij ponownie przycisk Dodaj punkty, aby wyłączyć ten tryb.
3. Przy włączonym stanie obrazowania niskiej dawki wybierz okno Nawigatora > zaznacz opcję Pobierz i otwórz nowy plik w elemencie dla każdego z wybranych kwadratów. W pierwszym przypadku otworzy się okno dialogowe z właściwościami pliku (Rysunek 7), a następnie nazwą pliku. Wybierz Obrazy montażowe, a następnie w oknie dialogowym Ustawienia montażu (Rysunek 8) zaznacz opcję Użyj parametrów widoku w trybie niskiej dawki i ustaw siatkę wystarczająco dużą, aby pokryć kwadrat (około 100 x 100 μm).
4. Kliknij menu Nawigator > Znajdź na pozycjach i wybierz parametry do mapowania. Co najważniejsze, w sekcji Działania podstawowe zaznacz opcję Utwórz mapę nawigatora, a następnie Przybliżona eucentryczność i Dokładna eucentryczność, a następnie naciśnij Go (Rysunek 9). W przypadku siatki 200 punktów wyniknie mapa składająca się z grubsza z całego kwadratu (Rysunek 10)
5. Przygotuj się do wyboru pozycji tomogramu. Otwórz nowy plik, klikając Plik > Otwórz nowy. Nadaj mu nazwę pliku (np. AnchorMaps.mrc).
   1. Gdy aktywny jest tryb Low Dose, wprowadź ustawienia Camera & Script > Setup i upewnij się, że Widok i Podgląd są w tym samym binowaniu (w przeciwnym razie nie można ich zapisać w tym samym pliku).
   2. Odwiedź punkty na kwadratowych mapach, klikając Okno Nawigatora > Przejdź do XYZ.
   3. Wybierz pozycję dla pierwszego tomogramu ze znacznikiem. Zrób obraz podglądu i doprecyzuj pozycję, przeciągając prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz Okno nawigatora > Nowa mapa i kliknij tak, aby zapisać opcję. Następnie zrób zdjęcie widoku tego samego obszaru i ponownie zapisz je jako nową mapę. Upewnij się, że opcja Wyświetl mapę jest podświetlona i sprawdź stan zakotwiczenia w oknie Nawigatora w prawym górnym rogu.
   4. Wybierz drugą pozycję, ponownie wykonaj Podgląd i doprecyzuj lokalizację jak powyżej, a następnie tym razem naciśnij Anchor Map w oknie Nawigatora. Spowoduje to zapisanie zarówno Podglądu, jak i Widoku jako nowych map w Nawigatorze.
   5. Powtórz krok 5.5.4 dla wszystkich żądanych lokalizacji. Przejdź z jednego kwadratu siatki do drugiego, zaznaczając punkt i naciskając przycisk Przejdź do XYZ w oknie Nawigatora.
6. Aby ustawić ostrość referencyjną, wybierz wyraźny obszar siatki i ostrożnie ustaw ostrość, ręcznie lub za pomocą autofokusa. Naciśnij przycisk Resetuj rozmycie na panelu mikroskopu. Utwórz skrypt w SerialEM, klikając Skrypt > Edytuj > Edytuj 15 (lub inny wolny numer) i wprowadź dwa wiersze: ScriptName SetDefocus i SetDefocus 0.
7. W oknie Nawigatora wyróżnij pierwszą lokalizację (Podgląd lub Widok). Naciśnij Shift-T, a następnie podświetl ostatnią lokalizację i ponownie naciśnij Shift-T. Otworzy się okno dialogowe Właściwości pliku. Wybierz obrazy i parametry pojedynczej klatki do zapisania, w tym nazwę pliku. Edytuj nazwę pliku, ale pozostaw etykietę elementu na końcu.
   UWAGA: Nazwy plików kończące się cyframi będą aktualizowane automatycznie dla kolejnych serii pochylenia. Wygodnie jest skorzystać z menu Nawigator > Opcje nawigacji. > Użyj etykiet elementów w nazwach plików.
8. Następnie automatycznie otworzy się menu ustawień serii Tilt. Wypełnij jak poprzednio (Rysunek 6), ale nie wybieraj opcji Uściślij eucentryczność. Punkty podglądu w Nawigatorze będą teraz oznaczone jako TS. Do tego menu można powrócić za pomocą przycisku w oknie Nawigatora nad listą elementów.
9. Wybierz menu Nawigator > opcję Zdobądź na elementach. Tym razem wybierz parametry dla Dane końcowe. Wybierz Akcja podstawowa: Zdobądź serię pochylenia i wybierz Zarządzaj Dewarsem/Próżnią, Wyrównaj do elementu, Fine Eucentricity i Uruchom skrypt przed działaniem, z Script, aby uruchomić: SetDefocus. Wybierz opcje ogólne: brak komunikatu w przypadku wystąpienia błędu i zamknięcie zaworów kolumny na końcu, a następnie naciśnij GO (Rysunek 11). SerialEM odwiedzi teraz wszystkie mapy Anchor i zarejestruje serię przechyłów w każdej pozycji (Rysunek 12).

6. Rejestracja mapy CLEM (Ulepszenie #2)

1. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, załaduj pełny montaż siatki do okna głównego, a następnie utwórz nowe okno, klikając Okno > Nowe okno i nadaj mu nazwę. Zwróć uwagę, że pełny montaż siatki pojawia się w Rejestracja 1.
2. Zaimportuj obraz mapy CLEM, klikając menu Nawigator > Importuj mapę. Powinien on trafić do Rejestracji 2. Można go również przypisać do nowego okna, jak wyżej.
3. Sprawdź mapę CLEM, aby określić względny obrót w odniesieniu do pełnego montażu siatki. Najłatwiej jest to zrobić na mapie, na której pojawiają się paski siatki. Należy pamiętać, że mapa może być również odwrócona. Wyrównaj go z grubsza za pomocą menu Nawigator > Obróć mapę, w razie potrzeby z odwróć.
   UWAGA: Następny krok może również pomieścić odwrócenie, ale zrobienie tego z wyprzedzeniem znacznie ułatwia wykonanie następujących czynności. Ten krok można powtarzać, aż wyrównanie będzie wyglądało zadowalająco, ale nie jest konieczne bycie precyzyjnym.
4. Wprowadź punkty mocowania w celu precyzyjnego wyrównania. Umieść kilka odpowiadających sobie punktów w jednym, a następnie w drugim oknie. Dla każdego takiego punktu zaznacz Punkt rejestracji na samej górze okna Nawigatora. Odpowiednie punkty zostaną oznaczone rosnącym indeksem, a następnie R1 lub R2 odpowiednio dla montażu siatki lub zaimportowanej mapy.
   UWAGA: Korzystanie z siatek szukacza sprawia, że ten krok jest bardzo prosty. W przeciwnym razie należy wybrać elementy bryły, takie jak znacznik środkowy lub narożniki kwadratów siatki. W zasadzie trzy punkty wystarczą do surowego wyrównania, ale więcej punktów pomaga zrekompensować drobne niedopasowania w konstrukcjach montażowych.
5. Jeśli wymaganych jest kilka kanałów mapy CLEM, na przykład różne kolory fluorescencyjne lub fluorescencja bez jasnego tła pola, zaimportuj je jak w kroku 6.2 powyżej i zmień rejestracje na 2. W ten sposób odziedziczą punkty rejestracji z pierwszej mapy.
6. Nałożenie opcji Rejestracja za pomocą menu Nawigatora > opcji Przekształć elementy. Odpowiednie punkty rejestracji pojawią się teraz na wszystkich mapach, które będą wymienione w Rejestracji 1. Aby wyrównać wizualnie, kliknij menu Nawigator > Obróć mapę. Należy pamiętać, że gdy mapa jest wczytywana z okna Nawigatora, nie jest automatycznie obracana, chyba że jest zaznaczone pole Obróć podczas ładowania. Zawsze można go obrócić z poziomu okna Nawigatora.
7. Teraz powinno być możliwe umieszczenie znacznika lub punktu na mapie fluorescencji i przesunięcie stolika w odpowiednie miejsce na siatce (Rysunek 13).

