Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) na Uniwersytecie Yale. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę. Uczestnicy musieli przejść badanie przesiewowe MRI, aby zapewnić bezpieczeństwo ich udziału. Wykluczano osoby z historią poważnych zaburzeń medycznych lub neurologicznych, które mogłyby wpłynąć na funkcjonowanie poznawcze (np. zaburzenia neuropsychologiczne lub depresyjne, urazy, schizofrenię lub zaburzenia obsesyjno-kompulsyjne).
UWAGA: Obecny protokół wykorzystuje urządzenie CW-NIRS ze 100 kanałami dalekiego zasięgu i 8 kanałami krótkiego zasięgu (32 źródła diodowe laserowe, λ = 785/830 nm ze średnią mocą 20mW / długość fali oraz 38 detektorów fotodiod lawinowych) z częstotliwością próbkowania 1,95 Hz. Obrazy MRI i fMRI zostały wykonane na skanerze Siemens 3 Tesla Prisma z zastosowaniem 20-kanałowej cewki głowowej. Wszystkie dane zostały zebrane w Yale Brain Imaging Center (https://brainimaging.yale.edu/). Modyfikacje specyficzne dla systemu w celu jednoczesnego zbierania danych fMRI i fNIRS są odnotowane w całym protokole.
1. Modyfikacje i rozwój sprzętu fNIRS w celu jednoczesnego gromadzenia danych
UWAGA: Kroki od 3 do 6 są specyficzne dla systemu NIRScoutXP i mogą nie mieć zastosowania do innych systemów fNIRS ze względu na różnice w oprogramowaniu do akwizycji oraz dostępnych fantomach do oceny optodów.
- Przygotowanie czepek fNIRS
- Zidentyfikuj czepek fNIRS potrzebne do badania. W przypadku badania dorosłych upewnij się, że dostępne są następujące rozmiary czepek (w cm): 54, 56, 58 i 60.
- UWAGA: Rozmiary czepek są specyficzne dla systemu użytego w niniejszym protokole. W związku z tym konkretne rozmiary wymagane dla różnych systemów NIRS mogą się różnić.
- Przy użyciu kapsułek z witaminą E i materiału wodoodpornego (np. tkaniny nylonowej z powłoką PU) przygotuj markery referencyjne. Owiń kapsułki wybranym materiałem i przyszyj (lub przyklej) markery do wybranych obszarów (patrz Rycina 1A). Kapsułki z witaminą E służą jako markery referencyjne do identyfikacji pozycji kanałów fNIRS względem leżącej pod nimi tkanki mózgowej przy użyciu obrazu T1w.
- Określ liczbę markerów referencyjnych w zależności od układu optod i metody koregistracji. Niektóre badania wymagają wykrycia tylko kilku punktów orientacyjnych anatomicznych, podczas gdy w innych korzystne może być umieszczenie markerów obok każdego optodu.
- Jeśli czepek fNIRS jest zbyt luźny z tyłu głowy, przymocuj po obu stronach czepka dwa paski z tkaniny elastycznej (z fabrycznymi dziurkami na guziki) i guziki, aby zwiększyć możliwość regulacji czepka. Niezależnie od uczestnika i stopnia dopasowania czepka, zabezpiecz paski, aby zapewnić spójną konfigurację czepka.
- Jeśli przód czepka zbyt mocno uciska czoło, umieść gumowe bufory na tych optodach, które mają bezpośredni kontakt ze skórą. Jeśli dostawca fNIRS nie dostarcza buforów, wykonaj je z naklejek z tkaniny filcowej. W przypadku stosowania gumowych buforów używaj ich u wszystkich uczestników, niezależnie od dopasowania czepka, aby zapewnić spójną konfigurację. Upewnij się, że skład gumowych buforów nie zawiera komponentów metalicznych, aby zapobiec powstawaniu artefaktów na obrazach MR.
- Konfiguracja sprzętu fNIRS w pomieszczeniu sterowania MRI i pomieszczeniu skanera
- Umieść urządzenie fNIRS w pomieszczeniu sterowania blisko jednego z falowodów prowadzących do pomieszczenia skanera. W razie potrzeby użyj podwyższonej powierzchni (np. podestu), aby urządzenie fNIRS znajdowało się jak najbliżej falowodów w celu maksymalizacji długości włókien.
- Przy użyciu siatki do kabli pogrupuj włókna optyczne w wiązki. Określ grupy na podstawie wybranego układu optodów. Idealnie włókna optyczne powinny być pogrupowane tak, aby wszystkie optody w grupie znajdowały się po tej samej stronie głowy (lewa vs prawa).
- Podłącz włókna optyczne do urządzenia fNIRS i poprowadź wiązki do pomieszczenia skanera przez falowody. Przed zamówieniem włókien optycznych zmierz odległość między urządzeniem fNIRS a centrum otworu skanera, aby upewnić się, że długość włókien optycznych będzie wystarczająca.
- Doprowadź włókna optyczne do stołu skanera. Użyj bezpiecznego dla MRI mostka do podtrzymania włókien optycznych, aby zapobiec ich zwisaniu pod własnym ciężarem oraz aby uniknąć ściągania czepka z głowy badanego (patrz Rycina 1B).
- Konfiguracja skrzynki replikatora portu równoległego
- Zainstaluj najnowszą wersję oprogramowania NIRStar na komputerze do akwizycji danych fNIRS.
