Artykuł metodologiczny

Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65087

⸱

15 września 2023

 ,  , 
1The Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA)

W tym artykule

Podsumowanie

Użycie referencyjnych odczynników do testów uwalniania cytokin pozwala na bardziej powtarzalne i standaryzowane profile bezpieczeństwa in vitro immunoterapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób testy uwalniania cytokin mogą być stosowane wraz z referencyjnym panelem odczynników do przewidywania bezpieczeństwa niektórych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych.

Streszczenie

Nowe leki immunostymulujące przeciwciała, zaprojektowane do bezpośredniej stymulacji określonych komórek odpornościowych lub pośrednio wzmacniania odpowiedzi immunologicznej poprzez blokowanie lub aktywację endogennego regulatora układu odpornościowego, mogą potencjalnie powodować poważne zdarzenia niepożądane związane z odpornością, takie jak zespół uwalniania cytokin (CRS). W związku z tym tak ważna jest ocena profilu bezpieczeństwa takich leków za pomocą kombinacji doświadczeń in vivo i in vitro przed podaniem pierwszej dawki u ludzi. Testy uwalniania cytokin (CRA), w których proponowana terapia przeciwciał jest hodowana wspólnie z ludzkimi komórkami odpornościowymi (takimi jak komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), krew pełna lub inna) i mierzona jest ilość wytwarzanej cytokiny zapalnej, mają kluczowe znaczenie dla identyfikacji zagrożeń. Jednak różne laboratoria stosujące różne przeciwciała kontrolne mogą zagrozić harmonizacji CRA, a klinicznie istotne kontrole (takie jak TGN1412) mogą być trudne do pozyskania, co może prowadzić do mniej dokładnych lub wiarygodnych wyników lub danych, które są trudne do porównania między laboratoriami. Włączenie kontroli dodatnich i ujemnych do agencji ratingowej może zapewnić dokładność i wiarygodność wyników. Narodowy Instytut Standardów Biologicznych i Kontroli (NIBSC) opracował panel liofilizowanych przeciwciał kontrolnych przeznaczonych do stosowania na różnych platformach CRA w celu harmonizacji wyników w różnych laboratoriach i metodach testowych. Zestaw trzech różnych przeciwciał kontroli pozytywnej obejmuje superagonistę anty-CD52, anty-CD3 i anty-CD28 (SA), o których wiadomo, że indukują CRS zależny od dawki u pacjentów. Każde przeciwciało jest wyposażone w dopasowane izotypowo ujemne przeciwciało kontrolne. Wcześniej wykazano, że ten panel odczynników referencyjnych ma dobrą odtwarzalność między laboratoriami i jest odpowiednią kontrolą w celu zwiększenia pewności i odporności danych dotyczących bezpieczeństwa z różnych platform CRA.

Wprowadzenie

Indukowane uwalnianie cytokin może być oczekiwanym i pożądanym efektem niektórych immunomodulujących przeciwciał monoklonalnych (mAb). Jednak nieoczekiwane uwolnienie cytokin prozapalnych może spowodować zespół uwalniania cytokin (CRS) u pacjentów charakteryzujących się gorączką, zmęczeniem, a nawet niewydolnością wielonarządową1. Dlatego tak ważne jest, aby nowe immunostymulujące przeciwciała monoklonalne były testowane in vitro pod kątem ich potencjału do wywoływania CRS poprzez pomiar uwalniania cytokin w teście uwalniania cytokin (CRA).

