Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Podsumowanie

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Streszczenie

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM) opiera się na obrazowaniu próbek biologicznych lub organicznych zanurzonych w ich naturalnym środowisku wodnym; woda jest zestalana w szklance (tj. zeszklona) bez krystalizacji. Metoda cryo-EM jest ostatnio szeroko stosowana do określania struktury makrocząsteczek biologicznych w rozdzielczości bliskiej atomowi. Podejście to zostało rozszerzone na badanie organelli i komórek za pomocą tomografii, ale konwencjonalny tryb obrazowania EM w transmisyjnym polu widzenia ma poważne ograniczenie grubości próbki. Doprowadziło to do praktyki frezowania cienkich lameli za pomocą skupionej wiązki jonów; Wysoką rozdzielczość uzyskuje się poprzez uśrednianie subtomogramu z rekonstrukcji, ale trójwymiarowe relacje poza pozostałą warstwą są tracone. Ograniczenie grubości można obejść poprzez obrazowanie za pomocą skanowanej sondy, podobnie jak w przypadku skaningowego EM lub konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Podczas gdy skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM) w materiałoznawstwie zapewnia rozdzielczość atomową pojedynczych obrazów, wrażliwość kriogenicznych próbek biologicznych na promieniowanie elektronowe wymaga szczególnych rozważań. Protokół ten przedstawia konfigurację do kriotomografii z wykorzystaniem STEM. Podstawowa konfiguracja miejscowa mikroskopu jest opisana zarówno dla systemów dwu-, jak i trzykondensatorowych, podczas gdy automatyzację zapewnia niekomercyjne oprogramowanie SerialEM. Opisano również ulepszenia w zakresie akwizycji wsadowej i wyrównania korelacyjnego z poprzednio uzyskanymi mapami fluorescencji. Jako przykład pokazujemy rekonstrukcję mitochondrium, wskazując błonę wewnętrzną i zewnętrzną oraz granulki fosforanu wapnia, a także otaczające mikrotubule, włókna aktynowe i rybosomy. Tomografia krio-STEM doskonale sprawdza się w odkrywaniu teatru organelli w cytoplazmie, a w niektórych przypadkach nawet na obrzeżach jądra przylegających komórek w hodowli.

Wprowadzenie

Trójwymiarowa (3D) wizualizacja organelli jest najważniejszym zadaniem w nowoczesnej biologii komórki. Biorąc pod uwagę stosowane skale, od dziesiątek nanometrów w przypadku pęcherzyków wydzielniczych do wielu mikronów w jądrze komórkowym, trudno jest znaleźć jedną technikę mikroskopii, która pasowałaby do wszystkich zastosowań. Podczas gdy współczesna mikroskopia fluorescencyjna może objąć większość zakresu pod względem rozdzielczości, pojawiają się tylko znakowane cząsteczki. Teatr komórkowy pozostaje domeną mikroskopii elektronowej. Konwencjonalne metody chemicznego utrwalania, zatapiania tworzyw sztucznych i barwienia metalami ciężkimi są silnie inwazyjne, więc wyniki mogą zależeć od szczegółów przygotowania próbki. Z drugiej strony Cryo-EM jest ograniczony przez konieczność zeszklenia środowiska wodnego; Kryształki lodu, które się tworzą, załamują oświetlenie elektronowe, powodując artefakty kontrastu o wyższym kontraście niż materiał organiczny będący przedmiotem zainteresowania.

W ciągu ostatniej dekady nastąpił wzrost ilości technik obrazowania elektromagnetycznego opracowanych lub dostosowanych do badań komórkowych¹. Zamrażanie wysokociśnieniowe w połączeniu z iteracyjnym frezowaniem wiązką jonów (FIB) i seryjnym obrazowaniem powierzchni przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (tj. FIB-SEM) jest obecnie metodą z wyboru dla dużych próbek². Kriogeniczna miękka tomografia rentgenowska (cryo-SXT) jest odpowiednia dla próbek o wielkości kilku mikronów, ograniczonych charakterystyczną długością absorpcji miękkiego promieniowania rentgenowskiego w wodzie^3,4,5. Skala ta obejmuje wiele nienaruszonych typów komórek, a ilościowy charakter kontrastu absorpcji promieniowania rentgenowskiego dodaje aspekt pomiaru stężenia⁶ lub spektroskopia⁷. W połączeniu z uśrednianiem subtomogramowym, kriotransmisyjna tomografia elektronowa (cryo-ET), oparta na mikroskopii elektronowej transmisyjnej z kontrastem fazowym (TEM), oferuje najwyższą rozdzielczość dla makrocząsteczek lub kompleksów^8,9^,10. Jednak rzadko zdarza się, aby nienaruszone organelle były tak regularne, że można je uśrednić w całości. Co więcej, konwencjonalny tryb szerokokątnego TEM jest ograniczony dla grubości próbki do kilkuset nanometrów przez połączenie nieelastycznego rozpraszania (obejmującego utratę energii) w próbce i aberracji chromatycznej w magnetycznej soczewce obiektywu^11,12. Duże rozproszenie energii wymusza użycie filtra energetycznego w celu usunięcia powstałego nieostrego zamglenia, ale czuła próbka nadal ulega uszkodzeniom spowodowanym promieniowaniem, podczas gdy sygnał obrazu staje się wykładniczo słabszy wraz ze wzrostem grubości.

Alternatywny tryb obrazowania, skanowanie transmisji EM (STEM), omija potrzebę filtrowania energii i zachowuje nieelastycznie rozproszone elektrony do tworzenia obrazu, choć obecnie w niższej rozdzielczości niż dla tomografii TEM (Rysunek 1). W rzeczywistości nie powstaje żaden prawdziwy obraz. Zamiast tego, podobnie jak w skanowaniu EM, pomiary są wykonywane punkt po punkcie, a obraz jest montowany przez komputer. Powiększenie zależy tylko od wielkości kroków skanowania bez zmiany prądów obiektywu. Przy prawidłowym skonfigurowaniu użyteczny zakres grubości próbki do tomografii krio-STEM (CSTET) może osiągnąć 1,5 lub nawet 2 μm, chociaż strefa komfortu, w której użyteczne natężenie sygnału pozostaje znaczną częścią oświetlenia, wynosi około 600-900 nm^11,13. To wystarczy, aby zobaczyć dużą część cytoplazmy, a czasami krawędź jądra komórkowego. W praktyce okazuje się, że witryfikacja standardową metodą zanurzania w płynie kriogenicznym nakłada poważniejsze ograniczenie grubości niż obrazowanie STEM. Celem tego artykułu wideo jest ułatwienie włączenia CSTET do skrzynki narzędziowej do obrazowania komórek i organelli w laboratoriach badawczych i placówkach mikroskopowych.

Pierwszym wyzwaniem jest to, że operacje mikroskopowe w CSTET nie są jeszcze ustandaryzowane dla zastosowań w naukach przyrodniczych w taki sposób, jak były dla tomografii krio-TEM. Sprzęt STEM rzadko (jeśli w ogóle) był kierowany na rynek krio-EM. Jednak wraz z najnowszą generacją mikroskopów zmienia się to i wiele istniejących narzędzi można doposażyć. STEM jako technika wystartowała i w dużej mierze przejęła kontrolę nad materiałoznawstwem, gdzie rośnie również zainteresowanie metodami kriogenicznymi i niskodawkowymi^14,15. Literatura materiałoznawcza obfituje w akronimy BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM itp., które przyczyniają się do zamieszania. Proponujemy tutaj zalecany punkt wyjścia, który, zgodnie z naszym zbiorowym doświadczeniem w Instytucie Naukowym Weizmanna, zapewnia najbardziej ogólny protokół dla użytecznych wyników opartych na obrazowaniu STEM w jasnym polu (BF)¹⁶. W żaden sposób nie wyczerpuje ani nawet nie eksploruje wachlarza możliwości, ale posłuży jako podstawa do dalszych ulepszeń. Chociaż kładziemy nacisk na cryo-STEM, większość protokołu jest równie istotna dla tomografii STEM w temperaturze pokojowej sekcji osadzonych w tworzywie sztucznym.

Istotą STEM jest skanowanie próbki za pomocą skupionej sondy elektronowej (Rysunek 1), stożka iluminacyjnego, oraz rejestrowanie sygnałów z płaszczyzny dyfrakcyjnej (rozpraszającej) podczas transmisji, piksel po pikselu, w celu wytworzenia obrazów 2D^17,18. Próbki amorficzne, w tym większość materiałów komórkowych, będą wytwarzać rozproszony wzór rozpraszania podczas transmisji. Najprostszą praktyczną konfiguracją STEM jest umieszczenie okrągłego detektora do rejestrowania centralnego dysku (tj. oświetlenia sondy, które byłoby transmitowane bez próbki). Próbka rozprasza elektrony z dala od tego stożka oświetleniowego do tego stopnia, że sygnał maleje. W ten sposób powstaje obraz BF - próbka wydaje się ciemna na jasnym tle. Detektor pierścieniowy może być również (lub zamiast) używany do wykrywania rozpraszania od próbki poza stożkiem oświetleniowym. Po usunięciu próbki nie ma sygnału. Gdy próbka jest na miejscu, obiekty wydają się jasne na ciemnym tle na obrazie w ciemnym polu (DF). Nomenklatura STEM (BF, pierścieniowe ciemne pole [ADF], pierścieniowe ciemne pole o wysokim kącie [HAADF] itp.) odnosi się głównie do zakresów kątów zbierania dla detektorów.

Kąt zbieżności oświetlenia stanowi istotną adaptację STEM do tomografii komórkowej. Gdy najwyższym priorytetem jest wysoka rozdzielczość, kąt zbieżności powinien być jak największy. (Jest to podobne do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej; rozdzielczość zależy od średnicy sondy, która skaluje się jako długość fali podzielona przez aperturę numeryczną. Zauważ, że dla EM, odnosimy się do kąta połówkowego lub półzbieżności). Z drugiej strony, gdy priorytetem jest głębia ostrości, kompromis w rozdzielczości daje ogromną przewagę, ponieważ skupiona wiązka pozostaje mniej więcej równoległa na odległość równą dwukrotności długości fali podzielonej przez półkąt do kwadratu. Idealnie byłoby, gdyby cała wolumin komórki pozostał w fokusie¹⁹. Na przykład przy 300 keV długość fali elektronu deBroglie'a wynosi 0,002 nm, więc zbieżność 1 mrad daje rozdzielczość 2 nm i głębię ostrości 4 mikrony. W tych warunkach tomografia może być wykonywana nawet bez ustawiania ostrości podczas procesu zbierania danych, ale tylko raz na początku akwizycji. Konwencjonalny STEM zdolny do tomografii może osiągnąć kąt półzbieżności 7 lub 8 mrad; W związku z tym w zasadzie moglibyśmy osiągnąć rozdzielczość rzędu 0,25 nm, ale wtedy o głębokości ogniskowej wynoszącej zaledwie 62 nm. Jest ona zdecydowanie zbyt cienka do obrazowania komórkowego. Bardziej zaawansowane mikroskopy z trzema soczewkami kondensatorowymi oferują ciągłą regulację kąta półzbieżności w znacznym zakresie. W bardziej tradycyjnej konfiguracji z dwoma kondensatorami zbieżność jest ustalana dyskretnie przez otwór kondensatora (C2).

Dla solidnych, osadzonych w plastiku próbek, można zarejestrować serię ogniskowych przy każdym nachyleniu i połączyć je w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości²⁰, ale dla próbek kriogenicznych budżet promieniowania jest zbyt mocno ograniczony. Wreszcie, rozważając zalety obrazowania BF lub DF, w przypadku grubych próbek, należy wziąć pod uwagę skutki wielokrotnego elastycznego rozpraszania w próbce. Sygnał BF jest mniej zniekształcony przez wielokrotne rozpraszanie i wykazuje wyższą rozdzielczość dla grubych próbek^16,21.

Przydatną zasadą było ustawienie kątów zbierania kilkakrotnie większych niż zbieżność. Im grubsza próbka, tym większy powinien być krążek zbiorczy. Zbyt mały dysk zapewni niską intensywność sygnału; Zbyt duży dysk spowoduje słaby kontrast obrazu, ponieważ przyczyni się do tego tylko rozpraszanie pod najwyższym kątem. Kąty pobierania powinny być zoptymalizowane dla danej próbki. Kąty detektora w funkcji długości kamery (dyfrakcyjnej) muszą być kalibrowane niezależnie. Mogą być one wygodnie wyświetlane przez oprogramowanie mikroskopu. W praktyce współczynnik od dwóch do pięciu w stosunku półkątów zbierania do oświetlenia, odpowiednio θ do α (Rysunek 1), jest zalecanym punktem wyjścia dla CSTET próbek komórkowych.

Poniższy protokół opisuje działanie tomografii STEM przy użyciu popularnego oprogramowania SerialEM do sterowania mikroskopem^22,23. SerialEM nie jest powiązany z konkretnym producentem i jest szeroko stosowany w tomografii TEM. Większość czynności związanych z przygotowaniem do tomografii można przenieść bezpośrednio z TEM. Strategia SerialEM polega na modelowaniu systemu skanowania jako kamery. Umożliwia to proste przejście z TEM na STEM. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak powiększenie i binning są całkowicie sztuczne. Ważnymi parametrami są pole widzenia w mikronach, liczba pikseli w polu widzenia oraz czas naświetlania. Odstępy między pikselami lub próbkowanie to pole liniowe podzielone przez liczbę pikseli, podczas gdy czas przebywania to liczba pikseli podzielona przez czas ekspozycji.

Minimalna konfiguracja dla STEM i CSTET obejmuje trzy funkcje mikroskopu: generator skanów, detektor STEM i oprogramowanie sterujące tomografią. Protokół odnosi się do nomenklatury FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), ale pojęcia są ogólne. Własnościowe oprogramowanie TFS zostało opisane w JoVE dla TEM²⁴, a operacja STEM jest bardzo podobna.

Zakładamy, że mikroskop został wcześniej ustawiony przez zespół serwisowy lub doświadczony personel i że wyrównanie kolumny można wywołać poprzez wczytanie pliku. Drobne korekty nazywane są wyrównaniem bezpośrednim i mogą być przechowywane w tak zwanych rejestrach FEG (mikroskopy TFS). Wyrównania bezpośrednie obejmują środek obrotu, punkty obrotu, wyrównanie dyfrakcji i kompensację astygmatyzmu kondensatora. Korekty muszą być wykonywane iteracyjnie. Należy pamiętać, że mikroskopy TFS implementują odrębne tryby nanosondy (nP) i mikrosondy (μP); dla danej apertury kondensatora zapewniają one stosunkowo wąskie lub szerokie pole widzenia z równoległym oświetleniem w TEM i mniej lub bardziej zbieżną (ściśle zogniskowaną) wiązką elektronów w STEM, odpowiednio. Inni producenci stosują różne schematy, aby objąć zakres kątów zbieżności.

Przed rozpoczęciem należy wybrać pole widzenia, L, oraz próbkowanie (szerokość pikseli), l, w zależności od badanej próbki. Na przykład dla l = 1 nm/piksel należy wybrać obraz o wymiarach 4 000 x 4 000 pikseli, który pokryje pole widzenia 4 μm². Rozdzielczość będzie w najlepszym razie dwukrotnie większa niż próbkowanie przestrzenne, więc 2 nm i średnica sondy, d, powinny się do tego pasować. Kalibracja kąta sondy wykracza poza zakres tego protokołu, więc zakładamy, że dostępna jest tabela lub odczyt ekranu. Średnica sondy to w przybliżeniu długość fali elektronu podzielona przez kąt półzbieżności (w radianach): d = λ/θ. Długość fali λ wynosi 0,002 nm dla elektronów 300 keV i 0,0025 nm dla elektronów 200 keV, więc θ 1 mrad zapewni średnicę plamki odpowiednio 2 lub 2,5 nm.

Protokół jest przedstawiany w postępie o rosnącej złożoności. Pierwszym zadaniem jest wytworzenie obrazu STEM, który zależy od oprogramowania producenta mikroskopu, a następnie serii pochylenia, do której wykorzystujemy SerialEM. Wielu czytelników z pewnością zna SerialEM, więc bardziej skomplikowane zadania przyjdą naturalnie. Nie ma potrzeby ścisłego przestrzegania procedur. Osiągnięcia związane z automatyzacją mogą być wdrażane bezpośrednio w odniesieniu do STEM, jak również w odniesieniu do TEM. Doświadczeni użytkownicy prawdopodobnie odwrócą protokół, zaczynając od korelacyjnej rejestracji map fluorescencyjnych i kontynuując konfigurację tomografii wsadowej. Więcej szczegółów można znaleźć w obszernej dokumentacji i bibliotekach samouczków dla samego SerialEM, w tym w niedawnym artykule JoVE na temat najnowszych osiągnięć w automation²⁵.

Protokół

1. Konfiguracja STEM

1. Wstępne ustawienia: Wczytaj plik ustawień kolumny, a następnie otwórz zawory kolumny (Column Valves). W przypadku użycia kriopodstawki z bocznym wlotem, otwórz osłonę kriogeniczną (Cryo-shield). Rozpocznij pracę w trybie TEM. Wiązka powinna pojawić się na ekranie. Jeśli tak się nie dzieje, zmniejsz powiększenie.
2. Ustaw mikroskop w ognisku eukentrycznym, naciskając przycisk na panelu sterowania.
3. Ustaw rozmiar plamki (spot size) na wygodną wartość (np. 6) w celu wizualizacji ekranu fluorescencyjnego, bezpośrednio lub za pomocą wbudowanej kamery (w zależności od modelu mikroskopu).
4. Przełącz mikroskop w tryb STEM i sprawdź, czy ostrość jest regulowana za pomocą soczewek kondensora (intensywność), a nie obiektywu. Ustaw ognisko eukentryczne. Następnie wyjdź z trybu dyfrakcji, aby przeprowadzić wstępne regulacje.
5. Upewnij się, że wiązka nie jest zablokowana. Zmniejszaj powiększenie, aż wiązka pojawi się na ekranie. Wycentruj wiązkę za pomocą przesunięcia (beam shift) i stopniowo zwiększaj powiększenie do około 70kx, utrzymując wiązkę w centrum.
6. Wstaw odpowiednią przysłonę kondensora, zazwyczaj 50 µm. Sprawdź centrowanie przysłony. Podczas lekkiego obracania pokrętłem ostrości w przód i w tył, plamka powinna się rozszerzać i kurczyć, ale pozostać w tym samym miejscu, tak jakby płaszczyzna przecinała wyimaginowaną pionową klepsydrę. Jeśli przysłona nie jest wycentrowana, oświetlenie będzie przesuwać się bocznie, jakby klepsydra była przechylona.
7. Ustaw wiązkę w ognisku i naciśnij Intensity List Focus (jeśli jest dostępny) w zakładce ustawień lub ponownie ustaw ognisko eukentryczne zgodnie z punktem 1.2. Ponownie wycentruj położenie wiązki.
8. Wyreguluj centrum rotacji. Obróć koło krokowe ostrości do minimum lub jednego kroku powyżej, tak aby wiązka delikatnie pulsowała, i upewnij się, że pozostaje ona nieruchoma podczas przesuwania ostrości w górę i w dół.
9. Wybierz punkty obrotu (pivot points) i zbiegnij je za pomocą regulacji X i Y.
   UWAGA: Jeśli w urządzeniu TFS zainstalowana jest płytka fazowa, należy używać wyłącznie regulacji X.
10. Lekko rozogniskuj wiązkę i wyreguluj stygmatory kondensora, aby plamka była okrągła. Przesuwaj ostrość w górę i w dół, aby zoptymalizować ustawienie; podczas przechodzenia przez ognisko nie powinno występować tendencji do wydłużania plamki w żadnym z kierunków.
11. Znormalizuj soczewki. Następnie stopniowo zwiększaj powiększenie do około 240kx, używając przesunięcia wiązki do utrzymania plamki w centrum, i powtórz regulacje centrum rotacji oraz punktów obrotu (kroki 1.6-1.8).
12. Powróć do trybu dyfrakcji. Wiązka powinna pojawić się na ekranie fluorescencyjnym jako jednolity dysk. Długość kamerowa (CL) kontroluje teraz efektywnie odległość optyczną do detektora, podobnie jak w krystalografii rentgenowskiej. Zmieniaj ją i obserwuj, jak dysk kurczy się i powiększa, jak gdyby położenie ekranu przesuwało się w stronę preparatu lub od niego. Stożek ten reprezentuje oświetlenie BF.
    UWAGA: Dla każdej wartości CL istnieje ustawienie dyfrakcji do skorygowania w celu sprowadzenia rzutowanej wiązki na oś centralną. Zazwyczaj nie ma potrzeby doprecyzowywania wszystkich ustawień, a jedynie tych (lub kilku), które będą używane do detekcji.
13. Uruchom tryb STEM przy dużym powiększeniu.
    1. Jeśli dostępny jest detektor BF STEM, zacznij od niego. Przesuń stolik w obszar z pustym otworem i wyreguluj ustawienia dyfrakcji, aby wycentrować wiązkę przy użyciu wybranej wartości CL.
    2. Wiele mikroskopów jest wyposażonych wyłącznie w detektor HAADF; istnieje sposób, aby użyć go jako detektora BF. Najpierw cofnij detektor, wycentruj wiązkę w ustawieniach bezpośrednich jak opisano wyżej, wstaw przysłonę obiektywu (zazwyczaj małą, np. 20 µm), i ustaw jej pozycję tak, aby równomiernie otaczała wiązkę. (Najłatwiej zrobić to, wstawiając preparat lub siatkę testową, aby zobaczyć halo wokół oświetlenia). Następnie użyj ustawienia dyfrakcji, aby przesunąć wiązkę poza oś i na obszar detektora. Wstawiaj i cofaj detektor, obserwując wiązkę na ekranie, aby potwierdzić, że wiązka jest blokowana przez detektor.
    3. Uruchom skanowanie w oprogramowaniu mikroskopu i dostosuj ustawienia jasności i kontrastu (B/C) tak, aby sygnał był bliski 0, gdy wiązka jest zablokowana, i bliski nasycenia, gdy pełne oświetlenie pada na detektor. W celu pomocy korzystaj z wyświetlacza mikroskopu. Ustawienia mogą być powiązane w nieoczekiwany sposób, dlatego regulację należy powtórzyć kilkakrotnie.
14. Przywróć mikroskop do stosunkowo niskiego powiększenia w rejestrze dużych powiększeń (tryb SA), nie przechodząc w tryb niskich powiększeń (LM).
15. Zanotuj prąd ekranu do późniejszego odniesienia (patrz krok 3.1.1). Prąd można zmieniać za pomocą ustawień soczewki działa i rozmiaru plamki, tak jak w TEM, gdzie wyższe wartości odpowiadają zmniejszonemu prądowi.
16. W tym momencie zapisz rejestr FEG, aby ułatwić powrót do wartości standardowych.
    UWAGA: Pracownia może przygotować domyślny zestaw rejestrów FEG, aby użytkownicy mogli rozpoczynać pracę od sprawdzonej konfiguracji.

2. Umieszczanie preparatu

1. W trybie LM TEM upewnij się, że siatka nie jest nieprzezroczysta. Znajdź pole siatki do dokonania wstępnych regulacji. Wygodnie jest znaleźć pusty obszar, otwór lub przerwane pole siatki. Zapisz pozycje stolika, aby móc do nich wygodnie powrócić.
2. Ustaw próbkę na wysokości eukentrycznej. Istnieje kilka metod, aby to osiągnąć. Na przykład można użyć funkcji stage wobbler, aby przechylać siatkę, jednocześnie zmieniając wysokość preparatu wzdłuż osi Z, aż obraz przestanie przesuwać się bocznie. Alternatywnie można zaznaczyć niektóre cechy na ekranie podglądu i przechylić stolik o 30°. Cecha ta przesunie się bocznie. Dostosuj wysokość preparatu, aby przywrócić ją do pierwotnej pozycji. Zwiększ powiększenie lub kąt nachylenia stolika, aby doprecyzować ustawienie. Powróć do nachylenia 0°.
3. Przełącz do trybu STEM i wsuń detektor STEM. Wybierz najniższy tryb dużego powiększenia (SA). Upewnij się, że na ekranie komputera widoczny jest obraz. Skanuj szybko, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji; typowy czas to 1 µs/pixel lub mniej. Należy zauważyć, że obraz może wydawać się zniekształcony przy lewej krawędzi, gdy skanowanie jest zbyt szybkie (patrz Rycina 2).
4. Naciśnij Eucentric Focus, zwiększ powiększenie i doprecyzuj ostrość podczas skanowania. Wygodne jest korzystanie z lupy ostrości (focus loupe) dostarczonej przez oprogramowanie mikroskopu.
5. Ustaw astygmatyzm kondensora. Można to zrobić najdokładniej metodą Ronchigramu. Kierując wiązkę na cienki obszar próbki, ustaw ostrość na punkcie, w którym wiązka przechodząca ulega rozproszeniu, pomiędzy obrazami cieni próbki po obu stronach. Następnie dostosuj ustawienia kondensora, aby centralny dysk stał się okrągły. Wymaga to pewnej wprawy, szczególnie w przypadku próbek kriogenicznych.
   ​UWAGA: Alternatywą jest znalezienie cząsteczek złota (często stosowanych jako markery fiducyjne do wyrównania w tomografii). Zwiększ powiększenie i zmieniaj ostrość w górę i w dół, korygując astygmatyzm tak, aby cząsteczki pozostały okrągłe, bez wydłużenia w żadnym kierunku.
6. Przejdź do trybu LM STEM i kontynuuj skanowanie, aby znaleźć interesujący obszar. W tym momencie, w razie potrzeby, ponownie dostosuj ustawienia B/C detektora (krok 1.13.3).

