Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65082

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Streszczenie

Pro-arytmiczne zaburzenie serca katecholaminergiczne polimorficzne częstoskurcze komorowe (CPVT) objawia się jako epizody polimorficznego częstoskurczu komorowego po aktywności fizycznej, stresie lub prowokacji katecholaminami, które mogą przekształcić się w potencjalnie śmiertelne migotanie komór. Serce myszy jest szeroko rozpowszechnionym gatunkiem do modelowania dziedzicznych chorób arytmicznych serca, w tym CPVT. Jednoczesne optyczne mapowanie potencjału transbłonowego (Vm) i stanów przejściowych wapnia (CaT) z serc myszy z perfuzją Langendorffa może wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw arytmogenezy. W porównaniu z badaniem na poziomie komórkowym, technika mapowania optycznego może testować niektóre parametry elektrofizjologiczne, takie jak określenie aktywacji, prędkość przewodzenia, czas trwania potencjału czynnościowego i czas trwania CaT. W artykule przedstawiono konfigurację oprzyrządowania i procedurę eksperymentalną wysokoprzepustowego mapowania optycznego CaT i Vm w mysich sercach typu dzikiego i heterozygotycznego RyR2-R2474S/+, w połączeniu z zaprogramowaną stymulacją elektryczną przed i w trakcie prowokacji izoproterenolem. Podejście to wykazało wykonalną i wiarygodną metodę mechanistycznego badania choroby CPVT w preparacie serca myszy ex vivo.

Wprowadzenie

Dziedziczna choroba serca katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT) objawia się epizodami polimorficznego częstoskurczu komorowego (PVT) po aktywności fizycznej, stresie lub prowokacji katecholaminą, które mogą przekształcić się w potencjalnie śmiertelne migotanie komór1,2,3,4. Ostatnie dowody po pierwszym raporcie jako zespół kliniczny w 1995 r. implikowały mutacje w siedmiu genach, wszystkie zaangażowane w sarkoplazmatyczne siatkowate (SR) magazynują uwalnianie Ca2 + w tym stanie: najczęściej zgłaszany RYR2 kodujący receptor ryanodine 2 (RyR2) kanałów uwalniania Ca2 + 5,6, FKBP12.67, CASQ2 kodujący sercową kalsekwetrynę8, TRDN kodujący skrzyżowane białko SR triadin9 oraz CALM19, CALM210 i CALM3 identycznie kodujące calmodulin11,12. Te wzorce genotypowe przypisują zdarzenia arytmiczne nieuregulowanemu patologicznemu uwalnianiu SR przechowuje Ca2 + 12.

Spontaniczne uwolnienie Ca2+ z SR może być wykryte jako iskry Ca2+ lub fale Ca2+, co aktywuje wymiennik Na+/Ca2+ (NCX). Wymiennik jednego Ca2+ na trzy Na+ generuje prąd wewnętrzny, który przyspiesza depolaryzację rozkurczową i doprowadza napięcie membrany do progu potencjału czynnościowego (AP). U myszy knock-in RyR2 zwiększona aktywność RyR2R4496C w węźle zatokowo-przedsionkowym (SAN) prowadzi do nieoczekiwanego zmniejszenia automatyzmu SAN o zależny od Ca2 + spadek wyczerpania ICa, L i SR Ca2 + podczas rozkurczu, identyfikując subkomórkowe zmiany patofizjologiczne przyczyniające się do dysfunkcji SAN u pacjentów z CPVT13,14. Wystąpienie powiązanych kardiomiocytów cytozylotycznych fal Ca2 + jest bardziej prawdopodobne po wzroście cytozolu tła [Ca2 +] po uczuleniu RyR przez katecholaminę, w tym izoproterenol (ISO), prowokację.

