Artykuł metodologiczny

Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

DOI:

10.3791/65123

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodologię przygotowania kulek lateksowych do testów z użyciem przeciwciał IgY do wykrywania antygenów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy immunologiczne są ważnymi testami do wykrywania wielu celów molekularnych. Wśród obecnie dostępnych metod w ostatnich dziesięcioleciach na znaczeniu zyskał test cytometryczny. Każda mikrosfera, która jest odczytywana przez urządzenie, reprezentuje zdarzenie analizy zdolności interakcji między badanymi cząsteczkami. Tysiące tych zdarzeń są odczytywane w jednym teście, co zapewnia wysoką dokładność i odtwarzalność testu. Metodologia ta może być również wykorzystywana do walidacji nowych danych wejściowych, takich jak przeciwciała IgY, do diagnozowania chorób. Przeciwciała te uzyskuje się poprzez uodparnianie kurcząt badanym antygenem, a następnie ekstrakcję immunoglobuliny z żółtka jaj zwierząt; Dlatego jest to bezbolesna i wysoce wydajna metoda pozyskiwania przeciwciał. Oprócz metodologii bardzo precyzyjnej walidacji zdolności rozpoznawania przeciwciał w tym teście, w niniejszym artykule przedstawiono również metodę ekstrakcji tych przeciwciał, określenie najlepszych warunków sprzężenia przeciwciał i kulek lateksowych oraz określenie czułości testu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród technik immunologicznych mających na celu diagnozowanie chorób, test cytometryczny z kulkami okazał się bardzo czułym i niezawodnym podejściem, ponieważ pozwala na analizę tysięcy cząstek w jednym teście1. Technika ta, oprócz wysokiej wydajności i możliwości wykorzystania mniejszych objętości próbek, charakteryzuje się również dużą elastycznością, ponieważ pozwala na wykrywanie kilku cząsteczek, takich jak cytokiny, cząsteczki adhezyjne, izotypy przeciwciał i białka2,3.

Do opracowania tych testów wykorzystywane są różne cząstki, wśród nich koraliki lateksowe, które są skutecznym i tanim wkładem. Mogą one wykazywać modyfikacje na swojej powierzchni, takie jak obecność grup funkcyjnych lub białek, które umożliwiają kowalencyjne lub niekowalencyjne sprzężenie niektórych cząsteczek3,4,5.

Te testy immunologiczne wykorzystują komponenty takie jak antygeny i przeciwciała do wykrywania markerów choroby i często wymagają przeciwciał od ssaków, takich jak myszy, króliki i kozy. Stwarza to problemy związane z kwestiami etycznymi, ponieważ immunizacja ssaków na ogół wymaga wielu zwierząt do uzyskania dobrego plonu, a także częstego wykonywania procedur, które prowadzą do cierpienia zwierząt6,7. Alternatywą dla tego jest zastosowanie przeciwciał IgY wyizolowanych z żółtek jaj uodpornionych kurczaków, ponieważ w żółtkach można znaleźć wysokie stężenia specyficznych przeciwciał przeciwko zaszczepionym antygenom; Produkcja kurczaka jest równa produkcji 4,3 królika w ciągu roku6,7.

Zatem celem tego protokołu jest dostarczenie metody oceny przeciwciał IgY uzyskanych z żółtek jaj kurzych za pomocą cytometrii przepływowej z kulkami lateksowymi. W tym celu proponujemy metodę standaryzacji cytometrycznego testu immunologicznego kulek w formacie kanapkowym przy użyciu kulek lateksowych. Jako model wykorzystano przeciwciała IgY skierowane do antygenu białka II bogatego w histydynę Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Opisujemy metodę ekstrakcji przeciwciał, omawiamy krytyczne etapy określania ich stężenia sprzężenia z kulkami lateksowymi oraz przedstawiamy ocenę granicy wykrywalności antygenu. Wysoka dokładność cytometrii przepływowej w połączeniu z niskim kosztem kulek lateksowych sprawia, że technika ta ma zastosowanie do analizy narzędzi do testów immunologicznych, takich jak przeciwciała i antygeny. Ta metoda może być stosowana do wykrywania różnych celów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów używanych w tym protokole.

1. Ekstrakcja IgY z żółtek jaj

  1. Higienizacja jaj
    1. Zanurz jaja (świeżo złożone lub do 4 dni po złożeniu, z linii Gallus gallus Dekalb White) w 0,2% rozcieńczonym roztworze podchlorynu sodu, szybko spłucz pod bieżącą wodą i delikatnie wytrzyj do późniejszego lub natychmiastowego użycia.
      UWAGA: Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 15 dni.
  2. Oddzielenie żółtek
    1. Ostrożnie rozbij jajko i oddziel żółtko od białka za pomocą separatora żółtek.
    2. Usuń nadmiar bieli za pomocą bibuły filtracyjnej. Przekłuj żółtko i zbierz jego wnętrze do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Żółtko należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 24 godziny przed użyciem.
      UWAGA: Podczas tych eksperymentów (dane nie pokazane) zaobserwowano, że stosowanie żółtek, które nie były wcześniej zamrożone, utrudniało izolację immunoglobulin z lipidowej części żółtek.
  3. Zakwaszenie żółtek
    1. Rozmrozić zmagazynowane żółtko i rozcieńczyć je w stosunku 1:10 w 1 mM PBS. Doprowadzić pH roztworu do 5 z 1 N HCl i inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 6-24 godziny.
    2. Odwirować roztwór o stężeniu 3 000 × g przez 40 minut, odzyskać supernatant i przefiltrować go za pomocą filtra celulozowego o średnicy 0,7 mm.
  4. Wytrącanie lipidów kwasem kaprylowym
    1. Ponownie dostosować pH supernatantów do 5 i dodać kwas kaprylowy (≥98% stężenia początkowego) do końcowego stężenia 8,7% przy ciągłym mieszaniu przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Objętość supernatantu może się różnić w zależności od masy lipidów wytrąconej w kroku 1.3.2. Tak więc, na przykład, 3,107 ml kwasu kaprylowego należy dodać do 35 ml supernatantu otrzymanego po filtracji.
    2. Odwirować próbki przez 15 minut przy ciśnieniu 18 600 × g i oddzielić supernatant od wytrąconego materiału.
    3. Ponownie dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą 1 M NaOH, określić ilościowo przeciwciała za pomocą testu Bradforda8 i przechowywać przeciwciała w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      UWAGA: Przeciwciała uzyskano w stężeniu 1 μg/μL, które zweryfikowano za pomocą 12% żelu SDS-PAGE.

