Artykuł metodologiczny

Oligonukleotydy antysensowne jako narzędzie do przedłużonego knockdown jądrowych lncRNA w ludzkich liniach komórkowych

DOI:

10.3791/65124

⸱

1 września 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przeanalizować funkcję lncRNA w procesach zależnych od czasu, takich jak niestabilność chromosomów, musi zostać osiągnięty przedłużony efekt knockdown. W tym celu przedstawiono tutaj protokół, który wykorzystuje zmodyfikowane oligonukleotydy antysensowne, aby osiągnąć skuteczny knockdown w liniach komórkowych przez 21 dni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długie niekodujące RNA (lncRNA) odgrywają kluczową rolę regulacyjną w ekspresji genów na poziomie transkrypcji. Dowody eksperymentalne wykazały, że znaczna frakcja lncRNA preferencyjnie gromadzi się w jądrze. Do analizy funkcji jądrowych lncRNA ważne jest osiągnięcie skutecznego knockdown tych transkryptów wewnątrz jądra. W przeciwieństwie do zastosowania interferencji RNA, technologii, która zależy od cytoplazmatycznej maszynerii wyciszającej, technologia oligonukleotydów antysensownych (ASO) może osiągnąć knockdown RNA poprzez rekrutację RNazy H do dupleksów RNA-DNA w celu rozszczepienia jądrowego RNA. W przeciwieństwie do stosowania narzędzi CRISPR-Cas do inżynierii genomu, gdzie mogą wystąpić możliwe zmiany w stanie chromatyny, ASO pozwalają na skuteczne eliminację transkryptów jądrowych bez modyfikacji genomu. Niemniej jednak jedną z głównych przeszkód dla knockdownu, w którym pośredniczy ASO, jest jego przejściowy efekt. Do badania długotrwałych efektów wyciszania lncRNA potrzebne jest utrzymanie skutecznego knockdown przez długi czas. W tym badaniu opracowano protokół mający na celu osiągnięcie efektu nokautu przez ponad 21 dni. Celem była ocena wpływu knockdownu lncRNA na sąsiedni gen kodujący RFC4, który jest związany z niestabilnością chromosomalną, stanem, który obserwuje się tylko poprzez upływ czasu i starzenie się komórek. Użyto dwóch różnych ludzkich linii komórkowych: PrEC, normalnych pierwotnych komórek nabłonka prostaty i HCT116, linii komórek nabłonkowych wyizolowanej z raka jelita grubego, osiągając skuteczne knockdown w badanych liniach komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdecydowana większość ludzkiego genomu jest transkrybowana, co daje początek szerokiej gamie transkryptów, w tym lncRNA, których liczba przekracza liczbę adnotowanych genów kodujących w ludzkim transkryptomie1. LncRNA to transkrypty dłuższe niż 200 nukleotydów, które nie kodują białek2,3 i zostały niedawno przebadane pod kątem ich ważnych funkcji regulacyjnych w komórce4. Wykazano, że ich funkcje są zależne od ich subkomórkowej lokalizacji5, takich jak jądro, w którym gromadzi się znaczna część lncRNA i aktywnie uczestniczy w regulacji transkrypcji6 oraz dla konserwacji architektury jądrowej7, wśród innych procesów biologicznych8,9,10.

Do funkcjonalnej charakterystyki jądrowych lncRNA, muszą być używane metody zdolne do wywołania knockdownu (KD) w jądrze, a ASO są potężnym narzędziem do wyciszania transkrypcji jądrowych. Ogólnie rzecz biorąc, ASO to jednoniciowe sekwencje DNA o długości ~20 par zasad, które wiążą się z komplementarnym RNA przez parowanie zasad Watsona-Cricka11,12,13 i mogą modyfikować funkcję RNA poprzez mechanizmy zależne od ich struktury chemicznej i modyfikacji13,14. Modyfikacje chemiczne ASO można podzielić na 2 główne grupy: modyfikacje szkieletu i modyfikacje pierścienia cukrowego 2'15, z których obie mają na celu zwiększenie stabilności poprzez nadanie wysokiej odporności nukleazom, ale także wzmocnienie zamierzonego efektu biologicznego13,16. Wśród modyfikacji szkieletu, morfolino fosforoamidate (PMO), tiofosforamidan i wiązania morfolino są szeroko stosowane do celów takich jak interferencja w splicingu17,18, służąc jako środki blokujące sterykę19, ale nie do wywoływania degradacji transkryptu. Inną modyfikacją szkieletu jest wiązanie fosforotionianowe (PS), jedna z najczęściej stosowanych modyfikacji w ASO. W przeciwieństwie do wcześniej wymienionych modyfikacji, wiązania PS nie zakłócają rekrutacji RNazy H12,20, umożliwiając w ten sposób knockdown RNA. Istnieje jednak również szeroka gama modyfikacji pierścienia cukrowego 2'21; niemniej jednak, w celu knockdownu RNA, wśród modyfikacji, które wywołują skuteczne efekty wyciszające, są zablokowane kwasy nukleinowe (LNA)22, 23 i modyfikacja 2'-O-metylu24. Mimo że LNA okazały się bardzo skuteczne w knockdown w porównaniu z innymi modyfikacjami25, mogą wywoływać niepożądane efekty, takie jak hepatotoksyczność26 i indukcja apoptozy in vivo i in vitro27.

W celu knockdownu RNA, ASO z odpowiednimi modyfikacjami wspomnianymi wcześniej mogą rekrutować RNazy H1 i H220,28, a te enzymy są rekrutowane do hybryd DNA-RNA i rozszczepiają docelowe RNA, uwalniając ASO13. Produkty RNA tego rozszczepienia są następnie przetwarzane przez maszynerię nadzoru RNA, co powoduje degradację RNA29 bez modyfikacji interesującego regionu genomu, w przeciwieństwie do innych technik, takich jak systemy CRISPR-Cas, gdzie modyfikacje stanu chromatyny mogą powodować niepożądane efekty biologiczne30. Pomimo zalet technologii ASO, tymczasowe efekty wyciszenia spowodowane podziałem komórki lub degradacją ASO w czasie są przeszkodą do pokonania podczas badania procesów zależnych od czasu, takich jak niestabilność chromosomów (CIN)31.

W szczególności, CIN jest definiowany jako zwiększona szybkość zmian w liczbie chromosomów i strukturze w porównaniu do zmian w normalnych komórkach32 i wynika z błędów w segregacji chromosomów podczas mitozy, prowadząc do zmian genetycznych, które z czasem powodują niejednorodność wewnątrz guza33. W związku z tym CIN nie może być oceniany tylko poprzez znalezienie kariotypu aneuploidalnego. Dla prawidłowego badania i oceny CIN w hodowli komórkowej ważne jest monitorowanie komórek w czasie. Do badania wpływu lncRNA KD na CIN potrzebna jest metodologia, która pozwala na przedłużony efekt KD. W tym celu w tym protokole zastosowano ASO, w którym lncRNA-RFC4 został skutecznie wyciszony w ludzkich liniach komórkowych HCT115 i PrEC odpowiednio przez 18 i 21 dni. Ten transkrypt jest niescharakteryzowanym lncRNA o długości 1,2 kb, a jego genomowa lokalizacja znajduje się na chromosomie 3 (q27.3). Sąsiaduje z genem kodującym białko RFC4, genem związanym z CIN w różnych typach nowotworów u ludzi34,35,36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony tylko dla personelu laboratoryjnego z doświadczeniem w procedurach bezpieczeństwa w laboratorium. Konieczne jest prawidłowe przeczytanie kart charakterystyki wszystkich odczynników i materiałów użytych w tym protokole przed rozpoczęciem pracy z materiałami i sprzętem niebezpiecznym. Niezbędne jest przeczytanie, zrozumienie i spełnienie wszystkich wymagań bezpieczeństwa wskazanych w podręczniku bezpieczeństwa laboratorium Twojej instytucji wraz z całym protokołem. Utylizacja wszystkich odpadów biologicznych i chemicznych musi odbywać się zgodnie z instrukcją gospodarki odpadami i ich unieszkodliwiania. Jeśli nie obchodzi się z nimi ostrożnie i zgodnie z bezpiecznymi praktykami laboratoryjnymi, materiały i sprzęt używany w tym protokole mogą spowodować poważne obrażenia. Zawsze postępuj zgodnie z instrukcją laboratorium bezpieczeństwa instytucji i procedurami bezpieczeństwa.