Szczegółowe zmiany kinetyczne w sygnalizacji Ca2+ po uwolnieniu Ca2+ za pośrednictwem RyR2 w odpowiedzi na aktywację potencjału czynnościowego (AP), które mogą być przyczyną obserwowanych komorowych zaburzeń rytmu serca w nienaruszonych modelach CPVT serca, pozostają do ustalenia dla pełnego zakresu zgłoszonych genotypów RyR212. W artykule przedstawiono konfigurację oprzyrządowania i procedurę eksperymentalną do wysokoprzepustowego mapowania sygnałów Ca2 + i potencjałów transbłonowych (Vm) w mysich sercach typu dzikiego (WT) i heterozygotycznego RyR2-R2474S/+, w połączeniu z zaprogramowaną stymulacją elektryczną przed i po prowokacji izoproterenolem. Protokół ten zapewnia metodę mechanistycznego badania choroby CPVT w izolowanych sercach myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Do eksperymentów wykorzystywane są samce 10 do 14-tygodniowych myszy typu dzikiego lub myszy RyR2-R2474S/+ (tło C57BL/6) o wadze 20-25 g. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego w Syczuanie w Chinach (zatwierdzenie nr 20160930) zgodnie z krajowymi wytycznymi, zgodnie z którymi działa instytucja.

1. Przygotowanie

  1. Roztwory podstawowe
    1. Roztwór podstawowy blibistatyny: Dodać 1 ml 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do oryginalnej kolby zawierającej 2,924 mg (-) blabistatyny w proszku, aby osiągnąć stężenie 10 mM.
    2. Wskaźnik napięcia RH237 roztwór podstawowy: Dodać 1 ml 100% DMSO do oryginalnej kolby z 1 mg proszku RH237, aby osiągnąć stężenie 2,01 mM.
    3. Wskaźnik wapnia Roztwór podstawowy Rhod-2 AM: Dodaj 1 ml 100% DMSO do 1 mg proszku Rhod-2 AM, aby osiągnąć stężenie 0,89 mM.
    4. Roztwór podstawowy Pluronic F127: Dodać 1 ml 100% DMSO do 200 mg Pluronic F127, aby osiągnąć stężenie 20% w/v (0,66 mM).
    5. Podwielokrotnić roztwory podstawowe do probówek PCR o pojemności 200 μl w 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM i 51 μl bibistatyny) do jednorazowego lub podwójnego użytku, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Następnie owinąć roztwory folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C, z wyjątkiem roztworu podstawowego Pluronic F127 umieszczonego w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze otoczenia.
  2. Roztwór perfuzyjny
    1. Roztwór Krebsa (w mM): Przygotować 1 l roztworu Krebsa (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH2PO4 1,0, KCl 4,7, MgCl2 1,05, CaCl2 1,35 i glukoza 10).
    2. Przefiltrować roztwór za pomocą aseptycznego filtra igłowego 0,22 μm i natlenić 95% O2/5% CO2 .
    3. Pobrać 40 ml roztworu Krebsa do probówki odśrodkowej o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu dalszej izolacji serca.
  3. System perfuzyjny Langendorffa i urządzenie do mapowania optycznego
    1. Skonfiguruj system perfuzyjny Langendorffa.
      1. Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 °C.
      2. Umyj system perfuzyjny Langendorff 1 litrem wody dejonizowanej.
      3. Roztworu należy wylać z przewodu doborowego i dostosować szybkość wypływu do 3,5-4 ml/min. Następnie natlenić perfuzat gazemO2/CO2 (95%/5%) w temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Bąbelki nigdy nie są dozwolone w systemie perfuzyjnym.
    2. Przygotuj system mapowania optycznego.
      1. Zainstaluj kamerę EMCCD (512 × 512 pikseli), obiektyw (40-krotne powiększenie), diody elektroluminescencyjne (LED) rozdzielające długość fali, monitor elektrokardiogramu (EKG) i elektrodę stymulacyjną (Rysunek 1).
      2. Dostosuj odpowiednią odległość roboczą od obiektywu do pozycji serca.
      3. Ustaw dwie diody LED w pozycji przekątnej wanny termostatycznej, aby uzyskać równomierne oświetlenie, zapewniając długość fali 530 nm do generowania światła wzbudzającego. Użyj filtra napylanego ET525/50, aby usunąć wszelkie światło spoza pasma dla diod LED.
      4. Wyreguluj przełącznik uchwytu, aby uzyskać równy kwadrat powierzchni docelowej, dzięki czemu obrazy napięcia i wapnia będą odpowiednio wyświetlane na interfejsie nabywczym.
      5. Obróć przysłonę obiektywu do maksymalnej średnicy, aby uniknąć wycieku voltage lub sygnały wapniowe.
      6. Ustaw obiektyw aparatu na odpowiedniej wysokości, ponieważ zapewnia on dobrą odległość roboczą od wanny termostatycznej, najczęściej stosuje się 10 cm.
      7. Włącz kamerę, aby uzyskać stabilną temperaturę próbkowania na poziomie -50 °C.

2. Procedury

  1. Żniwo, kaniulacja i perfuzja serca myszy
    1. Dootrzewnowo wstrzyknąć zwierzętom roztwór awertyny (1,2%, 0,5-0,8 ml) i heparynę (200 jednostek), aby zminimalizować cierpienie i odruch bólowy oraz zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi. Po 15 minutach należy złożyć zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Otwórz klatkę piersiową nożyczkami, ostrożnie zbierz serce i umieść je w zimnym roztworze Krebsa (4 °C, 95% O2, 5% CO2 ), aby spowolnić metabolizm i chronić serce.
    3. Usuń otaczającą tkankę aorty, kaniuluj aortę za pomocą specjalnie wykonanej igły kaniulującej (średnica zewnętrzna: 0,8 mm, średnica wewnętrzna: 0,6 mm, długość: 27 mm) i przymocuj ją za pomocą jedwabnego szwu 4-0.
    4. Perfuzja serca za pomocą systemu Langendorffa ze stałą prędkością 3,5-4,0 ml/min i utrzymywanie temperatury na poziomie 37 ± 1 °C.
      UWAGA: Wszystkie kolejne zabiegi są wykonywane w tym stanie.
    5. Włóż małą plastikową rurkę (o średnicy 0,7 mm, długości 20 mm) do lewej komory, aby uwolnić przekrwienie roztworu w komorze i uniknąć nadmiernego obciążenia wstępnego.
  2. Rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu i podwójnego ładowania barwnikiem
    1. Włożyć dwa przewody do perfuzatu w kąpieli, włączyć zasilanie skrzynki wzmacniacza EKG i sterownika stymulacji elektrycznej, a następnie uruchomić oprogramowanie EKG, do którego się odnosi, i monitorować EKG w sposób ciągły.
    2. Kolejne kroki wykonuj w ciemności, gdy serce osiągnie stan stabilny (serce bije rytmicznie z prędkością ~400 uderzeń na minutę).
    3. Zmieszaj 50 μl 10 mM roztworu podstawowego bróbstatyny z 50 ml roztworu Krebsa, aby osiągnąć stężenie 10 μM. Stale perfuzuj mieszaninę roztworu blebbisatyny i Krebsa do serca przez 10 minut, aby rozłączyć skurcz od wzbudzenia i uniknąć artefaktów skurczu podczas filmowania.
    4. Użyj czerwonej latarki, aby sprawdzić, czy skurcz serca całkowicie ustaje, ponieważ skurcz wpłynie na jakość ładowania barwnika.
    5. Po rozprzęgnięciu wzbudzenia-skurczu zmieszać 15 μl roztworu podstawowego Rhod-2 AM z 15 μl roztworu podstawowego Pluronic F127 w 50 ml roztworu Krebsa, aby osiągnąć końcowe stężenia 0,267 μM Rhod-2 AM i 0,198 μM Pluronic F127. Następnie perfuzję serca w sposób ciągły roztworem roboczym Rhod-2 AM przez 15 minut w systemie perfuzyjnym Langendorffa.
    6. Utrzymuj dopływ tlenu podczas wewnątrzkomórkowego ładowania barwnikiem wapniowym. Ponieważ pęcherzyki łatwo tworzą się w Pluronic F127, włóż pułapkę bąbelkową do systemu perfuzyjnego, aby uniknąć embolizacji gazowej naczyń wieńcowych.
    7. Rozcieńczyć 10 μl roztworu podstawowego RH237 w 50 ml perfuzatu do osiągnięcia końcowego stężenia przy 0,402 μM i wykonywać ładowanie przez 10 minut.
    8. Pod koniec ładowania podwójnym barwnikiem wykonaj sekwencję zdjęć, aby upewnić się, że zarówno sygnały napięcia, jak i wapnia są odpowiednie do analizy (brak interakcji między dwoma sygnałami).
