Artykuł metodologiczny

Ferrytynofagia: ocena selektywnej degradacji żelaza przez autofagię w ludzkich fibroblastach

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

23 lutego 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przeprowadzania wysokoprzepustowych, opartych na immunofluorescencji ocen ferrytynofagii w pierwotnych, pochodzących ze skóry ludzkich fibroblastach.

Streszczenie

Mutacje w genie autofagii WDR45/WIPI4 są przyczyną neurodegeneracji związanej z beta-śmigłami (BPAN), podtypu choroby ludzkiej znanej jako neurodegeneracja z akumulacją żelaza w mózgu (NBIA) spowodowana obecnością złogów żelaza w mózgach pacjentów. Wewnątrzkomórkowy poziom żelaza jest ściśle regulowany przez szereg mechanizmów komórkowych, w tym krytyczny mechanizm ferrytynofagii. W artykule opisano, w jaki sposób ferrytynofagia może być oceniana w pierwotnych ludzkich fibroblastach pochodzenia skórnego. W tym protokole stosujemy warunki modulujące żelazo do indukowania lub hamowania ferrytynofagii na poziomie komórkowym, takie jak podawanie bafilomycyny A1 w celu zahamowania funkcji lizosomów oraz leczenie cytrynianem żelazowo-amonowym (FAC) lub deferasioxem (DFX) w celu przeciążenia lub wyczerpania żelaza. Tak potraktowane fibroblasty są następnie poddawane wysokoprzepustowemu obrazowaniu i ilościowej analizie lokalizacji endogennej ferrytyny i markerów autofagosomalnych/lizosomalnych opartej na CellProfiler, w tym przypadku LAMP2. Na podstawie poziomu ferrytyny autofagosomalnej/lizosomalnej można wyciągnąć wnioski dotyczące poziomu ferrytynofagii. Protokół ten może być stosowany do oceny ferrytynofagii w pierwotnych fibroblastach pochodzących od pacjenta z BPAN lub innych typach komórek ssaków.

Wprowadzenie

Białka WIPI (WD-repeat interacting with fosphoinositids) są ewolucyjnie konserwatywnymi efektorami PI3P o różnych rolach w autofagii1. Cztery ludzkie białka WIPI (od WIPI1 do WIPI4) składają się w siedmiołopatowe śmigła β z dwoma ewolucyjnie konserwatywnymi regionami, w których homologiczne i niezmienne aminokwasy skupiają się w przeciwnych miejscach śmigła. Jedno miejsce jest wyrównane z regionem wiążącym fosfoinozytyd w łopatach śmigła 5 i 6. Drugie miejsce jest wyrównane z regionem interakcji białko-białko, w którym WIPI wiążą się z odrębnymi elementami maszynerii autofagii lub czynnikami regulacyjnymi autofagii2.

WIPI4 funkcjonuje w kontrolowaniu regulacji autofagii opartej na energii oraz na poziomie kontrolowania wielkości rosnącego, powstającego autofagosomu3. Mutacja w genie WIPI4, określana jako WDR45, jest przyczyną neurodegeneracji związanej z śmigłami beta (BPAN), neurodegeneracji z podtypem akumulacji żelaza w mózgu (NBIA) u ludzi, która charakteryzuje się hipointensywną aureolą żelaza w istocie czarnej i gałki bladej 4. Obecność nieprawidłowych złogów żelaza u pacjentów z BPAN prowokuje uszkodzenie neuronów, które przekłada się na encefalopatię, globalne opóźnienie rozwoju, drgawki, a ostatecznie parkinsonizm, demencję i spastyczność5.

Homeostaza żelaza jest ściśle regulowana przez wiele mechanizmów komórkowych, przy czym stężenie cytozolowego żelaza jest kontrolowane przez poziomy ekspresji i funkcjonalność nośników żelaza, transporterów żelaza i białek magazynujących żelazo6 . Stężenie żelaza cytozolowego z kolei określa, czy zaangażowane są szlaki degradacji, takie jak ferrytynofagia7, czy klirens proteasomalny utlenionej ferrytyny8.

Podczas ferrytynofagii, ferrytyna jest selektywnie rekrutowana do autofagosomów przez receptor ładunku NCOA4 i ukierunkowana na degradację lizosomalną w odpowiedzi na niski poziom żelaza w komórkach7. Biorąc pod uwagę rolę WIPI4 w regulacji wielkości błon autofagosomalnych3, można przewidzieć, że utrata tej specyficznej funkcji może wpływać na selektywną sekwestrację ferrytyny w autofagosomach, a tym samym na ferrytynofagię. Badanie tego kluczowego etapu metabolizmu żelaza może otworzyć drzwi do opcji terapeutycznych dla pacjentów z BFAN; Jednak powszechnie stosowane protokoły do badania ferrytynofagii w komórkach ludzkich są opracowywane dopiero teraz.

Ten artykuł opisuje wysokoprzepustową, opartą na fluorescencji metodę oceny ferrytynofagii w komórkach ludzkich. Zastosowanie tego testu do komórek BPAN pochodzących od pacjentów może dostarczyć cennych informacji na temat różnic między ferrytynofagią a zdrowymi komórkami ludzkimi i może służyć jako punkt odniesienia dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tej rzadkiej choroby ludzkiej.

Protokół

1. Hodowla i wysiewanie komórek pierwotnych

  1. Pobrać fiolkę z zamrożonymi komórkami ze zbiornika ciekłego azotu i trzymać ją na lodzie aż do momentu dotarcia do pomieszczenia do hodowli komórkowych. W uprzednio wysterylizowanym kapturze trzymaj fiolkę w dłoni, aby zawiesina komórek rozmroziła się. Ponownie zawiesić komórki i przenieść je na 10-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej z 9 ml wstępnie podgrzanego DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 1% penicyliną-streptomycyną (P/S). Wstrząsnąć delikatnie, aby komórki równomiernie rozłożyły się na płytce, i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2
  2. Następnego ranka spójrz na komórki, aby upewnić się, że są podłączone. Zmień pożywkę na świeży DMEM + 10% FCS + 1% P / S i pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną 80% zbieżności.
  3. Usunąć pożywkę hodowlaną, przemyć 2x DPBS, dodać 1 ml trypsyny do płytki i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min. Dodać 9 ml DMEM + 10% FCS do płytki i ponownie zawiesić komórki.
  4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Oznacz liczbę komórek ręcznie za pomocą komory Neubauera i rozcieńcz zawiesinę komórek w DMEM + 10% FCS, aż do osiągnięcia stężenia komórek 40 000 komórek/ml.
  5. Na 96-dołkowej płytce ze szklanym dnem zasiać 100 μl/basenik zawiesiny komórkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 godzin.

2. Zabiegi

  1. Przygotować następujące zabiegi zgodnie z tabelą materiałów: pożywka kontrolna, pożywka kontrolna plus deferasiox (DFX) do chelatacji żelaza lub pożywka kontrolna plus cytrynian żelazowo-amonowy (FAC) do ładowania żelazem. Przygotować wszystkie zabiegi, zarówno w obecności, jak i bez inhibitora lizosomów (bafilomycyny A1) w celu oceny strumienia ferrytynofagii.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki i zastąpić ją odpowiednim zabiegiem (100 μl/basenik).
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin.

3. Utrwalanie i barwienie

  1. Odessać pożywkę zabiegową i przemyć 2x DPBS (Tabela Materiałów).
  2. Dodaj 100 μl 3,7% paraformaldehydu (PFA, tabela materiałów) do dołka. Utrwal ogniwa na 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Usuń PFA i umyj komórki 2x PBS/T (Tabela Materiałów).
  4. Blok w PBS/T zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych (tabela materiałów) w PBS/T (przeciwciało ferrytynowe 1:50, przeciwciało LAMP2 1:50).
  6. Przemyć komórki 2x PBS/T i nałożyć 50 μl mieszanki przeciwciał na dołek. Owinąć płytki parafilmem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Następnego ranka przygotować mieszaninę przeciwciał drugorzędowych (tabela materiałów) (1:200) w PBS/T.
  8. Przemyć komórki 2x PBS/T i nałożyć 50 μl mieszanki przeciwciał drugorzędowych na dołek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w ciemności.
  9. Przygotować 5 μg/μL roztworu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI, tabela materiałów) w PBS o temperaturze pokojowej.
  10. Umyj komórki 2x PBS/T i dodaj 100 μL/studzienkę barwnika DAPI. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Umyj komórki 2x PBS i dodaj 50 μl PBS do każdej studzienki. Owinąć płytki parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