1. Projektowanie ASO

  1. Ręcznie zaprojektuj ASO zgodnie z poniższym opisem.
    1. Uzyskaj pełną sekwencję docelowego transkryptu i przeanalizuj ją na serwerze internetowym RNAfold, Uniwersytet Wiedeński37 (Tabela materiałów), używając domyślnych parametrów na stronie internetowej, aby uzyskać strukturę drugorzędową o minimalnej energii swobodnej (MFE).
    2. Gdy wyniki będą gotowe, przejdź do rysunku zwykłej struktury MFE i kliknij Wyświetl w Forna, aby otworzyć drugorzędną strukturę MFE na stronie internetowej, a oprogramowanie pokaże przewidywaną strukturę drugorzędową analizowanej transkrypcji.
    3. Z przewidywanej struktury drugorzędowej MFE wybierz region o długości 20 pz w RNA, unikając strun G (sekwencji 3 guaniny w rzędzie) podczas projektowania oligonukleotydów. Aby wybrać najlepszy region docelowy dla ASO, użyj regionów, co do których przewiduje się, że będą miały mniejsze prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad (Rysunek 1).
    4. Z wybranego obszaru 20 pz utwórz sekwencję odwrotnego dopełnienia. Ręcznie utwórz odwrotne uzupełnienie lub skorzystaj z narzędzia online do odwrotnego uzupełnienia (tabela materiałów). Odwrotna sekwencja dopełniacza będzie ASO, która musi zostać zsyntetyzowana na potrzeby eksperymentu.
    5. Przeanalizuj sekwencję ASO za pomocą Nucleotide Blast NCBI (blastn) i UCSC Genome Browser na człowieku (GRCh38/hg38). Upewnij się, że ASO nie wykazują homologii do innych transkryptów lub innych regionów genomu w ludzkim genomie.
      UWAGA: Synteza i oczyszczanie ASO zostały przeprowadzone przez firmę handlową (Tabela Materiałów).
  2. Upewnij się, że zsyntetyzowane oligonukleotydy mają następujące cechy.
    1. Upewnij się, że wiązania PS występują wzdłuż całej sekwencji oligonukleotydu38 (Rysunek 2A). Upewnij się, że ASO są chimeryczne, z 5 nukleotydami flankującymi końce 5' i 3' z pierścieniami cukrowymi zmodyfikowanymi 2'-O-metylem (Rysunek 2B).
    2. Upewnij się, że 10 nukleotydów w środku ma niezmodyfikowany pierścień cukrowy, który wspiera wiązanie RNazy H (Rysunek 2C).
    3. Poproś firmę o przeprowadzenie oczyszczania przy użyciu standardowego odsalania i odwróconej fazy (RP) HPLC39.
    4. Zamów dostawę ASO w formie liofilizowanej.
  3. Rozpuścić liofilizowane ASO w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco bez wapnia i magnezu do końcowego stężenia 200 μM. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować roztwór roboczy ASO, rozcieńczając skoncentrowany materiał podstawowy do stężenia 20 μM. Przygotować rozcieńczenie przy użyciu DPBS. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Na potrzeby tego badania zaprojektowano dwa ASO ukierunkowane na lncRNA-RFC4. W celu optymalizacji stężenia ASO pod kątem transfekcji i wydajności zastosowano protokół Zonga i wsp.40. Dwa ASO zostały zaprojektowane i eksperymentalnie zoptymalizowane zgodnie z protokołem Zonga: ASO-lncRFC4 i ASO-lncRFC4-2. Po optymalizacji wybrano jeden skuteczny ASO ukierunkowany na lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, do protokołu przedłużonego knockdown (rysunek uzupełniający 1). Jako kontrolę pozytywną użyto wcześniej potwierdzonego skutecznego ASO ukierunkowanego na lncRNA MALAT18: ASO-MALAT1. Do celów kontroli ujemnej zaprojektowano ASO ukierunkowany na gen Escherichia coli lacZ, ASO-LACZ (numer dostępu do NCBI: FN297865).

2. Przygotowanie komórek

UWAGA: Pracuj wewnątrz kaptura do hodowli komórkowej za każdym razem, gdy obsługiwane są linie komórkowe, roztwory, materiał lub jakikolwiek produkt, który ma być użyty podczas manipulacji kulturą komórkową. Podczas manipulowania płynami do hodowli komórkowych należy zawsze używać wysterylizowanych pipet serologicznych lub mikropipet ze sterylizowanymi końcówkami. Zawsze spełniaj i przestrzegaj wszystkich wymogów bezpieczeństwa wskazanych w instrukcji bezpieczeństwa laboratorium instytucji podczas całego protokołu.

  1. Przygotuj kompletną pożywkę do hodowli komórkowych dla każdej linii komórkowej, jak opisano poniżej.
    1. W przypadku HCT116 przygotuj pożywkę McCoy's 5A z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    2. W przypadku PrEC należy przygotować podłoże bazowe dla komórek nabłonka prostaty za pomocą zestawu do wzrostu komórek nabłonka prostaty.
  2. Do doświadczeń KD należy użyć trzech płytek hodowlanych o średnicy 100 mm (55cm2 powierzchni), po jednej dla każdego oligonukleotydu: ASO ukierunkowanego na lncRNA, ASO do użycia jako kontrola pozytywna (ASO-MALAT1) i ASO do użycia jako kontrola ujemna (ASO-lacZ).
  3. Użyj dwóch płytek hodowlanych o średnicy 35 mm (9 cm2 powierzchni), które będą używane jako punkty kontrolne dla KD między przejściami komórkowymi, z których jedna zostanie transfekowana kompletnymi pożywkami transfekcyjnymi dla ASO-lncRFC4, a druga dla ASO-lacZ.
    UWAGA: Transfekcja została zaplanowana zgodnie z procedurami i protokołami producenta odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz tabela materiałów), które zostały wcześniej zgłoszone41,42.
  4. Komórki nasienne do gęstości 1 x 104 komórki/cm2 w szalkach do hodowli komórkowych. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze, używając 5% CO2 w powietrzu, aż komórki osiągną 50% zbiegu (gdy 50% powierzchni jest pokryte monowarstwą komórki). Przy konfluencji 50% komórki są gotowe do transfekcji dla tego protokołu.
    UWAGA: Do transfekcji ASO-lncRFC4 i ASO-lacZ wysiewano jedną szalkę 100 mm i jedną szalkę 35 mm. Do transfekcji ASO-MALAT1 wysiano tylko szalkę o średnicy 100 mm (Rysunek 3A).