3. Rejestracja obrazu

1. Oszacuj dawkę do rejestracji. Przyjmij jako ogólną zasadę dążenie do uzyskania 100-150 e-^-/Ų dla całego tomogramu. Należy sprawdzić tolerancję dawki dla każdego preparatu. Natężenie prądu w amperach (A) podzielone przez ładunek elektronu reprezentuje liczbę elektronów (e)^-/s, co mnoży się przez czas ekspozycji, T, w sekundach i podzielone przez pole widzenia w ŲDla ułatwienia prąd wyrażono w nanoamperach (zgodnie z odczytem z ekranu), szerokość pola widzenia w mikrometrach, a czas ekspozycji klatki w sekundach, z zastosowaniem odpowiednich przeliczników:
   
   Liczbę tę należy pomnożyć przez liczbę pochyleń, aby uzyskać całkowitą ekspozycję w serii. Dla przykład, z a bieżący I = 0,04 nA, pole L = 4 µmoraz przy czasie ekspozycji wynoszącym 12 s, otrzymujemy 1,9 e^-/Ų na nachylenie, czyli około 110 e^-/Ų dla serii 61 projekcji.
2. Przenieś stolik nad otwór (lub wycofaj siatkę) i dostosuj natężenie wiązki za pomocą ustawień wielkości plamki (spot size) i/lub soczewki działa, aby osiągnąć pożądane natężenie ekranu. Jeśli pomiar wskazuje wartość 0, wstaw większą aperturę C2 w celu zwiększenia natężenia. Następnie skoryguj wynik, dzieląc go przez kwadrat stosunku średnic, a na koniec powróć do mniejszej apertury.
3. Dostroić ustawienia B/C zgodnie z krokiem 1.13.3, a następnie przesunąć stolik z powrotem do obszaru zainteresowania i ponownie sprawdzić osiowość oraz astygmatyzm w warunkach obrazowania.
4. Należy pozyskać obraz testowy.

4. Tomografia z użyciem SerialEM

1. Uruchom serwer SerialEM na komputerze mikroskopu (SerialEM jest zazwyczaj zainstalowany na innym komputerze). Następnie otwórz program SerialEM. STEM pojawia się w SerialEM jako kamera, z tym samym interfejsem. Upewnij się, że komunikacja działa prawidłowo dla danej konfiguracji. Na przykład karta mikroskopu powinna wyświetlać prawidłowe powiększenie. Jeśli tak nie jest, przerwij pracę i rozwiąż problem.
2. Znajdź kartę kamery i skryptów (camera and script tab) i otwórz menu Setup. Upewnij się, że wybrana jest kamera STEM, a dla każdego trybu wybierz odpowiedni binning oraz czas przebywania wiązki (dwell time). Upewnij się, że odpowiedni detektor (lub detektory) pojawia się w polu „channels to acquire” w dolnym lewym rogu. Naciśnij Acquire na dole, aby przeprowadzić test. Ponownie: nie kontynuuj, jeśli nic się nie dzieje lub jeśli wiązka nie zostaje odblokowana (unblank). Zatrzymaj się i sprawdź komunikację.
   UWAGA: Tryby są używane w sposób podobny do tomografii TEM. Binning jest zabiegiem zapewniającym kompatybilność z TEM. Kluczowym parametrem jest liczba pikseli; różne systemy mikroskopowe stosują różny binning, aby osiągnąć tę samą liczbę.
   1. Tryby View i Search powinny być szybkimi skanami z relatywnie małą liczbą pikseli (np. 512 x 512 pikseli w 1 s).
   2. Tryb Focus zazwyczaj obejmuje mały obszar z szybkim zapisem. W związku z tym, w trybie niskiej dawki (low dose mode), wybierz powiększenie dla trybu Focus inne niż dla trybu Record, co może pomóc w zwiększeniu dokładności. Pozostaw rozmiar plamki (spot size) bez zmian.
   3. W trybie Record użyj parametrów wybranych wcześniej w szacowaniu ekspozycji. Jeśli jest dostępna, wybierz również funkcję Dynamic Focus, która koryguje ostrość linia po linii w obrazie pochylonym.
   4. Dla późniejszej wygody wybierz binning dla podglądu (preview) identyczny z binningiem dla trybu View (patrz: Udoskonalenie #1, krok 5.5). Rozmiar obrazu (liczba pikseli) nie musi być taki sam.
   5. Użyj trybu Trial, aby utrzymać obszar Record w centrum podczas akwizycji. Może on być podobny do trybu View, ale należy zadbać o to, aby po lewej stronie ramki nie było widocznych zniekształceń skanu (przykład na Rysunku 2). Ponownie, w trybie Low Dose tryb Trial może mieć inne powiększenie niż tryb Record.
   6. Użyj trybu Montage bezpośrednio do skanowania siatki. Powinien on mieć wystarczającą gęstość pikseli, aby znaleźć obszary zainteresowania; zalecenie: 512 x 512 lub 1024 x 1024. Upewnij się, że obraz jest dobry i posiada odpowiedni zakres dynamiczny (widoczny w sterownikach wyświetlania obrazu), ponieważ tryb ten służy do wyszukiwania obszarów preparatu.
   7. Zapisz plik ustawień, aby wybory te zostały zachowane jako domyślne dla następnej sesji (co może być istotne w przypadku awarii programu).
3. Przetestuj kalibracje przesunięcia obrazu (image shift) i przesunięcia stołu (stage shift). W trybie mikrosondy (lub nanosondy) kliknij View Image, najeździj na niego myszką, przytrzymaj przycisk i przeciągnij go po przekątnej o około jedną czwartą pola widzenia. Następnie wykonaj kolejny obraz View. Obrazy powinny idealnie na siebie nachodzić. Powtórz czynność, przeciągając ponownie przy jednoczesnym przytrzymaniu klawisza Shift (aby wymusić ruch stołu). Obrazy powinny dobrze na siebie nachodzić, choć być może mniej precyzyjnie.
4. Przejdź do trybu LM i przetestuj przesunięcie stołu. Jeśli testy te zawiodą, przerwij pracę i rozwiąż problem. Pozostałe kroki nie będą działać.
5. Wykonaj mapę montażową LM całej siatki. Można to zrobić również w TEM.
   1. Przejdź do trybu STEM z najniższym powiększeniem, w którym obraz nie jest blokowany przez przysłony, zazwyczaj około 185x.
   2. Kliknij Navigator menu > Open. Następnie kliknij Navigator menu > Nav. Options > odznacz Convert Maps to Bytes.
   3. Wybierz Navigator menu > Montaging & Grids > Setup Full Montage. Otworzy się menu. Opcje do zaznaczenia to: Move stage instead of shifting image, Make map from each montage if Navigator open oraz Use Montage Mapping, not Record parameters. Siatka obrazów powinna wynosić mniej więcej 6 x 6 lub 7 x 7. Sprawdź całkowity obszar do zarejestrowania. Jeśli wymagana jest zbyt duża liczba obrazów, możliwe, że powiększenie nie jest prawidłowo odczytywane z mikroskopu (Rysunek 3). Zatrzymaj się i sprawdź.
   4. Aby rozpocząć akwizycję montażu, naciśnij Start w sekcji Montage Controls lub Montage w sekcji Camera & Script. Otworzy się kolejne menu do wyboru File Parameters: mrc, store as integers, a w jeszcze innym oknie dialogowym wybierz nazwę pliku do zapisu. Upewnij się, że dane są zapisywane w odpowiednim obszarze danych, a nie w ustawieniach użytkownika SerialEM. Zaleca się, aby nie zapisywać dużych ilości danych na dysku C, na którym znajduje się system.
   5. Po zakończeniu akwizycji montaż pojawi się w głównym oknie (Rysunek 4). Można teraz nawigować po siatce za pomocą znacznika i punktów w Nawigatorze, tak samo jak w TEM.
6. Ponownie sprawdź korekcję astygmatyzmu. Zazwyczaj wystarczy szybko przeskanować mały obszar i dostosować go wraz z ostrością tak, aby obiekty punktowe, takie jak nanocząstki złota, pozostawały całkowicie okrągłe podczas wchodzenia w ostrość i wychodzenia z niej (podobnie jak w SEM) przy dużym powiększeniu. Bardziej konserwatywnym podejściem jest powtórzenie bezpośrednich wyrównań z kroków 1.5-1.8 przed korekcją astygmatyzmu.
7. Wyrównaj obrazowanie przy dużym powiększeniu do montażu LM.
   1. Przejdź do pozycji na montażu LM z łatwo rozpoznawalną cechą. Dodaj punkt, klikając w Navigator window > Add Points, a następnie kliknij na wybraną cechę. Kliknij ponownie (zatrzymaj dodawanie), aby dezaktywować tę funkcję.
   2. Wykonaj obraz View lub Trial przy najniższym powiększeniu wysokim (HM) i znajdź wskazaną cechę. Umieść tam znacznik (zielony krzyżyk) i przy zaznaczonym odpowiadającym mu punkcie w oknie Nawigatora, w Navigator menu > Shift to Marker…, w otwartym oknie dialogowym wybierz All Maps oraz Save Shift, jak pokazano na Rysunku 5.
   3. Przetestuj to, przesuwając stół w inne pozycje i weryfikując, czy obraz HM jest wycentrowany w tych samych lokalizacjach wybranych w montażu LM. Jeśli cecha nie jest widoczna w obrazie HM, przesunięcie między trybami LM a HM może być zbyt duże. W takim przypadku wykonaj montaż wielokątny nad większym obszarem. Kliknij Navigator window > Add Polygon, wybierz kilka punktów, a następnie kliknij ponownie Add Polygon, aby zamknąć wielokąt. Kliknij Navigator menu > Montaging and Grids > Setup Polygon Montage, a następnie Montage Controls > Start. Następnie znajdź odpowiadające punkty jak wyżej i kliknij Shift to Marker….
8. Skonfiguruj tryb niskiej dawki (low dose mode).
   1. Otwórz kartę Low Dose Control i zaznacz pole Low Dose Mode.
   2. Zaznacz Continuous update i przejdź do trybu View. Wybierz powiększenie mikroskopu dla tego trybu, zazwyczaj najniższe lub drugie najniższe. Wybierz każdy z kolejnych trybów i ustaw odpowiednie powiększenie. Tryb Record powinien być ustawiony tak, aby uzyskać pożądany rozmiar piksela, a powiększenie trybu Focus powinno być wystarczająco duże, aby znaczniki fiducjalne lub inne wysokokontrastowe cechy służące do ostrzenia były wyraźnie rozdzielone. Następnie natychmiast odznacz Continuous update.
      UWAGA: Tryb Trial może być ustawiony podobnie do trybu Record, w przeciwnym razie obszar śledzenia będzie musiał być przesunięty z obszaru Record, aby zminimalizować ekspozycję, lub na niskim powiększeniu, obejmując znaczną część otoczenia.
   3. Wykonaj obraz View i ustaw pozycję Trial za pomocą funkcji Define position of area: Trial.
      UWAGA: Zalecenie #1: Biorąc pod uwagę zmianę próbkowanego obszaru i czasu, dodatkowa ekspozycja dla Trial przy niskim powiększeniu może być minimalna. Dopóki pręt siatki nie wejdzie w pole widzenia, ta metoda śledzenia jest zazwyczaj bardziej niezawodna. Zalecenie #2: Można również zaktualizować rozmiar plamki, aby dostosować dawkę dla różnych trybów, takich jak Focus. Dla stabilności ustawień optyki mikroskopu zalecamy nie robić tego, lecz pozostawić rozmiar plamki odpowiedni dla trybu Record, a następnie dostosować czas ekspozycji, jeśli jest to konieczne dla szybszych trybów skanowania.
   4. Kliknij Low Dose Control tab > Go to: Rec., a następnie kliknij Navigator menu > Open Imaging States > Add Current State. Nadaj mu nazwę, aby można go było łatwo przywołać (np. µP STEM dla STEM mikrosondy). Dla różnych zadań można zdefiniować różne stany.
9. Przesuń stół do lokalizacji interesującej dla tomografii (więcej o korzystaniu z Nawigatora poniżej).
   1. Dodaj punkt w Nawigatorze, klikając Navigator window > Add Points.
   2. Doprecyzuj wysokość eukentryczną, wybierając Tasks > Eucentricity > Rough. Navigator window > Update Z.
   3. Ustaw obszary dla trybów Focus i Trial. Najpierw wykonaj obraz View. Następnie na karcie Low Dose Control, w sekcji Define position of area, wybierz Focus lub Trial. Dostosuj pozycje tych dwóch obszarów wzdłuż osi pochylenia. Tryb Focus nie powinien nakładać się na obszar Record.
      UWAGA: Pamiętaj, że występuje pewne „przesunięcie” (over-shoot), szczególnie przy lewej krawędzi, więc żadna z tych stref nie powinna być ustawiona bezpośrednio przy obszarze Record. Zakres tego przesunięcia można ocenić na obszarze testowym, wielokrotnie skanując przy powiększeniu Record, a następnie zmniejszając powiększenie, aby uzyskać szerszy widok.
10. Dla pewności (opcjonalnie dla osób doświadczonych), pochyl stół do +60° a następnie do -60°, za każdym razem wykonując obraz View lub Preview, aby upewnić się, że pręt siatki nie wchodzi w pole widzenia obszaru Record zaznaczonego na zielono.
11. Skonfiguruj serię pochyleń (tilt series).
    1. Otwórz nowy plik do zapisu danych, klikając File > Open New i wybierz nazwę pliku. Wybierz Tilt Series menu > Tilt Series Setup (Rysunek 6). Rozwiązywanie problemów: jeśli przycisk Open New jest szary, sprawdź, czy poprzednia seria pochyleń została zakończona. Jeśli nie, zakończ ją, klikając Tilt Series > Terminate.
    2. Ustaw ekstremalne kąty pochylenia w polach Tilt to oraz End at, zazwyczaj odpowiednio -60° i +60°, a także przyrost (increment), zazwyczaj 2°.
    3. Dla trybu dawki symetrycznej (zalecany – upewnij się, że tryb Low Dose jest nadal aktywny), zaznacz Run series in two directions from ___. Puste pole to zazwyczaj 0, ale można je wykorzystać do kompensacji wstępnie pochylonych lameli FIB (np. przy 20°).
    4. Dla uproszczenia zaznacz Keep exposure time constant. Zmiana tego ustawienia wymaga ponownego przeliczenia ekspozycji i może zakłócać rekonstrukcje algebraiczne (np. ART/SART/SIRT), które porównują intensywności rzutowane z danymi oryginalnymi (patrz: krok 7.1).
    5. Zaznacz Skip Autofocusing. Mały kąt półzbieżności, np. 1 mrad, oznacza tak dużą głębię ostrości, że ustawianie ostrości może być niepotrzebne. W ramach testu ustaw ostrość przy 0°, pochyl do 60° lub -60° i naciśnij Record. Utrzymanie ostrości jest przede wszystkim kwestią precyzyjnej wysokości eukentrycznej. Przy większej zbieżności może być konieczne ustawianie ostrości w trakcie serii. W takim przypadku wykonaj obraz View, a na karcie Low Dose Control zdefiniuj pozycję obszaru i ostrości, a następnie dostosuj obszar ostrzenia.
    6. Działania początkowe i końcowe: Jeśli regulacja wysokości eukentrycznej została wykonana dokładnie, nie ma potrzeby jej powtarzania. Odznacz Close column valves at end of series, chyba że istnieje ku temu ważny powód.
    7. Do śledzenia parametrów kontrolnych dostępnych jest wiele opcji. W przypadku bezobsługowej zbiórki danych priorytetem jest uniknięcie zatrzymania programu w oczekiwaniu na reakcję użytkownika. Użyj zalecanych ustawień: powtórz Record, jeśli procent utraconego pola przekracza 5. Następnie śledź po i zaznacz Align with Preview before getting new track reference oraz Get new track reference, jeśli wyrównanie Record różni się o 2%. W przypadku zbiórki danych z nadzorem zastosuj bardziej rygorystyczne parametry, aby uniknąć ryzyka utraty wielu godzin czasu pracy instrumentu.
    8. Po przygotowaniu naciśnij GO na dole okna. Na koniec wybierz Tilt Series > Terminate.

5. Seryjne pozyskiwanie obrazów w wielu punktach przy użyciu Navigatora (Udoskonalenie nr 1)

UWAGA: Protokół jest uproszczony, ponieważ a) jest identyczny z TEM i b) pojawiają się nowe narzędzia, które prawdopodobnie sprawią, że pełny opis stanie się nieaktualny.