4. Automatyczne obrazowanie za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej

  1. Wymień PBS w płytce na 50 μl świeżego PBS w temperaturze pokojowej.
  2. Przykryj płytkę folią aluminiową i zanieś ją do sali mikroskopowej.
  3. Włącz konfokalny laserowy mikroskop skaningowy, ustaw na stole mikroskopu uchwyt na próbki do płytek 96-dołkowych i wybierz odpowiedni obiektyw (tutaj: 40x). Szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli 1.
  4. Dostosuj ustawienia obrazowania (Tabela 1).
    1. W Smart Setup wybierz lasery i filtry, a następnie przypisz je do ścieżek (Ścieżki 1-3), aby uzyskać optymalną jakość i szybkość obrazu (Tabela 1).
    2. Wybierając rodzaj eksperymentu, należy kliknąć na Kafelki, aby włączyć opcję wyboru i zapisania wyznaczonych pozycji X,Y na płycie.
    3. W module Imaging Setup zwizualizuj kanały akwizycji, przypisane do nich ścieżki oraz długości fal wzbudzenia i emisji (Tabela 1).
    4. W module Acquisition Mode (Tryb akwizycji) wybierz następujące opcje: Szybkość skanowania: 6; Kierunek: dwukierunkowy; Średnia: 2x; Bity na piksel: 8.
    5. W module Channels (Kanały) dostosuj moc lasera, wzmocnienie otworkowe i główne dla każdego kanału indywidualnie (Tabela 2). Dostosuj te parametry, aby uzyskać prawidłowo naświetlone obrazy bez ich przesycenia.
    6. Kliknij moduł Strategia Focus.
      1. Wybierz opcję Połącz programowy autofokus i Definite Focus.
      2. W obszarze Reference Channel and Offsets (Kanał referencyjny i przesunięcia) wybierz najbardziej stabilny/najjaśniejszy kanał jako odniesienie (zwykle DAPI lub 488 nm).
      3. W obszarze Stabilization Event Repetitions and Frequency (Powtórzenia i częstotliwość zdarzeń stabilizacyjnych) wybierz opcję Standard (Standardowy).
    7. W module Autofokus programowy wybierz następujące opcje: Tryb | Intensywność; Szukaj | Elegancki; Pobieranie próbek | Grzywna; Zakres względny.
    8. Kliknij moduł Kafelki.
      1. Wybierz pozycję | pojedyncze pozycje.
      2. W obszarze Ustawienia zaawansowane przejdź przez płytę, zidentyfikuj pozycję do obrazowania i kliknij przycisk + na karcie Ustawienia pozycji.
      3. Oznacz każdą pozycję dodatkowymi informacjami, które zostaną zapisane w metadanych obrazu. Aby to zrobić, otwórz zakładkę Właściwości, kliknij ikonę koła obok menu rozwijanego Kategoria, a następnie kliknij Nowy, aby otworzyć nowe okno dialogowe, w którym należy wprowadzić nową nazwę kategorii. Aby przypisać kategorię do określonej pozycji, wybierz pozycję, kliknij zakładkę Właściwości, przejdź do menu rozwijanego Kategorie i wybierz odpowiednią etykietę.
        UWAGA: Zaleca się utworzenie kategorii dla każdego zabiegu, aby oznaczyć każdą pozycję zabiegiem, któremu poddano komórki.
      4. W obszarze Sample Carrier (Nośnik próbki) wybierz Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0. Kliknij przycisk Kalibruj, aby skalibrować mikroskop do powierzchni płytki. Wybierz między kalibracją 1-punktową lub 7-punktową, w zależności od specyfikacji systemu.
      5. W obszarze Opcje wybierz nakładanie się kafelków o wartości 10%. W obszarze Podróżowanie w regionach kafelków wybierz opcję Grzebień. Zaznacz następujące opcje: użyj szybkości stołu montażowego z kontrolki sceny, użyj przyspieszenia etapu z kontrolki etapu i piramidy obrazu podczas akwizycji.
  5. Uruchom pobieranie obrazu i zapisz wyniki obrazu (pliki czi) oraz metadane obrazu (pliki csv) na przenośnym dysku twardym.
  6. Wyeksportuj obrazy jako pliki TIFF.