TGN1412 to przeciwciało monoklonalne, które zostało opracowane jako potencjalne leczenie przewlekłej białaczki limfocytowej komórek B, działając jako superagonista CD28 (CD28SA), zdolny do aktywacji limfocytów T poprzez sieciowanie receptora stymulującego CD282. W 2006 roku sześciu zdrowych ochotników, którym podawano TGN1412 w badaniu klinicznym, doświadczyło poważnych skutków ubocznych, w tym CRS, w ciągu kilku godzin od otrzymania leku1. Doprowadziło to do wstrzymania badania i wycofania TGN1412 z dalszego rozwoju. Inne przeciwciała, o których wiadomo, że powodują CRS jako efekt uboczny, to mAb anty-CD52, Campath-1H3 i mAb anty-CD3, Muromonab (OKT3)4. Biorąc pod uwagę ich zdolność do indukowania CRS zależnego od dawki u pacjentów, TGN1412, OKT3 i Campath-1H są odpowiednimi przeciwciałami kontroli pozytywnej do generowania solidnych i wiarygodnych wyników z CRA. Jednak te przeciwciała kontrolne nie były wcześniej łatwo dostępne ze względu na wysokie koszty lub ograniczoną dostępność.

Jednakże, zregenerowany liofilizowany panel referencyjny tych trzech przeciwciał5,6,7 wraz z kontrolami ujemnymi dopasowanymi izotypowo został niedawno udostępniony przez National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Wcześniej wykazano, że ten panel odczynników referencyjnych ma dobrą odtwarzalność międzylaboratoryjną8 i dlatego jest odpowiednią kontrolą zwiększającą pewność i solidność danych dotyczących bezpieczeństwa z różnych platform CRA. W związku z tym uzasadnieniem stosowania tego protokołu wraz z tymi odczynnikami jest poprawa harmonizacji CRA, z korzyścią wynikającą z tego, że odczynniki te zostały zatwierdzone w międzynarodowym badaniu zespołowym8.

Tutaj opisujemy, jak najlepiej wykorzystać ten panel odczynników referencyjnych w CRA w fazie stałej (SP) PBMC i CRA w fazie wodnej (AQ) pełnej krwi (WB) do przewidywania CRS wywołanego przeciwciałami. Oba te formaty CRA są komplementarne ze względu na sposób prezentacji przeciwciał (pośredni dla fazy stałej lub bezpośredni dla fazy wodnej) oraz ze względu na fakt, że są ukierunkowane na różne grupy komórek reagujących. Ten sam protokół może być dostosowany do stosowania z rozcieńczoną krwią pełną (dWB) lub z kokulturami śródbłonka: PBMC.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań NIBSC. Zgodnie z obowiązującymi przepisami i wytycznymi należy uzyskać pisemną świadomą zgodę zdrowego dawcy lub pacjentów. Użyj sterylnych technik, aby wykonać wszystkie etapy przygotowania protokołu w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu.

1. Przygotowanie płytki powlekanej z mAb do oznaczania w fazie stałej (SP)

  1. Rozpuścić zawartość ampułki z odczynnikiem odniesienia w 1 ml sterylnej wody destylowanej. Odczekaj 5-10 minut na ponowne nawodnienie przed zmieszaniem roztworu przeciwciał i przeniesieniem do sterylnej probówki z nakrętką.
  2. Po rozpuszczeniu w 1 ml wody stężenie podstawowe następujących rekombinowanych przeciwciał wyniesie 200 μg/ml: anty-CD3 (15/162), anty-CD52 (15/178), kontrola izotypu IgG1K (15/198) dla anty-CD52, kontrola izotypu IgG2a (15/218) dla anty CD3, kontrola izotypu IgG4 (15/232) dla anty-CD28SA.
  3. Po rozpuszczeniu w 1 ml wody stężenie podstawowe anty-CD28SA (15/144) wyniesie 100 μg/ml. W przypadku krótkotrwałego przechowywania do 7 dni należy przenieść odtworzony materiał w sterylnej probówce z nakrętką do temperatury 4 °C.
  4. Rozcieńczyć odtworzone przeciwciała i testowe przeciwciała do 10 μg/ml w sterylnym PBS i pokryć studzienki sterylnej, 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania z polipropylenu bez TC 100 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał (1 μg/basenik) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ważne jest, aby używać płytek polipropylenowych do adsorpcji białek, ponieważ były one używane w walidacji standardowych odczynników9.

2. Przygotowanie PBMC

  1. Pobrać co najmniej 30 ml obwodowej krwi pełnej (WB) do probówek zawierających heparynę/heparynę i kilkakrotnie odwrócić, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie z heparyną sodową.
  2. Przenieść 15 ml WB do oddzielnej probówki do wykorzystania później podczas przygotowywania testu krwi pełnej w fazie wodnej (etap 3.1)
  3. Rozcieńczyć pozostałe 15 ml krwi w stosunku objętościowym 1:1 za pomocą PBS lub pożywki RPMI-1640 bez surowicy i delikatnie nałożyć rozcieńczoną krew na wierzch 15 ml pożywki o gradiencie gęstości (np. lymphoprep, Ficoll-Hypaque) w probówce o pojemności 50 ml.
  4. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w odchylanym wirniku bez hamulca i ze zmniejszonym przyspieszeniem w celu rozdzielenia krwi na różne składniki.
  5. Po odwirowaniu gradient gęstości oddzieli się jako górna warstwa osocza, po której następuje cienka warstwa kożuchy zawierająca PBMC i dolna warstwa zawierająca czerwone krwinki (RBC) i granulocyty wielojądrzaste, w tym neutrofile i eozynofile. Ostrożnie zbierz PBMC, wkładając pipetę bezpośrednio przez górną warstwę osocza do PBMC. Alternatywnie, usuń górną warstwę przed pobraniem komórek.
  6. Delikatnie ponownie zawiesić kożuchową powłokę w 10 ml PBS lub pożywki RPMI-1640 bez surowicy. Ponownie odwirować probówkę o sile 500 x g przez 10 minut, aby otoczkować komórki. Usunąć supernatant i wyrzucić go.
  7. Powtórz krok prania 2.6. i ponownie zawieś osad w 2 ml RPMI z 10% FCS (kompletny RPMI-1640, cRPMI)
  8. Policz komórki za pomocą hemocytometru10.
  9. Dostosuj PBMC do stężenia 1 x 106 komórek/ml w cRPMI.

3. Przygotowanie testu uwalniania cytokin w fazie wodnej (AQ) krwi pełnej (WB)

  1. Dodać 190 μl WB do studzienek 96-dołkowej płyty polistyrenowej z dnem w kształcie litery U. Jeśli nie jest jeszcze przy 100 μg/ml, należy wstępnie rozcieńczyć wszystkie przeciwciała i odczynniki referencyjne do 100 μg/ml w PBS.
  2. Dodać 10 μl rozcieńczonych przeciwciał do 190 μl WB, aby uzyskać końcowe stężenie przeciwciał 5 μg/ml przeciwciała w 95% WB.
  3. Inkubować płytkę przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C.

4. Przygotowanie testu uwalniania cytokin PBMC w fazie stałej (SP)

  1. Za pomocą pipety wielokanałowej wyjąć i wyrzucić roztwór przeciwciała z powlekanych płytek (opisanych w kroku 1), napełnić zbiornik odczynnika PBS i przemyć płytkę 3x 200 μl PBS w celu usunięcia niezwiązanych mAb.
  2. Dodać 200 μl zawiesiny komórek z kroku 2.8 do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

5. Zbieranie supernatantu lub plazmy

  1. Po inkubacji przez 48 godzin z kontrolnymi i testowymi przeciwciałami monochromatycznymi, odwirować płytki o sile 400 x g przez 5 minut i zebrać kondycjonowaną komórkowo pożywkę lub osocze, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Zebrać supernatant lub osocze zamrozić w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że nie przeszkadzasz w tworzeniu się czerwonych krwinek podczas pobierania osocza.

6. Oznaczanie ilościowe cytokin w supernatancie lub osoczu

  1. Korzystając z pobranego supernatantu lub osocza, należy przeprowadzić analizę cytokin stężeń IFN-γ, IL-2, TNF-α i IL-6 przy użyciu preferowanej opcji multipleksowej. Przykładowa metoda analizy cytokin multipleksowych przy użyciu cytometrycznego testu kulkowego została wcześniej opublikowana11.
    UWAGA: Proszę zapoznać się z tabelą materiałów dla zestawu multipleksu, który został użyty do wygenerowania reprezentatywnych wyników.

