Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65121

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół do bezpośredniej wizualizacji aktywności metabolicznej w komórkach regulowanych przez aminokwasy za pomocą mikroskopii stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (ciężka wodaD2O), która jest zintegrowana z mikroskopią fluorescencyjną wzbudzenia dwufotonowego (2PEF).

Streszczenie

Niezbędne aminokwasy aromatyczne (AAA) są budulcem do syntezy nowych biomas w komórkach i utrzymania normalnych funkcji biologicznych. Na przykład obfita podaż AAA jest ważna dla komórek rakowych, aby utrzymać ich szybki wzrost i podział. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na wysoce specyficzne, nieinwazyjne podejście do obrazowania z minimalnym przygotowaniem próbki w celu bezpośredniej wizualizacji, w jaki sposób komórki wykorzystują AAA do metabolizmu in situ. Tutaj opracowujemy platformę obrazowania optycznego, która łączy sondowanie tlenkiem deuteru (D2O) ze stymulowanym rozpraszaniem Ramana (DO-SRS) i integruje DO-SRS z fluorescencją wzbudzenia dwufotonowego (2PEF) w jednym mikroskopie, aby bezpośrednio wizualizować aktywność metaboliczną komórek HeLa pod regulacją AAA. Reasumując, platforma DO-SRS zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i specyficzność nowo zsyntetyzowanych białek i lipidów w pojedynczych jednostkach komórkowych HeLa. Ponadto modalność 2PEF może wykrywać sygnały autofluorescencyjne dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) i flawiny w sposób bezznacznikowy. Opisany tutaj system obrazowania jest kompatybilny zarówno z modelami in vitro, jak i in vivo, co jest elastyczne dla różnych eksperymentów. Ogólny przebieg pracy tego protokołu obejmuje hodowlę komórkową, przygotowanie pożywek hodowlanych, synchronizację komórek, utrwalanie komórek i obrazowanie próbek za pomocą modalności DO-SRS i 2PEF.

Wprowadzenie

Będąc niezbędnymi aminokwasami aromatycznymi (AAA), fenyloalanina (Phe) i tryptofan (Tryp) mogą być wchłaniane przez organizm ludzki w celu syntezy nowych cząsteczek dla utrzymania normalnych funkcji biologicznych1. Phe jest potrzebne do syntezy białek, melaniny i tyrozyny, podczas gdy Tryp jest wymagany do syntezy melatoniny, serotoniny i niacyny2,3. Jednak nadmierne spożycie tych AAA może zwiększać docelowy szlak rapamycyny (mTOR) u ssaków, hamować kinazę białkową aktywowaną przez AMP i zakłócać metabolizm mitochondriów, wspólnie zmieniając biosyntezę makrocząsteczek i prowadząc do produkcji złośliwych prekursorów, takich jak reaktywne formy tlenu (ROS) w zdrowych komórkach4,5,6. Bezpośrednia wizualizacja zmienionej dynamiki metabolicznej pod wpływem nadmiernej regulacji AAA jest niezbędna do zrozumienia roli AAA w promowaniu rozwoju raka i wzrostu zdrowych komórek7,8,9.

Tradycyjne badania AAA opierają się na chromatografii gazowej (GC)10. Inne metody, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), mają ograniczoną rozdzielczość przestrzenną, co utrudnia przeprowadzanie analizy komórkowej i subkomórkowej próbek biologicznych11. Ostatnio opracowano desorpcję/jonizację laserową wspomaganą matrycą (MALDI) w celu wyjaśnienia roli AAA w syntezach lipidów i białek w proliferacji nowotworów za pomocą nieinwazyjnych biomarkerów12,13,14. Jednak technika ta nadal cierpi z powodu płytkiej głębokości obrazowania, słabej rozdzielczości przestrzennej i obszernego przygotowania próbki. Na poziomie komórkowym nietoksyczne stabilne izotopy, takie jak azot-15 i węgiel-13, można śledzić za pomocą obrazowania wieloizotopowego i spektrometrii mas jonów wtórnych w nanoskali, aby zrozumieć ich włączenie do makrocząsteczek. Jednak te metody są destrukcyjne dla żywych próbek biologicznych15,16. Mikroskopia sił atomowych (AFM) to kolejna potężna technika, która może wizualizować dynamikę metaboliczną17. Z drugiej strony powolne tempo skanowania podczas obrazowania AFM może powodować zniekształcenia obrazu wynikającego z dryfu termicznego.

Opracowaliśmy nieinwazyjną metodę obrazowania biortologicznego, łącząc mikroskopię stymulowanego rozpraszania Ramana (DO-SRS) z tlenkiem deuteru (D2O) i bezznacznikową mikroskopią fluorescencyjną z dwufotonowym wzbudzeniem (2PEF). Ta modalność osiąga wysoką rozdzielczość przestrzenną i specyficzność chemiczną podczas obrazowania próbek biologicznych18,19,20,21,22,23,24. Protokół ten wprowadza zastosowania DO-SRS i 2PEF do badania dynamiki metabolicznej zmian proporcji lipidów, białek i redoks podczas progresji raka. Ponieważ D2O jest stabilną izotopową formą wody, biomolekuły komórkowe mogą być znakowane deuterem (D) ze względu na jego szybką kompensację z całkowitą ilością wody w organizmie w komórkach, tworząc wiązania węgiel-deuter (C-D) poprzez wymianę enzymatyczną21. Wiązania C-D w nowo zsyntetyzowanych makrocząsteczkach, w tym lipidach, białkach, DNA/RNA i węglowodanach, można wykryć w cichym obszarze komórki widma Ramana20,21,22,25,26,27. Dzięki dwóm zsynchronizowanym impulsom laserowym wiązania C-D nowo zsyntetyzowanych lipidów i białek mogą być wyświetlane na pojedynczych komórkach za pomocą obrazowania hiperspektralnego (HSI) bez ekstrakcji lub znakowania ich środkami cytotoksycznymi. Ponadto mikroskopia SRS ma możliwość konstruowania trójwymiarowych (3D) modeli wybranych obszarów zainteresowania w próbkach biologicznych poprzez przechwytywanie i łączenie zestawu obrazów przekrojowych22,26. Dzięki obrazowaniu hiperspektralnemu i wolumetrycznemu 3D, DO-SRS może uzyskać rozkłady przestrzenne nowo zsyntetyzowanych makrocząsteczek w pojedynczych komórkach, wraz z typem organelli, które ułatwiają proces promowania wzrostu raka zgodnie z regulacją AAA22. Ponadto, korzystając z 2PEF, możemy uzyskać sygnały autofluorescencji dinukleotydu flawiny i nikotynamidoadeniny (NADH) o wysokiej rozdzielczości, głębokiej głębokości penetracji i niskim poziomie uszkodzeń w próbkach biologicznych21,23,24. Sygnały autofluorescencji flawiny i NADH wykorzystano do scharakteryzowania homeostazy redoks i peroksydacji lipidów w komórkach nowotworowych22,26. W związku z tym sprzężenie DO-SRS i 2PEF nie tylko zapewnia subkomórkową analizę regulowanej przez AAA dynamiki metabolicznej w komórkach nowotworowych o wysokim rozkładzie przestrzennym, informacji o swoistości chemicznej i minimalnym przygotowaniu próbki, ale metoda ta zmniejsza również potrzebę ekstrakcji lub znakowania endogenicznych cząsteczek toksycznymi odczynnikami. W tym protokole najpierw przedstawiamy procedury przygotowaniaD2Oi aminokwasów, a także hodowlę komórek nowotworowych. Następnie pokazujemy protokoły obrazowania DO-SRS i obrazowania 2PEF. Na koniec przedstawiamy reprezentatywne wyniki obrazowania SRS i 2PEF, które wykazują regulowane przez AAA zmiany metaboliczne lipidów i białek oraz zmiany stosunku redoks w komórkach nowotworowych. Szczegółowa ilustracja tego procesu jest przedstawiona w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotować 10 ml roztworów kontrolnych i nadmiaru AAA w zmodyfikowanym podłożu Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającym 50% D2O.
    1. W przypadku pożywki kontrolnej odmierzyć i wymieszać 10 mg proszku DMEM z 4,7 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Proszek DMEM zawiera wszystkie aminokwasy w standardowych stężeniach. Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany. Dodać 4,7 mlD2O, 0,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (5% FBS) i 0,1 ml penicyliny/streptomycyny (1%). Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.
    2. W przypadku pożywki zabiegowej 15x Phe odmierz i wymieszaj 10 mg proszku DMEM z 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) i 0,1 ml penicyliny/streptomycyny (1%) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany. Dodać nadmiar proszku Phe o stężeniu 924 mg/l do podłoża. Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.
    3. W przypadku pożywki leczniczej 15x Tryp odmierz i wymieszaj 10 mg proszku DMEM z 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) i 0,1 ml penicyliny/streptomycyny (1%) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany. Do podłoża dodać nadmiar proszku Tryp o stężeniu 224 mg/l. Dokładnie zwiruj i odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany.
    4. Dodać metioninę i treoninę w stężeniach odpowiednio 30,0 mg/ml i 95,0 mg/ml do wszystkich stożkowych probówek z poprzednich etapów. Dokładnie zwiruj i odwróć rurkę. Nie jest wymagane dodawanie pirogronianu sodu do pożywek hodowlanych.
    5. Przefiltrować media kontrolne i zabiegowe za pomocą filtra strzykawkowego 25 mm z filtrami membranowymi z polieterosulfonu 0,22 μm.
    6. Uszczelnić wszystkie stożkowe probówki zawierające media parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni. Przed potraktowaniem komórek pożywką podgrzej wszystkie podłoża do 37°C.
      UWAGA: Odczynniki w proszku i w płynie należy odmierzać i łączyć w oparciu o całkowitą objętość pożywki zabiegowej i kontrolnej.

2. Przygotowanie próbki komórki

  1. Utrzymuj komórki raka szyjki macicy (HeLa) w kolbie hodowlanej (tj. T10, T25 itp.) przy użyciu standardowego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2 ).
  2. Subkulturuj komórki HeLa w stosunku podziału 1:10, aż do osiągnięcia 80% lub wyższej żywotności komórek.
  3. Gdy komórki osiągną zbieżność 80% lub wyższą, przystąp do wysiewu 2 x 105 komórek na studzienkę na 24-dołkową płytkę za pomocą DMEM uzupełnionego 0,5% FBS i 1% penicyliny / streptomycyny.
    1. Przed wysiewem komórek należy przygotować 24-dołkową płytkę ze sterylizowanymi, okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm pokrytymi poli-d-lizyną, pokrytymi lamininą. Zanurz szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu i delikatnie wysusz za pomocą niestrzępiących się chusteczek. Umieść czyste szkiełka nakrywkowe w odpowiednich dołkach płytki.
    2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji w kroku 2.2, przemyj je raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) bez jonów magnezu i wapnia.
    3. Dodać 0,25% trypsyny, aby oddzielić przylegające komórki od kolby i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty.
    4. Dodać DMEM uzupełniony 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, delikatnie pipetować w górę i w dół i zebrać komórki przez odwirowanie przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 min.
    5. Ponownie zawiesić komórki w DMEM uzupełnionym 0,5% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną.
    6. Policz komórki za pomocą hemocytometru, mikroskopu świetlnego i błękitu trypanowego i zasiaj gęstość 2 x 105 komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Alternatywnie do zliczania komórek można użyć automatycznego licznika komórek.
    7. Włóż komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  4. Po 8 godzinach należy wymienić starą pożywkę hodowlaną na 50% D2O/nadmiar Phe lub 50% D2O/nadmiar pożywki Tryp. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 36 godzin.
  5. Po 36 godzinach utrwal komórki na szkiełkach mikroskopowych.
    1. Przed utrwaleniem należy przygotować szkiełka mikroskopowe z przekładkami obrazowymi o średnicy 9 mm i umieścić 15 μl 1x PBS uzupełnionego jonami wapnia i magnezu.
    2. Przepłucz komórki 1x PBS uzupełnionym jonami wapnia i magnezu.
    3. Dodać 0,5 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) bez metanolu i pozostawić płytkę pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego na około 15 minut.
    4. Odessać roztwór PFA i spłukać 1x PBS uzupełnionym dwukrotnie jonami wapnia i magnezu.
    5. Dodaj 1,5 ml 1x PBS uzupełnionego jonami wapnia i magnezu do każdej studzienki.
    6. Użyj sterylnej pęsety, aby delikatnie chwycić szkiełka nakrywkowe z każdego dołka. Odwrócić i umieścić stronę szkiełka nakrywkowego zawierającą komórki na przekładkach obrazowania, tak aby zetknęły się z PBS przygotowanym w kroku 2.5.1. Upewnij się, że strona niezawierająca komórek jest wystawiona na działanie powietrza.
    7. Za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci uszczelnij zewnętrzną warstwę szkiełka nakrywkowego za pomocą przekładki obrazowej.
  6. Przechowywać szkiełka mikroskopowe w temperaturze 4 °C, gdy nie wykonujesz obrazowania.

