Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

BS3 Chemiczny test sieciowania: ocena wpływu przewlekłego stresu na prezentację receptora GABAA na powierzchni komórki w mózgu gryzonia

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65063

⸱

26 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Addiction and Mental Health (CAMH), Campbell Family Mental Health Research Institute, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Psychiatry, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Test chemicznego sieciowania BS3 ujawnia zmniejszoną ekspresję receptora GABAA na powierzchni komórek w mózgach myszy w warunkach przewlekłego stresu psychospołecznego.

Streszczenie

Lęk to stan emocji, który w różny sposób wpływa na zachowania zwierząt, w tym na funkcje poznawcze. Behawioralne oznaki lęku są obserwowane w całym królestwie zwierząt i można je rozpoznać jako adaptacyjne lub nieadaptacyjne reakcje na szeroki zakres modalności stresu. Gryzonie stanowią sprawdzony model eksperymentalny do badań translacyjnych zajmujących się integracyjnymi mechanizmami lęku na poziomie molekularnym, komórkowym i obwodowym. W szczególności paradygmat przewlekłego stresu psychospołecznego wywołuje nieadaptacyjne reakcje naśladujące fenotypy behawioralne podobne do lęku/depresji, które są analogiczne między ludźmi a gryzoniami. Podczas gdy poprzednie badania wykazały znaczący wpływ przewlekłego stresu na zawartość neuroprzekaźników w mózgu, wpływ stresu na poziom receptorów neuroprzekaźników jest niedostatecznie zbadany. W tym artykule przedstawiamy eksperymentalną metodę ilościowego oznaczania poziomów receptorów neuroprzekaźników na powierzchni neuronów u myszy narażonych na przewlekły stres, ze szczególnym uwzględnieniem receptorów kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), które są zaangażowane w regulację emocji i funkcji poznawczych. Używając nieprzepuszczalnego dla błony, nieodwracalnego chemicznego środka sieciującego, suberianu bissulfosuccinimidylu (BS3), pokazujemy, że przewlekły stres znacznie obniża dostępność powierzchniową receptorówGABA A w korze przedczołowej. Poziomy neuronalne receptorówGABA A są procesem ograniczającym szybkość neurotransmisji GABA i dlatego mogą być używane jako marker molekularny lub wskaźnik zastępczy stopnia fenotypów podobnych do lęku / depresji w eksperymentalnych modelach zwierzęcych. To podejście sieciowania ma zastosowanie do różnych systemów receptorowych dla neuroprzekaźników lub neuromodulatorów ulegających ekspresji w dowolnym regionie mózgu i oczekuje się, że przyczyni się do głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw emocji i funkcji poznawczych.

Wprowadzenie

Receptory neuroprzekaźników są zlokalizowane albo na powierzchni błony plazmatycznej neuronów, albo wewnątrzkomórkowo na endobłonach (np. endosom, retikulum endoplazmatyczne [ER] lub aparat trans-Golgiego) i dynamicznie przemieszczają się między tymi dwoma przedziałami w zależności od wewnętrznych stanów fizjologicznych neuronów lub w odpowiedzi na aktywność zewnętrznej sieci neuronowej1,2. Ponieważ nowo wydzielane neuroprzekaźniki wywołują swoje funkcje fizjologiczne głównie poprzez powierzchniowo zlokalizowaną pulę receptorów, poziomy receptorów powierzchniowych dla danego neuroprzekaźnika są jednym z krytycznych wyznaczników jego zdolności sygnalizacyjnej w obrębie obwodu neuronalnego3.

