Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65123

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodologię przygotowania kulek lateksowych do testów z użyciem przeciwciał IgY do wykrywania antygenów.

Streszczenie

Testy immunologiczne są ważnymi testami do wykrywania wielu celów molekularnych. Wśród obecnie dostępnych metod w ostatnich dziesięcioleciach na znaczeniu zyskał test cytometryczny. Każda mikrosfera, która jest odczytywana przez urządzenie, reprezentuje zdarzenie analizy zdolności interakcji między badanymi cząsteczkami. Tysiące tych zdarzeń są odczytywane w jednym teście, co zapewnia wysoką dokładność i odtwarzalność testu. Metodologia ta może być również wykorzystywana do walidacji nowych danych wejściowych, takich jak przeciwciała IgY, do diagnozowania chorób. Przeciwciała te uzyskuje się poprzez uodparnianie kurcząt badanym antygenem, a następnie ekstrakcję immunoglobuliny z żółtka jaj zwierząt; Dlatego jest to bezbolesna i wysoce wydajna metoda pozyskiwania przeciwciał. Oprócz metodologii bardzo precyzyjnej walidacji zdolności rozpoznawania przeciwciał w tym teście, w niniejszym artykule przedstawiono również metodę ekstrakcji tych przeciwciał, określenie najlepszych warunków sprzężenia przeciwciał i kulek lateksowych oraz określenie czułości testu.

Wprowadzenie

Wśród technik immunologicznych mających na celu diagnozowanie chorób, test cytometryczny z kulkami okazał się bardzo czułym i niezawodnym podejściem, ponieważ pozwala na analizę tysięcy cząstek w jednym teście1. Technika ta, oprócz wysokiej wydajności i możliwości wykorzystania mniejszych objętości próbek, charakteryzuje się również dużą elastycznością, ponieważ pozwala na wykrywanie kilku cząsteczek, takich jak cytokiny, cząsteczki adhezyjne, izotypy przeciwciał i białka2,3.

Do opracowania tych testów wykorzystywane są różne cząstki, wśród nich koraliki lateksowe, które są skutecznym i tanim wkładem. Mogą one wykazywać modyfikacje na swojej powierzchni, takie jak obecność grup funkcyjnych lub białek, które umożliwiają kowalencyjne lub niekowalencyjne sprzężenie niektórych cząsteczek3,4,5.

Te testy immunologiczne wykorzystują komponenty takie jak antygeny i przeciwciała do wykrywania markerów choroby i często wymagają przeciwciał od ssaków, takich jak myszy, króliki i kozy. Stwarza to problemy związane z kwestiami etycznymi, ponieważ immunizacja ssaków na ogół wymaga wielu zwierząt do uzyskania dobrego plonu, a także częstego wykonywania procedur, które prowadzą do cierpienia zwierząt6,7. Alternatywą dla tego jest zastosowanie przeciwciał IgY wyizolowanych z żółtek jaj uodpornionych kurczaków, ponieważ w żółtkach można znaleźć wysokie stężenia specyficznych przeciwciał przeciwko zaszczepionym antygenom; Produkcja kurczaka jest równa produkcji 4,3 królika w ciągu roku6,7.

Zatem celem tego protokołu jest dostarczenie metody oceny przeciwciał IgY uzyskanych z żółtek jaj kurzych za pomocą cytometrii przepływowej z kulkami lateksowymi. W tym celu proponujemy metodę standaryzacji cytometrycznego testu immunologicznego kulek w formacie kanapkowym przy użyciu kulek lateksowych. Jako model wykorzystano przeciwciała IgY skierowane do antygenu białka II bogatego w histydynę Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Opisujemy metodę ekstrakcji przeciwciał, omawiamy krytyczne etapy określania ich stężenia sprzężenia z kulkami lateksowymi oraz przedstawiamy ocenę granicy wykrywalności antygenu. Wysoka dokładność cytometrii przepływowej w połączeniu z niskim kosztem kulek lateksowych sprawia, że technika ta ma zastosowanie do analizy narzędzi do testów immunologicznych, takich jak przeciwciała i antygeny. Ta metoda może być stosowana do wykrywania różnych celów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Ekstrakcja IgY z żółtek jaj

  1. Higienizacja jaj
    1. Zanurzyć jaja (świeżo zniesione lub do 4 dni po zniesieniu, z linii Gallus gallus Dekalb White) w 0,2% roztworze podchlorynu sodu, szybko opłukać pod bieżącą wodą i delikatnie wytrzeć do późniejszego lub natychmiastowego użycia.
      UWAGA: Jeśli jaja nie są używane natychmiast, przechowywać w temperaturze 4 °C do 15 dni.
  2. Oddzielanie żółtek
    1. Ostrożnie rozbić jajo i oddzielić żółtko od białka za pomocą separatora żółtek.
    2. Usunąć nadmiar białka za pomocą papieru filtracyjnego. Przebić żółtko i zebrać jego zawartość do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Przechowywać żółtko w temperaturze −20 °C przez co najmniej 24 h przed użyciem.
      UWAGA: Podczas tych eksperymentów (dane nie przedstawiono) zaobserwowano, że użycie żółtek, które nie zostały wcześniej zamrożone, utrudniało izolację immunoglobulin z lipidowej części żółtek.
  3. Zakwaszanie żółtek
    1. Rozmrozić przechowywane żółtko i rozcieńczyć je w stosunku 1:10 w 1 mM PBS. Dostosować pH roztworu do wartości 5 za pomocą 1 N HCl i inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 6-24 h.
    2. Odwirować roztwór przy 3 000 × g przez 40 min, zebrać nadfiltr i przefiltrować go przez filtr celulozowy o rozmiarze 0,7 mm.
  4. Wytrącanie lipidów kwasem kaprylowym
    1. Ponownie dostosować pH nadfiltrów do wartości 5 i dodać kwas kaprylowy (stężenie początkowe ≥98%) do stężenia końcowego 8,7%, przy stałym mieszaniu przez 30 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Objętość nadfiltru może się różnić w zależności od masy lipidów wytrąconych w kroku 1.3.2. Tak na przykład do 35 mL nadfiltru otrzymanego po filtracji należy dodać 3,107 mL kwasu kaprylowego.
    2. Odwirować próbki przez 15 min przy 18 600 × g i oddzielić nadfiltr od wytrąconego materiału.
    3. Ponownie dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 1 M NaOH, oznaczyć ilość przeciwciał metodą Bradforda8 i przechowywać przeciwciała w temperaturze −20 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Przeciwciała uzyskano w stężeniu 1 µg/µL, co zweryfikowano za pomocą żelu 12% SDS-PAGE.

2. Krzywa nasycenia przeciwciał IgY dla kulek lateksowych

  1. Sprzęganie kulek z przeciwciałami IgY
    1. Do 21 µL kulek lateksowych (4% w/v) dodać 21 µL 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu (EDC, stężenie początkowe 367 mM) oraz 21 µL N-hydroksysukcynimidu (NHS, stężenie początkowe 50 mM), a następnie dopełnić filtrowanym 10 mM PBS do końcowej objętości 2,1 mL.
      UWAGA: Zakres pH roztworu PBS powinien wynosić od 7,2 do 7,4, ponieważ w niniejszej pracy zaobserwowano negatywny wpływ na sprzęganie i pozostałe etapy przy użyciu roztworu poza tym zakresem.
    2. Inkubować w temperaturze 22 °C przy szybkim wstrząsaniu przez 3 h.
    3. Do różnych mikroprobek zawierających 100 µL roztworu opisanego w kroku 2.1.1 (końcowe stężenie kulek 0,04%) dodać odpowiednio 4 µg, 2 µg, 1 µg, 0,5 µg, 0,25 µg, 0,125 µg i 0 µg wcześniej wyekstrahowanego przeciwciała wychwytującego IgY-PfHRP2 (patrz krok 1.4.3), a następnie inkubować w warunkach opisanych w kroku 2.1.2 przez 16 h.
    4. Próbki wirować przy 857 × g w temperaturze 15 °C przez 5 min, odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć kulki lateksowe 500 µL filtrowanego 10 mM PBS (końcowe stężenie kulek 0,008%), stosując cykle wirowania i resuspensji.
      UWAGA: Nie przekraczać 857 × g, ponieważ w niniejszej pracy zaobserwowano, że powyżej tej prędkości kulki ulegają deformacjom, które negatywnie wpływają na wynik testu.
  2. Blokowanie kulek
    1. Próbki resuspender w 1 mL buforu blokującego (końcowe stężenie kulek 0,004%) (filtrowany 10 mM PBS + albuminy surowicy bydlęcej, BSA, 5%) i inkubować w warunkach opisanych w kroku 2.1.2 przez 2 h.
    2. Po blokowaniu przemyć zgodnie z opisem w kroku 2.1.4 i resuspender w buforze 10 mM PBS.
  3. Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi anty-kurczymi znakowanymi Alexa Fluor 488
    1. Do każdej mikroprobki, zgodnie z opisem w kroku 2.1.3, dodać 100 µL fluorescencyjnego przeciwciała anty-kurczego (2 mg/mL) rozcieńczonego 1:2 000 w 10 mM PBS + 0,5% BSA.
    2. Próbki inkubować zgodnie z opisem w kroku 2.1.2, tym razem w ciemności, przez 30 min.
    3. Kulki przemyć jak w kroku 2.1.4 i resuspender w 250 µL filtrowanego 10 mM PBS (końcowe stężenie kulek 0,016%). Wykonać odczyt cytometrem przepływowym zgodnie z opisem w sekcji 5.
      UWAGA: Na podstawie uzyskanych danych o procencie fluorescencji wyznaczyć początkowy punkt formowania się plateau (1 µg, jak zaobserwowano w tym badaniu). Zalecamy użycie drugiego punktu plateau (2 µg, jak zaobserwowano tutaj) w kolejnych etapach (Rycina 1).