- Podłącz replikator portu równoległego do kabla przesyłającego impuls typu TTL (Transistor-Transistor Logic) ze skanera, zgodnie z instrukcją wyzwalania producenta (wersja R2.1; patrz Rycina 1C). Impuls TTL odpowiada impulsowi czasu warstwy wysyłanemu bezpośrednio ze skanera. Gdy skaner wysyła impuls, zapala się jeden z wskaźników LED.
- Podłącz skrzynkę replikatora portu równoległego do urządzenia fNIRS poprzez wejście portu równoległego. Dzięki temu do oprogramowania NIRStar będzie wysyłany wyzwalacz za każdym razem, gdy zostanie wykryty impuls TTL ze skanera. Sygnał wyzwalający będzie widoczny na ekranie zapisu akwizycji danych jako linia przerywana. Taka konfiguracja zapewnia synchronizację zbierania danych fNIRS i fMRI, ponieważ każdy odebrany w skanerze impuls czasu warstwy zostanie odzwierciedlony w strumieniu danych fNIRS rejestrowanym przez oprogramowanie akwizycyjne NIRStar.
- Przygotowanie statycznego fantoma do oceny optodów
- Umieść optody w urządzeniu statycznego fantoma dostarczonym przez dostawcę fNIRS. Układ optodów na fantomie będzie zależeć od typu instrumentu fNIRS oraz liczby dostępnych źródeł i detektorów. Sprawdź prawidłowy układ optodów w przewodniku startowym producenta.
- Upewnij się, że fantom jest całkowicie osłonięty przed jakimikolwiek źródłami światła. Niektórzy dostawcy zapewniają dopasowane etui, które pomaga osłonić optody przed zewnętrznymi źródłami światła.
- Wepnij wszystkie dostępne wiązki źródeł i detektorów do fantoma fNIRS zgodnie z określonym układem optodów.
- Podłącz fantom fNIRS do komputera akwizycyjnego i uruchom oprogramowanie akwizycyjne NIRStar.
- Wykonanie testu szumu ciemnego instrumentu na fantomie
- W pozycji menu Configure Hardware oprogramowania akwizycyjnego NIRStar otwórz kartę Channel Setup. Upewnij się, że w polach Number of Sources i Number of Detectors poprawnie ustawiono całkowitą liczbę dostępnych źródeł i detektorów. Potwierdź te ustawienia, klikając OK.
- Uruchom okno testu szumu ciemnego, klikając pozycję menu Diagnostics w głównym menu okna NIRStar.
- Uruchom test, naciskając przycisk Run Test. Zapisz wyniki testu, naciskając przycisk Save Results.
UWAGA: W celu interpretacji wyników skorzystaj z przewodnika producenta „Getting Started Guide: Troubleshooting Static Phantom”.
- Wykonanie testu kalibracji fantoma
- W pozycji menu Configure Hardware oprogramowania akwizycyjnego NIRStar otwórz kartę Channel Setup. Upewnij się, że w polach Number of Sources and Number of Detectors poprawnie ustawiono całkowitą liczbę dostępnych źródeł i detektorów.
- W pozycji menu Configure Hardware otwórz kartę Channel Masking. Zamaskuj wszystkie kanały, naciskając przycisk Select All.
- W pozycji menu Configure Hardware, na karcie Hardware Specification, wybierz Static Phantom w polu Study Type. Potwierdź te ustawienia, klikając OK.
- Rozpocznij kalibrację, naciskając przycisk Calibrate. Po zakończeniu kalibracji naciśnij przycisk Details, aby wyświetlić szczegółowe wyniki kalibracji.
UWAGA: W celu interpretacji wyników skorzystaj z przewodnika producenta „Getting Started Guide: Troubleshooting Static Phantom”.

Rycina 1Sprzęt do jednoczesnej akwizycji danych z pomiarów fMRI i fNIRS. (A) Torebka wykonana z czarnego, wodoodpornego materiału do przechowywania kapsułek z witaminą E, przyszyta do czapki fNIRS w sąsiedztwie każdego optody. (B) bezpieczny dla MRI mostek do podtrzymywania światłowodów nad podłogą, aby mogły one dotrzeć do głowy uczestnika podczas zbierania danych. (C) Replikator portu równoległego, który przesyła impulsy ze skanera do urządzenia fNIRS. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
2. Projekt zadania eksperymentalnego
- Ustal czas trwania sesji skanowania, biorąc pod uwagę komfort uczestnika wewnątrz skanera. Na przykład badanie opisane w niniejszej pracy obejmuje dwa obrazy strukturalne (T1w i T2w) o łącznym czasie trwania około 14 min oraz pięć serii funkcjonalnych, które zajmują dodatkowe około 25 min.
UWAGA: Konieczne będzie przeprowadzenie pilotażu badania z kilkoma uczestnikami w celu ustalenia odpowiedniej długości badania, ponieważ czynniki specyficzne dla danego badania (np. wiek uczestnika, rozmiar czepek) będą determinować poziom komfortu.
- Zaprojektuj zadania neuroobrazowania zgodnie z celami badawczymi. Będą one specyficzne dla danego badania. W tym przypadku przedstawiono procedurę (oraz reprezentatywne wyniki) zadania z migającą szachownicą.
3. Zakładanie czepka fNIRS i kalibracja sygnału w dniu badania
UWAGA: Wszystkie poniższe kroki odbywają się w pomieszczeniu sterowania MRI lub w pokoju do wyrażania zgody, chyba że zaznaczono inaczej.
- Pomiar obwodu głowy i dobór czepek fNIRS
- Gdy uczestnik podpisze odpowiednie formularze zgody i otrzyma instrukcje dotyczące nadchodzących zadań, poproś go o zajęcie miejsca na krześle znajdującym się w pomieszczeniu kontrolnym.
- Używając standardowej miękkiej miarki krawieckiej, zmierz największy możliwy obwód głowy uczestnika; od najbardziej wystającej części czoła (zazwyczaj 1 lub 2 palce nad brwią), przez najszerszą część tyłu głowy i z powrotem. Staraj się znaleźć największy obwód.
- Wybierz rozmiar czepka najbliższy zmierzonemu obwodowi.
- Mocowanie sond detektorów krótkodystansowych do czepka
UWAGA: Ten krok jest specyficzny dla systemów NIRx i może nie dotyczyć innych urządzeń fNIRS.
- Zamocuj sondy detektorów krótkodystansowych, mocno chwytając podstawę i wsuwając ją w element przelotowy, który przechodzi przez siatkę czepka fNIRS (patrz Rysunek 2A). Należy uważać, aby nie wyciągnąć sond detektorów krótkodystansowych z kabla, ponieważ może to doprowadzić do jego uszkodzenia.
UWAGA: Przy ustalaniu rozmieszczenia sond należy zapoznać się z niedawnymi pracami porównującymi rozmieszczenie na całej głowie z rozmieszczeniem specyficznym dla ROI18.
- W razie potrzeby użyj organizerów do włókien dostarczonych przez producenta do zarządzania okablowaniem. Upewnij się, że kable detektorów krótkodystansowych są skierowane w stronę tyłu czepka, aby obszar wokół twarzy pozostał wolny.
- Zakładanie czepka fNIRS i optodów na głowę uczestnika
- Poproś uczestnika o założenie czepka poprzez nasunięcie go prosto z czubka głowy, tak jak zakłada się czapkę zimową. Upewnij się, że czepek jest prosto, a uszy znajdują się w wycięciach na uszy.
- Poproś uczestnika o zapięcie paska podbródkowego tak mocno, jak jest to komfortowe. Zaciśnij paski z tyłu i upewnij się, że czepek jest stabilnie zamocowany, a gniazda optodów przylegają ściśle do głowy.
- Przyklej zielone znaczniki, aby zaznaczyć kluczowe punkty referencyjne zgodnie z pozycjami systemu 10-20 (inion, nasion, punkty przeduszne przed uchem oraz Cz)21.
UWAGA: Zielone znaczniki są niezbędne w przypadku korzystania z trójwymiarowego czujnika struktury w celu określenia współrzędnych przestrzennych lokalizacji optodów źródłowych i detekcyjnych. Może to zależeć od typu czujnika struktury 3D. W niniejszym protokole użyto czujnika struktury (Mark II) firmy Occipital20.
- Używając miarki, symetrycznie dopasuj punkty na czepku do punktów na skórze głowy, upewniając się, że i) punkty przeduszne są w tej samej odległości od punktu Cz oraz ii) punkt inion i punkt nasion są w tej samej odległości od punktu Cz. Upewnij się, że pozycja czepka jest identyczna dla wszystkich uczestników.
- Tworzenie modelu głowy uczestnika za pomocą cyfrowego czujnika struktury 3D
- Poinstruuj uczestnika, aby siedział nieruchomo w celu stworzenia trójwymiarowego modelu jego głowy.
- Otwórz aplikację Structure na tablecie lub iPadzie.
UWAGA: Protokół opisuje kroki niezbędne do stworzenia siatki głowy za pomocą czujnika struktury (Mark II) firmy Occipital20. Kroki te mogą się różnić w zależności od systemu.
- Upewnij się, że następujące ustawienia są wyłączone: High resolution color, IR auto exposure oraz Improved tracker.
- Ustaw uczestnika w centrum, tak aby cała jego głowa znajdowała się wewnątrz kwadratu 3D na ekranie, cała głowa była renderowana, a w kadrze nie było zbyt wiele ramion.
- Ostrożnie obejdź uczestnika w promieniu 360°, aby stworzyć skan 3D. Przed przejściem dalej poczekaj, aż aplikacja przechwyci obraz mniej więcej co 90° (patrz Rysunek 3A).
- Po przechwyceniu całego skanu naciśnij przycisk po prawej stronie ekranu, aby utworzyć renderowanie 3D.
- Sprawdź renderowanie, aby upewnić się, że obraz jest wyraźny i zawiera wystarczającą ilość szczegółów, by ustalić rozmieszczenie optodów i zielonych znaczników referencyjnych. Zapisz skan 3D na serwerze chronionym zgodnie z HIPAA.
- Przygotowanie uczestnika do wejścia do pomieszczenia ze skanerem
- Po wygenerowaniu modelu 3D usuń zielone znaczniki i poproś uczestnika o włożenie zatyczek do uszu.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami obowiązującymi w centrum obrazowania MR, aby upewnić się, że uczestnik może bezpiecznie wejść do pomieszczenia ze skanerem. Krok ten zazwyczaj obejmuje potwierdzenie u uczestnika braku metalowych elementów w organizmie oraz przejście przez detektor metali w ramach końcowej kontroli. Większość ośrodków obrazowania wymaga często wypełnienia przez badanego kwestionariusza bezpieczeństwa MRI przed przyjazdem.
- Mocowanie sond źródłowych i detekcyjnych do czepka fNIRS
- W pomieszczeniu ze skanerem poproś uczestnika, aby wygodnie położył się na stole skanera.
- Stabilizując jeden element przelotowy optodu jedną ręką, użyj w drugiej ręce aplikatora bezpiecznego dla MRI, aby odsunąć włosy z centrum przelotki (patrz Rysunek 2B). Gdy włosy zostaną w wystarczającym stopniu odsunięte z obszaru (idealnie tak, aby widoczna była skóra głowy), mocno wciśnij optod w przelotkę.
- Upewnij się, że po zwolnieniu napięcia przelotki włosy nie wracają, zasłaniając centrum optodu. W przypadku stosowania matrycy na całą głowę zaleca się orientację optodów z tyłu głowy tak, aby ich włókna były skierowane do przodu, a optodów z przodu głowy tak, aby ich włókna były skierowane do tyłu. Taka konfiguracja włókien optycznych zapobiegnie ich plątaniu się lub zginaniu, gdy uczestnik położy się i umieści głowę w cewce MRI.
UWAGA: Proces wkładania i wyrównywania włókien jest szybszy i łatwiejszy do wykonania przy udziale dwóch eksperymentatorów znajdujących się po obu stronach uczestnika, zakładających czepek jednocześnie.
- Ułóż włókna optyczne starannie w pęczkach, używając organizerów do kabli (patrz Rysunek 2B i Rysunek 3B). Przeprowadź testową kalibrację i pomiar siły sygnału za pomocą oprogramowania NIRStar. Rozmieszczenie optodów i kalibracja wykonana przez dwóch doświadczonych badaczy zajmie około 10 min.
- W razie potrzeby dostosuj poszczególne optody, aż zostanie osiągnięta wystarczająca jakość sygnału, przesuwając przeszkadzające włosy z problematycznych optodów. Usuwaj optody z czepka, aby przesunąć włosy, używając plastikowej pęsety (patrz Rysunek 2B).

Rycina 2. Detektory krótkodystansowe i narzędzia do przygotowania czepka fNIRS. (A) Sondy detektorów krótkodystansowych i gumowe bufory do przymocowania do czepka fNIRS nad obszarami czołowymi o minimalnym owłosieniu. (B) Od lewej do prawej: Organizatory kabli do układania światłowodów w pęki, aplikatory bezpieczne dla MRI do odsuwania włosów podczas rozmieszczania optod i plastikowe pęsety do usuwania optod z czepka, jeśli jest to konieczne podczas konfiguracji czepka NIRS w celu odsłonięcia skóry głowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3Cyfryzator czujnika struktury 3D oraz rozmieszczenie czepka fNIRS. (A) Eksperymentator używający cyfryzera z czujnikiem struktury 3D do stworzenia modelu 3D głowy uczestnika. Zielone naklejki służą do identyfikacji punktów referencyjnych. (B) Włókna optyczne wprowadzone do czepka fNIRS na głowie uczestnika i ułożone w wiązki za pomocą organizerów do kabli przed kalibracją sygnału. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.
4. Przygotowanie uczestnika
UWAGA: Następne kroki są wykonywane w pomieszczeniu ze skanerem MRI. Użycie pasa oddechowego i pulsoksymetru jest opcjonalne i wymagane tylko wtedy, gdy badacze chcą usunąć te sygnały z danych fNIRS22. W protokole zastosowano pas oddechowy, który jest częścią jednostki oddechowej służącej do pomiaru amplitudy oddechu za pomocą pasa stabilizującego. Podobnie, fizjologiczna jednostka tętna składa się z czujnika pletyzmografii optycznej, który umożliwia pomiar rytmu serca.
- Upewnij się, że 20-kanałowa cewka głowowa jest umieszczona w skanerze. W przypadku stosowania pełnej macierzy fNIRS do głowy, cewki głowowe 32- i 64-kanałowe będą zbyt ciasne dla dorosłych uczestników.
- Umieść piankową poduszkę na dnie cewki głowowej MRI, aby podeprzeć tył głowy uczestnika (patrz Rysunek 4A).
- Poproś uczestnika, aby położył się powoli i ostrożnie, tak aby jego ruchy nie przesunęły czepek ani nie naciągnęły światłowodów. W razie potrzeby dostosuj wiązki światłowodowe, aby głowa uczestnika spoczywała wygodnie w cewce głowowej (patrz Rysunek 4B). W zależności od miejsca przebiegu kabli z falowodu, na tym etapie może być konieczne podniesienie stołu skanera.
- Umieść poduszkę pod nogami uczestnika, aby zapewnić mu komfort. Załóż pas oddechowy wokół talii uczestnika.
- Poproś uczestnika o założenie słuchawek z redukcją szumów, dbając o to, aby nie zakłócały one rozmieszczenia sond fNIRS. Aby zapobiec zsuwaniu się słuchawek, użyj bezpiecznych do MRI podkładek po obu stronach głowy, pomiędzy słuchawkami a wewnętrzną stroną cewki głowowej. Można użyć poszewki na poduszkę, aby zapobiec kontaktowi słuchawek z cewką głowową.
- Załóż pulsoksymetr na palec wskazujący niedominującej ręki badanego. Jeśli do zadań eksperymentalnych używany jest przycisk odpowiedzi (button box), poproś uczestnika o trzymanie go w dominującej ręce. Przekaż uczestnikowi instrukcje dotyczące obsługi przycisku.
- Umieść piłkę do ściskania lub przycisk alarmowy w niedominującej ręce badanego i poinstruuj uczestnika, jak go używać. Przetestuj alarm, prosząc uczestnika o jego naciśnięcie.
- Przesuń uczestnika o kilka cali w głąb otworu skanera, aby wyrównać pozycję głowy. Ustaw górną część cewki głowowej. Następnie wsuń mikrofon i lustro w odpowiednie inserty cewki.
- Powoli wsuń uczestnika do otworu skanera, trzymając światłowody. Proces ten wymaga udziału dwóch osób, które powinny znajdować się po obu stronach stołu skanera. Upewnij się, że światłowody są ostrożnie prowadzone do otworu skanera, aby uniknąć pociągania optodów lub przyciśnięcia światłowodów między cewką głowową a otworem skanera.
- Po potwierdzeniu z uczestnikiem, że jest gotowy do sesji skanowania, wróć do sterowni i potwierdź przez interkom, że uczestnik słyszy eksperymentatora, a eksperymentator słyszy uczestnika.

Rysunek 4. Ustawienie uczestnika w skanerze MRI. (A) Poduszki wewnątrz cewki głowowej MR służące do podparcia głowy uczestnika oraz światłowody ułożone w wiązki przed przygotowaniem uczestnika. (B) Uczestnik leżący na stole skanera z czapką fNIRS przygotowaną do testów. Górna część cewki głowowej nie została jeszcze umieszczona nad twarzą uczestnika. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
5. Konfiguracja skanera i sprzętu fNIRS przed rejestracją sygnału
- Na komputerze skanera wybierz odpowiednie sekwencje strukturalne i funkcjonalne dla badania. Podczas obliczania modelu czułości światła dla danych fNIRS, zbierz obrazy T1w i T2w, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość kontrastu tkanek.
- Sprawdź obraz lokalizacyjny, aby potwierdzić prawidłową pozycję głowy wewnątrz otworu skanera. Zweryfikuj, czy uzyskano pełny zasięg obrazowania mózgu, od czubka głowy do móżdżku.
- Potwierdź z uczestnikiem, czy ekran komputera jest widoczny przez lustro cewki głowy.
- Uruchom pierwszy skan strukturalny. Równolegle przeprowadź kolejny test kalibracji optodów fNIRS, aby sprawdzić, czy przygotowanie uczestnika wpłynęło na siłę sygnału któregokolwiek z kanałów.
- Po wykonaniu pierwszego strukturalnego skanu MRI, zbierz sekwencje mapy pola echo gradientowego i skalibruj słuchawki z redukcją szumów, aby upewnić się, że słuchawki będą w stanie dostarczyć bodźce słuchowe uczestnikowi oraz blokować wszelkie hałasy otoczenia.
UWAGA: Niektórzy uczestnicy mogą wymagać regulacji słuchawek. W takim przypadku ponownie wejdź do pomieszczenia skanera i dostosuj wyściółkę wokół słuchawek, uważając, aby nie naruszyć rozmieszczenia sond fNIRS. Przed kontynuacją uruchom ponownie obraz lokalizacyjny, sekwencje mapy pola echo gradientowego oraz test kalibracji optodów fNIRS.
6. Symultaniczna rejestracja sygnałów
- Skontaktuj się z uczestnikiem za pomocą interkomu, aby upewnić się, że czuje się komfortowo i wszystko jest w porządku. Przekaż instrukcje do zadania i przypomnij uczestnikom, aby nie ruszali głową ani ciałem.
- Przekaż następujące instrukcje, specyficzne dla zadania z migającą szachownicą (Rysunek 5).
- W tym zadaniu poinstruuj uczestnika, aby zawsze patrzył w środek ekranu wyświetlacza znajdującego się przed nim (poprzez lustro). Czasami na ekranie pojawi się szachownica z polami migającymi z różnymi częstotliwościami. W innych momentach uczestnik zobaczy białe koło na środku ekranu.
- Gdy na ekranie pojawi się białe koło, poproś uczestnika o naciśnięcie Button Box palcem wskazującym. Po naciśnięciu przycisku koło zmieni kolor na czerwony.
- Zadanie to wykorzystuje naprzemienny projekt blokowy. Pozwól uczestnikom ukończyć jeden przebieg trwający 6 min, który obejmuje 11 bloków z migającą szachownicą po 10 s każdy oraz 11 bloków z kołem po 20 s każdy.
- Rozpocznij rejestrację danych fNIRS na komputerze fNIRS i uruchom zadania na komputerze do prezentacji bodźców. Skrypt zadań eksperymentalnych zostanie wyświetlony jako instrukcje do zadań.
- Uruchom pierwszy przebieg funkcjonalny. Gdy skaner wyśle pierwszy impuls TTL, pojawi się on jako sygnał wyzwalający na ekranie rejestracji danych oprogramowania NIRStar. Ten pierwszy impuls rozpocznie również zadanie eksperymentalne.
- Monitoruj wyniki uczestnika i jego ruchy podczas wszystkich zadań. W niektórych przypadkach, szczególnie przy użyciu pełnej macierzy optodów i czapek o małym rozmiarze, niektórzy uczestnicy mogą odczuwać dyskomfort podczas noszenia czapki. Ważne jest stałe monitorowanie komfortu uczestnika.
- W razie potrzeby zapewnij uczestnikowi przerwę w połowie sesji. Jeśli podczas tej przerwy uczestnicy będą musieli usiąść prosto, wykonaj ponownie lokalizator, sekwencje mapy pola echa gradientowego, kalibrację słuchawek i kalibrację testową fNIRS przed kontynuacją. Ten krok zazwyczaj nie jest wymagany podczas badania młodych dorosłych w skanerze, jeśli przestrzegane są dokładne kroki opisane w niniejszym protokole.
- Podczas zbierania danych rób notatki dotyczące sesji (np. rozmiar czapki, pora dnia, optody, które nie zostały dobrze skalibrowane, lub wszelkie nietypowe zdarzenia).
- Po zakończeniu wszystkich przebiegów funkcjonalnych zatrzymaj zbieranie danych fNIRS. W razie potrzeby wykonaj drugi skan strukturalny.

Rysunek 5Paradygmat migającej szachownicy jako zadanie eksperymentalne. Uczestnicy oglądali czarno-biały wzór szachownicy z białymi kwadratami migającymi osiem razy na sekundę, które przeplatały się z szarym ekranem z białym kołem. W ramach kontroli uwagi uczestnicy otrzymali instrukcję, aby po pojawieniu się białego koła na środku ekranu nacisnąć przycisk prawą ręką. Po naciśnięciu przycisku koło zmieniało kolor na czerwony. Zadanie zostało wykonane w jednej serii składającej się z łącznie 22 bloków: 11 bloków z migającą szachownicą i 11 okresów międzypróbnych. Okresy z migającą szachownicą trwały 10 s, a okresy międzypróbne trwały 20 s. W związku z tym początek prezentacji migającej szachownicy występował co 30 s (0,033 Hz). Wyświetlania zostały wygenerowane za pomocą programu PsychoPy v2021.2.4 i rzutowane na lustro tylne w górnej części cewki głowowej za pomocą systemu projekcji DLP 1080p. Uczestnicy wykonali jedną serię tego zadania (~6 min). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
7. Sprzątanie po eksperymencie i przechowywanie danych
- Używając zmotoryzowanego stołu skanera, powoli wysuń uczestnika z otworu skanera, uważając, aby nie przytrzasnąć żadnego z włókien optycznych. Zdejmij górną część cewki głowowej i poproś uczestnika, aby powoli usiadł.
- Zdejmij czepek fNIRS z głowy uczestnika i wyjmij każdą optodę z odpowiednich przelotek. Włosy często zaplątują się w przelotkach nawet po wyjęciu optod, dlatego należy poinstruować uczestników, aby zdejmowali czepek powoli i ostrożnie.
- Niektóre przelotki mogą wypaść podczas zdejmowania czepka. Należy zlokalizować wszystkie elementy przelotek i uzupełnić brakujące przed sesją skanowania kolejnego uczestnika.
- Poproś uczestników o zsunięcie się ze stołu skanera, podziękuj im za poświęcony czas i przekaż rekompensatę finansową, jeśli jest ona przewidziana.
- Upewnij się, że logi zadań oraz dane fNIRS i fMRI zostały zapisane i utworzono ich kopie zapasowe. Zdezynfekuj czepek roztworem czyszczącym w sprayu, zgodnie z zaleceniami dostawcy fNIRS, a końcówki optod przetrzyj chusteczkami nasączonymi alkoholem bezpiecznymi dla tworzyw sztucznych i gumy.
8. Przetwarzanie wstępne danych fMRI
UWAGA: Dane fMRI zostały poddane wstępnemu przetwarzaniu zgodnie z minimalnymi potokami przetwarzania Human Connectome Project23 przy użyciu QuNex24, otwartoźródłowego pakietu oprogramowania wspierającego organizację danych, wstępne przetwarzanie, zapewnienie jakości oraz analizy w różnych modalnościach neuroobrazowania. Szczegółową dokumentację dotyczącą konkretnych ustawień i parametrów dla każdego z opisanych poniżej kroków można znaleźć na stronie internetowej QuNex pod adresem https://qunex.yale.edu/. Poniżej przedstawiono główne etapy i parametry wykorzystane do przetwarzania danych.
- Przetwarzanie wstępne danych strukturalnych
- Potok przetwarzania PreFreeSurfer. Należy wykonać następujące kroki: korekcję zniekształceń gradientu, dopasowanie powtórnych serii obrazów T1w i T2w za pomocą sztywnej transformacji ciała z 6 stopniami swobody (DOF), wyrównanie obrazów T1w i T2w w linii AC-PC do szablonu przestrzeni MNI, wstępną ekstrakcję mózgu, korekcję zniekształceń odczytu, rejestrację krzyżową obrazów T1w i T2w w natywnej przestrzeni wolumetrycznej, korekcję pola niejednorodności (bias field correction) oraz nieliniową rejestrację wolumetryczną do przestrzeni MNI.
- Procedura Freesurfer. Wykonać następujące kroki: przeprowadzić downsampling obrazów T1w do 1 mm przy użyciu interpolacji sklejkowej oraz uruchomić procedurę recon-all w celu wygenerowania powierzchni istoty białej, co obejmuje precyzyjne dopasowanie rejestracji obrazów T2w do T1w z wykorzystaniem algorytmu BBRegister programu Freesurfer (patrz23 w celu uzyskania dalszych szczegółów).
- Procedura po-FreeSurfer. Wykonaj następujące kroki: konwertuj wyniki procesu recon-all do formatów GIFTI i NIFTI w natywnej przestrzeni wolumetrycznej, wygeneruj końcową maskę mózgu oraz wolumen wstęgi korowej, wygeneruj mapy mieliny oraz przeprowadź nieliniową transformację wolumetryczną z przestrzeni natywnej do przestrzeni MNI.
- Wstępne przetwarzanie danych funkcjonalnych
- Procedura przetwarzania wolumenów fMRI. Wykonać następujące kroki: korekcję zniekształceń, korekcję ruchu w oparciu o FLIRT, preprocessing mapy pola w oparciu o TOPUP z wykorzystaniem mapy pola spin-echo, korekcję zniekształceń obrazów EPI oraz rejestrację obrazów EPI do T1w, jednowzorcowe próbkowanie metodą splajnów do przestrzeni atlasu (MNI), normalizację intensywności poprzez usuwanie pola bias oraz maskowanie mózgu.
- Procedura przetwarzania powierzchni fMRI. Wykonaj następujące kroki, aby zmapować szeregi czasowe objętościowe na połączoną reprezentację powierzchniową i objętościową w układzie współrzędnych gray-ordinate, przechowywaną w formacie CIFTI: konstrukcję wstęgi fMRI (ribbon construction), wygładzanie powierzchni, przetwarzanie struktur podkorowych oraz generowanie gęstych szeregów czasowych.
- Przygotuj dane BOLD. Oblicz ilościowe statystyki kontroli jakości (QC), które odzwierciedlają ruch oraz jego właściwości artefakcyjne, aby zidentyfikować wadliwe klatki. W celu zapoznania się z dostępnymi opcjami generowania ilościowych statystyk QC należy odwołać się do dokumentacji QuNex. Statystyki te często obejmują czasowy stosunek sygnału do szumu (tSNR) sygnału BOLD oraz statystyki usuwania klatek z artefaktami ruchu (motion scrubbing), takie jak próg przemieszczenia klatki oraz próg znormalizowanego błędu średniokwadratowego (RMSE) intensywności obrazu. W zależności od kryteriów specyficznych dla badania, należy zignorować lub interpolować zidentyfikowane problematyczne klatki.
- Ekstrakcja sygnału zakłócającego. Wyodręb sygnały zakłócające z komór mózgu, białej istoty oraz szarej istoty w celu przeprowadzenia regresji sygnałów zakłócających w kolejnych krokach.
9. Wstępne przetwarzanie danych fNIRS
UWAGA: Dane fNIRS zostały przeanalizowane zgodnie z najlepszymi praktykami analizy danych fNIRS25 przy użyciu NeuroDOT26, środowiska open-source do analizy danych optycznych – od surowych poziomów natężenia światła po mapy funkcji mózgu na poziomie wokseli, które są korejestrowane z anatomią konkretnego uczestnika lub atlasem. Wszystkie opisane poniżej kroki można wykonać w programie NeuroDOT. Dodatkową dokumentację dotyczącą konkretnych ustawień i parametrów dla każdego z wyróżnionych poniżej kroków można znaleźć w samouczkach i skryptach pod adresem https://github.com/WUSTL-ORL/NeuroDOT_Beta. Na koniec, rejestracja optodów względem skóry głowy wymaga uzyskania współrzędnych optodów fNIRS w odniesieniu do leżącej pod nimi tkanki mózgowej, co można osiągnąć za pomocą digityzera 3D lub kapsułek z witaminą E jako punktów orientacyjnych, jeśli są dostępne. Obie metody są opisane w tej sekcji, a odnośniki do odpowiednich pakietów oprogramowania zostały podane.
- Generowanie specyficznej dla badanego osoby siatki głowy i stworzenie modelu światła
- Przeprowadzić segmentację obrazu T1w na odpowiednie typy tkanek w celu stworzenia segmentowanego modelu głowy: skórę głowy, czaszkę, płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), istotę szarą i istotę białą. Należy wykorzystać obrazy T1w i T2w, jeśli są dostępne, ponieważ każdy z nich dostarcza komplementarnych informacji o odpowiednich typach tkanek.
UWAGA: Ten krok jest realizowany w niniejszym protokole za pomocą funkcji „Segment5R_fs” oprogramowania NeuroDOT, która przyjmuje jako dane wejściowe informacje z segmentacji wolumetrycznej Freesurfer28. Innymi powszechnie dostępnymi pakietami oprogramowania do segmentacji tkanek mózgu są SPM29 oraz AFNI30.
- Wygenerować siatkę głowy z segmentowanego modelu głowy, korzystając z pakietu oprogramowania Mimics za pośrednictwem NeuroDOT. Jeśli do wyznaczenia lokalizacji optodów na modelu głowy używany jest digitalizator 3D, należy postępować zgodnie z zaleceniami Fieldtrip dotyczącymi lokalizacji optodów31. Alternatywnie, jeśli kapsułki z witaminą E są używane jako punkty referencyjne do identyfikacji współrzędnych par źródło-detektor, należy ręcznie zidentyfikować pozycje źródeł i detektorów na obrazie T1w (przykład znajduje się w32).
- Nanieść lokalizacje źródeł i detektorów uzyskane za pomocą digitalizatora 3D lub kapsułek z witaminą E na odpowiednie miejsca na siatce, korzystając z NeuroDOT.
- Ustawić następujące parametry w celu obliczenia macierzy wrażliwości dla specyficznego dla badanego modelu głowy, korzystając z pakietu oprogramowania NIRFAST za pośrednictwem NeuroDOT: rozdzielczość wokselizacji: 2; etykiety obszarów: CSF, white, gray, bone, skin; współczynniki absorpcji dla obszarów: CSF [0.004, 0.004], white [0.0167, 0.0208]; gray [0.018 0.0192], bone [0.0116, 0.0139], skin [0.74, 0.64]; współczynniki rozpraszania dla obszarów: CSF [0.3, 0.3], white [1.1908, 1.0107]; gray [0.8359, 0.6726], bone [0.94, 0.84], skin [0.64, 0.74], współczynnik załamania dla obszarów: CSF [1.4, 1.4], white [1.4, 1.4]; gray [1.4, 1.4], bone [1.4, 1.4], skin [1.4, 1.4].
UWAGA: Protokół wykorzystuje pakiet oprogramowania NIRFAST (wersja 9.1)33,34, który stosuje bezpośredni model światła oparty na metodzie elementów skończonych i przybliżeniu dyfuzyjnym równania transportu radiacyjnego. Do obliczeń modelu światła NIRFAST opiera się na trzech typach informacji: i) kształcie granic tkanek, ii) wewnętrznym rozkładzie bazowych właściwości optycznych oraz iii) lokalizacjach źródeł i detektorów na powierzchni (szczegóły w 35, 36). Jako alternatywę do obliczania rozwiązań równania dyfuzji dla różnych typów tkanek można zastosować metody Monte Carlo37,38.
- Zwizualizować przykład wrażliwości pomiaru w celu przeprowadzenia oceny jakościowej.
- Przetwarzanie surowych danych z pomiarów par źródło-detektor
- Wyświetlić średni poziom światła dla każdego źródła i detektora w reprezentacji 2D macierzy obrazowania. Usunąć pary źródło-detektor z czasową odchyleniem standardowym przekraczającym 7.5%36. Jeśli dane są zbierane z częstotliwością klatek co najmniej 3Hz, należy zastosować próg mocy sygnału kardiologicznego do odrzucenia pomiarów par źródło-detektor, ponieważ prawidłowe sprzężenie optoda ze skórą głowy będzie wykazywać charakterystykę zgodną z częstotliwością tętna (~1 Hz).
- Przeprowadzić detrending danych w celu usunięcia trendu liniowego z każdego pomiaru. Zastosować filtr górnoprzepustowy (odcięcie 0.02 Hz), aby usunąć niskoczęstotliwościowy dryft. Alternatywą dla filtrowania jest dodanie czynnika dryftu do GLM jako regresora.
- Zastosować filtr dolnoprzepustowy (1 Hz), aby usunąć oscylacje kardiologiczne.
- Oszacować globalny sygnał powierzchowny, obliczając średnią ze wszystkich pomiarów par źródło-detektor o odległości 8 mm. Pomiary z krótkich dystansów należy traktować jako szacunek systemowych niekorowych sygnałów fizjologicznych, ponieważ próbkują one głównie skórę głowy i czaszkę.
- Usunąć sygnał globalny ze wszystkich pomiarów metodą regresji39.
- Zastosować filtr dolnoprzepustowy (odcięcie 0.5 Hz), aby dodatkowo skupić pozostałe dane wokół częstotliwości bodźca, a następnie przeprowadzić downsampling danych do 1 Hz40,41,42 w celu zmniejszenia obciążenia obliczeniowego.
- Wdrożyć cenzurowanie ruchu przy użyciu przebiegu czasowego globalnej wariancji pochodnych czasowych (GVTD)43. GVTD oblicza się jako pierwiastek średni kwadratowy pochodnych czasowych w zbiorze pomiarów lub wokseli43. Cenzurowanie ruchu lub „scrubbing” realizuje się poprzez wykluczenie punktów czasowych przekraczających próg szumu GVTD.
- Rekonstrukcja modelu światła i przetworzonych danych w wolumetryczny obraz neuroobrazowania funkcjonalnego
- Zrekonstruować względne zmiany absorpcji przy 785 nm i 830 nm na podstawie zregularizowanej inwersji macierzy wrażliwości, stosując regularyzację Tichonowa oraz regularyzację zmienną przestrzennie44.
- Obliczyć względne zmiany stężenia hemoglobiny poprzez dekompozycję spektralną danych absorpcyjnych zależnych od długości fali44,45.
10. Analizy danych wywołanych zadaniem w fMRI/fNIRS
- Przeprowadź analizę GLM pierwszego poziomu dla pojedynczej sesji (modelowanie HRF, regresja sygnałów fizjologicznych, w tym pomiary fNIRS z krótkich odległości), aby ocenić, w jaki sposób aktywność mózgu odnosi się do hipotezy statystycznej dla danego badanego.
UWAGA: Alternatywą dla GLM jest uśrednianie blokowe, które pozwala uniknąć założeń a priori dotyczących kształtu HRF. Uśrednianie blokowe nie umożliwia jednak modelowania istotnych czynników zakłócających w sygnale fNIRS wraz z odpowiedzią hemodynamiczną na bodziec.
- Przeprowadź grupową analizę GLM lub analizę drugiego poziomu, aby połączyć szacunki aktywacji z pierwszego poziomu dla wszystkich badanych.
- Wyodrębnij odpowiednie szacunki efektów z poszczególnych plików GLM i połącz je w pliki grupowe.
- Oblicz wymagane statystyki. Sprawdzonym pakietem do przeprowadzania metod resamplingu permutacyjnego zarówno dla jednowymiarowych, jak i wielowymiarowych modeli GLM w celu wnioskowania statystycznego jest FSL PALM46.
- Uzyskaj szacunki beta GLM dla całego mózgu.