Dostępnych jest kilka metod monitorowania poziomów receptorów powierzchniowych w hodowanych neuronach, w tym test biotynylacji powierzchniowej4, test immunofluorescencyjny ze specyficznym przeciwciałem w warunkach nieprzepuszczalnych5, lub użycie transgenu receptora genetycznie połączonego z wrażliwym na pH fluorescencyjnym wskaźnikiem optycznym (np. pHluorin)6. W przeciwieństwie do tego, podejścia te są albo ograniczone, albo niepraktyczne przy ocenie poziomów receptorów powierzchniowych in vivo. Na przykład procedura biotynylacji powierzchniowej może nie być praktyczna w przypadku przetwarzania dużych ilości i liczby próbek tkanek mózgowych in vivo ze względu na jej stosunkowo wysoką cenę i późniejsze etapy niezbędne do oczyszczenia biotynylowanych białek na kulkach sprzężonych z awidyną. W przypadku neuronów osadzonych w trójwymiarowej architekturze mózgu, niska dostępność przeciwciał lub trudności w kwantyfikacji pod mikroskopem mogą stanowić istotne ograniczenie w ocenie poziomów receptorów powierzchniowych in vivo. Aby zobrazować rozmieszczenie receptorów neuroprzekaźników w nienaruszonych mózgach, można zastosować metody nieinwazyjne, takie jak pozytonowa tomografia emisyjna, do pomiaru zajętości receptorów i oszacowania poziomów receptorów powierzchniowych7. Jednak podejście to opiera się w dużej mierze na dostępności określonych ligandów radiowych, drogim sprzęcie i specjalistycznej wiedzy, co sprawia, że jest ono mniej dostępne do rutynowego stosowania przez większość badaczy.

Tutaj opisujemy prostą, wszechstronną metodę pomiaru poziomów receptorów powierzchniowych w eksperymentalnych mózgach zwierząt ex vivo za pomocą rozpuszczalnego w wodzie, nieprzepuszczalnego dla błony chemicznego środka sieciującego, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 celuje w aminy pierwszorzędowe w łańcuchu bocznym reszt lizyny i może kowalencyjnie sieciować białka w bliskim sąsiedztwie. Kiedy wycinki mózgu są świeżo przygotowane z obszaru zainteresowania i inkubowane w buforze zawierającym BS3, receptory na powierzchni komórki są sieciowane z sąsiednimi białkami, a tym samym przekształcają się w gatunki o wyższej masie cząsteczkowej, podczas gdy wewnątrzkomórkowe receptory związane z błoną endomembranową pozostają niezmodyfikowane. W związku z tym powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe pule receptorów można rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) i oznaczyć ilościowo za pomocą western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla badanego receptora.

Nieprzewidywalny przewlekły łagodny stres (UCMS) to dobrze ugruntowany eksperymentalny paradygmat wywoływania przewlekłego stresu psychospołecznego u gryzoni10. UCMS wywołuje lękowe/depresyjne fenotypy behawioralne i deficyty poznawcze poprzez modulację szeregu systemów neuroprzekaźników, w tym GABA i jego receptorów10,11. W szczególności receptor GABAA zawierający podjednostkę α5 (α5-GABAAR) jest zaangażowany w regulację pamięci i funkcji poznawczych12,13, co sugeruje możliwy udział zmienionych funkcji tej podjednostki w deficytach poznawczych wywołanych przez UCMS. W tym protokole zastosowaliśmy test sieciowania BS3 do ilościowego określenia poziomów ekspresji powierzchniowej α5-GABAAR w korze przedczołowej myszy narażonych na UCMS w porównaniu z niezestresowanymi myszami kontrolnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace nad zwierzętami w tym protokole zostały wykonane zgodnie z Ustawą o Zwierzętach do Badań w Ontario (RSO 1990, Rozdział A.22) oraz Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC) i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Określ liczbę zwierząt, które mają być użyte w eksperymentach, i podziel je na odpowiednie grupy lub kohorty eksperymentalne. Zobacz sekcję dyskusji, aby zapoznać się z dyskusją na temat wielkości grupy, płci i mocy statystycznej.
    UWAGA: Ten protokół jest dostosowany do myszy (szczep C57BL6/J; wiek 2-4 miesięcy; zazwyczaj 20-30 g masy ciała; należy użyć równoważnej liczby samców i samic).
  2. Umieść zwierzęta w UCMS lub kontrolnych warunkach bezstresowych przez 5-8 tygodni, postępując zgodnie z protokołem opisanym wcześniej14.
  3. Po ostatniej procedurze UCMS należy pozwolić zwierzętom pozostać w klatkach domowych przez 1 dzień przed użyciem ich do testu sieciowania, aby uniknąć ostrego wpływu stresu na ekspresję receptorów.

2. Przygotowanie roztworów podstawowych

  1. Przygotuj i przechowuj następujące roztwory zgodnie z instrukcją przed testem.
    1. Przygotować 5 M NaCl, rozpuszczając 14,6 g NaCl w 40 ml wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Przygotować 1,08 M KCl, rozpuszczając 3,22 g KCl w 40 ml wody dejonizowanej. Sklep w RT.
    3. Przygotować 400 mM MgCl2 rozpuszczając 3,25 g MgCl2·6H2O w 40 ml wody dejonizowanej. Sklep w RT.
    4. Przygotować 1 M glicyny, rozpuszczając 3 g glicyny w 40 ml wody dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj 1 M ditiotreitol (DTT), rozpuszczając 1,54 g DTT w 10 ml wody dejonizowanej. Przesterylizuj go przez filtr o wielkości porów 0,2 μm i podziel na probówki o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    6. Przygotuj 10% Nonidet-P40 (NP-40), rozcieńczając go w stosunku 1:10 (v/v) w wodzie dejonizowanej. Sklep w RT.
    7. Przygotować 0,5 M EDTA (pH = 8,0) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    8. Przygotować 1 M bufor HEPES (pH = 7,2-7,5) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    9. Przygotować 2,5 M lub 45% (w/v) glukozy i przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie stanowiska pracy

  1. W dniu testu sieciowania BS3 należy zebrać następujące materiały w pomieszczeniu do przeprowadzania sekcji zwierząt (Rysunek 1), z kilkoma elementami wstępnie schłodzonymi na lodzie: wiadro na lód, metalowy blok temperatury (wstępnie schłodzony na lodzie), lodowaty PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zamrożony PBS na szalce Petriego, bibuła filtracyjna zwilżona PBS i umieszczona na schłodzonej płaskiej powierzchni lub niebieskim lodzie, matryca mózgowa (odstęp 1 mm do włożenia żyletki) wstępnie schłodzona na lodzie, żyletki (~10) wstępnie schłodzone na lodzie, narzędzia do preparowania (nożyczki, kleszcze, zakrzywiona sonda), dziurkacz do bibuły, papier do wycierania w sprayu 70% etanolu i ręczniki papierowe, końcówki do pipet (200 μl), pipetor (P200), stoper, notatnik, długopis i probówki do mikrowirówek (1,5 ml).
    1. Przed badaniem należy oznaczyć probówki do mikrowirówek informacjami o próbce (np. numerem identyfikacyjnym zwierzęcia, rodzajem leczenia [UCMS a brak stresu (NS)], regionem mózgu, z BS3 lub bez niego itp.).
      UWAGA: W przypadku testów sieciowania BS3 należy pobrać dwie próbki z każdego regionu mózgu; jedna próbka zostanie użyta do sieciowania (z BS3), a druga do reakcji bez sieciowania (bez BS3) jako kontrola. Dlatego, aby pobrać próbkę z dwóch regionów mózgu (tj. kory przedczołowej [PFC] i hipokampa [HPC]) u 12 myszy, oznacz 48 probówek do wstępnego pobierania próbek (= 2 próbki × 2 regiony × 12 myszy) (do użycia w sekcji 6). Oznaczyć dodatkowe dwa zestawy po 48 probówek do późniejszego przechowywania (do przechowywania dwóch różnych objętości [100 μl, 300 μl] każdej próbki) (do użycia w sekcji 7). W związku z tym wymagane jest oznakowanie łącznie 144 probówek dla tej wielkości kohorty.
  2. Ponadto należy upewnić się, że w laboratorium dostępny jest następujący sprzęt: stołowa wirówka z chłodzeniem, sonikator, rotator probówkowy (do stosowania w chłodni lub wewnątrz lodówki [4 °C]), zamrażarka (−80 °C) do przechowywania próbek oraz wiadro z suchym lodem do czasowego przechowywania próbek (do wykorzystania w sekcji 7)

4. Przygotowanie roztworów roboczych i

UWAGA: Rano w dniu testu przygotuj następujące roztwory. Obliczenia te opierają się na rozwiązaniach niezbędnych do przetworzenia dwóch regionów mózgu (tj. PFC i HPC) od 12 myszy.