3. Transfekcja

  1. Przed rozpoczęciem zabiegu rozgrzać zredukowaną pożywkę surowicy do temperatury 37 °C.
  2. W przypadku transfekcji za pomocą ASO-lacZ i ASO-lncRFC4 postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    UWAGA: Transfekcja z ASO-lacZ i ASO-lncRFC4 jest planowana dla komórek o powierzchni 55 cm2; Gdy używane są różne obszary, głośność można odpowiednio dostosować. Procedurę tę należy przeprowadzić dla każdego używanego ASO w tych samych warunkach.
    1. Przygotować probówkę 1 w kapturze do hodowli komórkowych, rozpuszczając 43,75 μl ASO (20 μM) w 1,4 ml ciepłej zredukowanej pożywki surowicy w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Przygotować probówkę 2 wewnątrz kaptura do hodowli komórkowych, mieszając 18,66 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów z 1,4 ml ciepłej pożywki z zredukowaną surowicą w 1,5 ml probówce do mikrofugi bez RNaz.
    3. Inkubować probówki 1 i 2 w okapie do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    4. Roztwór zawarty w probówce 2 (odczynnik do transfekcji + zredukowana surowica) dodawać bezpośrednio do probówki 1 (ASO + zredukowana surowica) powoli, kropla po kropli, aby uniknąć rozprowadzania odczynników po powierzchni probówki.
    5. Mieszaninę zawartą w probówce 1 inkubować przez 20 minut w okapie hodowlanym w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj ciepłą zredukowaną pożywkę surowicy do probówki 1 do końcowej objętości 8,75 ml.
      UWAGA: Końcowe podłoże transfekcyjne zawierało ASO w stężeniu 100 nM.
    7. Usunąć pożywkę hodowlaną z naczynia do hodowli komórkowej zawierającej komórki, które mają być transfekowane, i dodać 7,5 ml pożywki do transfekcji na płytkę hodowlaną o średnicy 100 mm i 1 ml do płytki hodowlanej o średnicy 35 mm bezpośrednio w monowarstwie komórki, kropla po kropli. Upewnij się, że podłoże jest równomiernie rozprowadzone na całej powierzchni poprzez delikatne potrząśnięcie naczyniem.
    8. Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w powietrzu przez 6 godzin.
    9. Po 6 godzinach inkubacji w pożywce do transfekcji dodać 7,5 ml kompletnej pożywki do komórek na płytce hodowlanej o średnicy 100 mm i 1 ml kompletnej pożywki do komórek na pożywce 35 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. W celu transfekcji za pomocą ASO-MALAT1 należy przeprowadzić eksperymenty opisane poniżej.
    UWAGA: Transfekcja za pomocą ASO-MALAT1 jest planowana dla komórek o powierzchni 55 cm2.
    1. Przygotować probówkę 1 wewnątrz okapu do hodowli komórkowych, rozpuszczając 37,5 μl ASO (20 μM) w 1,2 ml ciepłej zredukowanej pożywki surowicy w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Przygotować probówkę 2, mieszając 16 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów z 1,2 ml ciepłej zredukowanej pożywki surowicy.
    3. Inkubować probówki 1 i 2 w temperaturze pokojowej przez 10 minut w kapturze do hodowli komórkowych.
    4. Roztwór zawarty w probówce 2 (odczynnik do transfekcji na bazie lipidów + zredukowana surowica) dodawać bezpośrednio do probówki 1 (ASO + zredukowana surowica) powoli, kropla po kropli, aby uniknąć rozprowadzania odczynników po powierzchni probówki.
    5. Mieszaninę zawartą w probówce 1 inkubować przez 20 minut w okapie hodowlanym w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj ciepłą zredukowaną pożywkę surowicy do probówki 1 do końcowej objętości 7,5 ml. Końcowe podłoże transfekcyjne zawierało ASO w stężeniu 100 nM.
    7. Usunąć pożywkę hodowlaną z naczynia do hodowli komórkowej zawierającej komórki, które mają być transfekowane, i dodać kroplami 7,5 ml pożywki do transfekcji bezpośrednio do monowarstwy komórek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie pożywki na całej powierzchni poprzez delikatne potrząsanie szalką.
    8. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze, używając 5% CO2 w powietrzu przez 6 godzin.
    9. Po 6 godzinach inkubacji z pożywką do transfekcji dodać 7,5 ml kompletnej pożywki do komórek i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Oceniaj komórki pod mikroskopem co 12-24 godziny, aż komórki będą gotowe do następnej rundy transfekcji.
    UWAGA: Następnie należy wykonać transfekcję, gdy komórki osiągną konfluencję 70%. W razie potrzeby wymienić pożywkę, zastępując ją kompletną pożywką hodowlaną.
  5. Gdy komórki zlewają się w 70% z naczyniem do hodowli komórkowej, powtórz procedurę (kroki od 3.1 do 3.4) i wykonaj następną rundę transfekcji.
    UWAGA: Po drugiej transfekcji komórki należy oceniać pod mikroskopem co 12-24 godziny. Pobieranie i pasażowanie komórek należy przeprowadzić, gdy komórki osiągną konfluencję 80%-85%. W razie potrzeby wymienić pożywkę, zastępując ją kompletną pożywką hodowlaną.

4. Zbieranie i przechodzenie komórek

UWAGA: Pobieranie komórek i pasażowanie odbywa się po każdych 2 rundach transfekcji i po2, 4 i 6 rundzie transfekcji. Średni czas pobierania w komórkach HCT116 wynosił 6 dni po1., 3. i 5. transfekcji, a w przypadku komórek PrEC średni czas wynosił 7 dni po 1., 3. i 5. transfekcji. Punkt czasowy transfekcji różni się dla obu linii komórkowych używanych w tym protokole. W przypadku HCT116 2., 3.,4., 5. i 6. transfekcja jest wykonywana odpowiednio 3, 6, 9, 12 i 15 dni po pierwszej transfekcji. W przypadku PrEC 2, 3, 4, 5 i 6 transfekcja jest wykonywana odpowiednio 3, 7, 10, 14 i 18 dni po pierwszej transfekcji. Zapoznaj się z osią czasu w Rysunek 3, aby sprawdzić punkty czasowe transfekcji, przejścia i zbioru.

  1. Przeprowadzić pobieranie i pasażowanie komórek do eksperymentów KD na 100 mm płytkach hodowlanych, jak opisano poniżej.
    1. Przystąp do zbierania komórek i pasażu, gdy komórki osiągną konfluencję 80%-85%.
    2. Podgrzać całe podłoże i przemyć roztwory do temperatury 37 °C. Podgrzać odczynnik dysocjacyjny do temperatury pokojowej. Podgrzej roztwór neutralizujący odczynnik dysocjacyjny do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Roztwory myjące, odczynniki dysocjacyjne i roztwory neutralizujące różnią się dla dwóch linii komórkowych stosowanych w tym protokole. Komórki HCT116 przemywa się PBS (sól fizjologiczną buforowaną fosforanem) i dysocjuje roztworem trypsyny-EDTA. Neutralizację odczynnika dysocjacyjnego przeprowadza się za pomocą kompletnych pożywek hodowlanych dla komórek HCT116. W przypadku PrEC jako roztwór myjący stosuje się roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPES. Trypsyna-EDTA jest używana jako odczynnik dysocjacyjny. Do neutralizacji odczynnika dysocjacyjnego należy użyć roztworu neutralizującego trypsynę.
    3. Wewnątrz okapu hodowlanego wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia do hodowli komórkowych i delikatnie przemyj 3 ml roztworu myjącego, a następnie wyrzuć roztwór myjący. Powtórz ten krok 2 razy.
    4. Dodać 2 ml odczynnika dysocjacyjnego zgodnie z linią komórkową do monowarstwy komórki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Oceniać komórki co 2 minuty, aż do zakończenia dysocjacji.
    5. Dodać 2 ml roztworu neutralizującego zgodnie z linią komórkową i przenieść całą objętość zawiesiny komórkowej z naczynia do hodowli komórkowej do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    6. W celu ekstrakcji RNA należy pobrać 500 μl zawiesiny komórek i przenieść ją do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę na lodzie i przejdź do kroku 5.1 w celu ekstrakcji RNA i RT-qPCR.
    7. Odwirować pozostałą część zawiesiny komórkowej o sile 120 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    8. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej i przystąpić do liczenia komórek zgodnie ze standardowymi procedurami.
    9. W przypadku kariotypowania, komórki nasienne do gęstości 1 x 104 komórki/cm2 w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm (powierzchnia 9cm2), inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w powietrzu przez 24 godziny i przystąpić do kariotypowania zgodnie ze standardowymi procedurami.
    10. Aby kontynuować eksperymenty KD w następnym pasażu komórkowym, nasić komórki do gęstości 1 x 104 komórki/cm2 w nowym naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm. To danie będzie pasażem numer 2 dla eksperymentu. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze, używając 5% CO2 w powietrzu, aż komórki osiągną konfluencję 50%.
      UWAGA: W razie potrzeby pozostałe komórki można wykorzystać do ekstrakcji i/lub zamrożenia białka zgodnie ze standardowymi procedurami.
    11. Powtórzyć kroki 3.1-4.1.10 dla transfekcji i zbioru z przejścia 2 i z przejścia 3.
  2. Postępuj zgodnie z następną procedurą pobierania komórek dla punktów kontrolnych eksperymentów KD w 35-milimetrowych szalkach hodowlanych.
    UWAGA: Zbiór dla pierwszego punktu kontrolnego w eksperymencie KD odbywa się 2 dni po2 i 4 procedurze transfekcji.
    1. Podgrzać całe podłoże i roztwory myjące do temperatury 37 °C. Podgrzać odczynnik dysocjacyjny do temperatury pokojowej. Podgrzej roztwór neutralizujący odczynnik dysocjacyjny do temperatury pokojowej.
    2. Wewnątrz okapu hodowlanego wyjmij pożywkę hodowlaną z naczynia do hodowli komórkowych i delikatnie przemyj 0,5 ml roztworu myjącego, a następnie wyrzuć roztwór myjący. Powtórz ten krok 2 razy.
    3. Po odrzuceniu roztworów myjących dodać 0,5 ml odczynnika dysocjacyjnego zgodnie z linią komórkową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Oceniać komórki co 2 minuty, aż do zakończenia dysocjacji.
    4. Dodać 0,5 ml roztworu neutralizującego zgodnie z linią komórkową i przenieść całą objętość zawiesiny komórkowej z naczynia do hodowli komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić ją na lodzie.
    5. Przejdź do kroku 5.1 dla ekstrakcji RNA i qPCR.

5. Ekstrakcja RNA i RT-PCR

  1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyć osad komórkowy 600 μl zimnego PBS (4 °C).
  2. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    Użyj osadu komórkowego do ekstrakcji RNA zgodnie ze standardowymi procedurami.
  3. Przystąpić do obróbki oczyszczonego RNA za pomocą DNazy zgodnie ze standardową procedurą stosowaną w laboratorium. W punkcie pauzy należy przechowywać oczyszczony RNA w temperaturze -80 °C przez długi czas.
  4. Użyj RNA do standardowej syntezy cDNA z każdą uzyskaną próbką RNA. W punkcie pauzy przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C przez długi czas.
  5. Wykonaj standardowy qPCR zgodnie z krokami opisanymi poniżej.
    1. W przypadku qPCR oligonukleotydy amplifikują następujące transkrypty: lncRNA będącego przedmiotem zainteresowania, MALAT1 i konstytutywnie wyrażony gen jako kontrola wewnętrzna (Tabela 1). W przypadku tego protokołu wyrażenie RPS28 zostało użyte jako kontrola wewnętrzna.
    2. Przeprowadzić reakcje qPCR w celu amplifikacji kontroli wewnętrznej, lncRNA będącego przedmiotem zainteresowania i MALAT1 przy użyciu cDNA z próbki ASO-LacZ. Ten przykład zostanie użyty do znormalizowania wyrażenia z innych próbek.
    3. Przeprowadzić reakcje qPCR w celu amplifikacji kontrolnego RPS28 i lncRNA będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu cDNA z próbki ASO-lncRNA.
    4. Przeprowadzić reakcje qPCR w celu amplifikacji kontroli wewnętrznych RPS28 i MALAT1 przy użyciu cDNA z próbki ASO-MALAT1. Postępuj zgodnie z ustawieniami reakcji i warunkami termocyklera zgodnie z opisem w Tabeli 2.
    5. Przeanalizuj dane qPCR przez normalizację ΔΔCt ekspresji transkryptu zainteresowania w stosunku do kontroli wewnętrznej, a następnie znormalizuj ekspresję transkryptu będącego przedmiotem zainteresowania (lncRNA lub MALAT1) w stosunku do ekspresji tego samego transkryptu w próbce ASO-LacZ, aby uzyskać względny poziom ekspresji transkryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole, użycie ASO zostało dostosowane do KD jądrowego lncRNA przez dłuższy czas w ludzkich liniach komórkowych PrEC i HCT116.