7. 3D rekonstrukcja

1. Obejmuje to te same podstawowe kroki, co tomografia TEM: wyrównanie serii wychylenia, a następnie zazwyczaj projekcję wsteczną. Dostępnych jest kilka platform programowych, a dane mogą być traktowane podobnie jak dane TEM, z wyjątkiem tego, że korekta CTF powinna zostać pominięta.
2. Zastosuj normalizacje intensywności, aby zwiększyć udział projekcji wysokiego nachylenia lub zrównoważyć zmianę oświetlenia podczas serii, z zastrzeżeniem, że ma to wpływ na informacje ilościowe. IMOD²⁶ działa dobrze, na przykład, podczas gdy AreTomo²⁷ jest bardzo przydatny do wyrównania bez odniesienia; tam, gdzie obecne są cząstki odniesienia, ClusterAlign²⁸ może podążać za nimi jako klastry, a nie pojedyncze miejsca; Jest to szczególnie przydatne w przypadku danych STEM, w których plamy mogą zostać utracone lub ukryte przez elementy o wysokim kontraście.
3. Śledź rekonstrukcję za pomocą dekonwolucji 3D²⁹ w celu wzmocnienia kontrastu i odszumienia. Po zrekonstruowaniu należy przedstawić dane objętościowe STEM za pomocą dowolnej ze standardowych metod, takich jak ortoplasty lub segmentacja izopowierzchni. Warto zauważyć, że rozkład intensywności jest jednobiegunowy, bez inwersji kontrastu lub prążków Fouriera, które pojawiają się w konwencjonalnym TEM z kontrastem fazowym. Ciekawym sposobem reprezentacji tomogramów STEM jest odwrócenie jasnego pola (Rysunek 14). Efekt jest taki, że "rentgenowskie oczy" widzą gęste obiekty zainteresowania przez oczyszczone cell³⁰.

Pełny montaż siatki przygotowany w STEM pokazuje obszary z interesującymi komórkami (Rysunek 4). Zwróć uwagę, że obraz znajduje się w ciemnym polu, więc puste wydają się ciemne. Komórki wydają się częściowo jasne, a elektrony są rozpraszane w kierunku detektora HAADF. W najgrubszych miejscach, zazwyczaj w środku lub w pobliżu pasków siatki, kontrast ponownie ciemnieje. Wynika to z wielokrotnego rozpraszania, w wyniku którego elektrony osiągają kąty nieuchwycone przez detektor. W praktyce obszary te będą zbyt grube dla tomografii.

Następnym etapem są mapy o średnim powiększeniu (Rysunek 10). Są one często nazywane mapami średniego montażu lub mapami kwadratowymi, odnoszącymi się do kwadratów siatki, a nie do kształtu. Nawet w najniższym trybie STEM mikrosondy będą one również pozyskiwane jako obrazy montażowe. Kliknięcie elementu w oknie Nawigatora powoduje wczytanie obrazu mapy do okna głównego. W tym obszarze wybierane są konkretne punkty do nabycia tomogramu. Użyj trybu podglądu, aby zlokalizować obszar przy powiększeniu nagrywania. Należy pamiętać, że w zależności od szybkości skanowania może wystąpić boczne przesunięcie między podglądem a nagrywaniem. W tym miejscu można zarejestrować pojedynczą serię przechyłu. Na przykład mitochondria mogą być często identyfikowane na obrazie podglądu i zapisu (Rysunek 12).

W przypadku tomografii wsadowej, stolik będzie przemieszczał się po siatce i może nie powrócić dokładnie do tego samego miejsca. Mapy kotwic są używane w celu zapewnienia, że żądane obszary zapisu są ponownie niezawodnie identyfikowane poprzez dopasowanie obrazu podglądu do widoku o mniejszym powiększeniu, nawet jeśli ruch stołu montażowego uległ przesunięciu. PyEM23,24 oferuje szybszą alternatywę, która jest z pewnością zalecana, ale nie jest jeszcze częścią standardowej instalacji.