Krzywa odpowiedź-dawka dla przeciwciała anty-IgY z kurczaka; wykres przedstawia intensywność wiązania Alexa Fluor 488 w zależności od ilości IgY.
Rysunek 1: Wykres z analizy cytometrii przepływowej w celu określenia punktu nasycenia sprzęgania przeciwciała IgY-PfHRP2 z lateksowymi kuleczkami. Oś X przedstawia stężenie przeciwciał, a oś Y przedstawia uzyskany procent fluorescencji. Test Kruskala-Wallisa, p < 0.0033. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

3. Analiza cytometryczna z wykorzystaniem kulek lateksowych do wykrywania antygenu

  1. Po określeniu punktu nasycenia przeciwciał IgY względem kulek lateksowych, ponownie przeprowadź proces aktywacji kulek zgodnie z krokiem 2.1.1.
    1. Przeprowadź sprzęganie kulek przy zaobserwowanym stężeniu nasycenia (opisane w kroku 2.1.3) i inkubuj zgodnie z krokiem 2.1.2.
      UWAGA: W testach wykonanych z użyciem przeciwciała IgY-PfHRP2 warunkiem nasycenia było 2 µg na każde 1 µL kulek lateksowych.
  2. Zablokuj i przemyj kulki zgodnie z krokiem 2.2.
  3. Inkubacja z antygenem
    1. Aby określić granicę wykrywalności, rozdziel równoważnik 100 µL preparatu zablokowanych kulek do probówek zawierających różne ilości rekombinowanego białka PfHRP2 (1 µg/mL) (rPfHRP2, 10 µg, 1 µg, 0,1 µg, 0,01 µg, 0,001 µg, 0,0001 µg i 0 µg) rozpuszczonego w 10 mM PBS + 0,5% BSA, w trzech powtórzeniach.
      UWAGA: To białko rekombinowane zostało opracowane w pracy Sousy i wsp.9.
    2. Inkubuj roztwory kulek z białkiem rPfHRP2 zgodnie z opisem w kroku 2.1.2 przez 1 h.
    3. Przeprowadź przemywanie zgodnie z opisem w kroku 2.1.4 i odlej nadsącz po wirowaniu.
  4. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Do każdej próbki dodaj 2 µg przeciwciała IgG mysiego przeciwko białku rPfHRP2 rozcieńczonego w 10 mM PBS + 0,5% BSA do końcowej objętości 100 µL. Inkubuj próbki zgodnie z opisem w kroku 2.1.2 i odlej nadsącz po ostatnim wirowaniu.
      UWAGA: To przeciwciało zostało opracowane w pracy Sousy i wsp.9.
  5. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Do każdej próbki dodaj 100 µL fluorescencyjnego przeciwciała anty-mysiego (2 mg/mL) rozcieńczonego 1:2 000 w 10 mM PBS + 0,5% BSA. Inkubuj zgodnie z opisem w kroku 2.1.2, a następnie resuspenduj w 250 µL (końcowe stężenie kulek 0,016%) przefiltrowanego 10 mM PBS. Przeprowadź odczyt zgodnie z sekcją 5.

4. Odczyt próbek za pomocą cytometru przepływowego

  1. Ustawienia cytometru: Dopasowanie parametrów optycznych cytometru połączonego z komputerem
    1. Włącz komputer i cytometr przepływowy, a następnie odczekaj kilka minut, aż urządzenie połączy się z komputerem.
    2. Kliknij ikonę oprogramowania do cytometrii zainstalowanego na komputerze i zaloguj się do niego. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometer | Startup | Clean mode | SIT fluids.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza i zatory powinny zostać usunięte podczas procesu inicjacji cytometru przed rozpoczęciem akwizycji próbek.
  2. Kontrola jakości
    1. Użyj odczynnika do kontroli jakości, aby sprawdzić napięcia fotopowielaczy i ocenić czułość cytometru.
    2. Umieść odczynnik do konfiguracji cytometru oraz kulek śledzących (tracking beads) w probówce polistyrenowej z nakrętką o wymiarach 12 mm x 75 mm.
    3. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki za pomocą wortexa.
  3. Przygotowanie zawiesiny kulek
    1. W celu zdefiniowania linii bazowej, dodaj 0,5 mL rozcieńczalnika (przefiltrowany PBS 10 mM, pH 7) oraz trzy krople kulek do probówki polistyrenowej z nakrętką 12 mm x 75 mm. Przed użyciem delikatnie wymieszaj probówkę w vortexie.
    2. W obszarze roboczym oprogramowania cytometru wybierz Cytometer | CST i poczekaj, aż cytometr rozłączy się z interfejsem oprogramowania cytometru i połączy z interfejsem CS&T. Zwróć uwagę na następujący komunikat w pasku stanu (Status Bar) oprogramowania cytometru na dole ekranu: Disconnected Cytometer.
    3. Użyj probówki polistyrenowej z nakrętką 12 mm x 75 mm zawierającej odczynnik do kontroli jakości i przymocuj ją do sondy cytometru przepływowego.
  4. Weryfikacja konfiguracji cytometru
    1. W oknie System Summary zweryfikuj, czy konfiguracja cytometru jest odpowiednia dla danego eksperymentu.
  5. Konfiguracja sprawdzania wydajności
    1. Wybierz identyfikator (ID) kulek konfiguracyjnych odpowiadający partii badawczych kulek CS&T.
  6. Sprawdzanie wydajności
    1. Przymocuj probówkę do sondy cytometru przepływowego i kliknij okno Setup Control. Wybierz Check Performance, a następnie kliknij Run.
    2. Po zakończeniu sprawdzania wydajności poczekaj na otwarcie okna dialogowego. Wykonaj jedną z poniższych czynności:
      1. Aby wyświetlić raport Cytometer Performance, kliknij View Report.
      2. Aby zakończyć sprawdzanie wydajności i powrócić do widoku konfiguracji obszaru roboczego, kliknij Finish.
      3. Sprawdź końcowy wynik analizy morfometrycznej i czułości fluorescencji, który pojawia się w sekcji System Summary | Cytometer Performance Result ze statusem PASSED.
      4. Wyjmij probówkę z cytometru. Sprawdź wyniki wydajności cytometru wyświetlone w oknie System Summary.

