Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Rośliny mykoheterotroficzne prezentują jedną z najbardziej ekstremalnych form zależności mikoryzowej, całkowicie utraciwszy swoją zdolność autotroficzną. Tak samo niezbędne jak każdy inny ważny zasób, grzyby, z którymi te rośliny są ściśle powiązane, są dla nich niezbędne. W związku z tym niektóre z najbardziej odpowiednich technik w badaniu gatunków mykoheterotroficznych to te, które umożliwiają badanie powiązanych grzybów, zwłaszcza tych zasiedlających korzenie i organy podziemne. W tym kontekście powszechnie stosuje się techniki identyfikacji grzybów endofitycznych zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Izolowanie endofitów grzybów zapewnia środki do ich morfologicznej identyfikacji, analizy ich różnorodności i utrzymania inokulum do zastosowań w symbiotycznym kiełkowaniu nasion orchidei. Wiadomo jednak, że w tkankach roślinnych występuje duża różnorodność grzybów nienadających się do hodowli. W związku z tym niezależne od kultury techniki identyfikacji molekularnej oferują szerszy zakres różnorodności i liczebności gatunków. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie wsparcia metodologicznego niezbędnego do wszczęcia dwóch postępowań wyjaśniających: zależnego od kultury i niezależnego postępowania wyjaśniającego. Jeśli chodzi o protokół zależny od hodowli, szczegółowo opisano procesy pobierania i utrzymywania próbek roślin z miejsc pobierania do obiektów laboratoryjnych, wraz z izolacją grzybów strzępkowych z podziemnych i powietrznych organów roślin mykoheterotroficznych, utrzymywaniem kolekcji izolatów, morfologicznie charakteryzowaniem strzępek za pomocą metodologii hodowli szkiełkowej oraz identyfikacją molekularną grzybów przez całkowitą ekstrakcję DNA. Szczegółowe procedury, obejmujące metodologie niezależne od hodowli, obejmują pobieranie próbek roślin do analiz metagenomicznych i całkowitą ekstrakcję DNA z achlorofilnych organów roślinnych przy użyciu komercyjnego zestawu. Wreszcie, do analiz sugerowane są również protokoły ciągłości (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], sekwencjonowanie) i przedstawiono tutaj techniki.
Wprowadzenie
Grzyby endofityczne to, z definicji, organizmy zasiedlające wnętrze organów i tkanek roślin w sposób niepozorny (tj. bez wyrządzania szkód gospodarzowi)1,2. Grzyby te mogą wchodzić w neutralne lub korzystne interakcje z roślinami gospodarzami, mogą nadawać im odporność na patogeny i niekorzystne warunki środowiskowe, a także przyczyniać się do syntezy korzystnych dla roślin związków (np. czynników wzrostu i innych fitohormonów)1,3. Endofity mikoryzowe to grzyby tworzące z rośliną asocjacje mikoryzowe, biorące udział w transporcie składników odżywczych<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie próbek roślin
- Pobieranie próbek do metod zależnych od hodowli
- Ostrożnie wykop organy podziemne; mogą to być korzenie, łodygi, kłącza lub organy spichrzowe pobieranej rośliny. Z wyjątkiem gleb o bardzo dużym zagęszczeniu, próbki te należy pobierać ręcznie.
UWAGA: Stosowanie narzędzi takich jak szpachelki lub łopatki na tym etapie jest niewskazane, ponieważ może dojść do uszkodzenia delikatnych struktur roślin mykoheterotroficznych oraz zanieczyszczenia tkanek grzybami nieendofitycznymi. - Zabierz jak najwięcej organów podziemnych. Próbki przechowuj w papierowych torbach w chłodzonym pojemniku (np. w ....
- Ostrożnie wykop organy podziemne; mogą to być korzenie, łodygi, kłącza lub organy spichrzowe pobieranej rośliny. Z wyjątkiem gleb o bardzo dużym zagęszczeniu, próbki te należy pobierać ręcznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W protokole izolacji, w przypadku stwierdzenia kontaminacji wodą użytą do ostatniego płukania oraz wykrycia zanieczyszczenia w szalkach Petriego z zaszczepionymi fragmentami, można podjąć różne działania w zależności od rodzaju kontaminantu (Tabela 1). Procedurę tę należy powtórzyć od początku w przypadku silnie sporulujących grzybów, które wykazują również przyspieszony wzrost, oraz intensywnie namnażających się bakterii opornych na wybrane antybiotyki. Natomiast jeśli k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powierzchowna dezynsekcja próbek roślin jest jednym z najbardziej krytycznych etapów w przedstawionym protokole. Brak zanieczyszczeń w naczyniach PDA kroplami z ostatniego mycia jest wysoce pożądany. Bakterie są często obserwowane jako zanieczyszczenia w naczyniach izolacyjnych, zwykle bardziej niż grzyby zarodnikujące w powietrzu, biorąc pod uwagę, że bakterie endofityczne są również powszechne w tkankach roślinnych 3,11. W związku z tym niezbędne jest dodanie a.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy za dofinansowanie z FAPESP (2015/26479-6) i CNPq (447453/2014-9). JLSM dziękuje CNPq za dotacje na produktywność (303664/2020-7). MPP dziękuje Capes (stypendium magisterskie, proces 88887.600591/2021-00) i CNPq.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Taśma | (dowolnej firmy, do montażu taśmy klejącej w analizach mikromorfologicznych) | ||
| Ampicylina | Sigma-Aldrich | A5354 | (do montażu fragmentów roślin; można stosować inne antybiotyki - sprawdź krok 2.2.1) |
| Autoklaw | (od dowolnej firmy, do sterylizacji materiałów w wielu etapach) | ||
| Agar bakteriologiczny | Sigma-Aldrich | A1296 | (dla wielu kroków) |
| Roztwory C1, C2, C3, C4, C5 i C6 | Qiagen | 12888-50 | (zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil) |
| Wirówka | Merck/Eppendorf | 5810 G | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Probówki wirówkowe | Merck | CLS430828 | (do pobierania próbek) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Czerwień kongijska | Supelco | 75768 | (do barwienia strzępek) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | do wiele kroków) |
| Etanol | Supelco | 100983 | Konieczne będzie przeprowadzenie odpowiednich rozcieńczeń (dla wielu etapów) |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Bibuła filtracyjna | Merck | WHA10010155 | (dla wielu etapów) |
| Szklane probówki | Merck | CLS7082516 | (do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu) |
| Wata szklana | Supelco | 20411 | (do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu) |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G8270 | Lub dekstroza (do kriokonserwacji w wermikulicie) |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Lub gliceryna (do kriokonserwacji w wermikulicie, do przygotowania LPCB) |
| Izopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z grzybów izolaty) |
| Kwas mlekowy | Sigma-Aldrich | 252476 | (do przygotowania LPCB - barwienie strzępek) |
| Roztwór błękitu laktofenolowego (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (do barwienia strzępek) |
| Okap | (klasa I, z dowolnej firmy, do wielu kroków) | ||
| Mikroskop | z dowolnej firmy, do obserwacji strzępek) | ||
| MB Spin Kolumny | Qiagen | 12888-50 | (do kupienia z zestawem DNeasy PowerSoil) |
| Błękit metylowy (niebieski bawełniany) | Sigma-Aldrich | M5528 | (do przygotowania LPCB - barwienie strzępkami) |
| Probówka do mikrowirówek (1,5 ml) | Merck | HS4323 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Probówka do mikrowirówek (2 ml) | BR780546 | Merck | (do wielu etapów) |
| Olej mineralny | (do konserwacji izolatów grzybów) | ||
| Worki | Średni rozmiar 150 mm x 200 mm (do pobierania próbek) | ||
| Szalka Petriego (szkło, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoklawowalne, do hodowli grzybów, preferuj wyższe) |
| Szalka Petriego (szkło, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (do oczyszczania izolatów grzybów); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowane) |
| Szalka Petriego (szkło, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | do montażu fragmentów roślin); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, &napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowalne) |
| Fenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów, do przygotowania LPCB) |
| Porcelana moździerz | Sigma-Aldrich | Z247464 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Tłuczek porcelanowy | Sigma-Aldrich | Z247502 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) | Milipor | P2182 | (dla wielu kroków) |
| Rurki PowerBead | Qiagen | 12888-50 | (zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil) |
| Szybki montaż podłoże (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (do hodowli szkiełka grzybowego) |
| Żel krzemionkowy | Supelco | 717185 | (do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu) |
| Chlorek sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Sól sodowa laurylosiarczanu (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Podchloryn sodu (z 2% aktywnym chlorem) | (produkt handlowy, do powierzchownego usuwania | ||
| zanieczyszczeń)Zestaw do ekstrakcji DNA z gleby (zestaw DNeasy PowerSoil) | Qiagen | 12888-50 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych) |
| Spektrofotometr - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych) |
| Mikroskop | stereoskopowy(=mikroskop preparacyjny, dowolnej firmy, do analiz makromorfologicznych) | ||
| Tetracyklina | Sigma-Aldrich | T7660 | (do instalacji fragmentów roślin) |
| Termoblok | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (lub z innych firm) |
| Homogenizator tkankowy i lizer komórkowy | SPEX SamplePrep | 2010 Geno / Grinder - Automatyczny homogenizator tkanek i lizer komórkowy (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych) | |
| Błękit toluidynowy O | Sigma-Aldrich / Harleco | 364-M | (do barwienia strzępek) |
| Trehaloza | Sigma-Aldrich | T9531 | (do kriokonserwacji w wermikulicie) |
| Roztwór podstawowy Tris (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Niełuskane ziarna | (do krioprezerwacji) | ||
| Pręt | litery U (lub adaptacja - sprawdź krok 5.4.1, do hodowli szkiełka grzybowego) | ||
| Wermikulit | Drobna granulometria (do kriokonserwacji w wermikulicie) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów) |
| Ekstrakt drożdżowy | Sigma-Aldrich | Y1625 | (do kriokonserwacji w wermikulicie) |
Bibliografia
- de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer
