Artykuł metodologiczny

Dowody na ekspresję EpCAM i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65118

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  , 
1The Hormel Institute, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia powtarzalną metodę z nowymi odkryciami na temat obecności komórek nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Krt1-14; Transgeniczne myszy mTmG zastosowano jako metodę in vivo w celu potwierdzenia tych wyników.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe zostały zidentyfikowane we krwi i szpiku kostnym pacjentów z rakiem i innymi chorobami. Jednak obecność normalnych komórek nabłonkowych we krwi i szpiku kostnym zdrowych osób nie została jeszcze zidentyfikowana w spójny sposób. Przedstawiono powtarzalną metodę izolowania komórek nabłonka od zdrowej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnego (BM) przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF). Komórki nabłonkowe u zdrowych osób zostały najpierw zidentyfikowane i wyizolowane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu cząsteczki adhezji komórek nabłonka (EpCAM). Potwierdzono, że te komórki EpCAM+ wyrażają keratynę za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej w Krt1-14; Myszy transgeniczne mTmG. Próbki krwi ludzkiej zawierały od 0,18% ± 0,0004 komórek EpCAM+ (SEM; n=7 kontrprób biologicznych, 4 kontrpróby eksperymentalne). U ludzi BM 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne) komórek jednojądrzastych stanowiło EpCAM+. We krwi myszy komórki EpCAM+ stanowiły 0,45% ± 0,0006 (SEM; n=2 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne), a we krwi myszy BM 5,17% ± 0,001 (SEM; n=3 kontrpróby biologiczne, 4 kontrpróby eksperymentalne) stanowiły EpCAM+. U myszy wszystkie komórki EpCAM+ były immunoreaktywne na pan-cytokeratynę, co określono za pomocą mikroskopii IF. Wyniki potwierdzono przy użyciu Krt1-14; Myszy transgeniczne mTmG, z niską (8,6 natywnych komórek GFP+ na 106 analizowanych komórek; 0,085% żywotnych komórek), ale znaczną liczbą (p < 0,0005) komórek GFP+ obecnych w normalnym mysim BM, które nie były wynikiem losowości w porównaniu z wieloma kontrolami negatywnymi. Co więcej, komórki EpCAM+ we krwi myszy były bardziej niejednorodne niż komórki CD45+ (0,58% w BM; 0,13% we krwi). Z obserwacji tych wynika, że komórki wykazujące ekspresję białek cytokeratyny są odtwarzalnie wykrywalne wśród komórek jednojądrzastych z ludzkiej i mysiej krwi oraz BM. Demonstrujemy metodę pobierania tkanek, cytometrii przepływowej i barwienia immunologicznego, które można wykorzystać do identyfikacji i określenia funkcji tych komórek nabłonka pan-cytokeratyny u zdrowych osób.

Wprowadzenie

Komórki nabłonkowe znajdują się w fizycznych barierach między naszymi ciałami a środowiskiem i są w stanie rozpoznawać i reagować na zmiany w swoim mikrośrodowisku1. Mają one rozwijającą się niszę komórek macierzystych, która umożliwia przekształcanie nowych tkanek i naprawę uszkodzeń2. Nasze laboratorium bada komórki macierzyste w mieszkach włosowych skóry; Skóra jest dobrym modelem do badania tkanki nabłonkowej i proliferacji komórek macierzystych, ponieważ jest dobrze widoczna i występuje w niej ciągła rotacja komórek. Rak nabłonka jest najczęstszą formą raka, prawdopodobnie ze względu na to, że tkanki nabłonkowe, takie jak skóra, są pierwszą linią obrony przed rakotwórczymi czynnikami środowiskowymi, co prowadzi do wysokich wskaźników rotacji i proliferacji komórek nabłonkowych3. Większość naskórka skóry, wierzchniej warstwy ochronnej, składa się z keratynocytów, które wyrażają różne rodzaje keratyny, aby zapewnić wsparcie i strukturę4. Pacjenci z nowotworami nabłonkowymi często mają komórki nabłonkowe obecne we krwi i szpiku kostnym, które również wyrażają keratynę. Płynne biopsje to nieinwazyjny sposób wykrywania i monitorowania tych komórek nabłonka w różnych płynach ustrojowych5. Krążące komórki nabłonkowe, zwane również krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC), znajdują się we krwi obwodowej i mogą być biomarkerami rokowania w przypadku raka, a także kierować zindywidualizowanym leczeniem. CTC mogą również wskazywać na postęp choroby, skuteczność leczenia i całkowite przeżycie pacjenta5,6.

Cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych (EpCAM) jest klinicznie stosowanym markerem CTC i może identyfikować nowotwory pochodzenia nabłonkowego u pacjentów z rakiem. EpCAM odgrywa rolę w adhezji, migracji, sygnalizacji, proliferacji i różnicowaniu komórek6. Aby krążąca komórka nabłonkowa mogła zostać sklasyfikowana jako CTC, musi być dodatnia dla cytokeratyn 8, 18 i 19 oraz ujemna dla CD45, powszechnego markera leukocytów6. CTC są zwykle identyfikowane przez pierwsze zubożenie CD45 za pomocą mikrokulek magnetycznych, a następnie przez testowanie na EpCAM i cytokeratynę 19 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej7. Głównym ograniczeniem w wykrywaniu CTC jest ich rzadkość; Stanowią one mniej niż 0,01% wszystkich komórek we krwi, a bardzo niewiele z nich przeżywa w krążeniu, aby dotrzeć do odległych narządów8,9,10. Należy wziąć pod uwagę projektowanie eksperymentów i technik izolowania i identyfikowania tych komórek ze względu na ich rzadki charakter. Obecnie istnieje tylko jeden zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) automatyczny sortownik jednokomórkowy używany do identyfikacji CTC, który wykorzystuje EpCAM jako biomarker. Inne metody obejmują separację kulek magnetycznych i cytometrię przepływową lub kombinację tych metod. Istnieje zapotrzebowanie na nowe techniki o wyższej czułości i swoistości do wykrywania rzadkich CTC11.

Cytometria przepływowa jest preferowaną metodą wykrywania rzadkich populacji komórek w próbkach krwi, szpiku kostnego i innych tkanek. Te rzadkie komórki mogą obejmować komórki macierzyste, krążące komórki śródbłonka, CTC i resztkowe komórki chorobowe. Cytometria przepływowa umożliwia pomiary ilościowe każdego typu komórek i sortuje je do dalszych badań7,9. Przeprowadzono zliczanie przyrostowe, aby zapewnić dokładną ocenę tych rzadkich komórek. Możliwość użycia bramkowania w celu wykluczenia komórek z dalszej analizy jest sposobem na zwiększenie swoistości podczas analizowania komórek. Ograniczeniami cytometrii przepływowej są czas potrzebny na analizę dużych próbek i brak wizualnego potwierdzenia tożsamości komórki. Aby temu zaradzić, przeprowadzono mikroskopię immunofluorescencyjną na posortowanych komórkach, aby potwierdzić ich tożsamość.

Poprzednio nasze laboratorium wykazało, że u myszy komórki szpiku kostnego są rekrutowane i przyczyniają się do powstawania nowotworów skóry12. Te komórki pochodzące ze szpiku kostnego są dodatnie dla pan-cytokeratyny i cytokeratyny naskórka. Aby dokładniej wyjaśnić rolę nabłonkowych komórek macierzystych, komórek pochodzących ze szpiku kostnego i komórek wyrażających cytokeratynę w progresji guza, poszukiwano komórek EpCAM+ cytokeratyny w normalnych próbkach krwi i szpiku kostnego myszy i ludzi. Podobnie jak w przypadku większości eksperymentów, ta metoda została opracowana w wielu iteracjach. Wcześniej transgeniczne myszy były używane wraz z przyrostowymi liczeniami w celu poszukiwania komórek eksprymujących K14GFP w szpiku kostnym12. W miarę zliczania kolejnych komórek, reprezentatywna populacja rzadkich komórek była w stanie zostać zidentyfikowana, jak pokazano na Rysunek 1 w sekcji reprezentatywnych wyników. Uzasadnienie dla badania komórek nabłonkowych w prawidłowej krwi i szpiku kostnym opierało się na wczesnej literaturze na temat CTC, gdzie normalni zdrowi dawcy mieli poziomy tła komórek EpCAM+13. Jak wspomniano wcześniej, charakterystyka EpCAM często rozpoczyna się od wyczerpania CD45. Ten krok został pominięty, ponieważ niektóre komórki krwiotwórcze mają ekspresję EpCAM i cytokeratyny z nieznanych powodów, które wymagają dalszych badań. W związku z tym komórki posortowano na podstawie obecności lub braku EpCAM, niezależnie od linii komórkowej, a następnie wybarwiono immunologicznie pod kątem cytokeratyny. Poniższy protokół i przepływ pracy pokazany na Rysunek 2 opisują technikę, która wykorzystuje cytometrię przepływową z kompensacją i kontrolą, metody statystyczne i obrazowanie immunofluorescencyjne do izolowania i identyfikacji tych rzadkich populacji komórek nabłonkowych.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Minnesoty zgodnie z wytycznymi NIH oraz przepisami federalnymi. Świeża krew i szpik kostny człowieka zostały zakupione z komercyjnych źródeł. Próbki zostały pobrane przez firmę zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB od dawców u których nie stwierdzono obecności HIV, zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C oraz którzy zostali przebadani w kierunku COVID-19. Wszystkie próbki przed wysyłką przez firmę zostały uprzednio pozbawione danych identyfikacyjnych i zanonimizowane. Ponieważ zostały one pozyskane komercyjnie, nie było wymaganej zgody IRB.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Wszystkie roztwory muszą być przygotowane w komorze z laminarnym przepływem powietrza w środowisku sterylnym. Należy uzyskać certyfikat poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) do pracy z ludzką krwią i szpikiem kostnym.

  1. Przygotować roztwór do pobierania szpiku kostnego, dodając 1 mL gentamycyny i 5 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS).
  2. Przygotować roztwór buforu do barwienia, dodając 50 mL FBS do 500 mL HBSS.
  3. Przygotować 1x bufor do lizy, łącząc 10 mL 10x buforu do lizy z 90 mL sterylnej wody.

2. Przygotowanie dygestorium

  1. Włącz dygestorium i pozwól mu pracować przez kilka minut, aby uzyskać odpowiedni przepływ powietrza.
  2. Przygotuj wszystkie materiały niezbędne do pobrania szpiku kostnego. Spryskaj je wewnątrz dygestorium 70% etanolem, aby utrzymać sterylne środowisko. Spryskuj dłonie za każdym razem przed włożeniem ich do dygestorium.
  3. Umieść w dygestorium autoklawowaną tacę wraz z autoklawowanymi nożyczkami, złożonym skalpelem, pęsetą i zakrzywionym chwytakiem w małym kubku wypełnionym 70% etanolem, aby zachować ich sterylność.
  4. Dodaj 10 mL roztworu do pobierania szpiku kostnego do jednej probówki wirówkowej 50 mL i oznacz ją jako „Limbs”. Drugą probówkę wirówkową 50 mL oznacz jako „Bone Marrow”.
  5. Naciągnij 10 mL roztworu do pobierania szpiku kostnego do strzykawki, a następnie załóż igłę 26 G.

3. Pobieranie szpiku kostnego od myszy

  1. Uśmierć mysz poprzez uduszenie CO2. Śmierć potwierdza się brakiem bicia serca oraz uciśnięciem łapek, aby upewnić się, że nie występuje reakcja. Jako wtórna metoda całkowitej eutanazji można zastosować zwichnięcie stawów szyjnych.
  2. Umieść mysz w pojemniku o pojemności 500 mL i dodaj tyle jodu, aby przykrył połowę zwierzęcia. Delikatnie wstrząśnij i zakręć pojemnikiem, aby zapewnić dokładne pokrycie. Przepłucz wodą dejonizowaną. Wykonaj jeszcze jedno mycie jodem, a następnie dwa mycia 70% etanolem, postępując zgodnie z tymi samymi krokami.
  3. Umieść mysz w dygestorium i połóż ją na plecach na tacy. Chwyć tylne kończyny i rozsuń je, aż poczujesz kliknięcie; ma to na celu oddzielenie kończyn od kręgosłupa.
  4. Wykonaj nacięcie skóry myszy o długości 1 cm w okolicy pachwin. Wprowadź zamknięte nożyczki w nacięcie, a następnie otwórz je pod skórą, aby oddzielić ją od otrzewnej.
  5. Nacinij skórę na nodze w okolicy uda, a następnie przetnij skórę wzdłuż nogi, aby odsłonić mięśnie i kości.
  6. Usuń tylne kończyny, przecinając tkanki wokół stawu biodrowego, dbając o to, aby nie przeciąć kości udowej. Umieść kończyny w probówce oznakowanej jako „Limbs”. Po usunięciu obu nóg umieść mysz w worku na zwłoki i włóż do zamrażarki.
    UWAGA: Przed cięciem należy wyczuć kość biodrową, aby prowadzić nożyczki i uniknąć przecięcia kości udowej, ponieważ większość szpiku kostnego pozyskuje się właśnie z kości udowej.
  7. Zacznij odcinanie mięśni, tkanek i tłuszczu wzdłuż jednej z kończyn za pomocą nożyczek. Tnij równolegle do kości. Następnie użyj skalpela i usuń pozostały tłuszcz lub mięśnie, wykonując ruch skrobania prostopadle do kości.
  8. Po odpowiednim oczyszczeniu kości oddziel kość udową od piszczelowej w obrębie kolana. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcia na obu końcach kości udowej i piszczelowej w miejscach, gdzie nie widać szpiku kostnego.
  9. Wprowadź przygotowaną strzykawkę z igłą do kości. Jeśli występuje opór, odetnij nieco więcej z końca kości, aż opór ustąpi.
    1. Trzymając kość nad probówką oznakowaną jako „Bone Marrow”, wtłocz roztwór do pozyskiwania szpiku kostnego przez kość, aby wypłukać szpik do probówki. Powtórz czynność z drugiej strony kości, aby uzyskać resztę szpiku, aż kość stanie się całkowicie biała lub pusta.
  10. Powtórz kroki 7-9 dla wszystkich pozostałych kości i kończyn; cały szpik należy wypłukać do tej samej probówki stożkowej.
  11. Używając pustej strzykawki 10 mL i igły 20 G, rozbij grudki szpiku kostnego w probówce, zasysając i wypuszczając szpik w strzykawce 5-10 razy.
  12. Umieść sterylny filtr 40 µm w czystej probówce wirówkowej 50 mL i przepłucz go 1 mL roztworu do pozyskiwania szpiku kostnego. Następnie przefiltruj szpik kostny, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki. Oznacz tę probówkę jako „Filtered Bone Marrow”.
  13. Przechowuj przefiltrowany szpik kostny w lodówce lub w lodzie do momentu użycia. Należy go wykorzystać w tym samym dniu, w którym został pozyskany. Jeśli nie zostanie użyty tego samego dnia, zamroź komórki za pomocą krioprotektanta, takiego jak dimetylosulfoksyd (DMSO).
    OSTROŻNIE: Wszystkie odpady z tych eksperymentów należy zutylizować prawidłowo w pojemniku na odpady biologiczne. Wszystkie ostre narzędzia powinny trafić do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady medyczne ostre.

4. Lizy erytrocytów z szpiku kostnego

  1. Odwirować komórki szpiku kostnego przy 170 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odessać i usunąć nadsącz. Resuspender komórki w 10 mL 1x buforu do lizy erytrocytów i inkubować przez 4 min.
  2. Dodać 30 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), aby zatrzymać działanie buforu do lizy. Odwirować komórki przez 8 min przy 170 x g w temperaturze pokojowej. Odessać i usunąć nadsącz. Resuspender w 10-20 mL buforu do barwienia.

5. Liczenie komórek

  1. Połączyć 500 μl komórek z 9,5 mL roztworu do pozyskiwania szpiku kostnego, aby uzyskać rozcieńczenie 1:20.
    UWAGA: Roztwór ten zostanie wykorzystany do zliczenia komórek i nie musi być utrzymywany w warunkach sterylnych.
  2. Odpić 200 µL komórek z rozcieńczenia 1:20, dodać je do 200 µL błękitu trypanu i dokładnie wymieszać.
  3. Przenieść mieszaninę do hemocytometru i zliczyć komórki żywe oraz martwe po obu stronach. Obliczyć stężenie w pierwotnej zawiesinie komórkowej, korzystając z poniższej tabeli (przedstawionej w Supplementary File 1) oraz równań:
    Liczba komórek na mililitr:
    Wzór na zliczanie komórek; obliczanie stężenia żywych komórek; równania w eksperymentach biologicznych.
    Całkowita liczba komórek:
    Wzór na obliczanie liczby komórek; schemat ze zmiennymi dla analizy stężenia komórek i objętości.
  4. Odwirować komórki przy 170 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i resuspender do stężenia 10 x 106 na 1 mL (1 x 106 komórek na 100 µL), zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczeń przeciwciał.
  5. Przejść do cytometrii przepływowej (krok 8).

6. Pobieranie krwi od myszy

  1. Uśmierć mysz za pomocą gazu CO2 lub poprzez zwichnięcie stawów atlasowo-potylicznych.
  2. Pobierz krew z serca pod kątem 45° za pomocą igły 26 G przymocowanej do strzykawki 1 mL pokrytej 0,5 M kwasem etylenodiaminooctowym (EDTA).
  3. Odwiruj krew i resuspenduj w pożywce lub buforze barwiącym.
    UWAGA: Komórki zostaną odwirowane i resuspendowane do końcowego stężenia w buforze barwiącym po lizie erytrocytów i zliczeniu komórek.
  4. Przeprowadź lizę erytrocytów (krok 4).
  5. Przeprowadź zliczenie komórek (krok 5).
  6. Przejdź do cytometrii przepływowej (krok 8).

7. Przetwarzanie próbek ludzkiej krwi i szpiku kostnego

  1. Wszystkie procedury należy przeprowadzać pod dygestorium z certyfikatem BSL2, stosując środki ochrony osobistej.
  2. Próbki należy pobrać poprzedniej nocy i przeprowadzić lizę erytrocytów. Przed wysyłką próbek mononuklearnych w transporcie chłodniczym w ciągu jednej doby należy upewnić się, że próbki zostały odidentyfikowane i zanonimizowane.
  3. Po otrzymaniu próbek, żywe komórki należy odwirować z prędkością 170 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Są to próbki BSL2, których obsługa musi być zgodna z lokalnymi wytycznymi.
  4. Komórki należy resuspendować w pożywce lub buforze barwiącym.
    UWAGA: Po zliczeniu komórek należy je odwirować i resuspendować w buforze barwiącym do uzyskania stężenia końcowego.
  5. Należy przeprowadzić zliczanie komórek (krok 5).
  6. Należy przejść do cytometrii przepływowej (krok 8).

8. Cytometria przepływowa

  1. Barwienie
    1. Podzielić komórki do oddzielnie oznakowanych probówek w zależności od stosowanego panelu barwień, wliczając kontrole kompensacji (niebarwione, kontrole izotypowe, barwienia pojedyncze oraz kontrole FMO [fluorescence minus one]). Zamrozić pozostałe komórki lub wykorzystać je do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Przykład panelu barwień z zastosowanymi rozcieńczeniami przeciwciał znajduje się w Tabeli 1.
      UWAGA: Dla każdego dodatkowego fluoroforu należy dodać kontrole FMO w kombinacji z pozostałymi fluoroforami oraz barwienie pojedyncze tym fluoroforem. Kontrole izotypowe można zastosować w celu zablokowania barwienia nieswoistego. Każde nowe przeciwciało powinno zostać mianowane na próbkach w celu ustalenia optymalnego rozcieńczenia.
    2. Dodać przeciwciała zgodnie z rozcieńczeniami zalecanymi przez producenta i dokładnie wymieszać, stukując dnem probówek. Stężenia przeciwciał są zazwyczaj podawane jako 1 x 106 komórek na 100 µL. Rozcieńczenia z przeciwciałami i kontrolami przedstawiono w Tabeli 1. Przeciwciała są koniugowane z fluoroforami i muszą być chronione przed światłem.
      UWAGA: W celu wizualizacji małych populacji komórek najlepiej zastosować EpCAM koniugowany z fykoerytryną (PE) (mianować w zakresie 3-5 µL na 1 milion komórek, jak wskazano w Tabeli 1). PE-CD49f został użyty jako kontrola PE do barwienia pojedynczego (20 µL na 1 milion komórek), ponieważ komórki te występują częściej niż PE-EpCAM i są zatem łatwiejsze do wykorzystania w kompensacji.
    3. Inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
    4. Po inkubacji przenieść probówki z powrotem do komory z laminarem BSL2 i dodać 1 mL buforu do barwienia do każdej probówki.
    5. Następnie wirować probówki z prędkością 170 x g w temperaturze 4 °C przez 5-10 min.
    6. Po wirowaniu przenieść zakryte probówki z komórkami z powrotem do komory BSL2 i odessać nadsącz. Należy zmieniać końcówki pipety aspiracyjnej między każdą probówką, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
    7. Resuspendować osad komórkowy w 1 mL buforu do barwienia i wymieszać, stukując dnem probówek.
    8. Przemyć komórki jeszcze dwa razy, powtarzając kroki 8.1.4-8.1.7.
      UWAGA: Nie używać pipet do resuspendowania, aby uniknąć utraty komórek.
    9. Resuspendować w 500 µL buforu do barwienia w ramach końcowego przygotowania przed cytometrią przepływową. Dodać 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub inny dyskryminator martwych komórek, zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Cytometr przepływowy
    1. Po skonfigurowaniu urządzenia wykorzystać kontrole i FMO do ustawienia kompensacji i bramkowania. Jako płyn osłonowy zastosować zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby wspomóc przeżywalność kruchych komórek. Jeśli HBSS jest niedostępny, użyć PBS.
      UWAGA: Użyty cytometr przepływowy oraz oprogramowanie są wymienione w Tabeli materiałów.
    2. Ładować próbki jedna po drugiej i zbierać punkty danych dla 50 000, 100 000, 500 000 i jednego miliona zdarzeń. Przechowywać probówki w lodzie lub w lodówce do momentu użycia.
      UWAGA: Podczas zbierania danych można ustawić limit czasu, aby zapewnić żywotność próbek.
    3. Zebrać komórki do 3 mL pożywki RPMI z 10% FBS w probówkach wirówkowych 15 mL.
    4. W przypadku przeprowadzania immunofluorescencji na komórkach EpCAM+, wykorzystać cytometr przepływowy do posortowania od 800 do 1 000 komórek do każdego dołka szkiełka 8-dołkowego.
    5. Posortować populację komórek EpCAM- na oddzielne szkiełka jako kontrolę negatywną do wykorzystania podczas barwienia immunofluorescencyjnego.
      UWAGA: Komórki można również sortować do probówek 15 mL zawierających FBS i nanosić na szkiełko za pomocą cytocentryfugi lub pipety, aby zapobiec rozrywaniu komórek.
    6. Utrwalić szkiełka w mieszaninie 50% metanolu i 50% acetonu w temperaturze -20 °C przez 10 min. Przechowywać szkiełka w -20 °C do momentu barwienia immunofluorescencyjnego.
  3. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Uruchomić licencjonowane oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej.
    2. Wczytać pliki w standardzie cytometrii przepływowej (FCS) uzyskane z cytometru, zawierające kontrole i próbki.
    3. Kliknąć Create Group i użyć słów kluczowych, aby przypisać próbki i kontrole do grupy.
      UWAGA: Do bramkowania w oprogramowaniu do analizy cytometrii przepływowej użyć kontroli „bez barwienia” (no stain), jak pokazano na Rysunku 3.
    4. Kliknąć dwukrotnie próbkę no stain control, aby otworzyć wykres bez bramkowania.
    5. Ustawić oś Y wykresu na SSC-A i oś X na FSC-A (pole rozproszenia bocznego względem pola rozproszenia przedniego), co wskazuje na wielkość komórek i ich złożoność wewnętrzną.
    6. Kliknąć kształt wielokąta w lewym górnym panelu i stworzyć bramkę wokół komórek. Należy wykluczyć komórki na peryferiach, gdyż najprawdopodobniej są to debris. Oznaczyć tę bramkę jako „Cells”, jak pokazano na Rysunku 3A.
    7. Po bramkowaniu komórek kliknąć dwukrotnie wewnątrz wielokąta, aby otworzyć kolejny wykres w nowym oknie.
    8. Ustawić oś Y nowego wykresu na SSC-A, a oś X na SSC-W w celu dyskryminacji dubletów. Kliknąć kształt wielokąta i stworzyć prostokąt wokół pojedynczych komórek. Oznaczyć go jako „Single Cells”, jak pokazano na Rysunku 3B.
    9. Po bramkowaniu komórek kliknąć dwukrotnie wewnątrz wielokąta, aby otworzyć kolejny wykres w nowym oknie.
    10. Ustawić oś Y na FSC-A i oś X na DAPI-A (lub inny użyty dyskryminator martwych komórek).
    11. Stworzyć bramkę wielokątną wokół komórek negatywnych dla DAPI po lewej stronie wykresu. Oznaczyć je jako „Live Cells”, jak pokazano na Rysunku 3C.
    12. Po bramkowaniu komórek kliknąć dwukrotnie wewnątrz wielokąta, aby otworzyć kolejny wykres w nowym oknie.
    13. Ustawić oś Y na SSC-A i oś X na EpCAM-PE (lub dowolny fluorofor użyty do identyfikacji komórek EpCAM). Komórki po lewej stronie są negatywne pod kątem EpCAM. Jeśli jakiekolwiek komórki pojawią się po prawej stronie, są one pozytywne pod kątem EpCAM.
    14. Użyć wykresu EpCAM-PE do stworzenia bramki wielokątnej, która wyklucza komórki po lewej stronie i obejmuje jedynie pustą przestrzeń po prawej. Oznaczyć pusty obszar po prawej stronie wewnątrz wielokąta jako „EpCAM”, jak pokazano na Rysunku 3D.
      UWAGA: Jest to kontrola bez barwienia, więc ekspresja EpCAM nie powinna wystąpić. Użyć kontroli bez barwienia do określenia, które komórki są pozytywne pod kątem EpCAM. Tym samym strategia bramkowania dla kompensacji zostaje zakończona i wszystkie wykresy można teraz zamknąć.
    15. Na stronie obszaru roboczego zaznaczyć linię kontroli bez barwienia z bramkami „Cells”, „Single Cells”, „Live Cells” i „EpCAM”. Kliknąć prawym przyciskiem myszy i wybrać copy analysis to group. Przeniesie to strategię bramkowania na wszystkie pozostałe wczytane próbki w wcześniej utworzonej grupie. Jeśli grupa nie została utworzona na początku, można to zrobić teraz, wybierając Create Group w lewym górnym rogu.
    16. Przejrzeć próbki w grupie i sprawdzić wcześniej narysowane bramki wielokątne, aby upewnić się, że pasują do wszystkich próbek i kontroli. Pozwoli to uzyskać wartość procentową oraz liczbę komórek.
    17. Kliknąć przycisk edytora układu L w lewym górnym rogu nad napisem „Workspace”. Wykresy te można następnie ułożyć i wyeksportować za pomocą edytora układu.
  4. Przygotowanie odczynników do immunofluorescencji
    1. Przygotować rozcieńczalnik przeciwciał, łącząc 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 2 g mleka odtłuszczonego, 10 mL 10-krotnego buforu TBS (tris-buffered saline), 100 µL Tween oraz 90 mL wody destylowanej.
    2. Przygotować TBST, łącząc 50 mL 20-krotnego TBS, 950 mL wody destylowanej i 200 µL Tween.
    3. Przygotować 10% normalną surowicę konia (NHS), łącząc 1 mL NHS z 9 mL rozcieńczalnika przeciwciał (krok 8.4.1).
    4. Przygotować 1% NHS, łącząc 1 mL 10% NHS z 9 mL TBST.
  5. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Wyjąć szkiełka z temperatury -20 °C i pozwolić im ogrzać się do temperatury pokojowej.
    2. Przemyć szkiełka trzy razy w wodzie destylowanej po 5 min każde płukanie.
    3. Blokować szkiełka przez 1 h w temperaturze pokojowej w 10% NHS w rozcieńczalniku przeciwciał (krok 8.4.3).
    4. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (pan-cytokeratyna) w stosunku 1:750 w 1% NHS w TBST (krok 8.4.4). Inkubować szkiełka w rozcieńczonym przeciwciele pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Następnego dnia przemyć szkiełka trzy razy 1-krotnym buforem do mycia (PBS lub TBST) po 5 min każde płukanie.
    6. Rozcieńczyć przeciwciało wtórne w stosunku 1:1 000 w 1% NHS w TBST (krok 8.4.4). Inkubować szkiełka w rozcieńczonym przeciwciele wtórnym przez 1 h w temperaturze pokojowej.
    7. Przemyć szkiełka trzy razy 1-krotnym buforem do mycia po 5 min każde płukanie. Zamontować i przykryć szkiełka szkiełkami podstawowymi, używając utwardzalnego medium montażowego z DAPI. Użyć patyczka nasączonego watą, aby delikatnie wypchnąć pęcherzyki powietrza spod szkiełka podstawowego.

Wyniki

Zastosowanie tych metod pozwoliło na wizualizację rzadkich populacji komórek nabłonkowych we krwi i szpiku kostnym zdrowych ludzi oraz myszy. Przy zastosowaniu odpowiedniej kompensacji i kontroli, zgodnie z opisem, wyniki konsekwentnie wykazały, że 4%–5% komórek w mysim szpiku kostnym było EpCAM+, niezależnie od liczby zliczonych komórek, co przedstawiono w Rycina 4 i Rysunek 5W próbkach krwi mysiej mniej niż 0,5% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rycina 6W próbkach ludzkiego szpiku kostnego 2%–5% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rycina 7 i Rycina 8Choć zakres 2%–5% jest szeroki, wartości procentowe dla każdego pojedynczego dawcy były spójne wraz z przyrostem liczby przeliczonych komórek. W ludzkich próbkach krwi około 0,3% komórek było EpCAM+, co pokazano w Rysunek 9Nasze próbki kontrolne (brak barwienia, kontrola izotypowa oraz FMO) wykazały bardzo mało wyników fałszywie dodatnich dla EpCAM+, co pokazano w Rycina 4 i Rysunek 7Komórki z grup EpCAM+ i EpCAM-, które zostały posortowane na szkiełka, wykazały pozytywne barwienie na pan-cytokeratynę w próbkach EpCAM+ oraz ujemne barwienie na pan-cytokeratynę w próbkach EpCAM-, co przedstawiono w Rysunek 10Wyniki te wskazują, że eksperymenty zostały odpowiednio zaprojektowane i są powtarzalne.

Wykres słupkowy przedstawiający liczbę komórek GFP-dodatnich w zależności od liczby posortowanych komórek; kontrola K14Cre vs. hybryda K14Cre/mTmG.
Rycina 1: Myszy transgeniczne Krt14Cre;mTmG z przyrostową liczbą komórek szpiku kostnego. Liczbę komórek szpiku kostnego myszy Krt1-14;mTmG liczono przyrostowo. Komórki GFP-dodatnie wskazują na ekspresję keratyny 14 i zostały zidentyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej. Wraz ze wzrostem liczby liczonych komórek szpiku kostnego, populacja komórek dodatnich pod kątem keratyny 14 była łatwiejsza do zidentyfikowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat sortowania FACS komórek krwi i szpiku kostnego, cytospin EpCAM+/-, immunofluorescencja cytokeratyny.
Rycina 2: Schemat postępowania dla komórek EpCAM+ i cytokeratyna+. Komórki szpiku kostnego i krwi zostały najpierw posortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) w celu oddzielenia komórek EpCAM+ od EpCAM-. Komórki te zostały posortowane do dwóch różnych probówek, a także na dwa różne szkiełka. Komórki posortowane do probówek zostały przeniesione na szkiełka za pomocą cytocentryfugi. Szkiełka zabarwiono następnie za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko pan-cytokeratynie, a następnie przeciwciałem wtórnym. Szkiełka przeanalizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu obserwacji ekspresji pan-cytokeratyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej, wykresy rozrzutu, bramkowanie populacji komórek, porównanie intensywności fluorescencji, filtrowanie danych.
Rycina 3: Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Podczas analizy danych z cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania analitycznego, kontrola bez barwienia jest wykorzystywana do wyboru komórek zainteresowania. Komórki są najpierw selekcjonowane na podstawie SSC-A i FSC-A, które obrazują złożoność wewnętrzną oraz rozmiar komórek. (A) Wokół komórek rysowana jest bramka wielokątna. (B) Pojedyncze komórki są wyodrębniane poprzez bramkowanie SSC-A względem SSC-W. (C) Żywe komórki są wyodrębniane poprzez bramkowanie FSC-A względem DAPI. (D) Komórki negatywne pod kątem EpCAM są wykluczane poprzez bramkowanie po prawej stronie komórek negatywnych dla EpCAM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometryczna, ekspresja EpCAM, wykresy kropkowe, porównania braku barwienia i kontroli, kwantyfikacja komórek.
Rycina 4: Analiza cytometryczna komórek EpCAM+ w szpiku kostnym myszy. W górnym panelu przedstawiono kontrole bez barwienia, izotypowe oraz FMO, a w dolnym panelu przyrostowe liczby 50 000, 100 000 i 500 000 komórek. Wykresy te obrazują spójność procentową niezależnie od liczby komórek, pomimo ogólnego wzrostu całkowitej liczby policzonych komórek. Panele po prawej stronie wskazują strategię bramkowania, omówioną wcześniej w sekcji analizy cytometrycznej i przedstawioną na Rycini 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy komórek szpiku kostnego z ekspresją EPCAM w różnych metodach barwienia dla szpiku kostnego myszy.
Rycina 5: Komórki EpCAM+ w szpiku kostnym myszy stanowią 5,17% ± 0,001% populacji. Przeanalizowano komórki szpiku kostnego trzech poszczególnych myszy. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. Procent komórek dodatnich pozostał spójny we wszystkich próbkach ze względu na to, że myszy były genetycznie identyczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki cytometrii przepływowej; wykres słupkowy przedstawiający komórki EpCAM+ w stosunku do całkowitej liczby policzonych komórek krwi mysiej.
Rycina 6: Komórki EpCAM+ we krwi mysiej stanowią 0,45% ± 0,0006% populacji. Analizie poddano komórki krwi dwóch osobniczych myszy. Uwzględniono kontrole, aby wykazać, że zastosowano właściwą procedurę w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykresy cytometrii przepływowej, barwienie PE-EpCAM, porównanie kontroli i różnych liczb komórek, analiza danych.
Rysunek 7: Analiza cytometryczna przepływowa szpiku kostnego człowieka EpCAM+. W górnym panelu przedstawiono kontrole bez barwienia, izotypowe oraz FMO, a w dolnym panelu przyrostowe liczby komórek wynoszące 50 000, 100 000 i 500 000. Wykresy te obrazują spójność procentową niezależnie od liczby komórek, pomimo ogólnego wzrostu całkowitej liczby zliczonych komórek. Panele po prawej stronie wskazują strategię bramkowania, omówioną wcześniej w sekcji analizy cytometrii przepływowej i przedstawioną na Rysunku 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy cytometrii przepływowej; liczba komórek EpCAM+ w ludzkim szpiku kostnym z różnymi barwieniami.
Rycina 8: Komórki EpCAM+ w ludzkim szpiku kostnym stanowią 3,53% ± 0,006% populacji. Przeanalizowano trzy różne próbki ludzkiego szpiku kostnego. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. Procent komórek dodatnich różni się ze względu na heterogeniczność genetyczną ludzi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy liczby komórek EPCAM-dodatnich w ludzkiej krwi przy zastosowaniu różnych barwień, dla trzech próbek.
Rysunek 9: Komórki EpCAM+ w ludzkiej krwi stanowią 0,18% ± 0,0004% populacji. Przeanalizowano trzy różne próbki ludzkiej krwi. W celu zapewnienia rygoru naukowego zastosowano odpowiednie kontrole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna: barwienie DAPI i pan-cytokeratyną, identyfikacja i porównanie komórek.
Rycina 10: Immunofluorescencja preparatów EpCAM+ i EpCAM-. Do rozdzielenia komórek EpCAM+ i EpCAM- wykorzystano metodę FACS. Barwienie pan-cytokeratyny przeprowadzono przy użyciu przeciwciała pan-cytokeratynowego firmy DAKO. Nie stosowano kontroli bez przeciwciała pierwszorzędowego w normalnym serum, ponieważ pan-cytokeratyna jest przeciwciałem poliklonalnym. Wyniki te potwierdzają dokładność metody FACS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ludzki szpik kostny lub krew
PrzeciwciałoProbówka nrLiczba komórekstężenie przeciwciał
Nebarwione11x106X
wyłącznie DAPI21x1061 µL/mL
kontrola izotypowa PE31x1061 µL
Kontrola pojedynczego barwienia CD49f-PE41x10620 µl w 100 µl na 1x106
Niskie miareczkowanie EpCAM-PE51x1063 µL w 100 µL na 1x106
Tytracja medium EpCAM-PE61x1064 µL w 100 µL na 1x106
Wysokie miareczkowanie EpCAM-PE71x1065 µL w 100 µL na 1x106
Sortowanie komórek z wysoką ekspresją EpCAM-PE na szkiełkach810x10650 µL w 1 mL

Tabela 1: Panel barwień do cytometrii przepływowej. Przykład panelu barwień do cytometrii przepływowej dla mononuklearnych komórek krwi lub szpiku kostnego. W ramach kontroli uwzględniono: sam DAPI, kontrolę niebarwioną oraz kontrolę barwienia pojedynczym fluorochromem PE (jako lepszą kontrolę pozytywną zastosowano PE-CD49f). Kontrola FMO (fluorescence minus one) nie została uwzględniona w tym panelu, ponieważ zastosowano tylko jeden kolor (PE). Przy dodawaniu kolejnych kolorów fluorochromów, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) lub alloficocyjanina (APC), należy uwzględnić kontrole FMO, pomijając jeden fluorochrom dla każdej kontroli FMO.

Plik uzupełniający 1: Liczenie żywych komórek przy użyciu hematocytometru. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W literaturze istnieją pewne dowody na obecność komórek nabłonkowych w szpiku kostnym. Wcześniej prace zazwyczaj badały rolę komórek nabłonkowych w kontekście chorób i urazów, takich jak wątroba, płuca, przewód pokarmowy (GI), grasica i skóra 14,15,16,17. Jednak niewiele wiadomo na temat obecności tych komórek nabłonkowych w szpiku kostnym zdrowych osób. Niniejsza praca ma na celu ustalenie powtarzalnej metody w celu identyfikacji i wyizolowania komórek nabłonkowych z prawidłowej krwi i szpiku kostnego. Metoda ta przyczyni się do rozwoju w terenie, aby określić, dlaczego komórki nabłonkowe są obecne i jaka jest ich rola we krwi i szpiku kostnym przy braku choroby; Być może komórki te są częścią normalnej konserwacji tkanek lub są aktywowane w czasie urazu. Szpik kostny jest repozytorium komórek macierzystych; Nie jest jednak jasne, jaka może być linia tych komórek nabłonkowych. W niedawnym artykule omówiono komórki nabłonkowe pochodzące ze szpiku kostnego w grasicy, które najpierw wyrażają EpCAM i marker krwiotwórczy CD45, a następnie tracą ekspresję CD45 z czasem po urazie15. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium potwierdziły również obecność komórek CD45+ EpCAM+ w zdrowej krwi i szpiku kostnym przy braku urazu12. Jednak rola tych komórek nie została jeszcze ustalona.

Istniała potrzeba opracowania powtarzalnej metody badania komórek nabłonkowych w zdrowym szpiku kostnym. Opisana metoda pomoże w dalszym charakteryzowaniu tych komórek w ich normalnym stanie. W tej metodzie istnieją ważne kroki mające na celu utrzymanie odtwarzalności. Jednym z najważniejszych kroków w tym protokole jest utrzymanie sterylnego środowiska w kapturze podczas pobierania szpiku kostnego od myszy. W przypadku zbierania od wielu myszy unika się zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami poprzez użycie nowych igieł i strzykawek dla każdej myszy. Gwarantuje to również, że próbka jest czysta i wolna od wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby mieć wpływ na wyniki. Ponadto należy zwiększyć liczbę przygotowywanych strzykawek i oznakowanych stożkowych probówek dla każdej dodatkowej myszy. Kolejnym ważnym krokiem jest płukanie kości, aż do uzyskania czystego białego koloru, aby upewnić się, że większość komórek szpiku kostnego została usunięta; Szanse na wykrycie rzadkich komórek wzrastają w czystszej próbce. Wprowadzono modyfikację w celu optymalizacji protokołu lizy krwinek czerwonych; Przetestowano kilka do lizy, aby znaleźć właściwy, który zapewniałby niezmiennie wysoką żywotność, ponieważ na tym etapie tracono prawie połowę komórek. Różne odczynniki i okresy inkubacji mogą wymagać optymalizacji w celu uzyskania lepszych wyników w innych ustawieniach.

Najważniejszym ograniczeniem tego protokołu jest wykorzystanie cytometrii przepływowej do znajdowania rzadkich populacji komórek. Jak wspomniano wcześniej, dodanie kontrolek i zliczeń przyrostowych pomaga zwiększyć swoistość i dokładność analizy. Kolejnym ograniczeniem jest to, że odpowiednie markery dla populacji będącej przedmiotem zainteresowania muszą być wcześniej zidentyfikowane. Dlatego należy wiedzieć o kluczowych markerach, przeciwciałach do cytometrii przepływowej i przeciwciałach kompatybilnych z gatunkami docelowymi.

Metody te stanowią ulepszenie w stosunku do istniejących metod, ponieważ pozwalają na analizę pojedynczych komórek za ułamek kosztów istniejącego automatycznego izolatora CTC i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Dodatkowo cytometria przepływowa jest łatwiej dostępna. FACS utrzymał wyższą żywotność komórek w porównaniu z wcześniejszymi raportami wynikami przy użyciu magnetycznej separacji mikrokulek. Wreszcie, techniki te pozwalają na oddzielenie komórek w celu dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie masowego RNA, sekwencjonowanie scRNA lub hodowla komórkowa.

Oświadczenia

Nie są znane żadne konflikty interesów.

Podziękowania

Josh Monts, technik cytometru przepływowego, Instytut Hormela

Todd Schuster, kierownik głównego obiektu, Instytut Hormel

Derek Gordon, statystyk, Uniwersytet Rutgers

Chcielibyśmy podziękować Karen Klein z Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM za jej pomoc redakcyjną.

Ta praca była częściowo wspierana przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem Nagrody R21 AR075281, oraz Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Propozycja #324240). Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Instytutu Hormel.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40 μ m Sitko do komórekFalcon352340Służy do odfiltrowywania dużych kępek komórek ze szpiku kostnego
5 ml polistyrenu Probówka okrągłodennaFalcon352054Probówki używane do cytometrii przepływowej
Słoik 500 ml z pokrywkąNalgene11-823-32Służy do mycia myszy
190 proof EtanolDecon laboratories Inc2801Rozcieńczony do 70% z dH2O
Alexa Fluor 488 Kozia anty-królicza IgG (H + L)InvitrogenA11008Rozcieńczenie: 1:1000
Hemacytometr BrightlineHausser Scientific02-671-10Służy do liczenia żywych komórek
Albumina surowicy bydlęcejJackson ImmunoResearch001-000-162Składnik rozcieńczalnika przeciwciał
Scharakteryzowany płodowy surowica bydlęca (FBS)HyklonSH30071.03Składnik bufora barwiącego i roztworu do zbioru
Curity gąbki z gazyCovidien2187Służy do utrzymywania czystego miejsca pracy podczas zbierania kończyn i szpiku kostnego
Kleszcze zakrzywioneMiltex18-784Używane podczas zbiorów
Cytokeratyna, badanie przesiewowe o szerokim spektrum DakoZ0622Rozcieńczenie 1:750 *Obecnie wycofane
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS 1x)Gibco14190-144 500mLSłuży do zatrzymania reakcji lizy krwinek czerwonych
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigmaAldrich E9884-100GStosowany w 0,5 m 
Siarczan gentamycynyLonza17-518ZSkładnik roztworu do zbioru
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS 1x)Gibco14175-095 500mLSkładnik roztworu do zbioru i roztworu buforowego do barwienia
Końcówka Luer-Lok Strzykawka 10 mlBecton, Dickinson and Co309604Używany z igłą 26G do płukania kości, używany z igłą 20G do rozbijania grudek
Wiadrona lód Magic touch 2BelArtM16807-2001Służy do przechowywania próbek na lodzie
Beztłuszczowe mleko w proszkuApex20-241Składnik rozcieńczalnika przeciwciał
Normalna surowica końskaWektorZE0122Składnik przeciwciała Rozcieńczalnik
PE anty-ludzki CD 326 (EpCAM)Biolegend324206Rozcieńczenie: 5 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106
PE anty-mysie CD 326 (EpCAM)Biolegend118205Rozcieńczenie: 3 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106
mysz PE IgG2b, κ kontrola izotypuBiolegend400313Rozcieńczenie: 1 &mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106
PE szczur anty-ludzki CD49fBD Nauki biologiczne555763Rozcieńczenie: 20 &mikro; l w 100 i mikro; l na 1x106 komórek
PE szczur IgG2am, κ Kontrola izotypuBiolegend400508Rozcieńczenie: 1 i mikro; l w 100 i mikro; l na komórki 1x106
Polipropylenowe stożkowe probówki wirówkowe 50 mlBasix14-955-240Stosowany w wirówce
Povidone-Jodine ScrubAplicare82-227Środek antyseptyczny stosowany do sterylizacji myszy
Igła PrecisionGlide 20G x 1 1/2Igła Becton, Dickinson and Co30517620G służy do rozbijania grudek szpiku kostnego
Igła PrecisionGlide 26G x 1/2Becton, Dickinson and Co305111igła 26G służąca do płukania szpiku kostnego z kości
Szkiełka drukowane PTFEUsługi mikroskopii elektronowej63422-068 dołków szkiełkuje komórki posortowane do immunofluorescencji
Bufor do lizy RBC 10XInvitrogen00-4300-54Rozcieńczenie 1:10 przy użyciu sterylnej wody dejonizowanej
NożyczkiRobozRS-6762Używany podczas zbiorów
Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej #4Bard-Parker371222Używane podczas zbiorów
Sterylna tacaPolar ware10FUżywane podczas zbiorów
StretchEase Bezpudrowe rękawice nitrylowedo badań Denville ScientificG4161Używane podczas zbiorów
Rękojeść skalpela chirurgicznego #4Fischer12-000-164Używana z ostrzem chirurgicznym
TBS 20xSkładnik termicznyTBST, stosowany przy 1X
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061Służy do liczenia martwych komórek. Filtrowane za pomocą .45 i mikro; m
Tween 20Sigma AldrichP1379-500mLSkładnik
pęsetyMiltex6-8Używany podczas zbiorów
Vectashield Vibrance Antifade Podłoże montażowe z DAPIVectorH-1800Barwnik jądrowy do immunofluorescencji
TBST

Bibliografia

  1. Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E. Epithelial cells: liaisons of immunity. Current Opinion in Immunology. 62, 45-53 (2020).
  2. Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281(2014).
  3. Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
  4. Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33(2019).
  5. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid biopsy: General concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  6. Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836(2020).
  7. Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16(2017).
  8. Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404(2021).
  9. Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
  10. Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
  11. Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114(2019).
  12. Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293(2018).
  13. Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
  14. Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
  15. Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746(2022).
  16. Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
  17. Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki nabłonkowe EpCAMekspresja cytokeratynycytometria przepływowamikroskopia immunofluorescencyjnaludzka krewizolacja komórekbarwienie pan-cytokeratynąkomórki mononuklearnowe
Dowody na ekspresję EpCAM i cytokeratyny w komórkach nabłonkowych w normalnej ludzkiej i mysiej krwi i szpiku kostnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.