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF, pH = 7,4), jak podano w Tabeli 1. Dozować 750 μl aCSF do każdej probówki do pobierania próbek (48 probówek oznaczonych w kroku 3.1.1) i umieścić je w metalowym bloku temperatury na lodzie w celu wstępnego schłodzenia buforu.
  2. Przygotować bufor do lizy, jak podano w tabeli 2. Przechowywać na lodzie (400 μl na próbkę).
  3. Przygotować 52 mM roztwór podstawowy BS3 (26x) w 5 mM buforze cytrynianu sodu (pH = 5,0).
    1. Najpierw przygotuj 100 mM kwasu cytrynowego (zapas A) i 100 mM cytrynianu sodu (zapas B).
    2. Rozcieńczyć zapas A i zapas B w stosunku 1:20 wodą dejonizowaną. Dodaj po 100 μl do 1,9 ml wody, aby przygotować odpowiednio 5 mM kwasu cytrynowego (zapas C) i 5 mM cytrynianu sodu (zapas D).
    3. Zmieszać 410 μl roztworu C i 590 μl roztworu D, aby przygotować 5 mM bufor cytrynianu sodu (pH = 5,0) (roztwór E, 1 ml).
    4. Potwierdzić pH roztworu E za pomocą paska wskaźnika pH.
    5. Rozpuścić 24 mg BS3 w 806,4 μl roztworu E, wirując przez 30 sekund w celu przygotowania roztworu podstawowego BS3 (26x).
    6. Przygotować kolejny 1 ml roztworu E do użycia jako kontrola nośnika dla próbek niesieciujących.
      UWAGA: Przygotuj roztwór podstawowy BS3, gdy wszystko inne jest gotowe i eksperyment ma się rozpocząć. BS3 należy przechowywać w stanie wysuszonym w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Po rozpuszczeniu BS3 pozostaje aktywny tylko przez około ≤3 godziny. Ponieważ podaje się, że pH buforu cytrynianu sodu (roztwór E) o stężeniu 5 mM wzrasta z czasem, powodując przyspieszoną hydrolizę BS3, zaleca się, aby roztwór E był przygotowywany świeżo z roztworów podstawowych A i B9. Ze względu na ograniczoną rozpuszczalność BS3 w niskich temperaturach, rozpuszczony BS3 należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Rozpuszczony BS3 należy zużyć w ciągu 3 godzin i nie zamrażać/rozmrażać ani ponownie używać rozpuszczonego BS3.

5. Sekcja tkanek mózgowych

UWAGA: Od tego etapu, co najmniej dwie osoby powinny współpracować ze sobą w skoordynowany sposób. Podczas gdy jedna osoba skupia się na sekcji zwierząt (kroki 5.2-5.10 i 6.3), druga osoba powinna pracować jako chronometrażysta i pomagać w koordynowaniu testu (krok 5.1, krok 6.1, krok 6.2, krok 6.4 i krok 6.5)

  1. Przynieś pierwsze zwierzę do sekcji z pomieszczenia do pomieszczenia do prosektorium.
    UWAGA: Ponieważ ostre czynniki stresogenne (np. nowe środowisko, zapach krwi) mogą wpływać na dynamikę białek mózgowych, zwierzęta powinny być trzymane w swoich domowych klatkach umieszczonych z dala od obszaru sekcji, a następnie powinny być przenoszone pojedynczo do prosektorium w celu natychmiastowego ścięcia głowy.
  2. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dekapitację. Natychmiast wyjmij mózg z czaszki i zanurz go w lodowatym PBS na szalce Petriego na 10-15 s (Ryc. 2).
    UWAGA: Zwierzęta nie są znieczulane do eksperymentów BS3, ponieważ każdy środek znieczulający może potencjalnie wpłynąć na poziom prezentacji powierzchni receptorów neuroprzekaźników9.
  3. Umieść schłodzony mózg w macierzy mózgowej na lodzie, brzuszną stroną mózgu skierowaną do góry (Ryc. 3).
  4. Włóż pierwszą żyletkę przez granicę między opuszką węchową a szypułką węchową, aby przeciąć mózg koronalnie (Rysunek 4). Używając trzech do czterech dodatkowych żyletek, seryjnie naciąć przednią część mózgu w odstępach 1 mm.
  5. Podnieś wycinki koronalne z macierzy mózgowej, trzymając wszystkie włożone żyletki razem, pozostawiając tylną część mózgu w tyle w macierzy mózgowej. Użyj kleszczy, aby oddzielić żyletki od siebie i umieść je na płaskiej, schłodzonej powierzchni wycinkiem mózgu skierowanym do góry (Rysunek 5).
  6. Zidentyfikuj wycinki zawierające obszar zainteresowania. W celu pobrania próbki PFC należy wybrać drugi i trzeci plasterek znajdujący się za pierwszym wycinkiem zawierającym szypułkę węchową.
  7. Usuń obszar zainteresowania za pomocą dziurkacza do tkanek (Wideo 1), odłóż go na schłodzoną żyletkę i równomiernie podziel tkankę na dwie części (np. Tkanki z lewej i prawej półkuli, przy czym jedna połowa ma być użyta do reakcji sieciowania BS3, a druga połowa do kontroli bez sieciowania, jeśli docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania jest równomiernie wyrażane w obu półkulach).
  8. Zmiel każdą tkankę na kawałki na żyletce za pomocą cienkiej końcówki kleszczy, wykonując wiele pionowych ruchów na ostrzu (wideo 2), zamiast miażdżyć lub mielić tkanki. Pozwoli to zmaksymalizować powierzchnię dostępną dla BS3 bez poważnego naruszenia integralności błony komórkowej. Natychmiast po rozdrobnieniu należy przenieść rozdrobnione tkanki do odpowiednich probówek (patrz krok 6.3).
  9. W celu pobrania próbki HPC wyjmij tylną część mózgu z matrycy i umieść mózg na zwilżonej bibule filtracyjnej na schłodzonej płaskiej powierzchni, stroną grzbietową skierowaną do góry (Rysunek 6).
  10. Używając zakrzywionej sondy i kleszczy, zbliżając się od strony grzbietowej (wideo 3), wypreparuj HPC (połowa grzbietowa, połowa brzuszna lub oba) z obu półkul (jedna połowa do sieciowania BS3, a druga połowa do kontroli). Zmielić każdą tkankę jak w kroku 5.8 i przenieść tkankę do odpowiednich probówek (patrz krok 6.3).
    UWAGA: Cały czas sekcji dla każdego zwierzęcia powinien być utrzymywany na poziomie ~5 minut, aby warunki doświadczalne i wyniki były spójne.

6. Reakcja sieciowania

  1. Przynieś następne zwierzę do sekcji z pomieszczenia do pomieszczenia prosektoryjnego, gdy sekcja mózgu poprzedniej myszy ma się zakończyć (krok 5.10).
  2. Do probówki wstępnie schłodzonej na lodzie (od kroku 4.1) należy napełnić 30 μl roztworu BS3 (26x) lub roztworu nośnika E tuż przed tym, jak zmielone tkanki będą gotowe do przeniesienia do odpowiednich probówek. Zmień końcówki pipet między probówkami, aby upewnić się, że BS3 nie jest zanieczyszczony w rurkach kontrolnych bez sieciowania.
  3. Przenieś zmielone tkanki (z kroku 5.8 i kroku 5.10) do odpowiednich probówek, a następnie rozpocznij sekcję następnego zwierzęcia (krok 5.2)
  4. Odwróć i wymieszaj probówkę, aby rozbić kawałki tkanki na mniejsze kawałki (Wideo 4) i rozpocznij inkubację próbek na rotatorze probówki w chłodni przez 30 minut do 2 godzin. Zapisz czas rozpoczęcia inkubacji BS3 dla każdej probówki. Zobacz sekcję dyskusji, aby uzyskać informacje na temat optymalnego czasu inkubacji.
  5. Ugasić reakcję, napełniając probówkę 78 μl 1 M glicyny, a następnie inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C ze stałą rotacją. Zapisz czas rozpoczęcia i zakończenia hartowania dla każdej probówki. Kontynuuj pomaganie osobie skupiającej się na sekcji zwierzęcia, przynosząc następne zwierzę (krok 6.1) i pomagając w sieciowaniu (krok 6.2).
    UWAGA: Każdą próbkę należy traktować dokładnie w tym samym czasie we wszystkich próbkach. Jeśli pomieszczenie do przeprowadzania sekcji znajduje się daleko od pomieszczenia chłodniczego, zdecydowanie zaleca się zatrudnienie trzeciej osoby, która weźmie udział w inkubacji próbki i hartowaniu w chłodni.