2. Krzywa nasycenia przeciwciał IgY przeciwko kulkom lateksowym

  1. Sprzężenie kulek z przeciwciałami IgY
    1. Dodać 21 μl 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC, początkowe stężenie 367 mM) i 21 μl N-hydroksysukcynimidu (NHS, początkowe stężenie 50 mM) do 21 μl kulek lateksowych (4% w/v) i dostosować do końcowej objętości 2,1 ml za pomocą przefiltrowanego 10 mM PBS.
      UWAGA: Zakres pH roztworu PBS powinien wynosić od 7,2 do 7,4, ponieważ w tej pracy zaobserwowano ujemną zmianę sprzężenia i innych etapów przy użyciu roztworu spoza tego zakresu.
    2. Inkubować w temperaturze 22 °C, szybko wstrząsając przez 3 godziny.
    3. Dodać 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg i 0 μg wcześniej wyekstrahowanego przeciwciała wychwytującego IgY-PfHRP2 (patrz krok 1.4.3) do różnych mikroprobówek zawierających 100 μl roztworu opisanego w kroku 2.1.1 (0,04% końcowego stężenia kulek) i inkubować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.1.2 przez 16 godzin.
    4. Odwirować próbki o sile 857 × g w temperaturze 15 °C przez 5 minut, odrzucić supernatanty i dwukrotnie przemyć kulki lateksowe 500 μl przefiltrowanego 10 mM PBS (0,008% końcowego stężenia kulek), stosując cykle wirowania i ponownego zawieszania.
      UWAGA: Nie przekraczaj 857 × g, ponieważ w tej pracy zaobserwowano, że powyżej tej prędkości koraliki ulegają deformacjom, które negatywnie wpływają na wynik testu.
  2. Blokowanie koralików
    1. Zawiesić próbki w 1 ml buforu blokującego (0,004% końcowego stężenia kulek) (przefiltrowany 10 mM PBS + albumina surowicy bydlęcej, BSA, 5%) i inkubować w takich samych warunkach, jak opisano w kroku 2.1.2 przez 2 godziny.
    2. Po zablokowaniu umyj zgodnie z opisem w kroku 2.1.4 i ponownie zawieś w buforze PBS o pojemności 10 mM.
  3. Inkubacja z drugorzędowymi przeciwciałami przeciwko kurczakom znakowanymi Alexa Fluor 488
    1. Dodać 100 μl fluorescencyjnego przeciwciała przeciwko kurczakom (2 mg/ml) rozcieńczonego w stosunku 1:2 000 w 10 mM PBS + 0,5% BSA do każdej mikroprobówki, jak opisano w kroku 2.1.3.
    2. Inkubować próbki zgodnie z opisem w kroku 2.1.2, tym razem w ciemności, przez 30 minut.
    3. Umyć kulki jak w kroku 2.1.4 i ponownie zawiesić z 250 μl (0,016% końcowego stężenia kulek) przefiltrowanego 10 mM PBS. Wykonać odczyt cytometru przepływowego zgodnie z opisem w sekcji 5.
      UWAGA: Na podstawie uzyskanych danych dotyczących procentowej fluorescencji należy obserwować początkowy punkt tworzenia się plateau (1 μg, jak zaobserwowano w tym badaniu). Zalecamy użycie drugiego punktu płaskowyżu (2 μg, jak zaobserwowano tutaj) do kolejnych kroków (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Wykres analizy cytometrii przepływowej w celu określenia punktu nasycenia sprzężenia przeciwciała IgY-Pf HRP2 z kulkami lateksowymi. Oś x reprezentuje stężenie przeciwciał, a oś Y reprezentuje procent uzyskanej fluorescencji. Test Kruskala-Wallisa, p < 0,0033. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Test cytometrii przepływowej oparty na kulkach lateksowych do wykrywania antygenu

  1. Po określeniu punktu nasycenia przeciwciał IgY przeciwko kulkom lateksowym, ponownie przeprowadź proces aktywacji kulek, zgodnie z krokiem 2.1.1.
    1. Sprzęgnij kulki przy obserwowanym stężeniu nasycenia (jak opisano w kroku 2.1.3) i inkubuj zgodnie z krokiem 2.1.2.
      UWAGA: W testach przeprowadzonych z użyciem przeciwciała IgY-PfHRP2 warunek wysycenia wynosił 2 μg na każdy 1 μL kulek lateksowych.
  2. Zablokuj i umyj koraliki zgodnie z krokiem 2.2.
  3. Inkubacja z antygenem
    1. W celu określenia granicy wykrywalności, należy rozprowadzić ekwiwalent 100 μl preparatu z zablokowanych kulek do probówek zawierających różne ilości rekombinowanego białka PfHRP2 (1 μg/ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg i 0 μg) rozcieńczonych w 10 mM PBS + 0,5% BSA w trzech powtórzeniach.
      UWAGA: To rekombinowane białko zostało opracowane w pracy Sousa et al.9.
    2. Inkubować roztwory kulek z białkiem rPfHRP2 zgodnie z opisem w kroku 2.1.2 przez 1 godzinę.
    3. Przeprowadzić płukanie zgodnie z opisem w kroku 2.1.4 i odrzucić supernatant po odwirowaniu.
  4. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
    1. Dodać 2 μg mysiego przeciwciała IgG przeciwko białku rPfHRP2 rozcieńczonego w 10 mM PBS + 0,5% BSA do końcowej objętości 100 μl w każdej próbce. Inkubować próbki w sposób opisany w kroku 2.1.2 i odrzucić supernatant po ostatnim odwirowaniu.
      UWAGA: To przeciwciało zostało opracowane w pracy Sousa et al.9.
  5. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym
    1. Do każdej próbki dodać 100 μl fluorescencyjnego przeciwciała anty-mysiego (2 mg/ml) rozcieńczonego w stosunku 1:2,000 w 10 mM PBS + 0,5% BSA. Inkubować zgodnie z opisem w kroku 2.1.2 i ponownie zawiesić w 250 μl (0,016% końcowe stężenie kulek) przefiltrowanego 10 mM PBS. Wykonaj odczyt zgodnie z rozdziałem 5.