5. Wysokoprzepustowa analiza obrazu

  1. Utwórz osobny plik arkusza kalkulacyjnego metadanych z następującymi kolumnami: Pozycja, Studnia, Warunek, Seria i Zestaw. Odpowiednie dane do wypełnienia tych kolumn są pobierane z oryginalnego pliku metadanych, który pochodzi z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
  2. Pobierz oprogramowanie typu open source CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Uruchom program CellProfiler 4.2.4, klikając dwukrotnie, a następnie zaimportuj potok CellProfiler (plik uzupełniający 1), przeciągając i upuszczając.
    UWAGA: Poniżej znajdują się kroki, które należy wykonać, aby skompilować potok CellProfiler (plik uzupełniający 1) do automatycznego rozpoznawania fibroblastów za pomocą barwienia DAPI (moduł 1, rozpoznawanie jąder, patrz Tabela 2) i fluorescencji tła w pojedynczych komórkach pochodzących z AF488 (Moduł 2, rozpoznawanie komórek, patrz Tabela 2). Rozpoznawanie puncta (określanych jako obiekty) jest określane przez rozmiar puncta i intensywność fluorescencji puncta na tle (Moduł 3, rozpoznawanie puncta, patrz Tabela 2). Wreszcie, zgodnie z granicami komórek, puncta rozpoznane przez oprogramowanie są przypisywane do odpowiednich komórek (Przypisz relacje). Szczegółowy opis implementacji potoku CellProfiler do badań autofagii został opublikowany wcześniej9. Ponadto Tabela 2 zawiera ustawienia CellProfiler użyte w tym badaniu. Ponadto plik uzupełniający 2 wyświetla potok CellProfiler (plik uzupełniający 1) ze zrzutami ekranu wykonanymi w kolejności sekwencyjnej i odnoszącymi się do modułów wyszczególnionych w tabeli 2.
  4. Przed dostosowaniem potoku CellProfiler (Plik uzupełniający 1) przeciągnij i upuść pojedyncze pliki obrazów .czi lub folder zawierający wiele plików obrazów .czi do modułu Obraz.
  5. Dostosuj potok rozpoznawania obrazów. W module Names and Types (Nazwy i typy) zastąp kod c1-c3 kodem, który umożliwia oprogramowaniu identyfikację i sortowanie obrazów jednokanałowych do analizy.
  6. Dostosuj ustawienia potoku dla modułów IdentifyPrimaryObjects i IdentifySecondaryObjects, optymalizując wpisy liczbowe w modułach. Wartości wykorzystane w tym badaniu przedstawiono w tabeli 2.
  7. Aby śledzić korekty, wybierz opcję Tryb testowy, klikając przycisk Rozpocznij tryb testowy. Następnie kliknij przycisk Krok między modułami. Poczekaj na wyskakujące okienka (oryginalny obraz wejściowy, kontury rozpoznawania narysowane na oryginalnym obrazie i wynik analizy) pokazujące, w jaki sposób obraz zostanie przeanalizowany z ustawieniami, które zostały właśnie wprowadzone.
  8. Po zoptymalizowaniu potoku zakończ tryb testowy. Wykonaj analizę, aktywując tryb wyjścia z testu, a następnie klikając przycisk Analizuj obrazy.
  9. Po zakończeniu analizy sprawdź dokładność wykrywania komórek i punktów punktowych, porównując obrazy wejściowe z danymi wyjściowymi nakładki (granice komórek, puncta) wygenerowanymi przez program CellProfiler. Jeżeli wyniki nie są zadowalające, należy dostosować wartości liczbowe w różnych modułach (tabela 2), aż wynik analizy będzie wystarczająco dokładny.

6. Analiza danych

  1. Po uruchomieniu analizy poczekaj, aż oprogramowanie utworzy zestaw tabelarycznych plików tekstowych z wynikami. W przypadku korzystania z dostarczonego potoku CellProfiler (plik uzupełniający 1) poszukaj następujących plików wyjściowych:
    1. Plik CellProfilerOutputCells, który zawiera numer obrazu przypisany przez oprogramowanie, numer komórki przypisany do pojedynczych komórek, oryginalną nazwę pliku i ścieżkę wskazującą, gdzie pliki są przechowywane, liczbę punktów punktowych (ferrytyna, LAMP2) na komórkę oraz średnią powierzchnię punktową (ferrytyna, LAMP2) na komórkę.
    2. Plik CellProfilerOutputExperiment, który zawiera informacje o szczegółach technicznych związanych z eksperymentem (np. wersja oprogramowania, kanały obrazów, znaczniki metadanych).
  2. Otwórz te pliki jako arkusze kalkulacyjne.
  3. Kontynuuj przeprowadzanie analizy statystycznej liczby puncta i liczb kolokalizacji puncta przy użyciu preferowanego oprogramowania statystycznego (Tabela materiałów).

Wyniki

Pierwotne fibroblasty ludzkie pochodzące ze skóry (F-CO-60) od zdrowych dawców (Rysunek 1A) przygotowano do oceny ferrytynofagii poprzez zastosowanie baflomycyny A1, a następnie przeprowadzono immunostynowanie endogennej ferrytyny i białka LAMP2, zautomatyzowaną analizę obrazu oraz analizę z wykorzystaniem oprogramowania CellProfiler (Rysunek 1B).

Kolokalizacja endogennej ferrytyny i LAMP2 wzrosła po zablokowaniu lizosomalnej degradacji ferrytyny poprzez dodanie bafilomycyny A1, co jest zgodne z jej zdolnością do hamowania enzymów V-ATPase lizosomów, a tym samym blokowania ferrytynofagii7 (Rysunek 2). Ponadto, jako przykład przedstawiono rozpoznawanie komórek za pomocą oprogramowania, a także rozpoznawanie ferrytyny i LAMP2 (Rysunek 2).

W związku z tym należy zauważyć, że opisany tutaj schemat analizy w programie CellProfiler jest niezwykle wszechstronny i może zostać dostosowany do dodatkowych i/lub alternatywnych pomiarów, na przykład do oceny wpływu określonych mutacji BPAN na wzrost komórek, mitochondria lub inne organelle w kontekście funkcjonalnych systemów markerów jednokomórkowych.