7. Liza tkanek, przygotowanie białka i western blot

  1. Po 10 minutach hartowania (etap 6.5) wirować próbki w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Jeśli dostępna jest trzecia osoba, przejdź do kroku 7.2; W przeciwnym razie należy zamrozić próbki na suchym lodzie i wstrzymać test do czasu zakończenia sekcji mózgu (sekcja 5) i sieciowania (sekcja 6) dla wszystkich zwierząt.
  2. Dodać 400 μl lodowatego buforu do lizy na probówkę.
  3. Sonikować próbki przez 1 s pięć razy w odstępach 5 s pomiędzy nimi, utrzymując próbki na lodzie.
  4. Wiruj próbki o masie 20 000 x g przez 2 minuty, aby odwirować nierozpuszczalne resztki tkanek (osady) i uratować supernatant.
  5. Użyć 5 μl supernatantu do pomiaru stężenia białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
  6. Podzielić pozostałą część supernatantu na dwie probówki; jedna probówka zawiera 100 μl supernatantu do następnego western blot, a druga probówka zawiera resztę (~300 μl) do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C. Dodać do próbek odpowiednią ilość 4x bufor próbki SDS (uzupełniony β2-merkaptoetanolem), i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  7. Uruchom 10-20 μg białka na studzienkę na żelu akrylowym do elektroforezy (SDS-PAGE), a następnie przenieś białka do membrany polifluorku winylidenu (PVDF) w celu analizy western blot.
  8. Zablokować membranę PVDF w 5% (w/v) odtłuszczonym mleku rozpuszczonym w soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającej 0,1% Tween-20 (TBS-T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Krótko przemyć błonę dwukrotnie TBS-T i inkubować ją z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w TBS-T przez noc w temperaturze 4 °C.
  10. Przeciwciało pierwszorzędowe zmyć trzykrotnie po 10 minut w TBS-T w temperaturze pokojowej.
  11. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową rozcieńczonym w TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  12. Przeciwciało drugorzędowe zmyć trzykrotnie po 10 minut w TBS-T w temperaturze pokojowej.
  13. Inkubować membranę w odczynniku o wzmocnionej chemiluminescencji i wykrywać sygnał za pomocą aparatury do dokumentacji żelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wykazać możliwość zastosowania testu sieciowania BS3 do oceny powierzchniowych poziomów α5-GABAAR w PFC myszy, przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE dla próbek 10 µg białka sieciowanego BS3 oraz białka nieseciowanego, a następnie przeanalizowano białka metodą western blot przy użyciu przeciwciała anty-α5-GABAAR (królicze poliklonalne) (Rysunek 7). Próbki białka nieseciowanego wykazały całkowitą ilość α5-GABAAR przy ~55 kDa, natomiast próbki białka sieciow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż wpływ przewlekłego stresu psychospołecznego na zachowania (tj. emocjonalność i deficyty poznawcze) oraz zmiany molekularne (tj. zmniejszona ekspresja genów GABA-ergicznych i towarzyszące temu deficyty w neurotransmisji GABA-ergicznej) są dobrze udokumentowane10, mechanizmy leżące u podstaw takich deficytów wymagają dalszych badań. W szczególności, biorąc pod uwagę niedawne badanie pokazujące, że przewlekły stres znacząco wpływa na proteom neuronalny poprzez przeciążenie funkcji ER, a tym s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują personelowi zakładu dla zwierząt CAMH za opiekę nad zwierzętami przez cały czas trwania badania. Praca ta była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem (CIHR Project Grant #470458 dla T.T.), Discovery Fund z CAMH (dla T.P.), National Alliance for Research on Schizofrenia i Depresja (nagroda NARSAD #25637 dla E.S.) oraz Campbell Family Mental Health Research Institute (dla E.S.). E.S. jest założycielem Damona Pharmaceuticals, firmy biofarmaceutycznej, której celem jest wprowadzanie nowych związków GABA-ergicznych do kliniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