Wyniki

Wyniki testu SP powinny wykazać uwalnianie IL-2, IFN-γ, IL-6 i TNF-α12 w zakresie pg/mL dla wszystkich przeciwciał kontroli pozytywnej po 48 h i powinny być statystycznie istotnie wyższe niż w przypadku dopasowanych kontroli izotypowych. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że przeciwciała kontroli pozytywnej, αCD28, αCD3 i αCD28SA, indukują istotnie wysokie poziomy IFN-γ, IL-6 i TNF-α w porównaniu z dopasowanymi kontrolami izotypowymi podczas przeprowadzania testu SP na PBMC (Rysunek 1). Test ten charakteryzuje się również wysoką krotnością zmiany (fold-change) uwalniania IL-2 po stymulacji αCD28SA w porównaniu z dopasowanym izotypem (859,0). Z kolei αCD3 i αCD52, mimo że nadal indukują ekspresję IL-2, skutkują niższymi krotnościami zmiany niż αCD28SA (odpowiednio 6,2 dla αCD3 i 3,3 dla αCD52, Rysunek 2).

W analizie WB AQ (Rysunek 3) poziom wykrywalnych cytokin jest wyraźnie niższy niż w analizie PBMC SP, lecz charakteryzuje się większą wrażliwością na stymulację przeciwciałem αCD52 (Rysunek 2 i Rysunek 3), przy czym średni wzrost poziomu IL-2, IFN-γ i IL-6 przekracza 100-krotność.

Przeciwciało testowe, w przypadku którego spodziewane jest, że przyszłe dawkowanie u ludzi nie spowoduje nieprzewidzianych istotnych wzrostów uwalniania cytokin w porównaniu z odpowiednimi kontrolami izotypowymi. Należy jednak uznać, że pozytywny wynik w CRA, zamiast wstrzymywać rozwój nowego terapeutycznego mAb, powinien być traktowany jako element zarządzania ryzykiem i korzyścią13. Podczas opracowywania nowej platformy CRA, test należy powtórzyć z wykorzystaniem innej grupy dawców, aby zapewnić odtwarzalność platformy. Należy również przywiązać znaczenie do uwzględnienia zmienności odpowiedzi między dawcami14, dlatego zaleca się przeprowadzenie eksperymentu o odpowiedniej mocy statystycznej15. Aby zrozumieć zakres odpowiedzi i uzyskać pełny obraz zmienności, która może wystąpić w odpowiedziach dawców, test najlepiej przeprowadzić z udziałem wielu indywidualnych dawców, oprócz analizy terapeutyku w eksperymentach powtórzonych.