  3. Mapowanie optyczne i indukcja arytmii
    UWAGA: Mapowanie optyczne rozpoczyna się po ustaniu skurczu i odpowiednim obciążeniu barwnikiem, a serce jest kolejno perfundowane, jak w krokach opisanych powyżej w 2.1 (4).
    1. Włącz dwie diody LED dla świateł wzbudzenia i dostosuj ich intensywność w odpowiednim zakresie (wystarczająco mocnym do oświetlenia i stosunkowo prostego filmowania, ale niezbyt wytrzymałym na prześwietlenie).
    2. Umieść serce pod urządzeniem wykrywającym, upewnij się, że jest odpowiednio oświetlone dwiema diodami LED i dostosuj średnicę plamki świetlnej do 2 cm.
    3. Ustaw odległość roboczą od obiektywu do serca na 10 cm, uzyskując częstotliwość próbkowania prawie 500 Hz i rozdzielczość przestrzenną 120 x 120 μm na piksel.
    4. Otwórz oprogramowanie do próbkowania sygnału, aby sterować kamerą cyfrowo w celu jednoczesnego przechwytywania sygnałów napięcia i wapnia.
    5. Uruchom stymulator pola mięśniotwórczego i ustaw wzorzec stymulacji na Transistor Transistor Logic (TTL), czas trwania stymulacji 2 ms dla każdego impulsu i 0,3 V jako intensywność początkową.
    6. Użyj 30 kolejnych bodźców S1 10 Hz, aby przetestować próg napięcia rozkurczowego serca sterowany przez oprogramowanie do rejestracji EKG. Stopniowo zwiększaj amplitudę napięcia, aż do uzyskania wychwytywania 1:1 (sprawdź falę QRS z monitora EKG, sygnały potencjału czynnościowego (AP) i stanów przejściowych wapnia (CaT)).
    7. Po określeniu progu napięcia, nadążaj za sercem z intensywnością 2-krotności progu napięcia rozkurczowego za pomocą pary platynowych elektrod przymocowanych do nasierdzia wierzchołka lewej komory (LV) (ELVA).
    8. Zaimplementuj protokół S1S1 do pomiaru przemian wapnia lub potencjału czynnościowego i właściwości restytucyjnych. Ćwicz kolejno tempo pracy serca przez podstawową długość cyklu wynoszącą 100 ms, zmniejszając długość cyklu o 10 ms w każdej następnej sekwencji, aż do osiągnięcia 50 ms. Każdy epizod to 30 następujących po sobie bodźców o szerokości impulsu 2 ms. W tym samym czasie rozpocznij mapowanie optyczne przed stymulacją (czas próbkowania obejmuje ~10 rytmów zatokowych i czas trwania stymulacji).
    9. Aby zmierzyć efektywny okres refrakcji komorowej (ERP) przy użyciu protokołu bodźca S1S2, zacznij od cyklu stymulacji S1S1 o długości 100 ms z S2 sprzężonym co 60 ms ze stopniowym zmniejszaniem o 2 ms, aż S2 nie uchwyci ektopowego zespołu QRS.
    10. W przypadku indukcji arytmii należy przeprowadzić nieustanne impulsy 50 Hz (50 ciągłych stymulacji elektrycznych o szerokości impulsu 2 ms) i wykonać ten sam epizod stymulacji po 2-sekundowym okresie spoczynku.
    11. Uważnie obserwuj zapisy EKG w ciągłym okresie stymulacji o wysokiej częstotliwości, tak aby jednoczesne zapisy mapowania optycznego mogły rozpocząć się natychmiast po wygenerowaniu interesującej arytmicznej fali EKG (ponieważ większość zaburzeń rytmu serca jest wywoływana przez stymulację elektryczną, sygnały optyczne są próbkowane 2-3 s przed stymulacją impulsową w przypadku utraty ważnych zdarzeń sercowych).