1. Załaduj pełny montaż siatki do głównego okna.
2. Wybierz obszary, które wyglądają obiecująco. Kliknij Add Points i dodaj punkty w centrach wybranych pól siatki. Kliknij Add Points ponownie, aby dezaktywować ten tryb.
3. Przy aktywnym stanie obrazowania z niską dawką (low dose), wybierz Navigator window > check Acquire oraz New File w sekcji Item dla każdego z wybranych pól. Dla pierwszego z nich otworzy się okno dialogowe właściwości pliku (Rysunek 7), a następnie okno nazwy pliku. Wybierz Montaged images, a następnie w oknie dialogowym Montage Setup (Rysunek 8) zaznacz Use View parameters in Low Dose mode i utwórz siatkę wystarczająco dużą, aby pokryła pole (około 100 x 100 µm).
4. Kliknij Navigator menu > Acquire at items i wybierz parametry mapowania. Co najważniejsze, w sekcji Primary actions zaznacz Make Navigator Map, następnie Rough Eucentricity oraz Fine Eucentricity i naciśnij Go (Rysunek 9). Dla siatki o gęstości 200 mesh w rezultacie powstanie mapa obejmująca w przybliżeniu całe pole (Rysunek 10).
5. Przygotuj wybór pozycji dla tomogramów. Otwórz nowy plik, klikając File > Open New. Nadaj mu nazwę pliku (np. AnchorMaps.mrc).
   1. Przy aktywnym trybie Low Dose wejdź w Camera & Script > Setup i upewnij się, że View i Preview mają ten sam binning (w przeciwnym razie nie będą mogły zostać zapisane w tym samym pliku).
   2. Przejdź do punktów na mapach pól, klikając Navigator window > Go to XYZ.
   3. Wybierz za pomocą markera pozycję dla pierwszego tomogramu. Wykonaj obraz Preview i doprecyzuj pozycję, przeciągając ją prawym przyciskiem myszy. Następnie wybierz Navigator window > New Map i kliknij yes w oknie dialogowym, aby zapisać. Następnie wykonaj obraz View tego samego obszaru i ponownie zapisz go jako nową mapę. Upewnij się, że mapa View jest wyróżniona, i zaznacz For anchor state w oknie Navigator w prawym górnym rogu.
   4. Wybierz drugą pozycję, ponownie wykonaj Preview i doprecyzuj lokalizację jak powyżej, a tym razem naciśnij Anchor Map w oknie Navigator. Spowoduje to zapisanie zarówno obrazu Preview, jak i View jako nowych map w Navigatorze.
   5. Powtórz krok 5.5.4 dla wszystkich pożądanych lokalizacji. Przechodź z jednego pola siatki do drugiego, wybierając punkt i naciskając Go to XYZ w oknie Navigator.
6. Aby ustawić ostrość referencyjną, wybierz czysty obszar siatki i ostrożnie ustaw ostrość ręcznie lub za pomocą autofokusa. Naciśnij Reset defocus na panelu mikroskopu. Utwórz skrypt w SerialEM, klikając Script > Edit > Edit 15 (lub inny wolny numer) i wpisz dwie linie: ScriptName SetDefocus oraz SetDefocus 0.
7. W oknie Navigator wyróżnij pierwszą lokalizację (Preview lub View). Naciśnij Shift-T, a następnie wyróżnij ostatnią lokalizację i ponownie naciśnij Shift-T. Otworzy się okno dialogowe File Properties. Wybierz obrazy pojedyncze (single-frame) oraz parametry zapisu, w tym nazwę pliku. Edytuj nazwę pliku, ale pozostaw etykietę elementu (item label) na końcu.
   UWAGA: Nazwy plików kończące się cyframi będą aktualizowane automatycznie dla kolejnych serii pochyleń. Wygodne jest użycie opcji Navigator menu > Nav. Options > Use Item Labels in Filenames.
8. Następnie automatycznie otworzy się menu Tilt Series Setup. Wypełnij je jak wcześniej (Rysunek 6), ale nie wybieraj Refine eucentricity. Punkty Preview w Navigatorze zostaną teraz oznaczone jako TS. Do tego menu można powrócić za pomocą przycisku w oknie Navigator nad listą elementów.
9. Wybierz Navigator menu > Acquire at items. Tym razem wybierz parametry dla danych końcowych (Final Data). Wybierz Primary Action: Acquire tilt series oraz opcje Manage Dewars/Vacuum, Realign to Item, Fine Eucentricity oraz Run Script before Action, wskazując Script to run: SetDefocus. Wybierz opcje ogólne: no message box when error occurs oraz close column valves at end, a następnie naciśnij GO (Rysunek 11). SerialEM odwiedzi teraz wszystkie mapy Anchor i zarejestruje serię pochyleń w każdej pozycji (Rysunek 12).

6. Rejestracja mapy CLEM (Usprawnienie nr 2)

1. Jeśli nie zostało to jeszcze wykonane, załaduj pełny montaż siatki do głównego okna, a następnie utwórz nowe okno, klikając Window > New Window i nadaj mu nazwę. Należy zauważyć, że pełny montaż siatki pojawia się w Registration 1.
2. Zaimportuj obraz mapy CLEM, klikając Navigator menu > Import map. Powinien on trafić do Registration 2. Można mu również przypisać nowe okno, jak opisano powyżej.
3. Obejrzyj mapę CLEM, aby określić względny obrót w stosunku do pełnego montażu siatki. Najłatwiej zrobić to na mapie, na której widoczne są paski siatki. Należy pamiętać, że mapa może być również odwrócona. Wyrównaj ją orientacyjnie za pomocą Navigator menu > Rotate Map, korzystając z Flip, jeśli jest to konieczne.
   UWAGA: Następny krok może również uwzględniać odwrócenie obrazu, ale wykonanie tego wcześniej znacznie ułatwia dalsze czynności. Krok ten można powtarzać do momentu, aż wyrównanie będzie wyglądać satysfakcjonująco, jednak precyzja nie jest tutaj niezbędna.
4. Wprowadź punkty rejestracji w celu precyzyjnego wyrównania. Umieść kilka odpowiadających sobie punktów w jednym, a następnie w drugim oknie. Dla każdego takiego punktu zaznacz Registration point na samej górze okna Navigator. Odpowiadające sobie punkty zostaną oznaczone rosnącym indeksem, po którym następuje R1 dla montażu siatki lub R2 dla zaimportowanej mapy.
   UWAGA: Użycie siatek pomocniczych (finder grids) znacznie upraszcza ten krok. W przeciwnym razie wybierz wyraźne cechy, takie jak znacznik środkowy lub narożniki kwadratów siatki. W zasadzie trzy punkty są wystarczające do wstępnego wyrównania, ale większa liczba punktów pomaga skompensować niewielkie niezgodności w konstrukcji montażu.
5. Jeśli wymaganych jest kilka kanałów mapy CLEM, np. różne kolory fluorescencji lub fluorescencja bez tła w jasnym polu, zaimportuj je zgodnie z krokiem 6.2 powyżej i zmień rejestracje na 2. W ten sposób przejmą one punkty rejestracji z pierwszej mapy.
6. Zastosuj rejestrację za pomocą Navigator menu > Transform items. Odpowiadające sobie punkty rejestracji pojawią się teraz na wszystkich mapach, które zostaną wymienione w Registration 1. Aby wyrównać obraz wizualnie, kliknij Navigator menu > Rotate Map. Należy pamiętać, że gdy mapa jest ładowana z okna Navigator, nie jest ona automatycznie obracana, chyba że zaznaczone jest pole Rotate when load. Zawsze można ją jednak obrócić z poziomu okna Navigator.
7. Teraz powinno być możliwe umieszczenie znacznika lub punktu na mapie fluorescencji i przesunięcie stolika do odpowiadającej lokalizacji na siatce (Rycina 13).

7. Rekonstrukcja 3D

1. Proces ten obejmuje te same podstawowe etapy co tomografia TEM: wyrównanie serii nachyleń, po którym zazwyczaj następuje retrospekcja (back-projection). Dostępnych jest kilka platform programowych, a dane można przetwarzać w sposób podobny do danych TEM, z wyjątkiem tego, że należy pominąć korekcję CTF.
2. Zastosuj normalizację intensywności, aby wzmocnić wkład projekcji o dużym nachyleniu lub zrównoważyć zmiany oświetlenia w trakcie serii, pamiętając, że wpływa to na informacje ilościowe. Dobrze sprawdza się na przykład IMOD²⁶, natomiast AreTomo²⁷ jest bardzo użyteczny do wyrównania bez markerów (fiducials); w przypadku obecności markerów ClusterAlign²⁸ może śledzić je jako klastry, a nie pojedyncze punkty, co jest szczególnie przydatne dla danych STEM, gdzie punkty mogą zostać utracone lub przesłonięte przez elementy o wysokim kontraście.
3. Po rekonstrukcji przeprowadź dekonwolucję 3D²⁹ w celu poprawy kontrastu i odszumiania. Po zrekonstruowaniu przedstaw dane wolumetryczne STEM za pomocą dowolnej ze standardowych metod, takich jak przekroje ortogonalne (orthoslices) lub segmentacja izopowierzchni. Co istotne, rozkład intensywności jest jednobiegunowy, bez inwersji kontrastu lub prążków Fouriera , które pojawiają się w konwencjonalnym TEM z kontrastem fazowym. Interesującym sposobem reprezentacji tomogramów STEM w ogóle jest odwrócenie pola jasnego (Rysunek 14). Daje to efekt „rentgenowskiego wzroku”, umożliwiający dostrzeżenie gęstych obiektów zainteresowania przez przejrzystą komórkę³⁰.

Wyniki

Pełny montaż siatki przygotowany w STEM przedstawia obszary z komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania (Rysunek 4). Należy zauważyć, że obraz jest w polu ciemnym, zatem puste otwory wydają się ciemne. Komórki są częściowo jasne w miejscach, gdzie elektrony ulegają rozproszeniu w kierunku detektora HAADF. W najgrubszych częściach, zazwyczaj w centrach lub w pobliżu prętów siatki, kontrast ponownie staje się ciemny. Jest to spowodowane wielokrotnym rozproszeniem, w wyniku którego elektrony osiągają kąty nie rejestrowane przez detektor. W praktyce obszary te będą zbyt grube do przeprowadzenia tomografii.

Kolejny etap obejmuje mapy o pośrednim powiększeniu (Rysunek 10). Są one często nazywane mapami montażowymi o średniej skali lub mapami kwadratowymi, co odnosi się do kwadratów siatki, a nie do kształtu. Nawet w trybie STEM mikroanalizatora o najniższej rozdzielczości będą one pozyskiwane jako obrazy montażowe. Kliknięcie elementu w oknie Nawigatora ładuje obraz mapy do głównego okna. W tym obszarze wybierane są konkretne punkty do pozyskania tomogramu. Należy użyć trybu Preview, aby zlokalizować obszar przy powiększeniu rejestracyjnym. Należy pamiętać, że w zależności od prędkości skanowania może wystąpić przesunięcie boczne między trybami Preview a Record. W tym miejscu można zarejestrować pojedynczą serię pochyleń. Na przykład mitochondria można często zidentyfikować na obrazach w trybach Preview i Record (Rysunek 12).

W przypadku tomografii seryjnej stolik przesuwa się wokół siatki i może nie powrócić dokładnie w to samo miejsce. Mapy kotwiczące są wykorzystywane w celu zapewnienia niezawodnej ponownej identyfikacji pożądanych obszarów rejestracji (Record) poprzez dopasowanie obrazu podglądu (Preview) do obrazu w mniejszym powiększeniu (View), nawet jeśli wystąpiło przesunięcie stolika. PyEM^23,24 oferuje szybszą alternatywę, która jest zdecydowanie zalecana, lecz nie stanowi jeszcze części standardowej instalacji.

W podejściu CLEM mapa fluorescencyjna może być wykorzystana do zidentyfikowania obszarów zainteresowania dla tomografii. Obraz fluorescencyjny jest pozyskiwany zewnętrznie i musi zostać zarejestrowany na pełnym montażu siatki. Przydatne jest, aby paski i otwory siatki były widoczne, dlatego przed importem można przygotować kompozyt łączący fluorescencję i pole jasne, na przykład w programie GIMP (https://www.gimp.org) lub ImageJ³¹ (należy pamiętać, że ImageJ odwraca oś pionową). Gdy zakres dynamiczny fluorescencji jest duży, stworzenie takiego połączenia bez nasycenia może być trudne. W takim przypadku obie mapy można zaimportować osobno, a następnie zarejestrować je razem, jak opisano (Rysunek 13). W ten sposób wskazanie punktu na mapie fluorescencyjnej w oknie Navigator, a następnie wybranie funkcji „Go To XY”, przesuwa stolik do odpowiadającej pozycji na siatce zamontowanej w TEM. Należy pamiętać, że niewielkie niespójności podczas tworzenia montażu (lub mapy fluorescencyjnej, jeśli ona również jest montażem) doprowadzą do niewielkich przesunięć; dlatego dla uzyskania optymalnej precyzji fluorescencję należy ponownie zarejestrować konkretnie względem mapy kwadratowej. Często wystarczy przeprowadzić tę rejestrację „na oko”, na podstawie otworów w folii nośnej lub cech wspólnych z obrazem w polu jasnym.

Rekonstrukcja serii pochyleń pozwala na uzyskanie wolumenu 3D (Rysunek 14). W tym przykładzie rozmiar piksela wynosi 2,042 nm, co przekłada się na pole widzenia o wielkości ~4 µm. Osady fosforanu wapnia (pomarańczowe groty strzałek) są wyraźnie widoczne ze względu na wyższą liczbę atomową w porównaniu do otoczenia. Mikrotubule (czerwone groty strzałek) można śledzić w całym polu widzenia. Ponadto wyraźnie widoczne są wewnętrzna i zewnętrzna błona mitochondrialna (zielone groty strzałek). Aktynę można zaobserwować w postaci wiązek lub pojedynczych filamentów. Aby uzyskać bardziej izotropową rozdzielczość, zrekonstruowany obraz można poddać dekonwolucji.

Rycina 1: Porównanie TEM i STEM. W TEM pole widzenia jest oświetlone niemal równoległą wiązką, a soczewka obiektywu tworzy powiększony obraz na kamerze. W przypadku cryo-TEM przysłona obiektywu jest otwarta, aby przepuścić rozproszone fale elektronowe (czerwona przerywana linia), które w połączeniu z defokusem wytwarzają kontrast fazowy poprzez interferencję z falami nierozproszonymi (zielonymi). STEM natomiast skanuje skupioną wiązkę po próbce i zbiera rozproszone elektrony piksel po pikselu. Kilka detektorów może zbierać elektrony rozproszone pod różnymi kątami. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła³⁰. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Przykład zniekształcenia obrazu po lewej stronie wynikający z wysokiej prędkości skanowania. Zwróć uwagę na zniekształcenia zaznaczone żółtymi grotami strzałek, a także na zniekształcone otwory w kształcie owali w Quantifoil. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Okno dialogowe ustawień montażu dla całego montażu siatki. Wybierz powiększenie oraz liczbę pól w osiach X i Y tak, aby całkowity obszar wyniósł około 2,000 µm, co pozwoli uzyskać mapę większości siatki. Wybierz również opcję Move stage zamiast shifting image oraz Use Montage Mapping zamiast Record parameters. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Pełna mapa siatki (GridMap) zarejestrowana przy niskim powiększeniu w trybie STEM. Uszkodzone obszary są całkowicie czarne na obrazie w ciemnym polu. Ciemnoszare obszary są prawdopodobnie zbyt grube i słabo witryfikowane. Obszary stanowiące dobrych kandydatów do tomografii są białe lub jasnoszare w tym skanie. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Proces przesunięcia do znacznika. Rozpoznawalny obiekt zostaje zaznaczony na mapie o niskiej rozdzielczości za pomocą funkcji Add Points (38 na tym obrazie). Zauważ przesunięcie między mapą o niskiej rozdzielczości (zielone koło) a mapą o średniej rozdzielczości (pomarańczowe koło). Następnie obiekt zostaje zaznaczony znacznikiem (zielony krzyżyk, czerwone koło) i uruchamiane jest okno dialogowe Shift to Marker. Wybrana opcja przesuwa wszystkie mapy w powiększeniu 245x o tę samą wartość. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Okno dialogowe konfiguracji serii pochyleń dla serii pochyleń STEM. Zastosowano schemat symetryczny w zakresie od -60° do +60° w krokach co 2°. Pominięto autofokus ze względu na dużą głębię ostrości przy zastosowaniu niskiego kąta zbieżności. Nie ma potrzeby korygowania eukentryczności, ponieważ zostało to wykonane wcześniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Okno dialogowe właściwości pliku dla map o średniej rozdzielczości. Zapisz jako plik stosu MRC, wybierz liczby całkowite i zapisz dodatkowe informacje w pliku metadanych .mdoc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8: Okno dialogowe konfiguracji montażu w celu zapisania map o średniej rozdzielczości. W przypadku kwadratu na siatce o gęstości 200 oczek, którego szerokość wynosi 90 µm, zaleca się obszar całkowity co najmniej 90 µm x 90 µm. Należy wybrać opcję Move stage zamiast przesuwania obrazu (shifting image) oraz Use View parameters w trybie Low Dose. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Rejestracja mapy o średniej rozdzielczości. Przejdź do okna dialogowego Items w celu rejestracji map o średniej rozdzielczości. Wybierz Mapping, Acquire i zapisz obraz lub montaż, a następnie zaznacz Make Navigator map. W sekcji Tasks przed lub po Primary wybierz Rough and Fine Eucentricity. W przypadku pracy bez asysty opcjonalnie wybierz No message box when error occurs oraz Close column valves at end. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 10: Obraz mapy o średniej rozdzielczości. Mapa o średniej rozdzielczości (Square Map) zarejestrowana w trybie STEM za pomocą montażu 3 x 3. Dwie mapy kotwiczące (Anchor Maps) o średniej rozdzielczości służące do zbierania danych są zaznaczone niebieskimi kwadratami. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 11: Dane serii przechyłów seryjnych. Okno Acquire w dialogu Items służące do zbierania seryjnych serii przechyłów. Aby przeprowadzić zbiór danych serii przechyłów, należy wybrać Final Data oraz Acquire tilt series. W sekcji Tasks przed lub po Primary należy zaznaczyć Manage Dewars/Vacuum (wybrać odpowiednie ustawienia w menu Setup), Realign to Item, Fine Eucentricity oraz Run Script przed Action. W opcjach General należy zaznaczyć No message box when error occurs oraz Close column valves at end (patrz 5.14). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 12: Przechył 0° w serii przechyłów STEM mitochondrium. Pomarańczowe groty strzałek wskazują osady fosforanu wapnia (granul macierzy), zielone groty strzałek grzebienie, a czerwone groty strzałek złote markery fiducjalne 15 nm. Pasek skali = 500 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 13: Zarejestrowane mapy cryo-CLEM. (A) Mapa STEM o średniej rozdzielczości (mapa kwadratowa, 26-A) zarejestrowana z (B) mapą STEM o niskiej rozdzielczości, (C) mapą cryo-FM w kanale BF oraz (D) mapą cryo-FM w kanale GFP. Dziewięć punktów rejestracji (etykiety 4-21) pokazano w (E) Nawigatorze. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Rycina 14: Rendering objętościowy. Rendering objętościowy przekrojów o grubości (A) 60 nm oraz (B) 40 nm przez tomogram filtrowany metodą SIRT-like (30 cykli) na różnych głębokościach. Rozmiar piksela wynosi 2,048 nm, co daje pole widzenia o wielkości około 4 µm. Należy zwrócić uwagę na odwróconą gęstość w porównaniu do Ryciny 12, co oznacza, że elementy o wysokiej intensywności są jasne. Pomarańczowe, białe, czerwone, zielone i jasnoniebieskie groty strzałek wskazują odpowiednio na złogi fosforanu wapnia, rybosomy, mikrotubule, wewnętrzną i zewnętrzną błonę mitochondrialną oraz filamenty aktynowe. Pasek skali = 500 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół powinien pomóc mikroskopistom zajmującym się naukami przyrodniczymi, którzy są zainteresowani uzyskaniem widoku 3D organelli wewnątrzkomórkowych w obszarach komórki, które nie są dostępne dla konwencjonalnej tomografii TEM. Ten sam protokół może być również stosowany do tomografii STEM skrawków z tworzywa sztucznego, ze złagodzonymi ograniczeniami dotyczącymi ekspozycji. Protokół powinien być traktowany jako punkt wyjścia, a nie zbiór sztywnych zasad. Rzeczywiście, siła STEM polega na jego elastyczności; Nie ma jednego właściwego sposobu jego obsługi.