5. Analiza próbek z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

  1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru.
    1. W obszarze roboczym oprogramowania cytometru wybierz Cytometr | Tryb czyszczenia | Płyny SIT.
    2. Dostosuj do obszaru roboczego oprogramowania.
    3. Zdefiniuj strategię bramowania w oparciu o charakterystykę morfometryczną i fluorescencyjną cząstek kontroli negatywnej (kuleczki bez fluorescencji).
    4. Aby określić morfometrię komórek, należy wybrać Wykres punktowy do analizy FSC-A parametry z użyciem SSC-A (Rycina dodatkowa 1A).
    5. Wyznaczanie pojedynczych komórek za pomocą SSC przy użyciu Wykres punktowy do analizy SSC-H na osi rzędnych i SSC-W na osi X (Rysunek dodatkowy 1B), a następnie wyznaczyć pojedyncze komórki za pomocą FSC, stosując Wykres punktowy do analizy FSC-H na osi rzędnych i FSC-W na osi X (Rycina dodatkowa 1C).
    6. Do analiz fluorescencyjnych należy wybrać Wykresy kropkowe FL1 stosując FCS-ANależy użyć probówki polistyrenowej z korkiem o wymiarach 12 mm x 75 mm, zawierającej próbki nieoznakowane oraz próbki uprzednio oznakowane jednobarwnym barwnikiem Alexa Fluor 488 (Rycina dodatkowa 1D, E).
  2. Przeprowadź akwizycję próbki w cytometrii przepływowej.
    1. Należy użyć probówek polistyrenowych z korkiem o wymiarach 12 mm x 75 mm zawierających wcześniej oznakowane próbki. Zawartość probówki należy starannie wymieszać, a następnie przymocować probówkę do sondy cytometru przepływowego i kliknąć lewym przyciskiem myszy Acquire.
    2. Aby ustawić moc z laserykliknij w Parametry, a w poniższych opcjach, dostosować the napięcie FSC do 182 V i napięcie SSC Wpisz tekst źródłowy, który ma zostać przetłumaczony. 236 VAby ustawić próg, należy kliknąć Cytometr | Próg, a w poniższych opcjach, dostosować the FSC do 500 V.
    3. Ustaw bramkę analizy w celu charakterystyki cząstek pod kątem wielkości i złożoności, a także w celu przeprowadzenia analizy pojedynczych komórek.
    4. Aby usunąć autofluorescencję, należy przeanalizować próbkę bez barwnika zawierającą wyłącznie kulki lateksowe, a następnie dostosować napięcia detektora: w poniższych opcjach, dostosować the napięcie kanału FL1 (FITC) Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 332 V.
    5. Ustaw bramkę analizy fluorescencyjnej w formacie czworokąta, zaczynając od punktu negatywnego wskazanego na wykresie kropkowym.
    6. Po przeprowadzeniu korekt analiz morfometrycznych i fluorescencyjnych, skonfiguruj urządzenie na 50 000 zdarzeń: w sekcji Akwizycja, kliknij w Zapis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia schemat procesu ekstrakcji przeciwciał IgY poprzez zakwaszanie, a następnie ich separację z wykorzystaniem kwasu kaprylowego (Rysunek 2).

Schemat ekstrakcji białek jaja z centryfugowaniem, kwasem kaprylowym, cyklami 3 000xg i 18 600xg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda wytrącania przeciwciała IgY poprzez obniżenie pH, a następnie separację lipidów za pomocą kwasu kaprylowego jest skuteczna w izolowaniu całkowitych przeciwciał bez utraty funkcjonalności. Zaproponowana tutaj metoda jest prostsza i tańsza niż ta opisana przez Redwan i wsp.11, którzy również stosowali wytrącanie przez zakwaszenie i kwas kaprylowy, ale z bardziej złożonym i pracochłonnym protokołem. Metoda ta ma również przewagę nad powszechnie stosowanymi metodologiami izolacji IgY z żółtek j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i publikacji tego artykułu.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), podyplomowemu programowi studiów biotechnologicznych (PPGBIOTEC na Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) oraz Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) za przyznanie stypendiów. Rysunki 2 i 4 zostały utworzone za pomocą biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-Chicken IgY (H+L), silnie adsorbowany krzyżowo, CF  Przeciwciało 488A wytwarzane w osiołkuSigma-AldrichSAB4600031
Anty-mysie IgG (H+L), F(ab′)2Sigma-AldrichSAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS& Koraliki badawcze T (CS& Koraliki badawcze T)BD Biosciences655050
BD FACSDiva oprogramowanie 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikaBio-Rad#5000006
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503
Kwas kaprylowySigma-AldrichO3907
Wirówka 5702 REppendorfZ606936
Chlorek 37% kwasowy klasy cząsteczkowejNEON02618 NEON
CML lateks, 4% w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimid w proszku (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-hydroksysukcynimid (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-Aldrich1003335620
Wodorotlenek soduAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
Podchloryn soduAcs CientificaR09211000
Thermo Mixer Heat/CoolKASVIK80-120R
barwnikowego

Bibliografia

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeciwciała IgYcytometria przepływowakulki lateksowestandaryzacja immunoanalizyekstrakcja przeciwciałkanapkowa immunoanalizaanaliza fluorescencjitesty diagnostyczne
Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.