Proces ferrytynofagii ze schematem recyklingu żelaza; schemat przepływu pracy hodowli fibroblastów z biopsji skóry.
Rysunek 1: Przegląd eksperymentalny. Graficzna reprezentacja (A) procesu ferrytynofagii oraz (B) eksperymentalnego schematu przepływu pracy w celu oceny ferrytynofagii w pierwotnych ludzkich fibroblastach pochodzących ze skóry, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna ferrytyny-AF488 i LAMP2-AF546 w warunkach odżywiania oraz z dodatkiem bafilomycyny A1.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy. Pierwotne ludzkie fibroblasty skóry w medium kontrolnym (warunki odżywiania) w (A) obecności lub (B) braku bafilomycyny A1 poddano analizie pośredniej immunofluorescencji z użyciem przeciwciał antyferrytynowych i anty-LAMP2, natomiast jądra komórkowe wybarwiono DAPI. Przedstawiono przykładowe obrazy fluorescencyjne uzyskane za pomocą zautomatyzowanej konfokalnej mikroskopii laserowej (paski skali: 10 μm). Po podaniu bafilomycyny A1 zaobserwowano zmiany w obfitości i kolokalizacji ferrytyny i LAMP2 w wyniku inhibicji lizosomów. Przedstawiono również analizę opartą na oprogramowaniu CellProfiler, pokazującą wygenerowane przez program nałożenia obrazów rozpoznawania komórek (fioletowy), jąder (niebieski), ferrytyny (zielony), LAMP2 (czerwony) oraz kolokalizujących punktów ferrytyny/LAMP2 (żółty). (C) Powiększone fragmenty obrazu (pasek skali = 10 µm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Ustawienia konfokalnej mikroskopii skaningowej użyte w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Numeryczne ustawienia programu CellProfiler zastosowane w niniejszym badaniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Potok (pipeline) CellProfiler wykorzystany w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Prezentacja potoku CellProfiler (patrz Plik uzupełniający 1) ze zrzutami ekranu wykonanymi w kolejności chronologicznej (patrz Tabela 2). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ta metoda, która wykorzystuje zautomatyzowaną mikroskopię fluorescencyjną w połączeniu z ogólnodostępną analizą obrazu opartą na CellProfiler9 w celu oceny wewnątrzkomórkowej lokalizacji kluczowych czynników ferrytynofagii, została zaprojektowana w celu dostarczenia cennych informacji na temat skuteczności lizosomalnej klirensu ferrytyny poprzez selektywną autofagię, określaną jako ferrytynofagia7. Protokół ten umożliwia obsługę dużych zestawów próbek z wieloma liniami komórkowymi i zabiegami jednocześnie oraz ocenę pożądanych odczytów, takich jak liczby ferrytyny puncta i liczby ferrytyny puncta kolokalizujące się z LAMP2, który jest typowym markerem lizosomalnym do oceny strumienia ferrytynofagii. Należy jednak w tym miejscu podkreślić, że dokładna, zautomatyzowana analiza obrazu zależy od jakości obrazu, która z kolei zależy od swoistości przeciwciał i optymalnego obrazowania. Dlatego analiza obrazu oparta na oprogramowaniu powinna być wykonywana tylko w przypadku obrazów o wysokiej jakości.

Modulacja poziomu żelaza w komórkach może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów, które są aktywowane w celu regulacji homeostazy żelaza w kontekście choroby. W artykule opisano metodę badania chorób BPAN w komórkach pochodzących od pacjentów leczonych środkami obciążającymi żelazo i chelatującymi żelazo. Deferasiox (DFX) jest znanym chelatorem żelaza szeroko stosowanym w dziedzinie10. Po zastosowaniu zatrzymuje wolne żelazo w cytoplazmie i wyzwala odpowiedź komórkową na głód żelaza. Ponieważ celem tego badania była ocena ferrytynofagii, pozbawienie komórek żelaza było prostym sposobem na promowanie degradacji ferrytyny poprzez autofagię jako mechanizm kompensacyjny w celu uzupełnienia komórkowej puli żelaza. Wręcz przeciwnie, cytrynian żelazowo-amonowy (FAC) służy do obciążania komórek żelazem. Komórki aktywują syntezę ferrytyny w odpowiedzi na nadmierne, a tym samym toksyczne stężenia żelaza cytozolowego11. Cytrynian żelazowo-amonowy sprzyja zatem syntezie ferrytyny i uwięzieniu żelaza w heteropolimerach ferrytyny, co z kolei może aktywować ferrytynowagię.

Aby zbadać strumień ferrytynofagiczny, w tym protokole selektywnie barwimy kluczowych graczy w procesie - ferrytynę i lizosomy (tutaj oznaczone przez LAMP2) - i oceniamy ich kolokalizację. Wysoki odsetek kolokalizującej puncta wskazuje na efektywną lizosomalną degradację ferrytyny. Aby zmaksymalizować informacje uzyskane z takich eksperymentów, można zastosować dodatkowe barwniki lub przeciwciała markerowe.