3. Pomiar spontanicznej spektroskopii Ramana (Rysunek 2)

  1. Użyj konfokalnego mikroskopu Ramana, aby uzyskać spontaniczne widma Ramana (Rysunek 2A).
  2. Włącz laser, przekręcając kluczyk do pozycji ON.
  3. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania LabSpec6, aby otworzyć oprogramowanie do akwizycji.
  4. Załaduj próbkę biologiczną do uchwytu próbki bezpośrednio pod soczewką obiektywu.
  5. W oprogramowaniu kliknij ikonę Aparat, aby włączyć kamerę wideo.
  6. Dostosuj płaszczyznę ostrości, aby zidentyfikować obszar zainteresowania za pomocą soczewki obiektywu 50x. Przesuń joystick, aby sterować przesunięciem strugarki stolika XY i obróć joystick, aby zmienić głębokość ostrości.
  7. Po wybraniu pozycji do pomiaru przełącz się na soczewkę obiektywu 100x o mocy wzbudzenia 40 mW. Kliknij czerwoną ikonę Stop, aby wyłączyć kamerę wideo.
  8. Wybierz siatkę o długości 1800 linii/mm i ustaw zakres akwizycji od 400 cm-1 do 3 150 cm-1.
  9. Ustaw czas akwizycji na 90 s, akumulację na 3, a katymizację na 4, aby uzyskać najmniejszy szum i najdokładniejsze spektrum.
    UWAGA: Te parametry obrazowania można zoptymalizować w celu dopasowania do eksperymentu.
  10. Kliknij ikonę strzałki, aby włączyć wyświetlanie w czasie rzeczywistym.
  11. Dostrój przesunięcie Ramana (cm-1) do wybranej wartości, aby precyzyjnie dostroić płaszczyznę ostrości.
    UWAGA: W tym eksperymencie laser Ramana został skupiony na kropelkach lipidów, które zawierały wysokie stężenie wiązańCH2. W związku z tym do tego celu wybrano przesunięcie Ramana o 2850 cm-1, które odpowiadało trybom rozciągania wiązaniaCH2
    12. .
  12. Dostosuj płaszczyznę ostrości za pomocą joysticka, aby zoptymalizować najlepszy stosunek sygnału do szumu.
  13. Po wybraniu płaszczyzny ostrości kliknij czerwoną ikonę Zatrzymaj, aby wyświetlić obraz w czasie rzeczywistym.
  14. Wybierz ikonę Okrąg, aby rozpocząć akwizycję widma.
  15. Po wykonaniu obszaru komórkowego użyj tej samej płaszczyzny ostrości, aby zmierzyć tło za pomocą PBS. Odejmij widmo tła od każdego subkomórkowego widma docelowego za pomocą oddzielnej aplikacji komputerowej, takiej jak Origin (Rysunek 1B).

4. Eksperymenty obrazowania z użyciem 2PEF i SRS

UWAGA: Szczegółowe opisy osiowania lasera SRS można znaleźć w poprzednim raporcie28. Protokół ten koncentruje się na działaniu multimodalnego systemu obrazowania SRS i 2PEF (Rysunek 2C, D).

  1. Kliknij Start, aby rozgrzać laser.
  2. Postępuj zgodnie z kolejnością, aby włączyć wyłączniki główne jednostki sterującej i monitora: 1) nacisnąć wyłącznik główny skrzynki sterowniczej IX3-CBH na On, 2) nacisnąć wyłącznik główny sterownika panelu dotykowego na On, 3) nacisnąć wyłącznik główny zasilacza sieciowego zasilacza do LD OBIS 6 Laser Remote podłączonego do głównego łącznika laserowego FV31-SCOMB na Oni 4) nacisnąć główny wyłącznik zasilacza sieciowego zasilacza do LD OBIS 6 Laser Remote podłączonego do sumatora lasera pomocniczego FV31-SCOMB w pozycji On.
  3. Naciśnij główne wyłączniki detektora fotodiody Si i wzmacniacza blokującego On.
  4. Ustaw wiązkę Stokesa na 1,031 nm, szerokość impulsu na 6 ps, a częstotliwość powtarzania na 80 MHz.
  5. Sprzężony z mikroskopem ustaw system picoEmerald dostarczony ze zsynchronizowaną wiązką pompy o przestrajalnej długości fali od 720-990 nm, szerokości impulsu 5-6 ps i częstotliwości powtarzania 80 MHz. Średnia moc wzbudzenia zarówno pompy, jak i Stokesa wynosi 450 mW. Zoptymalizuj moc wzbudzenia, aby zminimalizować fotouszkodzenia próbki.
  6. Użyj skraplacza oleju o dużej aperturze numerycznej (NA) (tj. 1.4 NA), aby zebrać belki Stokesa i pompy, w których zamontowana jest próbka, emitując kilka kropel na skraplacz.
  7. Zamontuj próbkę na oleju i umieść dużą kroplę wody na szkiełku mikroskopowym, w miejscu, w którym próbka jest zamocowana. Dotyczy to soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie.
  8. Ustaw wzmacniacz lock-in na 20 MHz. Przetwarzaj obraz teraz za pomocą modułu oprogramowania o wysokiej rozdzielczości.
  9. Wybierz 512 pikseli x 512 pikseli i 80 μs/piksel jako czas zatrzymania.
  10. Gdy żądany obszar komórkowy zostanie prawidłowo skoncentrowany, uzyskaj obraz. Korzystając z oprogramowania do akwizycji mikroskopu, zapisz obrazy jako plik graficzny Olympus .oir.
  11. Uzyskaj obraz tła na wysokości 1,900 cm-1 i odejmij go od wszystkich obrazów komórkowych.
  12. Aby wykonać obrazowanie 2PEF, użyj tego samego przestrajalnego lasera pikosekundowego i ustaw autofluorescencję flawiny i NADH bez znaczników odpowiednio na 800 nm i 780 nm.
  13. Użyj kostki filtrującej 460 nm/515 nm, aby zebrać emisję wstecznie rozproszoną flawiny i NADH.
  14. Dostosuj czas zatrzymania na 8 μs/piksel, a rozmiar piksela na 512 x 512 pikseli. Ustaw parametr mocy migawki laserowej na 150 mW.
  15. Aby zrekonstruować obraz 3D, dostosuj stymulowaną utratę Ramana do 2 850 cm-1 (797 nm).
  16. Po zidentyfikowaniu żądanych pojedynczych komórek zarejestruj laser do skanowania od górnej płaszczyzny ostrości w celu wykrycia górnej i dolnej warstwy tych komórek.
    UWAGA: Modele 3D są generowane i zapisywane jako pliki .oir.

5. Analiza widm i obrazów

  1. Analiza widm
    1. Użyj oprogramowania Origin lub innych odpowiednich aplikacji, aby odjąć widmo tła od wszystkich subkomórkowych widm docelowych.
    2. Użyj operacji modelowania matematycznego MATLAB, aby przetworzyć widma Ramana za pomocą wbudowanych funkcji oprogramowania. Python może być również używany do przetwarzania widm.
      1. Wstępne przetwarzanie spektralne rozpoczyna się od konwersji plików na tablicę. Widma są interpolowane co drugi centymetr.
      2. W celu sprawdzenia poprawności narysuj wykres nieprzetworzonych danych. Wykonaj korekcję linii bazowej na surowych widmach za pomocą wbudowanej funkcji msbackadj w MATLAB. Krótko mówiąc, wbudowana funkcja szacuje punkty linii bazowej przy wartościach jednostek separacji zidentyfikowanych przez użytkowników i zwraca odległość między sąsiednimi oknami. Na podstawie punktów linii bazowej oszacuj i narysuj linię regresji. Zastosuj wygładzanie, aby wygładzić linię regresji w celu odjęcia linii bazowej od każdego pojedynczego surowego widma.
      3. Wykonaj normalizację min-max, dzieląc intensywność Ramana białka na poziomie 2,930 cm-1 przez intensywność każdego przesunięcia Ramana. Sygnał o zasięgu 2930 cm-1 jest zazwyczaj o najwyższym natężeniu w widmie Ramana. Dzięki tej normalizacji wartość maksymalna jest przekształcana na 1, podczas gdy wartość minimalna jest przekształcana na 0. Każda inna wartość jest przekształcana na ułamek dziesiętny z zakresu od 0 do 1.
      4. Uśrednij poszczególne widma tego samego stanu w jedno widmo, aby zredukować szum.
    3. Po przetworzeniu użyj aplikacji, takich jak Origin, aby wyświetlić wszystkie widma jednocześnie. Piki wyświetlane w widmach reprezentują określone wiązanie chemiczne lub grupę funkcyjną.
  2. Analiza obrazu 3D kropelek lipidów
    1. Użyj oprogramowania FIJI-ImageJ, aby przetworzyć wszystkie obrazy 3D
    2. Wykonaj funkcje Filtry pasmowo-przepustowe i Wygładzanie dla stosów obrazów 3D.
    3. W przypadku analizy obrazu 3D przypisz każdą kroplę lipidu do punktacji sferycznej obliczonej poprzez pomiar odległości między jej środkiem masy a powierzchnią. Porównaj każdy wynik sferyczny z wynikiem sferycznym idealnej kuli na tym samym planie euklidesowym. Wyrzuć kropelki lipidów z niskimi wynikami sferycznymi i oceń pozostałe kropelki lipidów pod kątem ich objętości i liczby.
    4. Analizuj objętość i liczbę kropelek lipidów między różnymi zabiegami w celu uzyskania istotności statystycznej w odpowiedniej aplikacji statystycznej. W tym przypadku zastosowano GraphPad Prism.
  3. Analiza obrazu hiperspektralnego 2D
    1. Użyj oprogramowania FIJI-ImageJ, aby przetworzyć wszystkie obrazy hiperspektralne 2D.
    2. Wybierz kanał 2,930 cm-1, aby utworzyć obraz maski zawierający wartości 0 i 1. Przypisz tło do wartości 0, a region sieci komórkowej do wartości 1.
    3. Odejmij kanał białkowy znakowany deuterem (2,175 cm-1) do kanału tła (1,900 cm-1), aby usunąć efekty fluorescencyjne.
    4. Podziel powstały kanał białkowy znakowany deuterem przez kanał białkowy (2,930 cm-1), aby uzyskać obrazy proporcjonalne do szybkości obrotu białka.
    5. Następnie pomnóż obraz maski utworzony w kroku 5.3.2 przez obrazy ratiometryczne, aby usunąć wszelkie pozostałe szumy tła. W rezultacie na każdym obrazie ratiometrycznym generowane jest ciemne tło.
    6. Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne w FIJI-ImageJ, aby ręcznie segmentować i obliczać intensywność pikseli wyświetlanych na pojedynczych komórkach. Intensywności pikseli odpowiadają stężeniom wiązania chemicznego, które jest wizualizowane.
    7. Analizuj intensywności pikseli pod kątem istotności statystycznej w odpowiedniej aplikacji statystycznej. W tym przypadku zastosowano GraphPad Prism. Powtórz tę analizę z pozostałą analizą ratiometryczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dodanie nadmiaru AAA w stężeniu 15x do pożywki hodowlanej komórek zawierającej 50% D2O spowodowało powstanie wyraźnych pasm Ramanowskich C-D nowo syntetyzowanych lipidów i białek w komórkach HeLa (Rysunek 2B). Wcześniejsze eksperymenty przeprowadzono przy różnych poziomach stężeń, takich jak 2x i 5x, i choć dane te nie zostały przedstawione, stężenie 15x spowodowało powstanie najbardziej wyraźnych pasm Ramanowskich C-D nowo syntetyzowanych lipidów i białek. W szczególności, podcza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie DO-SRS i 2PEF zastosowano do badania dynamiki metabolicznej w różnych modelach ex vivo, w tym w Drosophila i tkankach ludzkich 21,22,23,24,26,27,33. Metoda obrazowania zastosowana w tym badaniu integruje mikroskopię DO-SRS i 2PEF, która może wyprzedzić inne metody obrazo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Yajuanowi Li i Anthony'emu Fungowi za ich wsparcie techniczne, a laboratorium Fraley za linię komórkową. Uznajemy fundusze na rozpoczęcie działalności od UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 i Hellman Fellow Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 ml pipet serologicznych Avantor (by VWR)75816-100https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 ml stożkowa probówka wirówkowaVWR89039-664https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% formaldehydu, bez metanoluThermoFisher Scientific28906https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
płytka24-dołkowaFisherbrandFB0112929https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
Filtr strzykawkowy 25 mm, 2 μ m PESFoxx Life Sciences381-2216-OEMhttps://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Kostka filtrującaOlympusOCT-ET460/50M32
Zasilacze sieciowe do LD OBIS 6 Laser RemoteOlympusZasilanie lasera
Filtr pasmowo-przepustowyKR ElectronicsKR27248 MHz
Terminator BNC 50 Ohm Mini obwodyBNC STRM-50
Thorlabs2249-Ckoncentryczny, BNC Męski / męski
Szerokopasmowe lustro dielektryczneThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
Wirówka
KondensatorOlympus
Cover GlassCorning 2850-25https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
Zasilacz prądu stałegoTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
Odczynnik do hodowli komórkowych sulfotlenku dimetylumpbio 196055https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
zmodyfikowanego orła Dulbecco" s Pożywka bez metioniny, treoniny i pirogronianu soduMiliporeSigma38210000https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
Z wodorowęglanem sodu i bez metioniny, treoniny i pirogronianu sodu 
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumCorningMT10027CVhttps://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJIImageJWersja 1.53t 24 sierpnia 2022 https://imagej.net/software/fiji/downloads
Ciężka woda (tlenek deuteru)Cambridge Isotope Laboratories, Inc.7732-18-5https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela CellsATCCCCL-2https://www.atcc.org/products/ccl-2
HemocymetrMilliporeSigmaZ359629-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB& gclsrc=aw.ds
Filtr pasmowo-przepustowy o wysokiej średnicy zewnętrznejTechnologia ChromaET890/220mFiltruj wiązkę Stokesa i przesyłaj wiązkę pompy
Hyklon Płodowa surowica bydlęca (FBS)Cytiva SH300880340https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0,25% (1x) RoztwórCytivaSH30042.02https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Zintegrowany system laserowy SRSFizyka stosowana i Elektronika, Inc.picoEMERALDpicoEMERALD zapewnia impuls wyjściowy o długości fali 1031 nm z szerokością impulsu 6 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz, który służy jako wiązka Stokesa. Wiązka o podwójnej częstotliwości przy 532 nm jest używana do synchronicznego inicjowania pikosekundowego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) w celu wytworzenia ciągu impulsów z blokadą modów o szerokości impulsu pięć ~ 6 ps (wiązka luźna OPO jest zablokowana filtrem interferometrycznym). Długość fali wyjściowej OPO jest przestrajana od 720– 950 nm, który służy jako belka pompy. Intensywność wiązki Stokesa 1031 nm jest modulowana sinusoidalnie przez wbudowany EOM na częstotliwości 8 MHz o głębokości modulacji ponad 90%. Belka pompy nakłada się przestrzennie na belkę Stokesa za pomocą dichroicznego lustra wewnątrz pikoEMERALD. Czasowe nakładanie się impulsów pompy i Stokesa jest osiągane dzięki wbudowanemu stopniowi opóźniającemu i optymalizowane przez sygnał SRS czystego D2O pod mikroskopem.
Odwrócony laserowy mikroskop skaningowyOlympusFV1200MPE
IX3-CBH Skrzynka kontrolnaOlympusControl laserowy mikroskop skaningowy
Kinematyczny montaż lustrzanyThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Niskoprofilowe regulatory sześciokątne
L-fenalininaSigmaP5482-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-TryptofanSigmaT8941-25Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6Horiba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In AmplifierZurich InstrumentsN/Ahttps://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Długoprzepustowy dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockDi02-R980-25x36Laser 980 nm BrightLine jednokrawędziowy laserowo-płaski dichroiczny rozdzielacz wiązki
MATLABMathWorksWersja: R2022b https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-003
https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoOlympusFluoView
MPLN 100x, OlympusOlympus MPLAPONhttps://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, OlympusOlympusMPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
Ameryka Północna Skraplacz olejuOlympus 6-U130https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Lakier do paznokciWet n WildB01EO2G5O4https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
OriginOriginLab Origin 2022b (9.95)https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
ParafilmFisher ScientificS37440https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)Thermofischer - Gibco14040117https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Termofischer z penicyliną/streptomycyną- Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Zespół peryskopuThorlabsRS99Zawiera górną i dolną jednostkę, oraz Oslash; Słupek 1" i widelec mocujący.
picoEmerald SystemA.P.E. N/A
Ekranowane pudełko ze złączami BNCPomona Electronics2902Aluminiowe pudełko z pokrywą, BNC żeński/żeński
detektor fotodiody SiZbudowany w domuN/ADYI Silikonowe
waflowe
Grace Bio-Labs654008https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaniczna spektroskopia RamanaHoriba XploRAN/Ahttps://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stymulowana mikroskopia rozpraszania RamanaZbudowany w domuNie dotyczy
Dotyk  Sterownik paneluOlympusKontroluj kierunek X-Y laserowego mikroskopu skaningowego
Błękit trypanowy 0,4% (0,85% NaCl) Lonza17-942Ehttps://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
PęsetaKaverme - AmazonB07RNVXXV1https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Mikroskopia fluorescencyjna z wzbudzeniem dwóch fotonówZbudowany w domuN/A
 VWR12578-165https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich Oprogramowanie LabOneQZurich InstrumentsSterowanie wzmacniaczem Zurich lock-in
https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ seria przekładki papier wagowy

Bibliografia

  1. Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
  2. Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
  3. Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29(2018).
  4. Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
  5. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  6. Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
  7. Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
  8. Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
  9. Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
  10. Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
  11. Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R. The potential of metabolic imaging. Seminars in Nuclear Medicine. 46 (1), 28-39 (2016).
  12. Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
  13. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
  14. Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379(2013).
  15. Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869(2021).
  16. Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378(2016).
  17. Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
  18. Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501(2020).
  19. Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
  20. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  21. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  22. Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702(2021).
  23. Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903(2022).
  24. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017(2022).
  27. Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586(2022).
  28. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).
  29. Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
  30. Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501(2019).
  31. Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
  32. Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
  33. Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
  34. Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
  35. Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
  36. Zhang, W., et al. Multi-molecular hyperspectral PRM-SRS imaging. bioRxiv. , (2022).
  37. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  38. Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
  39. Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie bioortogonalnestymulowane rozproszenie Ramanowskiedwufotonowa fluorescencjasondowanie tlenkiem deuterukom rki HeLasynteza lipid wsynteza bia ekobrazowanie bez znakowania
Bioortogonalne obrazowanie chemiczne metabolizmu komórkowego regulowanego przez aminokwasy aromatyczne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.