Wyniki testu cytokin w PBMC; wykres porównujący markery αCD28, IgG4, αCD3, IgG2a, αCD52, IgG1.
Rycina 1: Uwalnianie cytokin w eksperymencie PBMC-SP. Reprezentatywne wyniki uwalniania IFN-γ, IL-2, IL-6 oraz TNF-α uzyskane w testach uwalniania cytokin PBMC-SP (3 niezależne eksperymenty, każdy zawierający 5-8 dawców; n=8, n=10, n=5 [od góry do dołu]) po 48 h przy użyciu referencyjnych przeciwciał odczynnikowych. Skróty: PBMC = mononuklearne komórki krwi obwodowej; SP = faza stała; IFN-γ = interferon-gamma; IL-2 = interleukina 2; IL-6 = interleukina 6; TNF-α = czynnik martwicy nowotworów alfa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe porównujące ekspresję cytokin; PBMC-SP vs WB-AQ, krotność zmiany dla przeciwciał αCD28, αCD3, αCD52.
Rycina 2: Wzrost krotności zmiany poziomu cytokin w eksperymentach PBMC-SP i WB-AQ. Krotność zmiany uwalniania IFN-γ, IL-2, IL-6 i TNF-α przez odniesione odczynniki przeciwciał indukujących CRS w stosunku do odpowiadających im kontroli izotypowych, uzyskana z testów uwalniania cytokin PBMC-SP i WB-AQ po 48 h. Skróty: PBMC = mononuklearne komórki krwi obwodowej; SP = faza stała; WB = krew pełna; AQ = faza wodna; IFN-γ = interferon gamma; IL-2 = interleukina 2; IL-6 = interleukina 6; TNF-α = czynnik martwicy nowotworu alfa; CRS = zespół uwalniania cytokin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres porównawczy poziomów cytokin w skali logarytmicznej; eksperymenty WB-AQ; analiza danych w immunologii.
Rysunek 3: Uwalnianie cytokin w eksperymencie WB-AQ. Reprezentatywne wyniki uwalniania IFN-γ, IL-2, IL-6 i TNF-α uzyskane z testów uwalniania cytokin WB-AQ (3 niezależne eksperymenty, każdy obejmujący 5-8 dawców; n=8, n=10, n=5 [od góry do dołu]) po 48 h przy użyciu referencyjnych przeciwciał odczynnikowych. Skróty: WB = krew pełna (whole blood); AQ = faza wodna (aqueous phase); IFN-γ = interferon gamma; IL-2 = interleukina 2; IL-6 = interleukina 6; TNF-α = czynnik martwicy nowotworu alfa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisano tutaj metody pomiaru uwalniania cytokin z PBMC i WB po stymulacji za pośrednictwem przeciwciał z płytki pokrytej przeciwciałem lub z przeciwciałem w roztworze, przy użyciu panelu odczynników referencyjnych do kontroli dodatniej i ujemnej. Każdy z tych testów ma swoje mocne i słabe strony. Testy PBMC i WB są komplementarne, ponieważ proporcje różnych komórek odpornościowych, takich jak limfocyty, monocyty i granulocyty, są różne w dwóch matrycach eksperymentalnych stosowanych w CRA. Interesujące jest zaobserwowanie, że chociaż test WB może lepiej reprezentować stan in vivo w przeciwieństwie do monokultury PBMC, pierwsza platforma jest mniej predykcyjna dla ryzyka CRS za pośrednictwem komórek T z TGN1412 i OKT315; w wyniku działania glikoforyny A na erytrocyty hamujące ekspansję limfocytów T za pośrednictwem IL-216. Niemniej jednak przewidywanie ryzyka CRS ze strony anty-CD52 pozostaje nienaruszone w WB CRA, ze względu na obecność neutrofili (utraconych podczas konwencjonalnych metod gradientu gęstości opisanych w kroku 2, stosowanych do izolacji PBMC).

Format CRA (prezentacja SP lub AQ) ma kluczowe znaczenie dla wykrycia specyficznego mechanizmu CRS. Na przykład, prezentacja mAb w fazie wodnej ludzkim limfocytom17,18, zastosowana podczas przedklinicznych testów bezpieczeństwa in vitro TGN1412 nie zidentyfikowała ryzyka CRS, prawdopodobnie z powodu braku zlokalizowanego grupowania i zaangażowania receptorów komórkowych19 oraz wynikającej z tego aktywacji limfocytów T za pośrednictwem przeciwciała w fazie wodnej. W rzeczywistości CRS za pośrednictwem TGN1412 można było dokładnie wykryć tylko w formacie SP, który sztucznie replikuje sieciowanie receptora Fc-gamma (FcγR), jak przedstawiono tutaj, lub przez zależne od kontaktu torowanie w prekulturze PBMC o dużej gęstości i interakcji Fc z komórkami odpornościowymi CD32 + (takimi jak limfocyty B20 i monocyty21).

Oprócz tych platform istnieją inne sposoby przeprowadzania CRA z bardziej złożonymi systemami współkultury. Przykładem alternatywnego CRA do tych opisanych w tych metodach jest jednoczesna hodowla PBMC z autologicznymi komórkami śródbłonka rozrostu krwi (BOEC)22. Test ten został opisany w 2015 roku jako ulepszenie ówczesnego konwencjonalnego testu HUVEC:PBMC z mieszanym dawcą poprzez usunięcie zakłócającego niedopasowania tkankowego. Wykazuje lepszą czułość na CRS anty-CD28SA niż test WB, a także pokonuje ograniczenia testu monokultury PBMC poprzez naśladowanie kombinacji komórek śródbłonka i leukocytów obecnych in vivo, ale kosztem dłuższych etapów proceduralnych wymagających specjalistycznych technik hodowli komórkowej22.