    12. Obraz za pomocą kamery EMCCD (częstotliwość próbkowania: 500 Hz, rozmiar piksela: 64 x 64).
  4. analiza danych
    1. Wczytywanie obrazu i przetwarzanie sygnału
      1. Naciśnij Wybierz folder i załaduj obrazy, aby załadować obrazy do oprogramowania do akwizycji obrazów w celu półautomatycznej analizy ogromnych danych wideo zgodnie z konfiguracją i protokołem opisanym wcześniej15,16.
      2. Wprowadź poprawne parametry próbkowania (takie jak rozmiar w pikselach i liczba klatek na sekundę).
      3. Ustaw próg obrazu poprzez ręczne wprowadzanie i wybierz obszar zainteresowania (ROI).
      4. Zaimplementuj filtr przestrzenny Gaussa 3 x 3 piksele, filtr Savitzky'ego-Goaly'ego i korekcję linii bazowej cylindra.
      5. Naciśnij przycisk Process Images, aby usunąć linię bazową i obliczyć parametry elektrofizjologiczne, takie jak APD80 i CaTD50.
    2. Analiza parametrów elektrofizjologicznych
      1. Ustaw czas inicjacji APD na szczycie i punkt końcowy na 80% repolaryzacji (APD80) w celu obliczenia APD80. Podobnie, czas rozpoczęcia CaTD jest zdefiniowany jako szczyt, a punkt końcowy jest zdefiniowany jako 80% relaksacji.
      2. Pomiar prędkości przewodzenia (CV) zależy od rozmiaru piksela i czasu przewodzenia potencjału czynnościowego między dwoma lub więcej pikselami. Oblicz średnią prędkość ze wszystkich wybranych pikseli - jest to średnia prędkość przewodzenia wybranego obszaru. Generuj jednocześnie odpowiednie mapy izochronne, aby uzyskać wyraźny obraz kierunku przewodzenia.
        UWAGA: O'Shea et al.15 szczegółowo opisali pomiar CV.
      3. W przypadku analizy alternanów i arytmii, alternany wapnia definiuje się jako ciągłą dużą i małą amplitudę piku występującą naprzemiennie. Użyj współczynnika amplitudy piku, aby ocenić nasilenie alternanów zależnych od częstotliwości (1-A2/A1). Zastosuj mapy fazowe do analizy złożonych arytmii, takich jak częstoskurcz komorowy (VT). Szukaj wirników, które pojawiają się wyraźnie w określonym obszarze, gdy wirniki się przesuwają.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mapowanie optyczne było w ciągu ostatniej dekady popularnym podejściem w badaniu złożonych arytmii serca. Układ do mapowania optycznego składa się z kamery EMCCD, zapewniającej częstotliwość próbkowania do 1 000 Hz i rozdzielczość przestrzenną 74 x 74 µm dla każdego piksela. Pozwala to na uzyskanie dość wysokiego stosunku sygnału do szumu podczas próbkowania sygnału (Rysunek 1). Gdy serce perfundowane metodą Langendorffa osiągnie stan stabilny, a ładowanie barwników zostanie zakończone, serc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opierając się na naszym doświadczeniu, kluczem do udanego mapowania optycznego serca myszy z podwójnym barwnikiem jest dobrze przygotowane rozwiązanie i serce, obciążenie barwnikiem, osiągnięcie najlepszego stosunku sygnału do szumu i redukcja artefaktu ruchu.