1 M HEPESGibco15630080
10x TBSBio-Rad1706435
2,5 M (45%, w/v) GlukozaSigmaG8769
2-merkaptoetanolSigmaM3148
4x SDS bufor do próbek (Laemmli)Bio-Rad1610747
Suberat bis(sulfosuccinimidylo)(BS3)PierceA39266Format bez ważenia; 10 x 2 mg
Macierz mózguTed Pella15003Dla myszy, 30 g dorosły, koronalny, 1 mm
Chlorek wapnia (CaCl2)SigmaC4901
Sonda zakrzywionaFine Science Tools10088-15Sonda anatomiczna ogólna; kątowy 45
Woda dejonizowanamilli-QEQ 7000Woda ultraczysta [rezystywność 18,2 MΩ &środkowa kropka; cm @ 25 ° C; całkowity węgiel organiczny (TOC) ≤ 5 ppb] 
Ditiothreitol (DTT)Sigma
(3MM)Kleszcze Whatman3030-917
(duże)Fine Science Tools11152-10Ekstra cienkie kleszcze Graefe
Kleszcze (małe)Fine Science Tools11251-10Dumont #5 Kleszcze
Przeciwciało GABA-A R alfa 5InvitrogenPA5-31163poliklonalny królik IgG; wykryć błędny sygnał po chemicznym sieciowaniu
GABA-A R alfa 5 C-końcowe przeciwciałoR& D SystemsPPS027Poliklonalna królicza IgG; reaguje krzyżowo z myszą i szczurem
GlycineSigmaW328707
IgG anty-króliczej persoksydazy chrzanowej anty-króliczej anty-króliczej peroksydazy chrzanowejBio-Rad1721019
Chlorek magnezu (MgCl2· 6H2O)SigmaM2670
Nonidet-P40, substytut (NP-40)SantaCruz68412-54-4
Chlorek potasu (KCl)SigmaP9541
Koktajl inhibitorów proteazySigmaP8340
Membrana PVDFBio-Rad1620177
Nożyczki (duże)Narzędzia do nauki o naprawie14007-14Nożyczki chirurgiczne - Nożyczki ząbkowane
(małe)Fine Science Tools14060-09Cienkie nożyczki - ostry
chlorek sodu (NaCl)SigmaS9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) Qsonica15338284
Wirówka stołowa z chłodzeniemEppendorf5425R
Dziurkacz do tkanek (ID 1 mm)Ted Pella15110-10Dziurkacz do biopsji Miltex z tłokiem, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Bufor transferowyBio-Rad10026938
Rotator probówek (LabRoller)LabnetH5000
Bibuła filtracyjna 10197777001

Bibliografia

  1. Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
  2. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  3. Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
  4. Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
  5. Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
  6. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
  7. Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
  8. Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
  9. Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
  10. Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
  11. Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
  12. Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
  13. Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
  14. Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208(2021).
  15. Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
  16. Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
  17. Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
  18. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
  19. Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358(2016).
  20. Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
  21. Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
  22. Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
  23. Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sieciowanie BS3receptor GABAreceptory powierzchni kom rkowejkora przedczo owaWestern blotsekcja tkanekmodel l ku
BS3 Chemiczny test sieciowania: ocena wpływu przewlekłego stresu na prezentację receptora GABAA na powierzchni komórki w mózgu gryzonia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.