Podkreślamy, że STEM sam w sobie odnosi się tylko do zeskanowanej sondy i nie definiuje powstawania obrazu. Kontrast zależy przede wszystkim od konfiguracji detektorów. Prostsze metody wykorzystują detektory z symetrią osiową, albo dyskiem wyśrodkowanym na osi optycznej, albo otaczającym go pierścieniem. Ogólnie rzecz biorąc, gdy oświetlenie pada bezpośrednio na detektor, rejestrujemy obraz BF, w którym próbka (rozpraszająca elektrony) wydaje się ciemna; I odwrotnie, gdy detektor zbiera tylko rozproszone elektrony, rejestrujemy obraz DF, na którym gęsty próbka wydaje się jasna. Gdy dostępny jest odpowiedni sprzęt, SerialEM może odbierać i nagrywać oba te sygnały jednocześnie. Dostępne są jeszcze bardziej wyrafinowane konfiguracje, od detektorów z wieloma segmentami po w pełni pikselowe kamery. Obrazowanie z kontrastem fazowym można uzyskać, na przykład, oceniając różnicę między elementami detektora poza osią^32,33. Zebranie całego wzoru rozpraszania (dyfrakcji) 2D na piksel definiuje metodę znaną jako 4D STEM³⁴, która umożliwia rekonstrukcję wielu kontrastów obrazu na podstawie tych samych oryginalnych danych. Czterowymiarowy STEM umożliwia ptychografię elektronową, która stanowi kolejny sposób na uzyskanie kontrastu fazowego³⁵.

Skupiliśmy się na konkretnej modalności STEM, którą uważamy za najbardziej przydatną do badania organelli i nienaruszonych komórek lub skrawków komórek o grubości mikronów. Wiąże się to w szczególności z zastosowaniem obrazowania BF z małym kątem półzbieżności w oświetleniu i stosunkowo dużym kątem zbierania w detektorze. Mała zbieżność zapewnia dużą głębię ostrości, dzięki czemu cała próbka pozostaje ostra w całej serii pochylenia¹⁹. W praktyce, przy dobrym stoliku mikroskopowym, może to również wyeliminować potrzebę regulacji ostrości podczas akwizycji. Cena jest kompromisem w rozdzielczości, jak opisano w sekcji 3 protokołu. Zaproponowaliśmy obrazy 4k z sondą o długości fali ~2 nm, która przy odstępie między pikselami 1 nm osiąga pole widzenia 4 μm. Czytelnik jest jednak gorąco zachęcany do eksperymentowania. Druga kwestia dotyczy strony detektora. Gdy dysk oświetleniowy wypełnia detektor BF na osi, kontrast fazowy jest tłumiony i dominuje kontrast rozpraszania (amplitudy); Ten stan został nazwany niespójnym kontrastem jasnego pola³⁶. Pytanie brzmi, o jaką frakcję należy niedopełnić, a odpowiedź zależy od próbki. Bardzo cienka próbka będzie wykazywać najlepszy kontrast z całkowicie wypełnionym detektorem (tj. kąt zbierania odpowiadający oświetleniu), ale grubsza próbka rozproszy całą intensywność, pozostawiając zaszumiony sygnał o słabym kontraście. Przydatną zasadą jest to, że im grubsza próbka, tym większy zewnętrzny kąt odcięcia detektora BF powinien wynosić²¹. Rozmiar i położenie detektora są oczywiście stałe, więc rozmiar tarczy dyfrakcyjnej jest regulowany za pomocą długości kamery, jak opisano w rozdziale 1. Jeśli ustawienia wzmacniacza detektora są takie, że sygnał wypełnia zakres dynamiki, ale nie nasyca się przy bezpośrednim oświetleniu (1.12.3), wówczas długość kamery można zwiększać, aż do osiągnięcia rozsądnego natężenia sygnału i kontrastu. Ponownie czytelnik jest zachęcany do eksperymentowania. Sztuka, że tak powiem, tkwi w kątach.

Kolejnym parametrem, nieomówionym w protokole, jest napięcie przyspieszenia mikroskopu. Oddziaływanie świecących elektronów z próbką będzie silniejsze przy niższym napięciu. Przy wszystkich innych równych sobie możemy spodziewać się wyższego kontrastu przy niższym napięciu. Z drugiej strony, to początek wielokrotnego rozpraszania w próbce ogranicza użyteczną grubość próbki, więc wyższe napięcie pozwala na użycie grubszych próbek. Efekty te są jednak dość subtelne. Nasze dotychczasowe doświadczenia z przyspieszeniami 200 kV i 300 kV są podobne.

Biorąc pod uwagę to, czego można oczekiwać od STEM pod względem rozdzielczości, to znowu zależy od próbki i konfiguracji detektora. Stosując podejście oparte na analizie pojedynczych cząstek, jony metali na ferrytynie mogą być lokalizowane przez pierścieniowe ciemne pole STEM z dokładnością do kilku angstremów³⁷. Niedawno uzyskano rozdzielczość subnanometrową dla próbek wirusów i białek przy użyciu obrazów uzyskanych za pomocą zintegrowanego kontrastu różnicowego fazowego (iDPC) STEM³² , a także ptychografii³⁵. W przypadku unikalnych obiektów w grubych próbkach komórkowych i przy opisanych tutaj metodach, tak wysoka rozdzielczość nie jest realistyczna. Optymalna rozdzielczość to średnica sondy, która odnosi się do opisanego kąta półzbieżności. Inne czynniki obniżą rozdzielczość, w szczególności próbkowanie grubych pikseli w celu osiągnięcia dużego pola widzenia, niewspółosiowość w serii nachylenia i rozproszenie wiązki sondy podczas transmisji. Obrazy dobrze wypadają w porównaniu z tomografią przekroju plastycznego. Na przykład przy opisanej tutaj konfiguracji powinno być łatwo dostrzec pusty rdzeń mikrotubul, ale nie poszczególne protofilamenty.

Podsumowując, zarówno metody, jak i sprzęt STEM są w fazie rozwoju. Możemy się spodziewać, że innowacje w obrazowaniu wpłyną również na tomografię, wprowadzając STEM do dziedzin, które nie były dostępne za pomocą innych technik. Spodziewamy się, że szczególnie owocna będzie konwergencja z korelacyjnym obrazowaniem fluorescencji kriogenicznej w oparciu o nowoczesne metody optyczne superrozdzielczościowe. Skala organelli, 100-1000 nm, jest idealnym celem dla tych nowych metod.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM to bezpłatna platforma oprogramowania do sterowania mikroskopem i akwizycji danych.
		elektronowy z funkcją STEM	Protokół został napisany na podstawie doświadczeń z kilkoma mikroskopami Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica i Tecnai T20-F. W zasadzie powinno to mieć zastosowanie również do innych producentów.

Transmisyjny mikroskop