W podejściu CLEM, mapa fluorescencyjna może być użyta do identyfikacji obszarów zainteresowania dla tomografii. Fluorescencja jest pozyskiwana zewnętrznie i musi być zarejestrowana w pełnym montażu siatki. Przydatne jest, aby paski siatki i otwory były widoczne, więc przed importem można przygotować połączony kompozyt fluorescencja + jasne pole, na przykład w oprogramowaniu GIMP (https://www.gimp.org) lub ImageJ31 (należy pamiętać, aby ImageJ odwrócił oś pionową). Gdy zakres dynamiczny fluorescencji jest duży, stworzenie takiego połączenia bez nasycenia może być trudne. W takim przypadku obie mapy mogą zostać zaimportowane oddzielnie, a następnie zarejestrowane razem zgodnie z opisem (Rysunek 13). W ten sposób punkt na mapie fluorescencji w oknie Nawigatora, po którym następuje napis "Go To XY", przenosi stolik do odpowiedniej pozycji na siatce, tak jak jest on zamontowany w TEM. Zadbaj o to, aby drobne niespójności w tworzeniu montażu (lub mapy fluorescencyjnej, jeśli to też jest montaż) prowadziły do małych przemieszczeń; Dlatego, aby uzyskać optymalną precyzję, fluorescencja powinna zostać ponownie zarejestrowana specjalnie na mapie kwadratowej. Często wystarcza wykonanie tej rejestracji wzrokowej, na podstawie otworów w folii nośnej lub cech wspólnych z obrazem światła jasnego pola.

Rekonstrukcja serii pochyleń daje w wyniku objętość 3D (Rysunek 14). Ten przykład ma rozmiar piksela 2,042 nm, co daje pole widzenia ~4 μm. Złoża fosforanu wapnia (pomarańczowe groty strzałek) wyróżniają się wyższą liczbą atomową w porównaniu z otoczeniem. Mikrotubule (czerwone groty strzałek) można śledzić w całym polu widzenia. Również wewnętrzne i zewnętrzne błony mitochondrialne (zielone groty strzałek) są wyraźnie widoczne. Aktynę można zaobserwować w postaci wiązek lub pojedynczych włókien. Aby uzyskać bardziej izotropową rozdzielczość, rekonstrukcję można przetworzyć przez dekonwolucję.

Rysunek 1: Porównanie TEM i STEM. W TEM pole widzenia jest oświetlane prawie równoległą wiązką, a soczewka obiektywu tworzy powiększony obraz na kamerze. W przypadku cryo-TEM apertura obiektywu jest otwierana w celu przejścia przez rozproszone fale elektronowe (przerywana czerwona linia), które przy rozogniskowaniu wytwarzają kontrast fazowy poprzez interferencję z falami nierozproszonymi (zielonymi). Z drugiej strony STEM rastruje skupioną wiązkę w poprzek próbki i zbiera rozproszone elektrony w sposób piksel po pikselu. Wiele detektorów może zbierać elektrony rozproszone pod różnymi kątami. Ten rysunek został zmodyfikowany z30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład zniekształcenia obrazu po lewej stronie z powodu dużej szybkości skanowania. Zwróć uwagę na zniekształcenia oznaczone żółtymi grotami strzałek, a także na zniekształcone owalne otwory w Quantifoil. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Okno dialogowe konfiguracji montażu dla całego montażu siatki. Wybierz powiększenie i liczbę elementów w X i Y, aby całkowity obszar osiągnął około 2,000 μm, aby uzyskać mapę dla większości siatki. Wybierz także Przesuń scenę zamiast przesuwania obrazu i Użyj mapowania montażu, a nie Nagraj parametry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Pełna mapa GridMap w małym powiększeniu nagrana w trybie STEM. Przerwane obszary są całkowicie czarne na obrazie w ciemnym polu. Ciemnoszare obszary są prawdopodobnie zbyt grube i słabo zeszklone. Dobrymi obszarami kandydującymi do tomografii są białe lub jasnoszare w tym skanie. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przejście do procesu znacznika. Rozpoznawalny obiekt jest oznaczony na mapie o niskiej rozdzielczości za pomocą opcji Dodaj punkty (38 na tym obrazie). Zwróć uwagę na przesunięcie między mapą o niskiej rozdzielczości (zielone kółko) a mapą o średniej rozdzielczości (pomarańczowe kółko). Następnie obiekt jest oznaczany znacznikiem (zielony krzyżyk, czerwone kółko) i uruchamiane jest okno dialogowe Shift to Marker. Wybrana opcja przesuwa wszystkie mapy z prędkością 245x o tę samą wartość. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Okno dialogowe konfiguracji serii tilt dla serii tilt STEM. Schemat symetryczny dawki jest stosowany od -60° do +60° w krokach co 2°. Autofokus jest pomijany ze względu na dużą głębię ostrości podczas korzystania z niskiego kąta zbieżności. Nie ma potrzeby udoskonalania eucentryczności, ponieważ robiono to już wcześniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Okno dialogowe właściwości pliku dla map o średniej rozdzielczości. Zapisz jako plik stosu MRC, wybierz liczby całkowite i zapisz dodatkowe informacje w pliku metadanych .mdoc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Okno dialogowe konfiguracji montażu do zapisywania map o średniej rozdzielczości. W przypadku kwadratu na siatce o oczkach 200 i szerokości 90 μm zalecana jest całkowita powierzchnia co najmniej 90 μm x 90 μm. Wybierz opcję Przesuń scenę zamiast przesuwania obrazu i użyj parametrów widoku w trybie niskiej dawki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Nagrywanie mapy o średniej rozdzielczości. Okno dialogowe Zdobądź w Items do nagrywania map o średniej rozdzielczości. Wybierz Mapowanie, Pobierz i zapisz obraz lub montaż, a następnie zaznacz opcję Utwórz mapę nawigatora. W obszarze Zadania przed lub po obszarze Podstawowe wybierz opcję Przybliżona i dokładna eucentryczność. W przypadku braku pomocy opcjonalnie wybierz opcję Brak okna komunikatu, gdy wystąpi błąd i Zamknij zawory kolumny na końcu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Obraz mapy o średniej rozdzielczości. Mapa o średniej rozdzielczości (Square Map) nagrana w trybie STEM przez montaż 3 x 3. Dwie mapy kotwic o średniej rozdzielczości do zbierania danych są oznaczone niebieskimi kwadratami. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Dane serii przechylania partii. Zdobądź w oknie dialogowym Przedmioty do zbierania serii pochylania partii. W przypadku zbierania danych serii pochylenia wybierz Dane końcowe i Uzyskaj serię pochylenia. W sekcji Zadania przed lub po trybie podstawowym zaznacz opcję Zarządzaj Dewarem/Próżnią (wybierz odpowiednie ustawienia w menu Ustawienia), Wyrównaj do elementu, Dokładna eucentryczność i Uruchom skrypt przed działaniem. W opcjach ogólnych zaznacz pole Brak komunikatu w przypadku wystąpienia błędu i Zamknij zawory kolumny na końcu (patrz 5.14). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Nachylenie 0° serii nachylenia STEM mitochondrium. Pomarańczowe groty strzałek wskazują na złoża fosforanu wapnia (granulki matrycy), zielone groty na cristae, a czerwone groty na złote znaczniki referencyjne 15 nm. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Zarejestrowane mapy cryo-CLEM. (A) Mapa STEM o średniej rozdzielczości (mapa kwadratowa, 26-A) jest zarejestrowana na (B) mapie STEM o niskiej rozdzielczości, (C) mapie krio-FM kanału BF i (D) mapie krio-FM kanału GFP. Dziewięć punktów rejestracji (etykiety 4-21) jest pokazanych w Nawigatorze (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Renderowanie objętościowe. Oddawanie objętościowe odcinków o grubości (A) 60 nm i A (B) 40 nm przez podobny do SIRT (30 cykli) filtrowany tomogram na różnych głębokościach. Rozmiar piksela wynosi 2,048 nm, co daje pole widzenia około 4 μm. Proszę zwrócić uwagę na odwróconą gęstość w porównaniu do Rysunek 12, co oznacza, że obiekty o wysokiej intensywności są jasne. Pomarańczowe, białe, czerwone, zielone i jasnoniebieskie groty strzałek wskazują odpowiednio na złoża fosforanu wapnia, rybosomy, mikrotubule, wewnętrzną i zewnętrzną błonę mitochondrialną oraz włókna aktynowe. Podziałka = 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.