Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65122

⸱

21 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs). Udostępniamy również szczegółowe metody wytwarzania naprężeń ścinających i rozciągania w celu zbadania naprężeń mechanicznych w hSVEC.

Streszczenie

Operacja pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG) to zabieg rewaskularyzacji niedokrwiennego mięśnia sercowego. Żyła odpiszczelowa pozostaje używana jako przewód CABG pomimo zmniejszonej długotrwałej drożności w porównaniu z przewodami tętniczymi. Nagły wzrost stresu hemodynamicznego związany z tętnicą przeszczepu powoduje uszkodzenie naczyń krwionośnych, zwłaszcza śródbłonka, co może wpływać na niską drożność przeszczepu żyły odpiszczelowej (SVG). Tutaj opisujemy izolację, charakterystykę i ekspansję ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVEC). Komórki wyizolowane przez trawienie kolagenazą wykazują typową morfologię bruku i wyrażają markery komórek śródbłonka CD31 i VE-kadherynę. Aby ocenić wpływ naprężeń mechanicznych, w tym badaniu zastosowano protokoły w celu zbadania dwóch głównych bodźców fizycznych, naprężenia ścinającego i rozciągania, na arteryalizowanych SVG. hSVEC są hodowane w równoległej komorze przepływowej w celu wytworzenia naprężenia ścinającego, wykazując wyrównanie w kierunku przepływu i zwiększoną ekspresję KLF2, KLF4 i NOS3. hSVEC mogą być również hodowane w membranie krzemowej, która umożliwia kontrolowane rozciąganie komórkowe, naśladując rozciąganie żylne (niskie) i tętnicze (wysokie). Wzorzec F-aktyny komórek śródbłonka i wydzielanie tlenku azotu (NO) są odpowiednio modulowane przez rozciąganie tętnicy. Podsumowując, przedstawiamy szczegółową metodę izolacji hSVEC w celu zbadania wpływu hemodynamicznego obciążenia mechanicznego na fenotyp śródbłonka.

Wprowadzenie

Dysfunkcja komórek śródbłonka (EC) jest kluczowym czynnikiem powodującym niepowodzenie przeszczepu żyły odpiszczelowej1,2,3,4. Utrzymujący się wzrost naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania indukuje prozapalny fenotyp ludzkich komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (hSVECs)3,4,5,6. Leżące u ich podstaw szlaki molekularne nadal nie są w pełni poznane, a ustandaryzowane protokoły badań in vitro mogą wykorzystać wysiłki na rzecz uzyskania nowych spostrzeżeń w tej dziedzinie. W tym miejscu opisujemy prosty protokół izolacji, charakteryzowania i rozszerzania hSVEC oraz sposób wystawiania ich na zmienne poziomy naprężeń ścinających i cyklicznego rozciągania, naśladując warunki hemodynamiczne żylne i tętnicze.

hSVEC są izolowane przez inkubację kolagenazy i mogą być używane do przejścia 8. Protokół ten wymaga mniej manipulacji naczyniem w porównaniu z innymi dostępnymi protokołami7, co zmniejsza zanieczyszczenie komórkami mięśni gładkich i fibroblastami. Z drugiej strony wymaga większego segmentu naczynia o długości co najmniej 2 cm, aby uzyskać skuteczną ekstrakcję EC. W literaturze przedmiotu podano, że EC z dużych zbiorników można również uzyskać poprzez mechaniczne usuwanie7,8. Chociaż podejście fizyczne jest skuteczne, ma wady w postaci niskiej wydajności EC i wyższego zanieczyszczenia fibroblastami. Aby zwiększyć czystość, potrzebne są dodatkowe kroki przy użyciu kulek magnetycznych lub sortowania komórek, co zwiększa koszt protokołu ze względu na pozyskiwanie kulek i przeciwciał7,8. Metoda enzymatyczna daje szybsze i lepsze wyniki w zakresie czystości i żywotności EC7,8.

Najczęściej używanymi EC do badania dysfunkcji śródbłonka są ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Wiadomo, że fenotyp EC zmienia się w różnych łożyskach naczyniowych i konieczne jest opracowanie metod reprezentujących badane naczynie9,10. W związku z tym ustanowienie protokołu izolowania hSVEC i hodowli go pod wpływem stresu mechanicznego jest cennym narzędziem do zrozumienia wpływu dysfunkcji hSVEC na chorobę przeszczepów żył

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niewykorzystane odcinki żył odpiszczelowych zostały pobrane od pacjentów poddawanych operacji pomostowania aortalno-wieńcowego w Instytucie Serca (InCor), Szkole Medycznej Uniwersytetu w São Paulo. Wszystkie osoby wyraziły świadomą zgodę na udział w badaniu, które zostało ocenione i zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną.

1. Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka (hSVECs)

  1. preparat
    1. Autoklaw z parą prostych lub zakrzywionych kleszczy i nożyczek do tkanek (7-8 cm).
    2. Przygotuj sterylną żelatynę. Wymieszać 0,1 g (0,1% w/v) lub 3 g (3% w/v) żelatyny ze skóry świń ze 100 ml ultraczystej wody, autoklawować przez 15 minut i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podgrzać do 37 °C w celu upłynnienia przed pokryciem szalek i szkiełek do hodowli komórkowych.
    3. Przygotować sterylną kolagenazę (1 mg/ml) w okapie z przepływem laminarnym. Rozcieńczyć kolagenazę w PBS i wysterylizować ją filtrem 0,2 μm.
    4. Pokryć naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm i szkiełko z 8 dołkami 0,1% w/v żelatyny przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar żelatyny przed wysiewem komórek.
    5. Przygotuj kompletną pożywkę dla komórek śródbłonka: pożywkę dla wzrostu komórek śródbłonka (EBM-2) uzupełnioną czynnikami wzrostu EGM2.
      UWAGA: Czynniki wzrostu EGM2 są dostarczane w zestawie przez firmę wymienioną w Tabeli Materiałów. Koncentracja czynników nie jest ujawniana przez spółkę.
    6. Przygotować 2% i 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 4% paraformaldehydu (PFA) i 0,1% roztworów Triton X-100, wszystkie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Izolacja i hodowla hSVEC
    1. Do tej procedury należy pobrać odcinek żyły odpiszczelowej o długości co najmniej 2-3 cm.
      NUTA. Wszystkie procedury hodowli komórkowej muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach i w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Przenieść segment żyły na szalkę Petriego wypełnioną wstępnie podgrzanym PBS. Włóż końcówkę pipety do jednego końca żyły i delikatnie przepłucz PBS, aby usunąć całą krew z wnętrza światła. Płucz go, aż przepływ prania stanie się całkowicie czysty.
    3. Zamknij jeden z końców żyły sterylnym bawełnianym szwem. Ostrożnie napełnić naczynie roztworem kolagenazy typu II o stężeniu 1 mg/ml. Zamknij drugi koniec naczynia bawełnianym szwem (Ryc. 1A). Inkubować naczynie z roztworem kolagenazy w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    4. Następnie odetnij jeden z końców naczynia w probówce o pojemności 15 ml i zbierz roztwór kolagenazy. Odetnij drugi koniec i przepłucz powierzchnię oprawy 1-2 ml PBS, aby zebrać wszystkie odłączone EC. Umieść wszystkie PBS razem z roztworem kolagenazy w tej samej probówce.
    5. Odwirować probówkę o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu osadzenia komórek.
      NUTA. Osad komórkowy jest bardzo mały i trudny do wizualizacji. Jeśli krew nie zostanie całkowicie usunięta przed leczeniem kolagenazą (krok 1.2.2.), komórki krwi również wytrącą się, a osad będzie czerwonawy.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 3-4 ml kompletnej pożywki komórkowej śródbłonka (EBM-2 uzupełniony czynnikami wzrostu EGM2) i dodatkowym roztworze heparyny (5 U/ml, stężenie końcowe). Umieść komórki w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm, wstępnie pokrytym 3% w/v żelatyny.
      UWAGA: Żelatyna była pierwszym wyborem ze względu na łatwość dostępności i niski koszt. Ponieważ powłoka z żelatyną z powodzeniem utrzymuje fenotyp EC, nie badano żadnej innej substancji powlekającej. Kolageny i fibronektyny mogą być testowane w badaniach mających na celu zbadanie wpływu różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej na adhezję EC i fenotyp.
    7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 4 dni bez zmiany pożywki. Następnie zmieniaj nośnik co drugi dzień. Od tego momentu dodatkowa suplementacja pożywki komórkowej heparyną nie jest już konieczna. Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że czerwone krwinki zostały usunięte.