Z pewnością, eksperyment KD zakończył się sukcesem na linii komórkowej PrEC przez 21 dni eksperymentu, jak zaobserwowano w Rysunek 4. Aby potwierdzić to stwierdzenie, oprócz analizy ekspresji w dniach przechodzenia komórek (Rysunek 4 A-C), przeanalizowaliśmy punkty kontrolne ustanowione mię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wcześniej wspomniano, lncRNA pełnią kluczowe funkcje regulacyjne w komórce; W związku z tym rozregulowanie tych transkryptów może być zaangażowane w choroby. Rak jest jedną z takich chorób charakteryzujących się dysregulacją lncRNA43,44. W tej chorobie wiadomo, że lncRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną jako onkogeny45 lub supresory guza46. Niektóre z nich biorą udział w rozwoju cech charakterystycznych raka i m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manriquez, Rogelio jest doktorantem w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i otrzymał stypendium CONACyT z numerem CVU CONACyT: 581151.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 15 ml - Probówki stożkowe 15 mlThermo Fisher Scientific339650
Naczynie hodowlane Corning 100 mm z powłoką TCCorning 430167Powierzchnia: 55 cm2
Naczynie hodowlane Corning 35 mm z powłoką TCCorning 430165Powierzchnia: 9 cm2
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14190144
Płodowa surowica bydlęca (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 linia komórkowaATCCCCL-247
HEPES, roztwór buforowy 1MThermo Fisher Scientific15630122
Zintegrowane technologie DNA NANAhttps://www.idtdna.com/
Odczynnik RNAiMAX LipofectamineThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normalne ludzkie pierwotne komórki nabłonka prostaty (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Blast nukleotydowy NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Zredukowane podłoże w surowicyThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7,4Thermo Fisher Scientific
Nabłonek nabłonka prostaty Podłoże podstawneATCCPCS-440-030
Zestaw do wzrostu komórek nabłonka prostatyATCCPCS-440-040
Narzędzie online do odwróconego dopełniaczaNANA https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANANA http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
probówki do mikrofuge bez RNaz, 1,5 mlThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific12604013Roztwór trypsyny-EDTA
Roztwór neutralizujący trypsynęATCCPCS-999-004
Trypsyna-EDTA dla komórek pierwotnychATCC PCS-999-003
Przeglądarka genomu UCSC, ludzka (GRCh38/hg38)NAhttps://genome.ucsc.edu/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832(2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119(2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501(2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377(2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693(2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019(2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , Humana Press. New York. (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56(2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608(2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9(2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nuclear lncRNA KnockdownLong Noncoding RNAsRNase H RecruitmentProlonged RNA KnockdownCis Regulatory EffectsChromosomal InstabilityPrEC CellsHCT116 Cells
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły