Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Summary

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Abstract

Genetycznie modyfikowane modele myszy (G-GEMMs) linii zarodkowej dostarczyły cennych informacji na temat funkcji genów in vivo w rozwoju, homeostazie i chorobie. Jednak czas i koszty związane z tworzeniem i utrzymaniem kolonii są wysokie. Ostatnie postępy w edycji genomu za pośrednictwem CRISPR umożliwiły generowanie somatycznych GEMM (S-GEMM) poprzez bezpośrednie ukierunkowanie na komórkę/tkankę/narząd będący przedmiotem zainteresowania.

Jajowód, czyli jajowód u ludzi, jest uważany za tkankę pochodzenia najczęstszego raka jajnika, surowiczego raka jajnika wysokiego stopnia (HGSC). HGSC inicjują się w okolicy jajowodu dystalnie do macicy, położonej w sąsiedztwie jajnika, ale nie w bliższym jajowodzie. Jednak tradycyjne mysie modele HGSC są ukierunkowane na cały jajowód, a zatem nie podsumowują kondycji ludzkiej. Przedstawiamy metodę mikroiniekcji roztworu DNA, RNA lub rybonukleoproteiny (RNP) do światła jajowodu oraz elektroporacji in vivo w celu ukierunkowania komórek nabłonka błony śluzowej w ograniczonych obszarach wzdłuż jajowodu. Istnieje kilka zalet tej metody do modelowania raka, takich jak: 1) wysoka zdolność adaptacji w celowaniu w obszar/tkankę/narząd i region elektroporacji, 2) wysoka elastyczność w docelowych typach komórek (giętkość komórkowa) w połączeniu ze specyficznymi promotorami ekspresji Cas9, 3) wysoka elastyczność w liczbie elektroporowanych komórek (stosunkowo niska częstotliwość), 4) nie jest wymagana specyficzna linia myszy (immunokompetentne modelowanie choroby), 5) wysoka elastyczność w kombinacji mutacji genowych oraz 6) możliwość śledzenia komórek elektroporowanych w połączeniu z linią reporterową Cre. W ten sposób ta opłacalna metoda podsumowuje inicjację raka u ludzi.

Introduction

Jajowód, zwany jajowodem u myszy, jest rurkowatą strukturą, która łączy macicę z jajnikiem. Odgrywa istotną rolę w rozrodzie ssaków, zapewniając środowisko do wewnętrznego zapłodnienia i rozwoju preimplantacyjnego^1,2. Pomimo jego znaczenia, niewiele wiadomo o jego funkcji i homeostazie, częściowo ze względu na rozwój technik zapłodnienia in vitro, które omijają wszelkie problemy związane z niepłodnością związaną z tym narządem³. Stwierdzono jednak, że zmiany przedrakowe surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSC), agresywnego histotypu raka jajnika, który odpowiada za około 75% przypadków raka jajnika i 85% powiązanych zgonów⁴, są ograniczone do dystalnego nabłonka jajowodu5^,6,7,8. Oznacza to, że nie wszystkie komórki w naszym ciele są jednakowo podatne na onkogenne zniewagi, ale raczej tylko unikalne/podatne komórki w każdej tkance/narządzie stają się komórką pochodzenia raka - określaną jako elastyczność komórkowa⁹. W związku z tym wykazano, że komórki nabłonkowe dystalnego jajowodu, znajdujące się w sąsiedztwie jajnika, różnią się od reszty jajowodu^10,11. Tak więc tradycyjne mysie modele HGSC, które celują we wszystkie komórki w jajowodzie, nie podsumowują kondycji ludzkiej. W niedawnym badaniu zastosowaliśmy kombinację edycji genomu za pośrednictwem CRISPR, elektroporacji jajowodu in vivo i śledzenia linii opartej na Cre, aby skutecznie indukować HGSC poprzez mutację czterech genów supresorowych guza w dystalnym jajowcu myszy ^12,13. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół krok po kroku opisujący procedurę mikroiniekcji i elektroporacji in vivo w celu ukierunkowania nabłonka błony śluzowej jajowodu myszy.

Ta metoda ma kilka zalet. Można go dostosować do innych tkanek/narządów, w tym miąższu narządu¹⁴. Chociaż inne metody dostarczania genów in vivo, takie jak systemy lentiwirusowe i adenowirusowe, mogą być stosowane w celu osiągnięcia podobnego ukierunkowania specyficznego dla tkanki/narządu, obszar celowania jest łatwiejszy do dostosowania przy użyciu różnych rozmiarów elektrod typu pęseta do dostarczania opartego na elektroporacji. W zależności od stężenia DNA/RNA/rybonukleoprotein (RNP), parametrów elektroporacji i wielkości elektrod, liczba elektroporowanych komórek może ulec zmianie. Co więcej, określone typy komórek mogą być ukierunkowane, gdy są stosowane w połączeniu z promotorami ekspresji Cas9, bez bezwzględnej potrzeby stosowania genetycznie modyfikowanych modeli myszy linii zarodkowej (G-GEMM). Ponadto, w przeciwieństwie do systemów dostarczania wirusów, elektroporacja pozwala na wielokrotne dostarczanie plazmidu do pojedynczych komórek i mniejsze ograniczenia w rozmiarze wstawienia DNA¹⁵. Badania przesiewowe in vivo mutacji genowych mogą być również przeprowadzane ze względną łatwością ze względu na tę wysoką elastyczność. Co więcej, elektroporowane ogniwa mogą być śledzone lub śledzone, gdy ta metoda jest używana w połączeniu z liniami reporterowymi Cre, takimi jak Tdtomato lub Confetti^16,17.

Protocol

Zwierzęta były trzymane w statycznych klatkach mikroizolacyjnych z filtrami, umieszczonych w dedykowanym pomieszczeniu zawierającym komorę bezpieczeństwa biologicznego typu II. Wszystkie prace na zwierzętach zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Wydziału Medycyny i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu McGill (AUP #7843).

1. Przygotowanie igły do mikroiniekcji

1. Przeciągnij szklaną rurkę kapilarną w ostry punkt za pomocą ściągacza do mikropipet z następującym programem: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70.
2. Używając pary zwężających się kleszczyków z ultracienką końcówką, odetnij spiczasty koniec ciągniętej rurki kapilarnej pod mikroskopem preparacyjnym, aby utworzyć otwór, jak pokazano na Rysunek 1A, B. Upewnij się, że otwór nie jest zbyt duży, ponieważ spowoduje to uszkodzenie jajowodu i uniemożliwi powolne wstrzykiwanie.

Rysunek 1: Przygotowanie igły do mikroiniekcji. (A,B) Wyciągnięta rurka kapilarna ze spiczastym końcem (A), która została przecięta, aby utworzyć otwór (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie środka znieczulającego do iniekcji dootrzewnowej

1. Przygotuj przefiltrowaną, rozcieńczoną awertynę w dniu zabiegu. Roztwór podstawowy Avertin (2,2,2-tribromoetanolu) przygotowuje się w stężeniu 1,6 g/ml w alkoholu tert-amylowym przez energiczne mieszanie i przechowuje w ciemności.
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy awantyny solą fizjologiczną 1,25% v/v izotonicznego do końcowego stężenia 20 mg/ml w dygestorium. Odwirować rozcieńczoną awertynę i przefiltrować przez sterylny filtr 0,22 μm. Trzymaj w ciemności.

3. Przygotowanie obszaru operacji

1. Obszar operacyjny powinien być dedykowanym sterylnym środowiskiem, najlepiej czystą ławką lub szafką bezpieczeństwa biologicznego. W razie potrzeby rozmieść sterylny sprzęt chirurgiczny, mikroskop, mikromanipulator i elektroporator. Przykład tego jest pokazany w Rysunek 2.
2. Podgrzej poduszkę/tarczę grzewczą i umieść ją pod czystą, w pełni wyposażoną klatką. Ta klatka będzie używana do trzymania myszy po operacji.
3. Wlej sterylną sól fizjologiczną 1x buforowaną fosforanem (PBS) do sterylnej szalki Petriego. Użyj czystych nożyczek, aby pociąć chłonny papier na kwadraty o przybliżonych wymiarach 1 cm x 1 cm. Wrzuć te kawałki chłonnego papieru do 1x PBS, aby je namoczyć.

4. Przygotowanie roztworu i igły do wstrzykiwań

1. Roztwór do wstrzykiwań należy przygotować w dniu zabiegu. Zmieszać DNA/RNA/RNP z przefiltrowanym błękitem trypanowym do minimalnego stężenia końcowego 200 ng/μl każdy i odpowiednio 5%. Przed wstrzyknięciem przechowywać w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby pobrać 100% błękitu trypanowego i przefiltruj przez sterylny filtr 0,22 μm przed użyciem.
2. Przymocuj ciągniętą igłę kapilarną, zwaną odtąd igłą do mikroiniekcji, do mikromanipulatora mocowanego do zacisku stabilizowanego mocowaniem magnetycznym (konfiguracja pokazana na Rysunek 2B).
3. Pobrać pipetą 2 μl roztworu do wstrzykiwań na sterylną szalkę Petriego. Podczas obserwacji pod mikroskopem powoli nabierz 1-2 μl tego roztworu do igły do mikroiniekcji za pomocą strzykawki pod ciśnieniem powietrza dołączonej do mikromanipulatora. Należy unikać tworzenia pęcherzyków/gromadzenia się pęcherzyków w igle do mikroiniekcji.

Rysunek 2: Przygotowanie pola operacyjnego. (A) Ustawienie obszaru operacyjnego w czystym gabinecie. (B) Mikroskop preparacyjny i zestaw mikromanipulatora dla osoby praworęcznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Odsłanianie żeńskiego układu rozrodczego

1. Znieczulić 6-8-tygodniową samicę myszy, podając dootrzewnowo przefiltrowaną, rozcieńczoną awertynę (środek znieczulający) w dawce 0,25-0,5 mg/g. Następnie należy podać podskórnie karprofen (prewencyjny środek przeciwbólowy) w dawce 5 mg/kg.
   UWAGA: Inne alternatywy, które mogą być stosowane jako środek znieczulający, to izofluran lub ketamina/ksylazyna.
2. Umieść chłonny papier na czystej, podgrzanej podkładce/dysku. Następnie umieść znieczuloną mysz na tym podgrzewanym papierze chłonnym stroną grzbietową skierowaną do góry. Nałóż smar do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu.
   UWAGA: Upewnij się, że poduszka/tarcza grzewcza jest lekko ciepła w dotyku, testując ją grzbietem dłoni.
3. Przetestuj pod kątem głębokiego zatrzymania znieczulenia, ściskając palec u nogi znieczulonej myszy parą kleszczy. Usuń sierść grzbietową wokół potencjalnego miejsca nacięcia (lokalizacja pokazana na Ryc. 3A) i przetrzyj gołą skórę środkiem antyseptycznym.
4. Użyj pary prostych, kleszczy, aby uszczypnąć gołą skórę i wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłuż linii środkowej ciała za pomocą sterylnych ostrych, nożyczek. Oczyść obszar wokół nacięcia środkiem antyseptycznym.
5. Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą sterylnych kleszczy Adson. Następnie, za pomocą sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy, delikatnie oddziel skórę od ściany ciała, zaczynając od nacięcia w linii środkowej i przesuwając się na boki.
6. Zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową poniżej nerki. Używając pary sterylnych, prostych, kleszczy, ściśnij ścianę ciała bezpośrednio nad poduszką tłuszczową. Wykonaj małe nacięcie w ścianie ciała za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych o ostrym zakończeniu, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych.
7. Nadal ściskając ścianę ciała prostymi, kleszczami, włóż parę sterylnych,, zakrzywionych kleszczy do nacięcia i poszerz nacięcie utworzone w ścianie ciała.
8. Chwyć widoczną poduszeczkę tłuszczową zakrzywionymi kleszczami i wyciągnij ją z otworu, aby odsłonić jajnik, jajowód i macicę.
9. Aby utrzymać odsłonięty układ rozrodczy, zaciśnij poduszeczkę tłuszczową za pomocą sterylnego zacisku buldoga, jak pokazano na Rysunek 3B.

6. Iniekcja jajowodu in vivo i elektroporacja

1. Ostrożnie umieść rozgrzany papier absorpcyjny i znieczuloną mysz z naświetlanym układem rozrodczym na stoliku mikroskopu preparacyjnego, tak aby można było obserwować ten przewód. Przykładowy widok obserwowany pod mikroskopem pokazano w Rysunek 3B.
2. Wyregulować mikromanipulator tak, aby igła iniekcyjna z roztworem mogła być również obserwowana pod mikroskopem.
3. Używając pary sterylnych, stożkowych, ultracienkich kleszczyków, przytrzymaj nieruchomo obszar jajowodu, który ma zostać wstrzyknięty. Obszar, który ma być wstrzyknięty, musi być zgodny z kierunkiem igły do mikroiniekcji.
   UWAGA: Użyj zacisku buldoga zakotwiczającego poduszkę tłuszczową i układ rozrodczy, aby w razie potrzeby delikatnie obrócić/przesunąć przewód do optymalnej pozycji.
4. Wyreguluj mikromanipulator tak, aby nakłuć jajowód igłą do mikroiniekcji, jednocześnie podając jajowód na igłę za pomocą zwężających się kleszczyków z ultracienką końcówką. Delikatnie przesunąć igłę do mikroiniekcji, aby upewnić się, że została wprowadzona do jajowodu.
   UWAGA: Wprowadzić igłę do mikroiniekcji w prostym segmencie zamiast w punkt zwrotny zwiniętego jajowodu, aby zapobiec wielokrotnym nakłuciom i wyciekowi roztworu do wstrzykiwań.
5. Powoli wstrzyknąć do 1 μl roztworu do jajowodu, obserwując pod mikroskopem ruch niebieskiego roztworu i rozszerzanie się światła jajowodu. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków do światła. Reprezentatywne obrazy jajowodów, którym wstrzyknięto 100% błękit trypanowy, pokazano w Rysunek 3C,D.
6. Usunąć igłę z jajowodu. Przykryj obszar, który ma być docelowy, kawałkiem chłonnego papieru nasączonego sterylnym 1x PBS (od kroku 3.3).
7. Chwyć wstępnie namoczony papier i obszar/obszar, który ma być celowany, za pomocą pęsety elektrodowej (1 mm, 3 mm lub 5 mm, w zależności od rozmiaru obszaru, który ma być celowany) i odciągnij od ciała, przed elektroporacją przy użyciu tych ustawień w generatorze impulsów/elektroporatorze: 30 V, trzy impulsy, odstęp 1 s, Długość impulsu 50 ms, unipolarny.
   UWAGA: Odległość między elektrodami powinna być ustawiona w taki sposób, aby elektrody mogły zacisnąć się na docelowym obszarze bez deformacji jajowodu. Zalecana odległość to około 1 mm.
8. Po elektroporacji usuń papier chłonny i umieść mysz (z podgrzanym papierem chłonnym pod spodem) z powrotem na poduszce grzewczej. Odkręć zacisk buldoga i ostrożnie wepchnij odsłonięty układ rozrodczy z powrotem pod ścianę ciała. Powtórz sekcję 5, aby odsłonić układ rozrodczy po drugiej stronie.
   UWAGA: Elektroporacja jest skuteczna niezależnie od stadium rui myszy, o ile światło jest wypełnione roztworem.
9. Przykryj odsłonięty przewód chłonnym papierem nasączonym sterylnym 1x PBS, aby zapobiec jego wysychaniu, a następnie przygotuj igłę do mikroiniekcji do drugiego wstrzyknięcia, powtarzając kroki 4.2 i 4.3.
   UWAGA: W razie potrzeby wymienić igłę do mikroiniekcji. Zapobiegaj wysuszeniu odsłoniętej tkanki, stosując w razie potrzeby sterylny 1x PBS.
10. Powtórz powyższe kroki, aby wstrzyknąć i elektroporować jajowód po przeciwnej stronie.
    UWAGA: W razie potrzeby ponownie nałóż lubrykant do oczu w trakcie i po zabiegu.
11. Po elektroporacji obu jajowodów i umieszczeniu ich z powrotem pod ścianą ciała, zszyj lub zszyj miejsce nacięcia grzbietowego. Do szycia użyj hemostatu, aby chwycić igłę jedwabnych szwów plecionych (koło 3/8; rozstaw: 5-0; rozmiar drutów: 18 mm; długość nici: 75 cm). Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą pary sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy, a następnie użyj hemostatu, aby manipulować szwem, aby zamknąć ranę.
12. Przenieś mysz do czystej klatki, która jest umieszczona na podgrzewanej podkładce/dysku (od kroku 3.2) i monitoruj, aż mysz będzie aktywna.
13. Karprofen należy podawać podskórnie w dawce 5 mg/kg mc. co 24 godziny przez następne 3 dni i monitorować przez kolejne 10 dni.

Rysunek 3: Ekspozycja żeńskiego układu rozrodczego i mikroiniekcja. (A) Lokalizacja nacięcia linii środkowej (pokazane jako żółta linia) na grzbietowej stronie myszy Rosa-LSLtdTomato. (B) Narażenie żeńskich dróg rozrodczych. Poduszka tłuszczowa została zaciśnięta za pomocą sterylnego zacisku buldoga, aby zakotwiczyć przewód i utrzymać go odsłoniętym. (C,D) Reprezentatywne obrazy iniekcji jajowodu in vivo. Igłę do mikroiniekcji wprowadzono do dystalnej bańki (oznaczonej jako AMP), a przefiltrowany 100% błękit trypanowy wstrzyknięto do światła jajowodu, podczas gdy przewód był odsłonięty (C). Reprezentatywny obraz wypreparowanego jajowodu, pokazujący, że wstrzyknięty roztwór błękitu trypanowego rozprowadza się w dalszym i bliższym świetle jajowodu (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Rysunek 1 i Rysunek 2 przedstawia odpowiednio przygotowanie igły do mikroiniekcji mikroiniekcyjnej i ustawienie obszaru chirurgicznego in vivo dla mikroiniekcji in vivo i elektroporacji jajowodu myszy. Podczas operacji żeński układ rozrodczy został odsłonięty przez nacięcia wykonane w skórze grzbietowej (Ryc. 3A) i ścianie ciała znieczulonej myszy Rosa-LSLtdTomato (Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze/J})¹⁷ myszy. Zacisk buldoga został zaciśnięty na poduszce tłuszczowej nad traktem, aby była odsłonięta i zakotwiczona (Rysunek 3B). Roztwór do wstrzykiwań zawierający plazmidy PCS2 CreNLS¹⁸ o stężeniu 400 ng/μL wstrzyknięto do bańki (oznaczonej AMP) zwijanego jajowodu i pozostawiono do rozproszenia w świetle jajowodu (Rysunek 3C, D). Chociaż plazmidy PCS2 CreNLS zostały użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników w tym manuskrypcie, opisana metoda może być stosowana z łatwo wymiennymi DNA/RNA/RNP w roztworze iniekcyjnym do edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas w jajowowodzie myszy. Następnie umieszczono elektrody typu pęseta 1 mm lub 3 mm, tak aby dystalny jajowód znajdował się pomiędzy elektrodami do dostarczania opartego na elektroporacji.

Jajodukty zostały pobrane 4 dni po operacji i rozciągnięte poprzez usunięcie mesosalpinxu, aby uwidocznić specyficzność elektroporacji. Używając elektrod typu pęseta 1 mm lub 3 mm, obszar docelowy, oznaczony TdTomato, ograniczono do dystalnego nabłonka jajowodu (Rysunek 4A,D). Wielkość tego docelowego obszaru była dodatkowo kontrolowana za pomocą elektrod o różnych rozmiarach. Używając elektrod typu pęseta 3 mm, celowaliśmy w znacznie większy obszar AMP (Rysunek 4B,C), w porównaniu do celowania tylko w najbardziej dystalną końcówkę, INF (Rysunek 4E, F), przy użyciu elektrod typu pęseta 1 mm. Te pobrane jajowody utrwalono, potraktowano gradientem sacharozy i pocięto za pomocą kriostatu w celu szczegółowych analiz. Skrawki wybarwiono przeciwstawnie Hoeschtem 33342 i falloidyną w celu wybarwienia jąder i cytoszkieletu, a następnie zobrazowano je za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. W docelowym regionie elektroporowane ogniwa, oznaczone przez TdTomato, zostały losowo rozmieszczone wśród komórek nienaelektryzowanych (TdTomato-ve) (Rysunek 4G). Dodatkowo, elektroporowane komórki były ograniczone do nabłonka błony śluzowej i nie znaleziono ich w leżącej poniżej warstwie zrębu lub mięśni (Rysunek 4G, H). Wreszcie, aby potwierdzić edycję genów za pośrednictwem CRISPR-Cas, komórki TdTomato+ve można wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w celu izolacji DNA i sekwencjonowania MiSeq¹².

Rysunek 4: Walidacja udanego wstrzyknięcia in vivo i elektroporacji komórek nabłonka jajowodów, 4 dni po operacji. (A-C) Elektroporacja przy użyciu elektrod typu pęseta o średnicy 3 mm. Jajowód rozwinięto poprzez usunięcie mezoalpinksu w celu lepszej wizualizacji specyficzności elektroporacji (A). Obszar elektroporacji, zidentyfikowany za pomocą ekspresji TdTomato, był ograniczony do dystalnego jajowodu, oznaczonego jako AMP (B,C). (D-F) Elektroporacja za pomocą elektrod typu pęseta o średnicy 1 mm. Jajowód został rozwinięty poprzez usunięcie mesosalpinxu w celu lepszej wizualizacji specyficzności elektroporacji (D). Obszar elektroporacji był ograniczony do lejka (oznaczonego INF), najbardziej dystalnego końca jajowodu (E,F). (G,H) Przekrój poprzeczny dystalnego jajowodu 4 dni po elektroporacji plazmidami PCS2 CreNLS. Elektroporowane komórki znakowane TdTomato (G) ograniczono do monowarstwy nabłonka (H). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Kluczowymi krokami w tym szczegółowym protokole są mikroiniekcja roztworu DNA/RNA/RNP do światła jajowodu oraz kontrola siły i obszaru elektroporacji. Wyciek roztworu DNA/RNA/RNP podczas mikroiniekcji może spowodować transfekcję niepożądanych obszarów/komórek. Aby uzyskać spójną i wydajną elektroporację, zaleca się wypełnienie światła jajowodu roztworem (rysunek 3C,D). Dzieje się tak, ponieważ obszar elektroporacji jest kontrolowany głównie przez rozmiar i umiejscowienie elektrody. Słaba elektroporacja zmniejsza liczbę elektroporowanych ogniw, a ostra elektroporacja może powodować elektroporację niepożądanych komórek lub zaburzać strukturę tkanki. Liczbę elektroporowanych ogniw można zmieniać, dostosowując stężenie roztworu DNA/RNA/RNP lub parametry elektroporacji. Ponieważ jednak wysokie napięcie/wytwarzanie ciepła podczas elektroporacji może uszkodzić tkankę, parametry te należy przetestować przed użyciem na żywych/znieczulonych myszach. Wreszcie, ze względu na wymagający charakter tej procedury, zaleca się ćwiczenie ekspozycji przewodu pokarmowego i mikroiniekcji na martwych myszach przed wykonaniem tej operacji na żywych/znieczulonych myszach.

Uznaje się, że wiele genów jest zaangażowanych w inicjację raka, dlatego rekapitulacja tego wydarzenia wymaga wieloallelicznej modyfikacji kilku genów. Ponadto wiadomo również, że nie wszystkie komórki są jednakowo podatne na mutacje onkogenne⁹. Modelowanie raka wymaga zatem specyficznych linii myszy Cre, aby osiągnąć ścisłą kontrolę onkogennych urazów. Jednak ich dostępność i swoistość powoduje różne wyzwania, w tym wpływ na tkanki niedocelowe i śmiertelność¹⁹. Co więcej, tradycyjne G-GEMM wiążą się z wysokimi kosztami konserwacji i wymagają czasu na wygenerowanie linii myszy. Rozwój technologii edycji genomu CRISPR/Cas9 i poprawa dostarczania genów do określonych komórek somatycznych pozwoliły nam przezwyciężyć te problemy. W tym protokole przedstawiamy metodę dostarczania DNA/RNA/RNP do manipulacji genomem somatycznym, która może być wykorzystana do modelowania raka, bez bezwzględnej potrzeby stosowania określonych linii myszy¹². Poprzez wstrzykiwanie roztworów DNA/RNA/RNP do światła i używanie różnych rozmiarów elektrod typu pęseta do dostarczania opartego na elektroporacji, celuje się w ograniczone obszary nabłonka błony śluzowej jajowodu myszy (ryc. 4A-F). Jest to szczególnie przydatne w modelowaniu inicjacji HGSC, które pochodzą z dystalnego końca jajowodu.

Przedstawiona metoda mikroiniekcji i elektroporacji in vivo jest bardzo uniwersalna w celowaniu w tkanki/narządy za pomocą światła. Za pomocą tej metody można również celować w miąższ narządu¹⁴. Metody dostarczania wirusa, takie jak systemy lentiwirusowe i adenowirusowe, mogą być również wykorzystywane do podobnych celów. Jednak zalety elektroporacji w porównaniu z metodami dostarczania wirusa to: 1) dostarczanie wielu plazmidów do pojedynczych komórek, 2) brak ograniczeń co do rozmiaru wkładki¹⁵ oraz 3) łatwa kontrola obszaru i czasu podawania. Ponadto swoistość kierowania można poprawić, stosując promotory specyficzne dla linii. Jest to czasami trudne w systemach wirusowych ze względu na limit opakowań wirusowych.

Podobnie jak natura elektroporacji, elektroporowane komórki nabłonkowe są losowo przeplatane zdrowymi, nieedytowanymi komórkami (ryc. 4G). Jednak ta mozaikowość w genetycznie zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych komórkach może być korzystna dla badania inicjacji raka, ponieważ podsumowuje sporadyczny charakter wczesnej inicjacji raka w immunokompetentnym mikrośrodowisku. Częstotliwość elektroporowanych ogniw można regulować, zmieniając stężenia roztworu DNA/RNA/RNP i/lub parametry elektroporacji. Korzystając z edycji genów za pośrednictwem CRISPR-Cas w połączeniu z przedstawionym protokołem, łatwo jest przeprowadzić badania przesiewowe wielu genów i wygenerować heterogeniczne wzorce mutacji/kombinacji alleli w docelowych genach; Jest to szczególnie przydatne w modelowaniu nowotworów, które prezentują znaczną liczbę zmian genomowych, takich jak HGSC ^20,21. Ponadto, poprzez sekwencjonowanie docelowych genów podczas progresji raka, możliwe jest śledzenie ewolucji klonalnej in vivo guzów i przerzutów u myszy immunokompetentnych¹².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 &mikro; m Sterylna jednostka filtrująca	LifeGene	SF0,22PES
1 ml	Terumo Medical Corportation	SS-01T
Elektrody typu pęseta 1 mm	BEX CO., LTD
Elektrody pęsetowe 3 mm	BEX CO., LTD
Igła 30G x 1/2	Igła BD	305106	jest dołączona do strzykawki 1 ml podczas stosowania środka znieczulającego lub przeciwbólowego do wstrzykiwań.
Kleszcze Adson	Fisher Scientific	10-000-451
Strzykawka pod ciśnieniem powietrza	BD	B302995	Podłączona do mikromanipulatora; jak pokazano na rysunku 2B
Przeciwbólowe	-		karprofen, dawka: 5 mg / kg.
Antyseptyczny	Cardinal Health	OMEL0000017	Baxedin: 2% chlorheksydyna w 70% alkoholu izopropylowym
Avertin (2,2,2-tribromoetanol) - Znieczulenie	Sigma Aldrich	T48402-25G
Mikromanipulator do montażu zaciskowego	AD Instruments	MM-33
Zakrzywione ząbkowane kleszcze	Fisher Scientific	NC0696845
Mikroskop	preparacyjnyZeiss	SteREO Discovery.V8	Apochromat S, 0,63X, FWD 107mm. Dołączona dioda KL 200 LED do światła górnego, oznaczona jako źródło światła na rysunku 2B.
Smar do oczu	Maść Alcon-Systane (Smarująca maść do oczu)
Szklane igły kapilarne	Sutter Instrument Co.	B100– 50-10	Średnica zewnętrzna: 1 mm, średnica wewnętrzna: 0,5 mm, długość: 10 cm
Hmostatyki Hartmana	Fisher Scientific	50-822-711
Poduszka grzewcza/tarcza	-		W tym protokole użyto podkładki grzewczej do kuchenki mikrofalowej SnuggleSafe Pet Bed. Kuchenka mikrofalowa przez 2-5 minut i przetestuj grzbietem dłoni w rękawiczce.
Uchwyt magnetyczny do mikromanipulatora	AD Instruments	MB-B	Służy do utrzymywania mikromanipulatora z mocowaniem zaciskowym stabilnie i w pozycji pionowej podczas wstrzykiwania.
Zacisk Micro Bulldog	Fisher Scientific	50-822-230	3 cm
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97	P-97 Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego. Zastosowany program: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70
Szalka Petriego	Fisher Scientific	263991	Można również stosować autoklawowane/sterylne szklane szalki Petriego.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Bio Basic Inc.	PD8117	10X PBS rozcieńczono do 1X wodą DI. Autoklaw przed użyciem.
Generator impulsów/Elektroporator	BEX CO., LTD	CUY21 EDIT II	Ustawienia elektroporacji: 30 V, 3 impulsy, interwał 1 s, długość P. = 50 ms, jednobiegunowe
Rosa-LSLtdMyszy pomidorowe	Laboratorium Jacksona	7914	Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J
Ostro-nożyczki preparacyjne	Fisher Scientific	28251
Nożyczki preparacyjne z ostrym zakończeniem	Fisher Scientific	Golarka SDI130
	-		można również użyć kremu do depilacji.
Jedwabne nici plecione	Ethicon	682G	3/8 koło, grubość: 5-0, rozmiar drutów: 18 mm, długość gwintu: 75 cm. Można również użyć zszywek.
Stożkowe kleszczyki z ultracienką końcówką	Fisher Scientific	12-000-122
Cienki papier chłonny	Kimberly-Clark Professional	34120	Kimwipes
Trypan blue	STEMCELL Technologies	7050	Filtrowane za pomocą 0,22 i mikro; m sterylny filtr przed użyciem do mikroiniekcji.