4. Odczyt próbek za pomocą cytometru przepływowego

  1. Ustawienie cytometrii: Wyrównanie parametrów optycznych cytometru sprzężonego z komputerem
    1. Włącz komputer i cytometr przepływowy i poczekaj kilka minut, aż sprzęt połączy się z komputerem.
    2. Kliknij oprogramowanie do cytometrii zainstalowane na komputerze i zaloguj się do niego. Z obszaru roboczego oprogramowania wybierz Cytometr | Uruchomienie | Tryb czyszczenia | SIT płyny.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza i przeszkody należy usunąć podczas procesu inicjacji cytometru przed pobraniem próbki.
  2. Kontrola jakości
    1. Użyj odczynnika do kontroli jakości, aby sprawdzić napięcia lamp fotopowielacza i ocenić czułość cytometru.
    2. Umieść odczynnik do ustawiania cytometru i kulki śledzące w rurki polistyrenowej z nakrętką 12 mm x 75 mm.
    3. Delikatnie wymieszaj probówkę, wirując.
  3. Przygotowanie kulek do zawieszania
    1. Aby określić linię bazową, dodaj 0,5 ml rozcieńczalnika (10 mM przefiltrowany PBS, pH 7) i trzy krople kulek do probówki polistyrenowej z nakrętką 12 mm x 75 mm. Delikatnie przekręć tubkę przed użyciem.
    2. W obszarze roboczym oprogramowania cytometru wybierz pozycję Cytometr | CST i poczekaj, aż cytometr odłączy się od interfejsu oprogramowania cytometru i połączy się z interfejsem CS&T. Zwróć uwagę na następujący komunikat na pasku stanu oprogramowania cytometru u dołu ekranu: Odłączony cytometr.
    3. Użyj rurki polistyrenowej z nasadką 12 mm x 75 mm zawierającej odczynnik do kontroli jakości i podłącz ją do sondy cytometru przepływowego.
  4. Weryfikacja konfiguracji cytometru
    1. W oknie Podsumowanie systemu sprawdź, czy konfiguracja cytometru jest odpowiednia dla eksperymentu.
  5. Konfiguracja do sprawdzenia wydajności
    1. Wybierz identyfikator koralików konfiguracyjnych odpowiadający partii koralików badawczych CS&T.
  6. Kontrola wydajności
    1. Podłącz rurkę do sondy cytometru przepływowego i kliknij okno Setup Control (Kontrola konfiguracji). Wybierz Sprawdź wydajność i kliknij Uruchom.
    2. Po zakończeniu sprawdzania wydajności poczekaj na otwarcie okna dialogowego. Wykonaj jedną z następujących czynności:
      1. Aby wyświetlić raport wydajności cytometru, kliknij Wyświetl raport.
      2. Aby zakończyć sprawdzanie wydajności i powrócić do widoku ustawień obszaru roboczego, kliknij przycisk Zakończ.
      3. Obserwuj końcowy wynik analizy morfometrycznej i wrażliwości fluorescencyjnej, który pojawia się w Podsumowaniu systemu | Wynik działania cytometru ze statusem PASSED.
      4. Wyjmij probówkę z cytometru. Sprawdź wyniki działania cytometru wyświetlane w oknie Podsumowanie systemu.