Warto zauważyć, że istnieją wyzwania techniczne związane z tą metodą. Pierwotne fibroblasty pochodzące od różnych ludzkich dawców mogą namnażać się i rosnąć w różny sposób in vitro. Stąd, aby uzyskać porównywalne wyniki, różne komórki powinny być wysiewane w tym samym pasażu. Dlatego zaleca się przeprowadzenie eksperymentu testowego przed przystąpieniem do tego protokołu w celu zbadania czasów podwajania komórek lub linii komórkowych, które mają być użyte.

Metoda ta nie ogranicza się do badania ferrytynofagii; Po prostu zmieniając stosowane terapie i przeciwciała, można go ponownie wykorzystać do oceny różnych innych selektywnych szlaków autofagii; na przykład mitofagię można zbadać przy użyciu CCCP jako mitochondrialnego induktora stresu i przeciwciał optynuryny, LC3 i LAMP2 do barwienia12.

Ogólnie rzecz biorąc, połączenie zautomatyzowanej akwizycji obrazu i analizy CellProfiler stanowi potężne narzędzie do wysokoprzepustowej oceny funkcjonalnej pojedynczych ludzkich fibroblastów. Jest to szczególnie istotne w przypadku badania chorób ludzkich, w przypadku których analiza i porównanie dużych kohort komórek pochodzących od pacjentów i zdrowych komórek pochodzących od dawców jest bardzo interesujące.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (project E03). Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linie komórkowe
Pierwotne ludzkie fibroblasty pochodzenia skórnego Biopsja skóry, zdrowy dawca ludzki, Biobank University Clinic Tü bingen, Aprobata etyczna 389/2019BO2F-CO-60, przejście 9
Zabiegi hodowli komórkowychStężenie końcowe (związek)
Pożywka kontrolnaDMEM 10%FCS(tylko DMSO)
Pożywka kontrolna + bafilomycynaA1DMEM 10%FCS100 nM bafilomycyna A1
Pożywka kontrolna + deferasiox (DFX)DMEM 10%FCS30 i mikro; M DFX
Pożywka kontrolna + DFX + bafilomycynaA1DMEM 10%FCS30 &mikro; M DFX, 100 nM bafilomycyna A1
Pożywka kontrolna + cytrynian żelazowo-amonowy (FAC)DMEM 10%FCS0,05 mg/ml FAC
Pożywka kontrolna + FAC + bafilomycynaA1DMEM 10%FCS0,05 mg/ml FAC, 100 nM bafilomycyna A1
Materiał
albumina [BSA] Frakcja VAppliChemA1391
Alexa 488 koza a-królikLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 kozia myszLife TechnologiesA-11003
Bafilomycyna A1Sigma Aldrich196000
BioLite Cell Culture Treated 10 cm szalkiThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS bez wapnia i magnezuGibco14190094
Płodowa surowica bydlęca (FCS)Gibco10437-028
Cytrynian żelazowo-amonowy (FAC)MerckF5879
Anty-FERRITIN (ludzka śledziona)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSC-18822
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny)Life Technologies15140-122
Trypsin-EDTA (0,05%) z czerwienią fenolowąGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96-dołkowe płytki ze szklanym dnem #0CellvisP96-0-N
Rozwiązanie
3,7% paraformaldehyd (PFA)PFA rozpuszczony w PBS, pH 7,5 
Bafilomycyna A1 100 mM zapasBafilomycyna A1 rozcieńczona w DMSO
Cytrynian żelazowo-amonowy (FAC) 100 mg/ml zapasFAC rozcieńczony w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej
PBS/TPBS, uzupełniony 10% Tween20 
PBS/T + BSAPBS, uzupełnione o 10% Tween20, 1% BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel Wersja 16.50Microsoft Office Plus 365

Bibliografia

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Homeostaza elazalizosomalna degradacja ferrytynymutacja genu autofagiiobrazowanie wysokoprzepustowemikroskopia konfokalnaanaliza w programie CellProfilerimmunobarwieniemarker LAMP2
Ferrytynofagia: ocena selektywnej degradacji żelaza przez autofagię w ludzkich fibroblastach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.