Ponadto, podczas gdy protokół ten koncentruje się w szczególności na uwalnianiu IFN-γ, IL-2, IL-6 i TNF-α, koledzy z MHRA wcześniej przyjrzeli się IL-12 i innym w tym ustawieniu23. Produkcja IL-12 jest zwiększana przez te pozytywne przeciwciała kontrolne CRS, chociaż nie jest ona szczególnie czuła, a zatem być może nie jest dobrym predyktorem CRS w tej modalności. Niektóre cytokiny, takie jak między innymi IL-15, nigdy nie zostały przetestowane, chociaż 4 cytokiny oceniane w naszym protokole stanowią dobre wskazanie potencjalnego ryzyka CRS. Oczywiście, w zależności od badanej modalności i przeciwciał, można było ocenić inne cytokiny.

Podsumowując, obserwacje te podkreślają znaczenie zwrócenia uwagi na fakt, że chociaż stosowanie odczynników referencyjnych może pomóc w identyfikacji ryzyka CRS związanego z nowymi przeciwciałami, należy zachować ostrożność, aby uniknąć nieoptymalnej platformy CRA, która może nie zidentyfikować potencjału CRS. Co najważniejsze, przewidywany mechanizm działania środka terapeutycznego, czy to poprzez jego region Fc, czy hipotetyczne działanie na komórki wykazujące ekspresję antygenu, musi być zgodny z biologią testu. W związku z tym, chociaż różnice w mechanizmie działania testowych odczynników terapeutycznych i referencyjnych omówione w tym artykule mogą stanowić potencjalne ograniczenie w taki sposób, że odpowiedni CRA dla testowanego przeciwciała może być niezgodny z biologią odczynników referencyjnych, test zapewnia solidną, wiarygodną platformę do identyfikacji zagrożeń. Wyniki z kilku formatów CRA obejmujących różne mechanizmy działania i podzbiory komórek odpornościowych mogą być jednak niezbędne do uzyskania optymalnej pewności co do danych oceny bezpieczeństwa.

Oświadczenia

EM był wcześniej zatrudniony przez Agencję Regulacyjną ds. Leków i Produktów Opieki Zdrowotnej (MHRA). Pozostali autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institute for Biological Standards and Control. Dziękujemy Sandrze Diebold za zrecenzowanie manuskryptu oraz za pomocne komentarze i sugestie. Jesteśmy również wdzięczni Ka Seng Ieongowi za nakręcenie teledysku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml  Probówki do mikrowirówek, naturalne (sterylne)StarlabS1615-5510
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, inaktywowana termicznieThermoFisher10500064
Probówki heparynizowaneTermoFisher12967676
Heracell 150i Inkubator CO2ThermoFisher16406639
Panel prozapalny dla ludzi QuickPlex SQ 120 1 zestaw V-PLEX Meso Scale DiscoveryK15049
MESO QuickPlex SQ 120MMMeso Scale DiscoveryAI1AA-0
Neubauer Ulepszona komora zliczania hemocytometrówHawksleyAS1000
Panel liofilizowanych rekombinowanych przeciwciał kontrolnych do testów uwalniania cytokinNISBC19/156
PBSThermoFisher10010023
Polipropylenowa 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowania Corning3879
Polistyrenowa 96-dołkowa płytka do mikromiareczkowaniaCorning3799
RPMI 1640Wirówka ThermoFisher11875093
Sorvall ST 40ThermoFisher75004525
Sterylna wodaThermoFisher15230162

Bibliografia

  1. Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. The New England Journal of Medicine. 355 (10), 1018-1028 (2006).
  2. Hünig, T. The storm has cleared: lessons from the CD28 superagonist TGN1412 trial. Nature Reviews Immunology. 12 (5), 317-318 (2012).
  3. Wing, M. G., et al. Mechanism of first-dose cytokine-release syndrome by CAMPATH 1-H: involvement of CD16 (FcgammaRIII) and CD11a/CD18 (LFA-1) on NK cells. Journal of Clinical Investigation. 98 (12), 2819-2826 (1996).
  4. Gaston, R. S., et al. OKT3 first-dose reaction: Association with T cell subsets and cytokine release. Kidney International. 39 (1), 141-148 (1991).
  5. Riechmann, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G. Reshaping human antibodies for therapy. Nature. 332 (6162), 323-327 (1988).
  6. Kung, P., Goldstein, G., Reinherz, E. L., Schlossman, S. F. Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens. Science. 206 (4416), 347-349 (1979).
  7. Ball, C., et al. Antibody C region influences TGN1412-like functional activity in vitro. Journal of Immunology. 189 (12), 5831-5840 (2012).
  8. Vessillier, S., et al. Development of the first reference antibody panel for qualification and validation of cytokine release assay platforms - Report of an international collaborative study. Cytokine: X. 2 (4), 100042(2020).
  9. Findlay, L., et al. Improved in vitro methods to predict the in vivo toxicity in man of therapeutic monoclonal antibodies including TGN1412. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 1-12 (2010).
  10. oVE Science Education Database. Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  11. Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440(2017).
  12. Murthy, H., Iqbal, M., Chavez, J. C., Kharfan-Dabaja, M. A. Cytokine Release Syndrome: Current Perspectives. Immunotargets Therapy. 8, 43-52 (2019).
  13. Vidal, J. M., et al. In vitro cytokine release assays for predicting cytokine release syndrome: the current state-of-the-science. Report of a European Medicines Agency Workshop. Cytokine. 51 (2), 213-215 (2010).
  14. Grimaldi, C., et al. Cytokine release: A workshop proceedings on the state-of-the-science, current challenges and future directions. Cytokine. 85, 101-108 (2016).
  15. Vessillier, S., et al. Cytokine release assays for the prediction of therapeutic mAb safety in first-in man trials - Whole blood cytokine release assays are poorly predictive for TGN1412 cytokine storm. Journal of Immunological Methods. 424, 43-52 (2015).
  16. Chu, J. W. K., Sharom, F. J. Glycophorin A interacts with interleukin-2 and inhibits interleukin-2-dependent T-lymphocyte proliferation. Cellular Immunology. 145 (2), 223-239 (1992).
  17. Stebbings, R., Eastwood, D., Poole, S., Thorpe, R. After TGN1412: recent developments in cytokine release assays. Journal of Immunotoxicology. 10 (1), 75-82 (2013).
  18. Hanke, T. Lessons from TGN1412. Lancet. 368 (9547), author reply 1570 1569-1570 (2006).
  19. Stebbings, R., et al. #34;Cytokine storm" in the phase I trial of monoclonal antibody TGN1412: better understanding the causes to improve preclinical testing of immunotherapeutics. Journal of Immunology. 179 (5), 3325-3331 (2007).
  20. Bartholomaeus, P., et al. Cell contact-dependent priming and Fc interaction with CD32+ immune cells contribute to the TGN1412-triggered cytokine response. Journal of Immunology. 192 (5), 2091-2098 (2014).
  21. Hussain, K., et al. Upregulation of FcγRIIb on monocytes is necessary to promote the superagonist activity of TGN1412. Blood. 125 (1), 102-110 (2015).
  22. Reed, D. M., et al. An autologous endothelial cell:peripheral blood mononuclear cell assay that detects cytokine storm responses to biologics. The FASEB Journal. 29 (6), 2595-2602 (2015).
  23. Eastwood, D., et al. Severity of the TGN1412 trial disaster cytokine storm correlated with IL-2 release. British Journal of Clinical Pharmacology. 76 (2), 299-315 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test uwalniania cytokinizolacja PBMCtest z u yciem krwi pe nejprzeciwcia a kontroli pozytywnejzesp uwalniania cytokinpowtarzalno testuuwalnianie interleukiny 2harmonizacja testu
Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.