5. Analiza próbki za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru.
    1. Z obszaru roboczego oprogramowania cytometru wybierz Cytometr | Tryb czyszczenia | Płyny do siedzenia.
    2. Dostosuj się do przestrzeni roboczej oprogramowania.
    3. Zdefiniowanie strategii bramkowania w oparciu o charakterystykę morfometryczną i fluorescencyjną cząstek kontroli ujemnej (kulki bez fluorescencji).
    4. Aby określić morfometrię komórki, wybierz opcję Wykres punktowy do analizy parametrów FSC-A przy użyciu SSC-A (rysunek uzupełniający 1A).
    5. Wyznacz pojedyncze komórki za pomocą SSC za pomocą wykresu kropkowego do analizy SSC-H na osi y i SSC-W na osi x (rysunek uzupełniający 1B) i określ pojedyncze komórki za pomocą FSC za pomocą wykresu kropkowego do analizy FSC-H na osi y i FSC-W na osi x (rysunek uzupełniający 1C).
    6. Do analiz fluorescencyjnych wybierz FL1 Dot Plot Plots przy użyciu FCS-A. Użyj rurki polistyrenowej o wymiarach 12 mm x 75 mm z korkiem, zawierającej nieoznakowane próbki i próbki uprzednio oznaczone jednokolorowym Alexa Fluor 488 (rysunek uzupełniający 1D, E).
  2. Pobrać próbkę w cytometrii przepływowej.
    1. Użyć zakorkowanej rurki polistyrenowej o wymiarach 12 mm x 75 mm, zawierającej uprzednio oznaczone próbki. Ostrożnie wymieszaj zawartość probówki, przymocuj probówkę do sondy cytometru przepływowego i kliknij lewym przyciskiem myszy Pobierz.
    2. Aby ustawić moc laserów, kliknij Parametry, a w poniższych opcjach dostosuj napięcie FSC do 182 V, a napięcie SSC do 236 V. Aby ustawić próg, kliknij Cytometr | Próg, a w poniższych opcjach ustaw FSC na 500 V.
    3. Ustaw bramkę analizy, aby scharakteryzować cząstki według wielkości i złożoności, a także przeprowadzić analizę jednokomórkową.
    4. Aby usunąć autofluorescencję, przeanalizuj bezbarwną próbkę zawierającą tylko kulki lateksowe i wyreguluj napięcia detektora: w poniższych opcjach dostosuj napięcie FL1 (FITC) do 332 V.
    5. Ustaw bramkę analizy fluorescencji w formacie czworokątnym od punktu ujemnego pokazanego na wykresie wykresu kropkowego.
    6. Po dostosowaniu analiz morfometrycznych i fluorescencyjnych skonfiguruj urządzenie na 50 000 zdarzeń: w sekcji Akwizycja kliknij Nagraj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 przedstawia graficzne przedstawienie procesu ekstrakcji przeciwciał IgY poprzez zakwaszenie, a następnie separację za pomocą kwasu kaprylowego (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie etapu ekstrakcji przeciwciał IgY i separacji za pomocą kwasu kaprylo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda wytrącania przeciwciała IgY poprzez obniżenie pH, a następnie separację lipidów za pomocą kwasu kaprylowego jest skuteczna w izolowaniu całkowitych przeciwciał bez utraty funkcjonalności. Zaproponowana tutaj metoda jest prostsza i tańsza niż ta opisana przez Redwan i wsp.11, którzy również stosowali wytrącanie przez zakwaszenie i kwas kaprylowy, ale z bardziej złożonym i pracochłonnym protokołem. Metoda ta ma również przewagę nad powszechnie stosowanymi metodologiami izolacji IgY z żółtek j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i publikacji tego artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), podyplomowemu programowi studiów biotechnologicznych (PPGBIOTEC na Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) oraz Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) za przyznanie stypendiów. Rysunki 2 i 4 zostały utworzone za pomocą biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-Chicken IgY (H+L), silnie adsorbowany krzyżowo, CF  Przeciwciało 488A wytwarzane w osiołkuSigma-AldrichSAB4600031
Anty-mysie IgG (H+L), F(ab′)2Sigma-AldrichSAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS& Koraliki badawcze T (CS& Koraliki badawcze T)BD Biosciences655050
BD FACSDiva oprogramowanie 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad Test białkowy Koncentrat odczynnikaBio-Rad#5000006
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503
Kwas kaprylowySigma-AldrichO3907
Wirówka 5702 REppendorfZ606936
Chlorek 37% kwasowy klasy cząsteczkowejNEON02618 NEON
CML lateks, 4% w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimid w proszku (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-hydroksysukcynimid (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-Aldrich1003335620
Wodorotlenek soduAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
Podchloryn soduAcs CientificaR09211000
Thermo Mixer Heat/CoolKASVIK80-120R
barwnikowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeciwcia a IgYcytometria przep ywowakulki lateksowestandaryzacja immunoanalizyekstrakcja przeciwciakanapkowa immunoanalizaanaliza fluorescencjitesty diagnostyczne

Powiązane artykuły