Przygotowanie roztworu
Roztwór Krebsa jest niezbędny do udanego eksperymentu na sercu. Roztwory podstawowe MgCl2 i CaCl2 (1 mol/l) przygotowuje się z wyprzedzeniem, biorąc pod uwagę ich absorpc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81700308 do XO i 31871181 do ML, a 82270334 do XT), Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Sichuan (CN) (2021YJ0206 do XO, 23ZYZYTS0433 i 2022YFS0607 do XT oraz 2022NSFSC1602 do TC) oraz Państwowe Kluczowe Laboratorium Chemii i Inżynierii Molekularnej Zasobów Medycznych (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 do XO), MRC (G10031871181 do ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE w Oksfordzie (ML).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 μ m filtr strzykawkowyFabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, ChinyNie dotyczyDo filtrowania roztworu
15 ml probówki wirówkowejGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinyCFT011150
1 ml pipety PasteuraBeijing Labgic Technology Co., Ltd. Chiny00900026
Strzykawka 1 mlB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μ L Rurka PCRSangon Biotech Co., Ltd. Szanghaj. ChinyF611541-0010Aliquote roztwory podstawowe  aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
50 ml probówki wirówkowejGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinyCFT011500Przechowuj roztwór Tyrode w temperaturze 4 & stopni; C do kontrolnej izolacji serca
Filtr 585/40 nmTechnologia ChromaN/AFiltr sygnału wapniowego
Filtr długoprzepustowy 630 nmTechnologia ChromaG15604AJFiltr sygnału napięciowego
Avertin (2,2,2-tribromoetanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Wielka BrytaniaT48402-100GAby zminimalizować cierpienie i odruch bólowy
BlebbistatynaTocris Bioscience, Minneapolis, MN, Stany ZjednoczoneSLBV5564Rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu do  eliminacji artefaktów ruchu podczas mapowania
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneSLBK1794VDla rozwiązania Tyrode
Wanna termostatyczna wykonana na zamówienieMappingLab, Wielka BrytaniaTBC-2.1Aby utrzymać temperaturę roztworu
perfuzyjnegoDimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Rozpuszczalnikdo barwników
Kleszcze DumontaFabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, ChinyOprogramowanie YAF030
ElectroMapUniversity of BirminghamN/AKwantyfikacja parametrów elektrycznych
Kamera EMCCDEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Stany ZjednoczoneA18G150001Pozyskiwanie obrazów sygnałów optycznych
Filtr napylany ET525/36Technologia Chroma319106Filtr wzbudzenia
GlukozaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneSLBT4811VDla roztworu Tyrode'a
Heparyna sodowaChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Chiny(H51021209)Aby zapobiec zakrzepom krwi w tętnicy wieńcowej
  Kleszcze do tęczówkiFabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, ChinyYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, Stany ZjednoczoneHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneSLBS5003Dla rozwiązania Tyrode
MacroLEDCairn Research, Faversham, Wielka Brytania7355/7356Światło wzbudzenia sond fluorescencyjnych
Źródło światła MacroLEDCairn Research, Faversham, Wielka Brytania7352Kontroluj diody LED
Nożyczki Mayo Fabrykasprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, ChinyYBC010
MetaMorph Molecular DevicesNie dotyczyPróbkowanie sygnałów optycznych
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneBCBS6841VDla rozwiązania Tyrode'a
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, Wielka BrytaniaM5337Podłącz stymulator elektryczny i oprogramowanie Spike2
Stymulator pola MyoPacer EPIon Optix Co, Milton, MA, Stany ZjednoczoneS006152Stymulator elektryczny
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneSLBS2340VDla rozwiązania Tyrode'a
NaH2PO4  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneBCBW9042Dla rozwiązania Tyrode
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany ZjednoczoneSLBX3605Dla rozwiązania Tyrode
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229Do wzmacniacza EKG
OmapScope5MappingLab, Wielka BrytaniaNie dotyczyAlternany wapnia i analiza arytmii
Nożyczki okulistyczneHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinyT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, Wielka Brytania6970Podziel światło emisyjne do wykrywania Ca2+ i Vm  jednocześnie
Pompa perystalycznaLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Chiny, BT100-2JDo pompowania roztworu
szalka PetriegoBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, StanyZjednoczone 1899021Aby zwiększyć obciążenie za pomocą Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone1971387Barwnik wrażliwy
na napięcie Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone1890519Wskaźnik wapnia
Rurka z żelem krzemionkowymLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Chiny,96402-16Połącz się z pompą perystaltyczną
Szew jedwabnyYuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Chiny20172650032Aby naprawić aortę
Spike2Cambridge Electronic Design limited, Wielka BrytaniaNie dotyczyRejestrowanie i analizowanie danych EKG
Stymulacja elektrodaMappingLab, Wielka BrytaniaSE1600-35-2020
T510lpxrTechnologia Chroma312461Do źródła światła
T565lpxrTechnologia Chroma321343 Do źródła światła

Bibliografia

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314(2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie z u yciem dw ch barwnik wmyszy z wprowadzeniem genu RyR2 knock inperfuzja Langendorffaprzej ciowe st enia wapniapotencja b onowyczas trwania potencja u czynno ciowegopr ba z izoproterenolemmodele arytmii serca
Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.