Artykuł metodologiczny

Model ucha myszy do oceny alergicznego kontaktowego zapalenia skóry

DOI:

10.3791/65120

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou University, 2Department of Traditional Chinese and Western Medicine, Medical College, Yangzhou University, 3The Key Laboratory of Syndrome Differentiation and Treatment of Gastric Cancer of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Yangzhou University, 4Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases, Yangzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metody wywoływania alergicznego kontaktowego zapalenia skóry w uszach myszy za pomocą 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (DNFB) i jak ocenić nasilenie alergicznego kontaktowego zapalenia skóry.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra jest pierwszą linią obrony ludzkiego ciała i jednym z najbardziej narażonych organów na działanie substancji chemicznych w środowisku. Alergiczne kontaktowe zapalenie skóry (ACD) jest powszechną chorobą skóry, która objawia się miejscową wysypką, zaczerwienieniem i zmianami skórnymi. Na występowanie i rozwój ACD mają wpływ zarówno czynniki genetyczne, jak i środowiskowe. Chociaż wielu uczonych skonstruowało w ostatnich latach szereg modeli ACD, eksperymentalne protokoły tych modeli są różne, co utrudnia czytelnikom ich prawidłowe ustalenie. Dlatego stabilny i wydajny model zwierzęcy ma ogromne znaczenie dla dalszych badań nad patogenezą atopowego zapalenia skóry. W tym badaniu szczegółowo opisujemy metodę modelowania z wykorzystaniem 1-fluoro-2,4-dinitrobenzenu (DNFB) do wywoływania objawów podobnych do ACD w uszach myszy i opisujemy kilka metod oceny nasilenia zapalenia skóry podczas modelowania. Ten eksperymentalny protokół został z powodzeniem zastosowany w niektórych eksperymentach i pełni pewną rolę promocyjną w dziedzinie badań nad ACD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alergiczne kontaktowe zapalenie skóry (ACD) jest powszechną chorobą skóry, która charakteryzuje się objawami podobnymi do egzemy w miejscu kontaktu, obrzękiem i rumieniem w umiarkowanych przypadkach oraz grudkami, nadżerką, wysiękiem, a nawet masywnymi bliznami w ciężkich przypadkach1. Dotyka do 20% populacji i może dotyczyć osób w każdym wieku2. ACD często występuje u osób, które były wielokrotnie narażone na alergeny i może być spowodowane reakcją immunologiczną danej osoby na jeden lub więcej alergenów w domu lub miejscu pracy3. Opóźniona nadwrażliwość typu IV jest uważana za główny typ odpowiedzi immunologicznej w ACD4. W obszarach skóry, które były wielokrotnie narażone na alergeny, krążące limfocyty T pamięci gromadzą się w dużych ilościach i indukują reakcje immunologiczne i zapalne3,5,6. Celem niniejszej pracy jest zaproponowanie wiarygodnej techniki laboratoryjnej do dalszych badań odpowiedzi immunologicznych i zapalnych w rozwoju ACD.

Początek ACD jest zwykle spowodowany nadwrażliwością kontaktową spowodowaną powtarzającym się kontaktem z chemikaliami. Wielu badaczy opracowało różne modele zwierzęce ACD u myszy domowych7,8, świnki morskie9,10 i innych zwierząt w ciągu ostatnich kilku dekad, aby symulować początek choroby. Większość metod eksperymentalnych składa się z dwóch etapów: uwrażliwienia (indukcji) brzucha oraz dostarczania bodźców na plecy lub płatek ucha (stymulacja). Powszechnie stosowane substancje chemiczne to głównie 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (DNFB)/1-chloro-2,4-dinitrobenzen (DNCB)8,9,11, oxazolone12, urushiol13, itd. Wśród nich DNFB i DNCB są najczęściej używane, po raz pierwszy zgłoszone w październiku 1958 roku10. Często stosowane są również modele uczulające na nikiel14 oraz fotoalergiczne kontaktowe zapalenie skóry model15.

Przedstawiamy eksperymentalną metodę budowy modelu ACD. Metoda ta jest podsumowywana i optymalizowana na podstawie wcześniejszych badań i po porównaniu z wieloma eksperymentami. W porównaniu z innymi modelami ACD, model ten ma pewne zalety, takie jak małe różnice indywidualne, krótkie okresy eksperymentalne, niewielka ilość stymulacji chemicznej itp. Ponadto badanie to ma zastosowanie do myszy, które są nie tylko ekonomiczne, ale także mają więcej opcji nokautu genów lub przygotowania myszy transgenicznych16. Opisujemy również różne metody stosowane do monitorowania postępów ACD w eksperymencie, takie jak pomiar grubości ucha, użycie niebieskiego barwnika Evansa do pomiaru wysięku zapalnego itp. Model ten może nie tylko analizować uszy myszy, krew, śledzionę i inne próbki za pomocą środków laboratoryjnych w celu zbadania patogenezy ACD, ale ma również zastosowanie w przedklinicznej ocenie nowych metod terapeutycznych, co ma pewne znaczenie promocyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cała opieka i leczenie myszy były zgodne z wytycznymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Yangzhou i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na podstawie licencji projektu SYXK(SU)2022-0044. W tym badaniu wykorzystano samce i samice myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni. Każda grupa składała się z sześciu myszy (patrz Tabela Materiałów). Klatki umieszczono w komorze o kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C, 12 godzin cyklu jasnego/ciemnego) ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Eksperymentalny diagram przepływu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Modelowanie należy rozpocząć po 1 tygodniu od aklimatyzacji do środowiska.
  2. Użyj lampy ultrafioletowej i 75% alkoholu dezynfekującego, aby oczyścić i zdezynfekować otoczenie i blaty przed manipulowaniem myszami.
    UWAGA: Aby uniknąć wpływu czynników zewnętrznych, znakowanie myszy do identyfikacji nie może być wykonywane na uchu myszy; Alternatywą może być barwienie na grzbiecie lub ogonie.
  3. Użyj małego bawełnianego wacika, aby nałożyć wodę z mydłem na brzuch myszy (około 1-2cm2 wielkości). Ogol obszar w kierunku wzrostu włosów za pomocą ostrza lub golarki (patrz Tabela materiałów) na początku modelowania (dzień 0; Rysunek 2A).
    UWAGA: Użycie prostej żyletki do usuwania włosów wymaga wykwalifikowanego operatora. Jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo, może spowodować podrażnienie skóry. Rozważ użycie kremu do depilacji, maszynki do strzyżenia lub maszynki do golenia do depilacji.
  4. Zważ mysz i porównaj zmiany wagi w każdej grupie.

2. Stymulacja uwrażliwiania brzucha

  1. Zapewnić pełną regenerację wszelkich drobnych urazów skóry brzucha spowodowanych goleniem. Zastosuj uczulenie na brzuch 2 dni po goleniu (dzień 2).
  2. Przygotować 0,5% roztwór DNFB: rozcieńczyć DNFB mieszaniną acetonu i oliwy z oliwek w stosunku 4:1 (np. 400 μl acetonu zmieszanego ze 100 μl oliwy z oliwek; patrz Tabela Materiałów). Użyj pistoletu do pipet, aby przedmuchać i wymieszać 20 razy, aby dokładnie wymieszać roztwór DNFB. Przed każdym podaniem roztworu DNFB myszy, należy go przedmuchać i wymieszać trzy do pięciu razy.
    UWAGA: Przygotuj roztwór przed użyciem i zawiń go w folię aluminiową, aby chronić go przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych.
  3. Nałóż 25 μl 0,5% roztworu DNFB na skórę ogolonego obszaru na brzuchu myszy za pomocą pipetora (Rysunek 2B).
  4. Roztworem DNFB rozprowadzić na środku obszaru golenia brzucha i delikatnie rozprowadzić gładką stroną końcówki pipety, aby równomiernie go rozprowadzić.
  5. Po 30 s od stymulacji DNFB umieść myszy w pustych klatkach bez ściółki, aby zapobiec ścieraniu się roztworu DNFB. Gdy roztwór DNFB całkowicie wyschnie (około 2 minut), włóż myszy z powrotem do ich pierwotnej klatki.
  6. Podczas pracy z roztworem DNFB należy nosić rękawice, ponieważ działa on silnie drażniąco na ludzką skórę.

3. Stymulacja uczulania uszu

  1. Przygotować 0,2% roztwór DNFB, jak wyżej, roztwór nośnika (mieszanina acetonu i oliwy z oliwek w stosunku 4:1) i czystą wodę.
  2. Ustaw korpus myszy i spraw, aby zewnętrzna krawędź małżowiny usznej była skierowana w dół podczas całej operacji, aby zapobiec przedostawaniu się roztworu do kanału słuchowego podczas stymulacji DNFB.
  3. W dniach 4, 6, 8 i 10 za pomocą pipety powoli i równomiernie nanieść 20 μl 0,2% roztworu DNFB lub roztworu nośnika na wewnętrzną powierzchnię lewych małżowin usznych myszy. Aby zapobiec przedostawaniu się roztworu DNFB do przewodu słuchowego, należy delikatnie rozprowadzić roztwór DNFB gładką stroną końcówki pipetora podczas podawania. Prawe uszy należy pozostawić nieleczone (Rysunek 2C).
  4. Poczekaj, aż roztwór DNFB wyschnie i umieść myszy z powrotem w klatce (około 30 s).
  5. Podczas pracy z roztworem DNFB należy nosić rękawice.

4. Rejestrowanie wagi myszy i objawów ACD

  1. Waż mysz codziennie, zacznij od 1 dnia i porównaj z odpowiadającą jej wagą w dniu 0; ocenić wpływ ACD na masę ciała myszy jako zmianę masy ciała (g) ± błąd standardowy średniej (SEM).
  2. Rób zdjęcia uszu myszy w wysokiej rozdzielczości, aby rejestrować objawy kliniczne ACD co 2 dni, począwszy od 1 dnia.

5. Pomiar grubości małżowiny usznej

  1. Mierz grubość małżowiny usznej co 2 dni, począwszy od 1 dnia. Szczegółowo zmierz i zapisz oba uszy.
  2. Użyj suwmiarki z noniuszem (patrz tabela materiałów), aby zmierzyć grubość małżowiny usznej o tej samej porze każdego dnia, aby uzyskać dokładne wyniki (Rysunek 3A). Zatrzymaj suwmiarki z noniuszem przed dalszym zaciskaniem do wewnątrz, gdy występuje niewielka blokada, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek ucha myszy. Utrzymuj stałą pozycję i zapisuj dane.
  3. Zbierz grubość z trzech różnych miejsc na każdej małżowinie usznej (Rysunek 3B). Zapisz średnią z trzech danych jako prawidłową wartość. Oceń obrzęk ucha w mikrometrach (μm) ± błąd standardowy średniej (SEM).

6. Ocena stopnia obrzęku zapalnego

  1. Przygotować 0,5% roztwór niebieskiego barwnika Evansa (patrz tabela materiałów): rozcieńczyć niebieski barwnik Evansa roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w dniu 11. Przez cały czas noś fartuch laboratoryjny i rękawice, ponieważ niebieski barwnik Evans jest lekko toksyczny dla ludzi.
  2. Unieruchomić myszy za pomocą stabilizatora: otwórz pokrywę stabilizatora (patrz Tabela materiałów), przytrzymaj ogon myszy, spraw, aby głowa myszy była skierowana w stronę stabilizatora i spraw, aby mysz instynktownie weszła do stabilizatora. Przykryj pokrywę, spraw, aby ogon myszy wysunął się z otworu w pokrywie i wyreguluj długość utrwalacza, aby odsłonić cały ogon myszy.
  3. Kilkakrotnie przetrzyj ogon wacikiem nasączonym alkoholem lub namocz go w ciepłej wodzie na 30 sekund i delikatnie uszczypnij korzeń ogona, aby wypełnić i rozszerzyć żyły po obu stronach. Wykonać iniekcję pod wpływem napromieniowania zimnego źródła światła.
  4. Powoli wstrzyknąć roztwór niebieskiego barwnika Evansa do żyły ogonowej myszy za pomocą igły insulinowej o średnicy 1 mm. Odczekaj 15 minut, a następnie zrób zdjęcia uszu myszy.
    UWAGA: Połóż mysz na stole i delikatnie ją przytrzymaj, aby odsłonić obszar ucha w celu uzyskania obrazu. Wkrótce po wstrzyknięciu roztworu niebieskiego barwnika Evansa i przestrzeganiu odpowiednich wskazań, należy zastosować zwichnięcie szyjki macicy w celu eutanazji myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pod powtarzającą się stymulacją DNFB, uszy myszy z grupy DNFB wykazywały wyraźne objawy kliniczne porównywalne do ACD, z wrażliwymi obszarami wykazującymi typowe objawy zaczerwienienia, suchości, a nawet erozji i wysięku. Jednak podawanie do ucha czystej wody (grupa kontrolna) lub kontroli rozpuszczalnika (grupa nośnika) nie powodowało podobnych objawów (Ryc. 4).

Tymczasem, w grupie DNFB, w porównaniu do nieleczonego prawego ucha, grubość lewego ucha znacznie wzrosł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół wywoływania objawów podobnych do ACD w uszach myszy może być wykorzystany do badania patofizjologii ACD oraz jako narzędzie przesiewowe do opracowywania nowych leków.

Istnieją dwa kluczowe kroki do ustanowienia modelu ACD: wstępne uczulenie i późniejsza stymulacja. Brzuch jest zwykle miejscem początkowego uczulenia, ale kolejne miejsce stymulacji zostało wybrane nieco inaczej. Wcześniejsze badania wykazały, że większość naukowców decyduje się na użycie chemicznych środkó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC) dla N.-N. Y. (81904212); Projekt Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Jiangsu (YB201995); oraz specjalny projekt finansowania dla naukowców ze stopniem doktora w Chinach (2020T130562).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (DNFB)Merck200-734-31-fluoro-2,4-dinitrobenzen, ≥ 99%
AcetonSinopharm Chemical Reagent Co. LTD10000418≥ 99,5%
Folia aluminiowa CleanwrapCF-2
Evans niebieski barwnikSolarbio314-13-6Zawartość barwnika ok. 80%
Utrwalacz myszyZHUYANBANGGEGD-SM1830
Oliwa z oliwekSolarbio8001-25-0500 ml
Końcówka do pipetyBiofountFT-20010 - 200 μ l
PipetorEppendorf AG312300025020 - 200 μ l
ŻyletkaShanghai Gillette Co. LTD74-S Suwmiarki
z noniuszemDelixi ElectricDECHOTVCS1200

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
  2. Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
  3. Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
  4. Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J. Allergic contact dermatitis. International Immunopharmacology. 2 (2-3), 201-211 (2002).
  5. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  6. Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
  7. Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
  8. Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
  9. Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
  10. Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
  11. Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
  12. Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
  13. Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
  14. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
  15. Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
  16. Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397(2022).
  17. Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
  18. Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
  19. Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237(2021).
  20. Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukcja DNFBmodel zwierz cypomiar obrz ku uchabarwnik b kit ewansagrubo ma owiny usznejobrz k zapalnyindeks ledzionyocena przedkliniczna

Powiązane artykuły