    8. Po 3-10 dniach od ekstrakcji, w zależności od wielkości i średnicy odcinka żyły, uwidocznij hSVEC za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
    9. Oceń stopień zbieżności i morfologię kostki brukowej w mikroskopii z kontrastem fazowym.
    10. Kontynuuj wymianę pożywki co 2 dni, aż komórki osiągną zbieżność 70%-80%.
    11. Pasaż hSVEC 0,25% roztworem trypsyny-0,02% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
      1. Umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS.
      2. Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA do naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty lub do momentu odłączenia wszystkich komórek.
      3. Dodaj 2 ml kompletnej pożywki z komórek śródbłonka, aby dezaktywować trypsynę.
      4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
      5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej.
      6. Policz zawiesinę komórek w błękitu trypanowym w proporcji 1:1 (0,4%), aby pokryć żywe komórki.
      7. Aby rozszerzyć hodowlę, należy umieścić komórki w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm z 10 ml wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki dla komórek śródbłonka i hodować ją w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2,
        NUTA. Średnio wysiew 4 x 104 hSVEC/cm2 będzie w 100% zlewany po 48 godzinach.
    12. Aby kriokonserwować komórki, należy ponownie zawiesić osad z kroku 1.2.11.5 w 5% dimetylosulfotlenku (DMSO) w płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i przechowywać w ciekłym azocie.
  3. Charakterystyka hSVEC: Barwienie cytometrią przepływową dla CD31
    1. Przenieść 1 x 10 5 hSVEC do jednej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS zawierającego 2% BSA i przeciwciało monoklonalne CD31-FITC (1:100).
    2. Plamić komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Przepłukać wybarwione komórki, dodając 0,5 ml PBS i odwirować je przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 400 μl PBS z 2% BSA.
    4. Stosować nieznakowane hSVEC, bez przeciwciała CD31, jako kontrolę negatywną.
    5. Przejdź do analizy akwizycji cytometru przepływowego przy użyciu niebieskiego lasera i kanału FITC (maksimum wzbudzenia/emisji [Ex/Em] 498/517 nm). Jeśli stosowane są inne fluorochromy, sprawdź, czy cytometr posiada odpowiednie zestawy filtrów do ich wykrywania. Oddziel komórki od zanieczyszczeń w funkcji ich wielkości i ziarnistości, a następnie bramkuj pojedyncze komórki przez rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne.
  4. Charakterystyka hSVEC: Barwienie fluorescencyjne dla CD31 i VE-kadheryny
    1. Płytka 0,1 x 105 komórek w szkiełku 8-dołkowym pokrytym żelatyną. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 , aby umożliwić komórkom przyczepienie się do powierzchni hodowli.
    2. Usuń pożywkę i umyj komórki raz za pomocą PBS.
    3. Dodaj 0,3 ml / dołek 4% PFA, aby utrwalić komórki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj trzy razy PBS.
    5. Dodaj 0,3 ml/studzienkę 0,1% roztworu Triton X-100, aby przeniknąć komórki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj trzy razy PBS.
    7. Aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał, dodaj 0,3 ml / studzienkę 5% roztworu BSA do komórek. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Umyj trzy razy PBS.
    9. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (CD31 i VE-kadheryna, 1:100) rozcieńczonymi w PBS z 2% BSA przez noc, delikatnie kołysząc w temperaturze 4 °C. Pozostawić jedną studzienkę inkubowaną z PBS z 2% BSA (brak przeciwciała pierwszorzędowego) jako kontrolą ujemną.
    10. Umyj trzy razy PBS.
    11. Inkubować komórki z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi (1:500) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodać 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) do barwienia jądrowego do końcowego stężenia 1 mg / ml.
    12. Umyj trzy razy PBS.
    13. Wyjmij komorę na media z separatorem. Umieścić jedną kroplę odczynnika w pożywce montażowej (50% glicerolu w PBS) i umieścić szkiełko podstawowe (24 mm x 60 mm), unikając zatrzymywania pęcherzyków.
    14. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: DAPI jest wykrywany za pomocą kostki świetlnej DAPI (np. 335-379 nm; Em: 417-477 nm), a CD31/VE-kadheryna jest wykrywana za pomocą sześcianu świetlnego z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Kostki świetlne o podobnym zakresie długości fal wzbudzenia/emisji są również odpowiednie dla tych fluorochromów. Jeśli używane są inne fluorochromy, należy sprawdzić, czy używany mikroskop ma odpowiednie zestawy filtrów do ich wykrywania.

2. Naprężenie ścinające na hSVEC

  1. preparat
    1. Pokryć szkiełko komory przepływowej 0,1% w/v żelatyny przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar żelatyny przed wysiewem komórek.
    2. Zrównoważyć jednostkę fluidyczną i sterylny zestaw perfuzyjny ze zbiornikami o pojemności 10 ml przez noc wewnątrz inkubatora w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Eksperyment naprężenia ścinającego
    1. Nasiona 2 x 105 EC zawieszone w 100 μl podłoża EC do szkiełka komory przepływowej pokrytej żelatyną. Inkubować komórki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i przy stężeniu 5% CO2 , aby umożliwić komórkom przyczepienie się do powierzchni hodowli.
    2. Umieść zestaw perfuzyjny na jednostce fluidycznej zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Napełnij zbiorniki i zestaw perfuzyjny w około 12 ml wstępnie podgrzanego, kompletnego podłoża komórkowego śródbłonka. Ręcznie usuń pęcherzyki powietrza z zestawu do perfuzji, aby wyrównać poziom obu zbiorników na poziomie 5 ml.
    3. Umieścić zespół fluidyczny z zamontowanym zestawem perfuzyjnym, bez suwaka komory, w inkubatorze i podłączyć jego elektryczny do pompy regulowanej komputerowo. Usuń wszystkie pęcherzyki powietrza ze zbiorników i zestawu perfuzyjnego, uruchamiając predefiniowany protokół w oprogramowaniu sterującym pompą.
      NUTA. Bardzo ważne jest usunięcie pęcherzyków powietrza, aby system działał prawidłowo.
    4. Weź jednostkę fluidyczną z zamontowanym zestawem perfuzyjnym do okapu z przepływem laminarnym i przymocuj szkiełka za pomocą monowarstwy zlewających się komórek.
    5. Umieść zespół fluidyczny z zamontowaną perfuzją i szkiełkami z komórkami w inkubatorze i podłącz jego elektryczny do pompy.
    6. W oprogramowaniu sterującym pompą ustaw następujące parametry: lepkość medium (0,0072), rodzaj szkiełka, współczynnik kalibracji zestawu perfuzji, szybkość naprężenia ścinającego (20 dyn/cm2), rodzaj przepływu (jednokierunkowy) i czas (72 h), a następnie uruchom przepływ (więcej informacji można znaleźć w instrukcji obsługi). Zebrać komórki poddane działaniu tych samych pożywek bez wystawiania na działanie przepływu jako kontroli statycznej.
    7. Po zakończeniu bodźca należy raz przemyć komórki PBS i przystąpić do pobierania próbek zgodnie z wymaganym testem. W przypadku barwienia fluorescencyjnego patrz krok 2.3.1, a w przypadku ekstrakcji RNA patrz krok 2.3.2.
  3. Demonstracja skuteczności protokołu naprężeń ścinających
    1. Barwienie fluorescencyjne włókien aktynowych (F-aktyna)
      1. Napraw i przepuszczalność komórek, jak wskazano w krokach 1.4.2-1.4.6. Użyć objętości 100 μl w szkiełku μ.
      2. Wybarwić F-aktynę falloidyną znakowaną fluorescencyjnie (rozcieńczoną w stosunku 1:200 w PBS) i przeciwbarwić jądro DAPI (końcowe stężenie 1 mg/ml w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      3. Umyj trzy razy PBS.
      4. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
        UWAGA: DAPI jest wykrywany za pomocą kostki świetlnej DAPI (np. 335-379 nm; Em: 417-477 nm), a falloidyna jest wykrywana za pomocą sześcianu świetlnego GFP (Ex: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Kostki świetlne o podobnym zakresie długości fali wzbudzenia/emisji są również odpowiednie dla tych fluorochromów. Jeśli używane są inne fluorochromy, należy sprawdzić, czy używany mikroskop ma odpowiednie zestawy filtrów do ich wykrywania.
    2. Ekspresja genów metodą ilościowej odwrotnej transkrypcji w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
      1. Zebrać komórki z szkiełka μ z 350 μl dostępnego w handlu buforu do lizy zawierającego tiocyjanian guanidyny. Wyizolować całkowite RNA za pomocą zestawów do ekstrakcji opartych na kolumnach, zgodnie z instrukcjami producenta.
        UWAGA: Ze względu na ograniczoną liczbę komórek hodowanych na szkiełku μ, zaleca się stosowanie ekstrakcji RNA na podstawie kolumny.
      2. Przygotuj cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA z enzymem odwrotnym transkryptazy, zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Sprawdź ekspresję genów regulowanych przez naprężenie ścinające: KLF2, KLF4 i NOS3. Użyj genu gospodyni domowej PPIA/cyklofiliny, aby znormalizować wyniki. Konkretne startery dla tej reakcji są wymienione w Tabeli 1.
      4. Przeprowadzić RT-qPCR przy użyciu zestawu do barwienia DNA zieloną fluorescencyjną SYBR w następujących warunkach reakcji: i) 50 °C przez 2 min, ii) 95 °C przez 15 min, iii) 94 °C przez 15 s, iv) 60 °C przez 30 s, v) 72 °C przez 30 s. Powtórz kroki od iii do v przez 40 cykli. Na końcu reakcji dodać etap topnienia, aby sprawdzić specyficzność podkładu.

3. Cykliczne rozciąganie na hSVEC

  1. preparat
    1. Nałóż smar na bazie silikonu na górę i boki 6-dołkowej równoosiowej stacji załadowczej 25 mm.
      UWAGA: Zmniejsza to tarcie między membraną płytki hodowlanej a stacją, umożliwiając lepsze rozprowadzenie cyklicznego odkształcenia. Ten krok należy wykonać przed każdym eksperymentem.
  2. Eksperyment z cyklicznym rozciąganiem
    1. Wysiew 4 x 105 komórek zawieszonych w 3 ml do każdego dołka z 6-dołkowych płytek hodowlanych z elastycznym dnem pokrytych kolagenem I (tabela materiałów). Zaplanuj, aby talerz (talerze) był w stanie statycznym jako grupa kontrolna. Utrzymuj komórki w inkubatorze (37 °C w wilgotnym powietrzu z 5% CO2 ) do momentu osiągnięcia 100% zbiegu (zwykle 48 godzin po wysianiu). Przed rozpoczęciem protokołu rozciągania należy raz przemyć komórki wstępnie podgrzanym PBS i dodać 3 ml świeżej pożywki hodowlanej do dołka.
    2. Włóż płytkę bazową ze wszystkimi nasmarowanymi stacjami ładowania do inkubatora i odpowiednio połącz rurkę z wyposażeniem sterującym systemu bioreaktora rozciągającego ogniwa napinające (więcej informacji można znaleźć w instrukcji wyposażenia).
    3. Przymocuj każdą płytkę hodowlaną do jednej czerwonej uszczelki, dostarczonej przez system bioreaktora rozciągającego ogniwa napinające. Następnie umieść je w płytce bazowej wewnątrz inkubatora.
      1. Upewnij się, że płytki są całkowicie osadzone, dociśnięte i uszczelnione do płyty podstawy, aby uniknąć wycieku powietrza podczas pompowania próżniowego. Ważne jest, aby wszystkie cztery płytki hodowlane znajdowały się w płytce podstawowej, aby uzyskać odpowiednie podciśnienie i obciążenie rozciągające.
      2. W przypadku mniejszej liczby płytek doświadczalnych, należy użyć pustej płytki (płytek), aby wypełnić cztery pozycje na płytce podstawowej. Dodaj arkusz akrylowy (dostarczony z wyposażeniem) na wierzchu płytek hodowlanych, aby poprawić uszczelnienie płytki podstawowej. Umieść płytki statyczne w tym samym inkubatorze.
    4. Włącz sprzęt kontrolera i system komputerowy. Otwórz ikonę oprogramowania i skonfiguruj żądany schemat: rozmiar stacji ładowania, która ma być używana, rodzaj odkształcenia, procent wydłużenia, kształt fali, częstotliwość i czas. Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta. Wybierz i pobierz schemat. W tym przypadku zastosowano następujący schemat: kształt fali 1/2 zatoki, częstotliwość 1 Hz, 5% wydłużenia (w celu naśladowania rozciągania żylnego) i 15% wydłużenia (w celu naśladowania rozciągnięcia tętnicy) do 72 godzin.
    5. Włącz system próżniowy i kliknij Start na ekranie komputera, aby uruchomić rozciąganie. Sprawdź, czy membrana silikonowa porusza się i rozciąga komórki.
    6. Po zakończeniu bodźca należy raz przemyć komórki PBS i przystąpić do pobierania próbek zgodnie z wymaganym testem. Tutaj, aby zademonstrować skuteczność cyklicznego rozciągania, należy zebrać pożywkę hodowlaną hSVEC, utrzymać ją w temperaturze -80 °C w celu dalszego pomiaru tlenku azotu (NO) i utrwalić komórki do barwienia fluorescencyjnego.
      NUTA. Płytka bazowa nie może być przechowywana w inkubatorze, gdy nie jest używana; W przeciwnym razie temperatura może zmodyfikować płaski kształt i uczynić go bezużytecznym.
  3. Demonstracja skuteczności protokołu cyklicznego rozciągania
    1. Barwienie fluorescencyjne F-aktyny
      1. Napraw komórki zgodnie ze wskazówkami w kroku 1.4.3. Użyj objętości 1 ml na studzienkę.
      2. Umyj komórki trzykrotnie PBS. Utrzymuj komórki w PBS, aby nie wyschły, jednocześnie przygotowując membranę silikonową do kolejnych kroków.
      3. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć nadmiar smaru na bazie silikonu z dolnej części membrany. Następnie delikatnie nałóż płyn do mycia okien lub mydło do rąk za pomocą nowego bawełnianego wacika. Powtarzaj proces, aż cały smar zostanie usunięty z membrany. Następnie wyczyść wodą dejonizowaną.
        NUTA. Ważne jest, aby całkowicie usunąć smar z membrany silikonowej, aby uzyskać obrazy mikroskopowe dobrej jakości.
      4. Ostrożnie pokrój membrany silikonowe na małe kawałki, aby pasowały do 8-dołkowych szkiełek do barwienia. Przepuszczalność komórek zgodnie z opisem w kroku 1.4.5.
      5. Po etapach mycia wybarwić F-aktynę za pomocą falloidyny, a jądro za pomocą DAPI. Przejdź do analizy, jak wskazano w krokach 2.3.1.2 i 2.3.1.3. Użyj objętości 0,3 ml na komorę.
      6. Wyjmij komorę na media z separatorem. Umieścić jedną kroplę odczynnika w pożywce montażowej (50% glicerolu w PBS) i umieścić szkiełko podstawowe (24 mm x 60 mm).
      7. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
        UWAGA: DAPI jest wykrywany za pomocą kostki świetlnej DAPI (np. 335-379 nm; Em: 417-477 nm), a falloidyna jest wykrywana za pomocą czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP) light cube (Ex: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Kostki świetlne o podobnym zakresie długości fali wzbudzenia/emisji są również odpowiednie dla tych fluorochromów. Jeśli używane są inne fluorochromy, należy sprawdzić, czy używany mikroskop ma odpowiednie zestawy filtrów do ich wykrywania.
    2. Pomiar NO - oszacowany przez akumulację azotynów (NO2) w pożywce kondycjonowanej hSVEC przy użyciu testu redukcyjnej chemiluminescencji na bazie jodku potasu
      1. preparat
        1. Przygotować krzywą wzorcową z 0,01-10 mM roztworu azotynu sodu (NaNO2 w wodzie ultraczystej).
        2. Dodać 5 ml kwasu octowego i 1 ml jodku potasu (50 mg w 1 ml ultraczystej wody) do naczynia przepłukującego analizatora tlenku azotu.
      2. Pomiar BRAK
        1. Dodać 20 μl krzywej wzorcowej NaNO2 do naczynia odpowietrzającego analizatora tlenku azotu. Zmierz go zgodnie z protokołem producenta.
    3. Dodać 20 μl kondycjonowanego podłoża do naczynia odpowietrzającego analizatora tlenku azotu. Zmierz go zgodnie z protokołem producenta.
    4. Obliczyć stężenia NO2 w oparciu o kalibrację krzywej wzorcowej. Dostosuj wartości uzyskane przez całkowitą objętość analizowanego kondycjonowanego podłoża6,11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zazwyczaj przylegające EC można zaobserwować 3-4 dni po ekstrakcji. hSVECs początkowo tworzą skupiska komórek i wykazują typową morfologię „bruku” (Rysunek 1B). Ekspresują one markery EC: CD31 (Rysunek 1C,D) oraz VE-kadherynę (Rysunek 1D). hSVECs można łatwo propagować na niepowlekanej, modyfikowanej płytce do hodowli komórkowej; komórki te zachowują fenotyp śródbłonka w hodowli do ośmiu pasaży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odcinek żyły odpiszczelowej powinien mieć co najmniej 2 cm, aby skutecznie wyizolować hSVEC. Małe segmenty są trudne w obsłudze i wiążą końce naczynia, aby utrzymać roztwór kolagenazy w celu wyizolowania komórek. Zmniejszona powierzchnia świetlna nie daje wystarczającej liczby komórek do ekspansji kultury. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia substancjami innymi niż EC, manipulacja odcinkiem żyły odpiszczelowej musi być bardzo delikatna podczas całego zabiegu. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas wprowadzani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

JEK jest wspierany przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 i 2013/17368-0] oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 i 309179/2013-0). AAM jest wspierany przez granty z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) i Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-0,02% roztwór EDTAGibco25200072
15 µ slide I 0,4 Luer Ibidi80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571
6-dołkowa równoosiowa stacja załadowcza 25 mm Flexcell Międzynarodowa korporacjaLS-3000B25. Szkiełko 8-dołkowe VJW
z wyjmowaną studzienkąThermo Fisher Scientific154453
Kwas octowy (Lodowaty)Millipore100063
Arkusz akrylowy o grubości 1 cmPrzeciwciało z pleksi
Anty-CD31Abcamab24590
Przeciwciało anty-CD31, FITCThermo Fisher ScientificMHCD3101
Przeciwciało anty-VE-kadherynySygnalizacja komórkowa2500
Płytki Bioflex kolagen IFlexcell International CorporationBF3001C
Roztwór albuminy surowicy bydlęcejSigma-AldrichA8412
Szew bawełniany EP 3,5 15 x 45 cmBrasutureAP524
Cyklofilinowy podkład do przoduThermo Fisher ScientificCustom zaprojektowany
Cyklofilinowy odwrócony podkładThermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD4540
EBM-2 podłoże podstawoweLonzaCC3156
EGM-2 SingleQuots suplementyLonzaCC4176
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific2657-029
System napinania Flexcell FX-5000Flexcell International CorporationFX-5000T
Fluoromount wodne medium montażoweSigma-AldrichF4680
Żelatyna ze skóry świniSigma-AldrichG2500
GlicerolSigma-AldrichG5516
Kozia anty-mysia IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11008
Heparyna sodowa z błony śluzowej jelit świń 5000 IU / mlBlau Farmacê uticaSKU 68027
System pompy Ibidi (pompa + jednostka płynowa)Podkład do przodu Ibidi10902
KLF2Thermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
podkład odwrotny KLF2Thermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
podkład do przodu KLF4Thermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
wsteczny KLF4Thermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
analizator tlenku azotu NOA 280Sievers InstrumentsNOA-280i-1
NOS3 starter do przoduThermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
odwrócony starter NOS3Thermo Fisher ScientificSpecjalnie zaprojektowany
paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127
Zestaw perfuzyjny 15 cm, ID 1,6 mm, czerwony, zbiorniki 10 mlIbidi10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010031
JodekpotasuZestaw do zielonego PCR Sigma-Aldrich221945
QuanTitec SYBRQiagen204143
QuantStudio 12K Zestaw Applied Biosystems4471087
RNeasy micro Quiagen74004
Szkło ślizgowe (24 mm x 60 mm)Knittel GlassVD12460Y1D.01
Azotyn soduSigma-Aldrich31443
System syntezy pierwszej nici SuperScript IVThermo Fisher Scientific18091200
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Trypan niebieska bejca 0,4%Gibco15250-061
Kolagenaza typu II z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC6885
podkład Platforma elastyczna

Bibliografia

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413(2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozci ganie cyklicznetrawienie kolagenazkomora przep ywowahodowla kom rkowamarkery r db onkacytoszkielet aktynowyuwalnianie tlenku azotu
Izolacja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej człowieka i narażenie na kontrolowane poziomy naprężeń ścinających i rozciągania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.