Artykuł metodologiczny

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65135

⸱

5 maja 2023

 ,  , 
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, State University of Campinas (UNICAMP)

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Streszczenie

Rośliny mykoheterotroficzne prezentują jedną z najbardziej ekstremalnych form zależności mikoryzowej, całkowicie utraciwszy swoją zdolność autotroficzną. Tak samo niezbędne jak każdy inny ważny zasób, grzyby, z którymi te rośliny są ściśle powiązane, są dla nich niezbędne. W związku z tym niektóre z najbardziej odpowiednich technik w badaniu gatunków mykoheterotroficznych to te, które umożliwiają badanie powiązanych grzybów, zwłaszcza tych zasiedlających korzenie i organy podziemne. W tym kontekście powszechnie stosuje się techniki identyfikacji grzybów endofitycznych zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Izolowanie endofitów grzybów zapewnia środki do ich morfologicznej identyfikacji, analizy ich różnorodności i utrzymania inokulum do zastosowań w symbiotycznym kiełkowaniu nasion orchidei. Wiadomo jednak, że w tkankach roślinnych występuje duża różnorodność grzybów nienadających się do hodowli. W związku z tym niezależne od kultury techniki identyfikacji molekularnej oferują szerszy zakres różnorodności i liczebności gatunków. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie wsparcia metodologicznego niezbędnego do wszczęcia dwóch postępowań wyjaśniających: zależnego od kultury i niezależnego postępowania wyjaśniającego. Jeśli chodzi o protokół zależny od hodowli, szczegółowo opisano procesy pobierania i utrzymywania próbek roślin z miejsc pobierania do obiektów laboratoryjnych, wraz z izolacją grzybów strzępkowych z podziemnych i powietrznych organów roślin mykoheterotroficznych, utrzymywaniem kolekcji izolatów, morfologicznie charakteryzowaniem strzępek za pomocą metodologii hodowli szkiełkowej oraz identyfikacją molekularną grzybów przez całkowitą ekstrakcję DNA. Szczegółowe procedury, obejmujące metodologie niezależne od hodowli, obejmują pobieranie próbek roślin do analiz metagenomicznych i całkowitą ekstrakcję DNA z achlorofilnych organów roślinnych przy użyciu komercyjnego zestawu. Wreszcie, do analiz sugerowane są również protokoły ciągłości (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], sekwencjonowanie) i przedstawiono tutaj techniki.

Wprowadzenie

Grzyby endofityczne to, z definicji, organizmy zasiedlające wnętrze organów i tkanek roślin w sposób niepozorny (tj. bez wyrządzania szkód gospodarzowi)1,2. Grzyby te mogą wchodzić w neutralne lub korzystne interakcje z roślinami gospodarzami, mogą nadawać im odporność na patogeny i niekorzystne warunki środowiskowe, a także przyczyniać się do syntezy korzystnych dla roślin związków (np. czynników wzrostu i innych fitohormonów)1,3. Endofity mikoryzowe to grzyby tworzące z rośliną asocjacje mikoryzowe, biorące udział w transporcie składników odżywczych4. W rodzinie Orchidaceae interakcja z endofitami mikoryzowymi jest kluczowa dla kiełkowania nasion u ogromnej większości gatunków oraz dla zakorzenienia siewek u wszystkich roślin z tej rodziny5. W takim kontekście storczyki mykoheterotroficzne stanowią przykład całkowitej zależności od partnerów mikoryzowych, ponieważ przez cały cykl życiowy zależą one od transferu składników mineralnych i związków węgla realizowanego przez te grzyby6. Dlatego izolacja i identyfikacja stowarzyszonych grzybów stanowi fundamentalną podstawę badań nad strategiami życiowymi mykoheterotrofów. Co więcej, niewiele wiadomo o roli endofitów grzybowych u roślin mykoheterotroficznych, a nawet o rzeczywistej różnorodności tych grzybów7,8.

Badania nad grzybami endofitycznymi można prowadzić poprzez różne techniki, tradycyjnie opisywane jako niezależne lub zależne od hodowli, na przykład: (a) obserwacja bezpośrednia, (b) izolacja grzybów oraz identyfikacja morfologiczna i/lub molekularna, a także (c) ekstrakcja całkowitego DNA z tkanek roślinnych i identyfikacja molekularna9W obserwacji bezpośredniej (a) grzyby endofityczne można badać za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej, gdy znajdują się one jeszcze wewnątrz komórek i tkanek roślinnych.9, zgodnie ze szczegółowymi opisami różnych protokołów mikroskopowych przedstawionymi przez Pena-Passos i wsp.10Za pomocą metod izolacji (b) endofity grzybowe można scharakteryzować pod kątem morfologii ich kolonii, strzępek oraz struktur rozrodczych lub przetrwalnikowych. Ponadto, poprzez techniki izolacji, możliwe jest przeprowadzenie identyfikacji molekularnej izolatów poprzez ekstrakcję DNA, amplifikację sekwencji identyfikacji molekularnej (kodów kreskowych lub odcisków palców) oraz sekwencjonowanie11Ta druga technika (c) umożliwia molekularną identyfikację grzybów endofitycznych poprzez ekstrakcję DNA bezpośrednio z wnętrza tkanek roślinnych (metabarcoding), a następnie przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie.12.

Ponadto izolaty grzybów można wykorzystać w próbach kiełkowania symbiotycznego, stosując nasiona storczyków autotroficznych lub mykoheterotroficznych. Przykładem takiego zastosowania jest badanie przeprowadzone przez Sisti i wsp.13, opisujące kiełkowanie i wczesne stadia rozwoju protokormu u Pogoniopsis schenckii, storczyka mykoheterotroficznego, w powiązaniu z niektórymi jego izolatami, obejmującymi nie-mikoryzowe grzyby endofityczne. Zastosowany protokół kiełkowania symbiotycznego został szczegółowo opisany i przedstawiony w filmie autorstwa Pena-Passos i wsp.10. Izolowanie grzybów z różnych organów roślin pozwala na zróżnicowanie celów badawczych w zakresie natury interakcji roślina-grzyb (np. w celu zrozumienia aspektów ekologicznych lub fizjologicznych tej symbiozy, a także badania transferu składników odżywczych z grzybów do rośliny)9.

Metodyki przedstawione w sekcji 1 opierają się na zbiorze próbek organów podziemnych, ponieważ organy te sprawiają największe trudności podczas pobierania i budzą duże zainteresowanie ze względu na kolonizację przez endofity mikoryzowe. Niemniej jednak oba zawarte protokoły (kroki 1.1 i 1.2) można zastosować do innych organów roślin mykoheterotroficznych (np. kłączy, łodyg kwiatowych i owoców). Metodyka pobierania opisana w kroku 1.1 jest przeznaczona do izolacji grzybów endofitycznych (sekcja 2) w celu charakterystyki morfologicznej (sekcje 4 i 5) i/lub ekstrakcji całkowitego DNA do identyfikacji izolatów (sekcja 6). Z kolei metodyka pobierania opisana w kroku 1.2 jest przypisana wyłącznie do ekstrakcji całkowitego DNA z tkanek roślinnych na potrzeby technik metabarcodingu (sekcja 7). W sekcji 3 przedstawiono cztery metody przechowywania i konserwacji grzybów nitkowatych, z czego dwie służą do przechowywania krótkoterminowego (3-6 miesięcy), a dwie pozostałe są odpowiednie do przechowywania długoterminowego (>1 rok). Charakterystyka morfologiczna (sekcje 4 i 5) może być powiązana z identyfikacją molekularną w celu jej wzmocnienia oraz dostarczenia istotnych informacji na temat makro- i mikromorfologii grzybów. Rysunek 1 podsumowuje opisane poniżej metodyki pobierania.

Schemat analizy grzybów w próbkach roślinnych; obejmuje ekstrakcję DNA i kwantyfikację spektrofotometryczną.
Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie przedstawionych metod. Pobieranie roślin i izolacja grzybów, ich konserwacja oraz identyfikacja molekularna za pomocą metod zależnych i niezależnych od hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek roślin

  1. Pobieranie próbek do metod zależnych od hodowli
    1. Ostrożnie wykop organy podziemne; mogą to być korzenie, łodygi, kłącza lub organy spichrzowe pobieranej rośliny. Z wyjątkiem gleb o bardzo dużym zagęszczeniu, próbki te należy pobierać ręcznie.
      UWAGA: Stosowanie narzędzi takich jak szpachelki lub łopatki na tym etapie jest niewskazane, ponieważ może dojść do uszkodzenia delikatnych struktur roślin mykoheterotroficznych oraz zanieczyszczenia tkanek grzybami nieendofitycznymi.
    2. Zabierz jak najwięcej organów podziemnych. Próbki przechowuj w papierowych torbach w chłodzonym pojemniku (np. w pudełku ze styropianu lub torbie termicznej z lodem). Jeśli pobierane są również organy nadziemne, transportuj je oddzielnie od organów podziemnych.
  2. Pobieranie próbek do metod niezależnych od hodowli
    1. Ostrożnie wykop korzenie pobieranej rośliny, stosując się do tych samych zaleceń wskazanych w UWAGI w kroku 1.1.1.
    2. Zabierz jak najwięcej organów podziemnych. Pobrane próbki przechowuj w krioprobówkach w ciekłym azocie (opcja preferowana) lub w probówkach wirówkowych otoczonych suchym lodem (opcja alternatywna). Organy nadziemne, jeśli zostały pobrane, przechowuj oddzielnie.

2. Izolacja grzybów endofitycznych związanych z organami roślin14

UWAGA: Wszystkie materiały, roztwory i odczynniki użyte w tej sekcji muszą być sterylne. Te, których nie można nabyć w formie wysterylizowanej, należy poddać autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 20 min.

  1. Powierzchowna dezynfekcja organów roślinnych
    1. Przemyć zebrane próbki (krok 1.1.2) pod bieżącą wodą i usunąć jak największą ilość podłoża oraz innych zanieczyszczeń, które mogły znajdować się na próbkach.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zanurzyć przemyte próbki w 70% etanolu na 1 min (można użyć zlewki lub szklanego słoika).
    3. Przenieść próbki do innego naczynia z podchlorynem sodu zawierającym 2% aktywnego chloru na 3 min.
    4. Przenieść próbki do naczynia z 70% etanolem i pozostawić zanurzone przez 1 min. Następnie przemyć próbki sekwencyjnie w dwóch naczyniach z wodą destylowaną.
  2. Osadzenie fragmentów roślin na pożywce hodowlanej
    UWAGA: Każdy krok opisany w punkcie 2.2 musi być przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Przed osadzeniem przygotować szalki Petriego (o średnicy 8-10 cm) z pożywką z agaru ziemniaczanego z dekstrozą (PDA) o stężeniu 19,5 g/L + 7 g/L agaru bakteriologicznego + 3 mL/L antybiotyków (np. streptomycyny, penicyliny, tetracykliny, ampicyliny).
    2. Przechowywać szalki Petriego z pożywką w temperaturze 36 °C przez 24 h przed użyciem, aby upewnić się, że nie doszło do kontaminacji. Odrzucić szalki z koloniami bakterii lub grzybów.
      UWAGA: Dodatek antybiotyków do pożywki jest w tym kroku niezbędny, ponieważ organy są silnie zakażone bakteriami, które mogą hamować wzrost grzybów. Należy sprawdzić, czy antybiotyki można poddać działaniu wysokiej temperatury podczas autoklawowania; niektóre antybiotyki należy dodać po schłodzeniu pożywki do około 36 °C (przed rozlaniem jej do szalek).
    3. Bezpośrednio po powierzchownej dezynfekcji próbek, nadal w komorze z laminarnym przepływem powietrza, na pożywkę PDA zaszczepić kilka kropli wody destylowanej z ostatniego naczynia użytego do mycia próbek. Krok ten jest istotny dla oceny skuteczności powierzchownej dezynfekcji próbek.
    4. Do pustej, autoklawowanej szalki umieścić próbki i za pomocą wypalonej nad ogniem skalpela oraz pęsety pociąć próbki na plastry o grubości około 0,2 cm.
    5. Próbki cylindryczne pociąć wzdłuż na dwie połowy, jeśli chcemy zwiększyć powierzchnię kontaktu z pożywką. Aby lepiej wyeksponować owoce i inne organy o bardziej sferycznym kształcie, należy je dokładnie posiekać lub pokroić w plastry. Nasiona również mogą być ważnym źródłem grzybów, dlatego należy upewnić się, że przekrój owocu eksponuje je na pożywkę.
      UWAGA: Do izolacji endofitów grzybowych należy używać wyłącznie zdrowych organów, bez uszkodzeń tkanek oraz oznak możliwych chorób lub infekcji patogennych.
    6. Rozmieścić pięć fragmentów organów podziemnych w szalkach Petriego z PDA + antybiotykiem. Należy upewnić się, że fragmenty znajdują się jak najdalej od siebie i nie dotykają krawędzi szalki. Nie układać fragmentów w regularne rzędy na pożywce. Przygotować powtórzenia dla każdego osadzonego organu jako zabezpieczenie na wypadek kontaminacji.
    7. Uszczelnić szalki Petriego folią spożywczą i przechowywać w ciemności w temperaturze 25-27 °C (najlepiej w inkubatorze) przez 5 dni.
  3. Obliczanie częstotliwości izolacji (IF)11
    1. Po 5 dniach inkubacji fragmentów organów obliczyć IF, dzieląc liczbę inkubowanych fragmentów, na których wyrosły kolonie grzybów, przez całkowitą liczbę inkubowanych fragmentów, zgodnie z poniższym równaniem:
      Schemat formuły IF, analiza wzrostu kolonii grzybów, obliczanie współczynnika inkubacji, metoda badawcza
  4. Oczyszczanie izolatów grzybowych poprzez kreskowanie it podpożywianie
    UWAGA: Każdy krok opisany w punkcie 2.4 musi być przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Przygotować szalki Petriego (o średnicy 5 cm) z agar-agarem (AA; wyłącznie agar bakteriologiczny) o stężeniu 5-7 g/L. Przechowywać szalki przez 24 h w temperaturze 36 °C, aby wyeliminować ewentualne zanieczyszczone naczynia.
    2. Każdą wyrosłą kolonię grzyba oznaczyć kodem i wyznaczyć jej brzegi na spodzie szalki (można to zrobić markerem permanentnym). Różnicować kolonie na podstawie koloru, wzoru wzrostu, tekstury i kształtu brzegów.
    3. Za pomocą autoklawowanego drewnianego wykałaczką, używając cienkiej końcówki, pobrać niewielką ilość grzybni z kolonii grzyba. Skupić się najlepiej na brzegach kolonii i wybrać obszar jak najdalej od innej kolonii, unikając pobrania więcej niż jednego rodzaju kolonii jednocześnie.
    4. Używając tej samej wykałaczki z grzybnią na końcówce, wykonać kreskowanie na AA, tworząc trzy kreski (rowki). Należy upewnić się, że każda kreska znajduje się w odległości 1 cm od drugiej oraz od krawędzi szalki. Zapisać odpowiedni kod (używając samoprzylepnej etykiety i ołówka), uszczelnić szalki i inkubować w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 3 dni.
    5. Przygotować szalki Petriego (o średnicy 8 cm) z PDA o stężeniu 39 g/L. Na tym etapie nie trzeba dodawać antybiotyków.
    6. Po inkubacji szalek AA dokładnie obejrzeć je pod światło (z lampy lub okna), aby zidentyfikować cienkie strzępki tworzące pojedyncze kolonie. Wyznaczyć obszar pojedynczej kolonii na szalce, używając markera permanentnego na spodzie szalki Petriego.
    7. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając autoklawowanej wykałaczki, wyciąć fragment pożywki zawierający kolonię i przenieść wyciętą objętość do centrum nowej szalki z PDA.
    8. Oznaczyć szalki Petriego kodami izolatów, uszczelnić je folią spożywczą i przechowywać w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 7-14 dni.

3. Przechowywanie oczyszczonych izolatów grzybów

UWAGA: Wszystkie materiały, roztwory i odczynniki użyte w tej sekcji muszą być sterylne. Te, których nie można kupić w formie wysterylizowanej, należy poddać autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 20 min.

  1. Przechowywanie metodą Castellaniego lub w oleju mineralnym (3-6 miesięcy)11,15​
    1. Przygotować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL z 0,5 mL wody destylowanej lub zawierające 0,5 mL oleju mineralnego (w zależności od wybranej metody). Należy upewnić się, że probówki zostały autoklawowane na pustych, a autoklawowana woda i olej zostały dodane do probówek w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami wyhodowanymi na PDA (39 g/L) przez 7-14 dni. Za pomocą autoklawowanego wykałaczką wyciąć małe sześciany (0,5 cm x 0,5 cm w powierzchni górnej) podłoża zawierające brzegi grzybni.
    3. Umieścić od czterech do sześciu sześcianów w probówkach do mikrocentryfugi z wodą destylowaną (metoda Castellaniego) lub olejem mineralnym. Przechowywać probówki w ciemności, w temperaturze 25 °C tak długo, jak to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.
      UWAGA: Należy unikać dodawania zbyt wielu sześcianów do probówek i ich przepełniania, co może zwiększyć ryzyko kontaminacji. Można przechowywać probówki w chłodni, co może sprzyjać dłuższej konserwacji niektórych izolatów. Currah i wsp.16 zalecają przechowywanie powtórzeń izolatów grzybów mikoryzowych z orchidei tropikalnych zarówno w chłodni, jak i w 25 °C, ponieważ mogą one zostać utracone podczas przechowywania w niskiej temperaturze.
    4. Wyjąć sześcian i umieścić go w centrum nowej szalki z PDA, aby wyhodować przechowywany izolat.
  2. Kriokonserwacja w niełuskanych ziarnach ryżu (>1 rok)17
    1. Umyć niełuskane ziarna ryżu w bieżącej wodzie i gotować, aż łuska ryżu zacznie się otwierać. Rozdzielić ugotowane ziarna do szklanych probówek z zakrętką i autoklawować dwukrotnie w odstępie 24 h.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami wyhodowanymi na PDA (39 g/L) przez 7-14 dni. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki pobrać pięć małych fragmentów strzępek z brzegów grzybni i zaszczepić je w probówce zawierającej autoklawowane ziarna ryżu.
      ​UWAGA: Szczepienie strzępek w różnych punktach i na różnych głębokościach probówki gwarantuje, że izolat skolonizuje niełuskane ziarna ryżu w krótszym czasie.
    3. Inkubować probówki w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 14 dni. Wstrząsać probówkami za pomocą vortexa co 3 dni, aby ziarna pozostały rozdzielone.
    4. Po zaobserwowaniu wzrostu grzyba w ziarnach ryżu, rozdzielić ziarna w autoklawowanej szalce Petriego wyłożonej papierem filtrowanym w celu absorpcji wilgoci, rozkładając je na papierze tak, aby ziarna mogły wyschnąć. Przechowywać w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 2-3 dni.
    5. Przygotować krioprobówki z 1/3 żelu krzemionkowego na dnie i 1/3 waty szklanej nad krzemionką. Na koniec dodać 1/3 ziaren ryżu z wyrośniętą grzybnią grzybową. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 24 h.
    6. Po 24 h przechowywać krioprobówki w temperaturze -80 °C tak długo, jak to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.
  3. Kriokonserwacja w wermikulicie z użyciem krioprotektanta (>1 rok)18
    1. Przygotować płynne podłoże hodowlane składające się z 0,2% ekstraktu drożdżowego i 2% glukozy w wodzie destylowanej. Dostosować pH do 5 i autoklawować.
    2. Rozdzielić 0,2 g wermikulitu (użyć drobnej granulacji) do krioprobówek z zakrętką i autoklawować. Dodać 0,8 mL autoklawowanego podłoża płynnego do krioprobówek zawierających wermikulit.
    3. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami wyhodowanymi na PDA (39 g/L) przez 7-14 dni. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki pobrać od trzech do pięciu fragmentów strzępek z brzegów grzybni i zaszczepić wzdłuż probówki zawierającej wermikulit + płynne podłoże hodowlane. Pamiętać o opisaniu krioprobówek odpowiednim kodem izolatu.
      UWAGA: Szczepienie strzępek w różnych punktach i na różnych głębokościach krioprobówki gwarantuje, że izolat skolonizuje wermikulit w krótszym czasie.
    4. Przechowywać krioprobówki w ciemności w temperaturze 25-27 °C do momentu, aż będzie można zaobserwować kolonizację większości ziaren wermikulitu, co zazwyczaj zajmuje około 14 dni.
    5. Przygotować roztwór krioprotektanta składający się z 5% glicerolu i 5% trehalozy w wodzie destylowanej i autoklawować. Pozostawić roztwór do ostygnięcia przed użyciem.
    6. Po skolonizowaniu wermikulitu w krioprobówkach przez odpowiedni izolat grzyba, rozdzielić 0,4 mL krioprotektanta do każdej probówki i przechowywać krioprobówki w chłodni w temperaturze 4 °C przez 48 h. Następnie przechowywać krioprobówki w temperaturze -80 °C tak długo, jak to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.

4. Charakterystyka makromorfologiczna grzybów nitkowatych (morfologia kolonii)

  1. Prowadź rejestrację fotograficzną grzybni hodowanej w każdej szalce Petri na podłożu PDA 39 g/L przez 7-14 dni. Pamiętaj o dokumentowaniu obu stron kolonii – górnej oraz dolnej (rewersu). Jeśli szalki mają zostać niezwłocznie wykorzystane w sekcji 6 lub nie będą dalej utrzymywane, otwórz je podczas fotografowania, aby uzyskać lepsze zdjęcia.
  2. W przypadku zainteresowania ilościowymi danymi dotyczącymi morfologii kolonii, wykonaj subkulturę powtórzeń izolatów i utrzymuj je w tych samych warunkach hodowlanych przez stały okres czasu, aby zarejestrować średnicę kolonii i obliczyć tempo wzrostu (zazwyczaj w mm/h).
    UWAGA: Bardziej zaawansowane wyniki ilościowe można uzyskać, stosując do porównania różne rodzaje pożywek 19 oraz wykorzystując narzędzia statystyczne do analizy danych.
  3. Obserwuj kolonie również pod stereomikroskopem, aby zidentyfikować cechy morfologiczne, i wykonaj zdjęcia z powiększeniem. Oceń kolonie pod kątem ich cech makromorfologicznych, zgodnie ze szczegółami opisanymi w sekcji wyników. Skorzystaj z różnorodnych źródeł bibliograficznych, aby pomóc w kategoryzacji i powiązaniu makromorfologii z identyfikacją molekularną i/lub morfologiczną.

5. Charakterystyka mikromorfologiczna grzybów nitkowatych (morfologia strzępek)

UWAGA: Techniki mikromorfologiczne zostały porównane w sekcji dyskusji, z uwzględnieniem ich możliwych zastosowań oraz wad.

  1. Hoduj izolaty na szalkach Petri z 39 g/L PDA przez 7-14 dni. W celu oceny domniemanych grzybów mikoryzowych storczykowatych hoduj izolaty na 17 g/L agarze kukurydzianym (CMA; lub innym medium ograniczającym dostępność składników odżywczych) przez 3-7 dni19.
  2. Przygotowanie preparatu metodą rozcierania (tease mount)
    1. Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nanieś kroplę wybranego barwnika (krok 5.5) na czyste szkiełko przedmiotowe.
    2. Używając autoklawowanego wykałaczką lub innego sterylnego narzędzia, ostrożnie pobierz część strzępek z wyhodowanego izolatu i umieść je w kropli barwnika. Nałóż szkiełko nakrywkowe (najlepiej pod kątem początkowym 45°, aby uniknąć pęcherzyków powietrza) i analizuj pod mikroskopem świetlnym.
  3. Przygotowanie preparatu metodą taśmy klejącej (adhesive tape mount)
    UWAGA: Technikę tę stosuje się zazwyczaj w kulturach grzybów, które mają być bezpośrednio wykorzystane w sekcji 6 lub nie będą podtrzymywane, ponieważ taśmy klejącej nie można autoklawować, a po wykonaniu metody może dojść do kontaminacji.
    1. Nanieś kroplę wybranego barwnika (krok 5.5) na czyste szkiełko przedmiotowe. Odetnij pasek przezroczystej taśmy klejącej o rozmiarze, który dobrze pasuje do szkiełka przedmiotowego i centralnej kropli barwnika.
    2. Przyłóż klejącą stronę paska do powierzchni grzybni. Nie dociskaj i staraj się zebrać część strzępek, nie przyklejając ich zbyt wielu.
    3. Przyklej taśmę do szkiełka przedmiotowego, upewniając się, że barwnik ma kontakt z zebranymi strzępkami. Nanieś kroplę wody na taśmę i nałóż szkiełko nakrywkowe. Analizuj preparat pod mikroskopem świetlnym.
  4. Kultura na szkiełku dla grzybów nitkowatych20
    1. Wewnątrz dużej szalki Petri (preferably >9 cm średnicy) umieść: papier filtracyjny na dnie, szklaną prętkę w kształcie litery U lub adapter (celem jest zapewnienie uniesienia dla szkiełka przedmiotowego), jedno szkiełko przedmiotowe oraz dwa szkiełka nakrywkowe. Wyższe szalki Petri ułatwiają manipulację. Autoklawuj te zestawy szalek Petri, jeden dla każdego izolatu.
    2. Przygotuj niewielką objętość 39 g/L PDA lub 17 g/L CMA, dodaj 10 g/L agaru bakteriologicznego i autoklawuj (objętość na jedną szalkę Petri wystarczy dla ponad 30 izolatów). Pożywki stosowane w kulturze na szkiełku muszą być twardsze niż standardowe pożywki. Autoklawuj 100 mL wody destylowanej.
    3. Pracuj w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wlej płynne medium do szalki Petri, tworząc warstwę o wysokości około 0.5 cm. Pozostaw medium do zastygnięcia. Po zastygnięciu użyj sterylnego skalpela, aby wyciąć kwadraty medium o wymiarach 1 cm x 1 cm.
    4. Otwórz zestaw szalki Petri w komorze z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą wypalanych pęsety zorganizuj materiał autoklawowany wewnątrz szalki. Rozmieść materiał w kolejności numerowanej, jak pokazano na Rysunku 2A, kładąc kwadrat pożywki na szkiełku przedmiotowym. Przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego na medium przejdź do kroku 5.4.5.
    5. Użyj autoklawowanej wykałaczki, aby pobrać część strzępek z izolatu i ostrożnie wetrzyj je w cztery boczne ścianki medium umieszczonego na szkiełku przedmiotowym. Nałóż autoklawowane szkiełko nakrywkowe na kwadrat medium, używając wypalanej pęsety.
    6. Użyj sterylnego końcówki do pipety, aby nanieść autoklawowaną wodę na papier filtracyjny w celu stworzenia komory wilgotnej. Użyj objętości wystarczającej do nasycenia papieru, unikając nadmiaru wody. Uszczelnij szalkę Petri folią spożywczą i oznacz ją odpowiednim kodem izolatu. Przechowuj szalki w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 3-7 dni.
    7. Oceń wzrost strzępek na szkiełku przedmiotowym i szkiełku nakrywowym. Z każdego zestawu do kultury na szkiełku powstają dwa preparaty: jeden z wykorzystaniem szkiełka przedmiotowego ze strzępkami i autoklawowanego szkiełka nakrywkowego, drugi z wykorzystaniem szkiełka nakrywkowego ze strzępkami i innego szkiełka przedmiotowego.
    8. Po zaobserwowaniu wzrostu strzępek ostrożnie oddziel kwadrat medium od szkiełka przedmiotowego (Rysunek 2B), przygotuj oba preparaty przy użyciu wybranego barwnika (krok 5.5) i analizuj pod mikroskopem świetlnym. Pamiętaj o oznaczeniu kodu izolatu na szkiełku. Aby przygotować preparaty półtrwałe, zabezpiecz szkiełko nakrywkowe bezbarwnym lakierem do paznokci.
    9. Aby przygotować preparaty trwałe, po barwieniu ostrożnie wypłucz barwnik z przylegających strzępek i pozostaw szkiełko do wyschnięcia. Zamontuj za pomocą szybkiego medium montażowego (szczegóły w Pena-Passos et al.10).
      UWAGA: Wadą przygotowania trwałego preparatu tą techniką jest możliwość wypłukania zarodników i struktur, które nie przylegają do szkła.
  5. Metody barwienia i obserwacja strzępek
    1. Błękit bawełniany w laktofenolu (LPCB)21: Dodaj 20 mL kwasu mlekowego, 40 mL glicerolu i 20 mL wody destylowanej. Rozpuść 20 g kryształów fenolu w tym roztworze poprzez delikatne podgrzewanie. Rozpuść 0.05 g błękitu metylowego (błękit bawełniany lub 2 mL 1% roztworu wodnego). LPCB można również łatwo nabyć w formie gotowej.
      ​OSTROŻNIE: Fenol jest silnie toksyczny i lotny; należy go używać wyłącznie w dygestorium i w rękawiczkach.
    2. Błękit toluidyny O10(TBO): Przygotuj 0.05% TBO w 0.1 M buforze fosforanowym (pH 6.8).
    3. Czerwień Kongo22,23,24: Przygotuj 1% roztwór czerwieni Kongo w wodzie destylowanej i przefiltruj go. Inkubuj przez 5-10 min. Barwnik ten może być również stosowany w mikroskopii fluorescencyjnej25.
    4. Podczas obserwacji i fotografowania strzępek grzybni pod mikroskopem świetlnym korzystaj z różnorodnych źródeł bibliograficznych, aby pomóc w identyfikacji struktur (patrz dyskusja).

Przygotowanie szalki Petri z pręcikiem szklanym do eksperymentu nad równowagą statyczną; schemat i rzeczywiste ustawienie.
Rycina 2: Procedury hodowli na podstawkach szkiełkach dla grzybów strzępkowych. (A) Schematyczna konfiguracja zestawu do hodowli na podstawkach szkiełkach, gdzie numery wskazują kolejność rozmieszczania elementów. (B) Oddzielanie kwadratu pożywki po zaobserwowaniu wzrostu strzępek na szkiełku podstawkowym i szkiełku nakrywce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

6. Ekstrakcja całkowitego DNA z izolatów grzybów (protokół własny26 z modyfikacjami 27)

UWAGA: Wszystkie materiały, roztwory i odczynniki użyte w tej sekcji muszą być sterylne. Te, których nie można zakupić w formie wysterylizowanej, należy poddać autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 20 min. Przez cały czas trwania protokołu należy nosić rękawiczki, a niektóre etapy przeprowadzić w dygestorium.

  1. Przygotować bufor do ekstrakcji: 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8.0) oraz 25 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Oczyszczone izolaty hodować na podłożu PDA 39 g/L przez 7-14 dni.
  2. Ostrożnie zebrać grzybnię z izolatu za pomocą szpatułki lub łyżeczki i przenieść fragmenty do autoklawowanego moździerza, unikając przeniesienia pożywki wraz z agregatem strzępek. Za pomocą porcelanowego tłuczka rozetrzeć grzybnię w ciekłym azocie na drobny proszek. Nie dopuścić do roztopienia mielonej grzybni, dodając w razie potrzeby azot.
  3. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL dodać 1 mL buforu do ekstrakcji, a następnie przenieść zmieloną próbkę do poziomu kreski 1,5 mL. Delikatnie wymieszać zawartość probówek w celu homogenizacji.
  4. Wymieszać probówki na wstrząsacu vortex przez 5 s i umieścić w bloku grzejnym w temperaturze 65 °C na 20 min. Ostrożnie homogenizować zawartość poprzez odwracanie probówek co 7-10 min.
  5. Wirować probówki przy 10,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Przenieść 800 µL fazy górnej do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL, dodać do probówek 800 µL fenolu i wymieszać zawartość przez odwracanie.
    OSTROŻNIE: Fenol jest reagentem silnie toksycznym i lotnym; może powodować rumień, zgorzel i martwicę tkanek. W przypadku wdychania może wywołać duszność i kaszel. Wchłanianie ogólnoustrojowe może uszkodzić wątrobę, nerki i ośrodkowy układ nerwowy. Fenolem manipulować wyłącznie w dygestorium i używać rękawiczek.
    UWAGA: Od tego kroku wzwyż używać rękawiczek i przeprowadzać protokół w dygestorium.
  6. Wirować probówki przy 10,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i przenieść 800 µL fazy górnej do nowej probówki 2 mL, uważając, aby nie przenieść zawartości fazy dolnej.
  7. Do probówek dodać 400 µL fenolu i 400 µL chloroformu, a następnie wymieszać zawartość przez odwracanie. Wirować przy 10,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    OSTROŻNIE: Chloroform jest reagentem silnie toksycznym i lotnym; w kontakcie ze skórą może powodować podrażnienia i obrażenia, a w przypadku wdychania wpływa na ośrodkowy układ nerwowy, układ sercowo-oddechowy, wątrobę i nerki. Chloroformem manipulować wyłącznie w dygestorium i używać rękawiczek.
  8. Odzyskać 800 µL lub mniej fazy górnej do nowej probówki 2 mL. Dodać 800 µL chloroformu, wymieszać zawartość przez odwracanie i wirować przy 10,000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na tym etapie do nowych probówek nie mogą zostać przeniesione żadne pozostałości fazy dolnej. Należy zatem zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania fazy górnej.
  9. Przenieść 600-800 µL fazy górnej do nowej probówki 1,5 mL i dodać 450 µL izopropanolu. Wymieszać zawartość przez odwracanie i inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 min.
  10. Wirować probówki przy 10,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C i usunąć nadsącz za pomocą mikropipety. Należy uważać, aby nie usunąć osadu zgromadzonego na dnie probówki.
  11. Dodać 500 µL 80% etanolu i wirować przez 5 min. Powtórzyć czynność dwukrotnie, jeśli osad nie jest klarowny.
  12. Usunąć etanol za pomocą mikropipety i suszyć osad w temperaturze 37 °C przez 30-60 min. Dodać 30-50 µL wody dejonizowanej, eluując osad za pomocą mikropipety.
  13. Przechowywać probówki w temperaturze 4 °C przez noc w celu całkowitej elucji DNA, a następnie zamrozić zawartość w temperaturze -20 °C.

7. Ekstrakcja całkowitego DNA z organów roślin do metodologii metabarcodingu (zestaw komercyjny)

UWAGA: W przypadku poniższej metodologii konieczne jest zakupienie komercyjnego zestawu wskazanego w Tabeli materiałów jako zestaw do ekstrakcji DNA z gleby. Wszystkie materiały, roztwory i odczynniki użyte w tej sekcji muszą być sterylne. Te, których nie można nabyć w wersji sterylnej, należy poddać autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 20 min. Zaleca się noszenie rękawiczek przez cały czas trwania protokołu; poszczególne kroki można przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Opisany protokół jest modyfikacją metody De Souzy i wsp.12 oraz protokołu szczegółowo opisanego przez producenta.

  1. Za pomocą porcelanowych moździerzy i tłuczków rozetrzeć korzenie zebrane zgodnie z krokiem 1.2 w ciekłym azocie, aż próbki zostaną zredukowane do postaci drobnego proszku. Odważyć 0,3 g zmielonych próbek do probówek PowerBead i delikatnie wymieszać w celu homogenizacji.
  2. Do probówek PowerBead dodać 60 µL roztworu C1 (zawartego w zestawie) i wymieszać zawartość poprzez odwracanie probówek. Używając homogenizatora do tkanek i lizera komórkowego (Tabela materiałów), mocno przymocować probówki do odpowiedniego uchwytu, podłączyć uchwyt do wstrząsarki typu vortex i uruchomić urządzenie z maksymalną prędkością na 10-20 min.
    UWAGA: W przypadku wytrącenia się osadu w roztworze C1, należy go podgrzać do 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Wirować probówki z prędkością 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C. Przenieść 500 µL supernatantu do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Przeniesiona zawartość może zawierać cząstki stałe.
  4. Do probówek dodać 250 µL roztworu C2 i mieszać w vortexie przez 5 s. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min, a następnie wirować z prędkością 10 000 x g przez 1-2 min w temperaturze 25 °C.
  5. Przenieść ponad 600 µL supernatantu do nowych probówek 2 mL, unikając pobrania osadu. Dodać 200 µL roztworu C3 i mieszać w vortexie przez 5 s.
  6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 min, a następnie wirować z prędkością 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 25 °C. Na tym etapie należy upewnić się, że supernatant nie zawiera cząstek stałych.
  7. Przenieść ponad 750 µL supernatantu do nowych probówek 2 mL, unikając pobrania osadu. Dokładnie zhomogenizować roztwór C4, dodać 1 100 µL roztworu C4 do supernatantu i mieszać w vortexie przez 5 s.
  8. Nanieść 675 µL zawartości probówek do kolumn MB Spin Columns, bezpośrednio na filtr, i wirować z prędkością 10 000 x g przez 1 min w temperaturze 25 °C. Odrzucić ciecz.
  9. Powtórzyć poprzedni krok dwukrotnie, aż cała zawartość każdej probówki zostanie przetworzona. Następnie dodać 500 µL roztworu C5 na środek filtra znajdującego się w górnej kolumnie probówki i wirować z prędkością 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C.
  10. Odrzucić ciecz i ponownie wirować w tych samych warunkach co w poprzednim kroku. Ostrożnie przenieść górną kolumnę MB Spin Column do nowych probówek do mikrocentryfugi 2 mL, unikając skapywania cieczy z kolumny.
  11. Na środek filtra nanieść 85-100 µL roztworu C6 i odczekać 1 min. Wirować z prędkością 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C, a następnie usunąć kolumnę MB Spin Column. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.

8. Oznaczanie ilości DNA za pomocą spektrofotometru (patrz Tabela materiałów)

  1. Korzystając z wskazanego spektrofotometru, uruchom oprogramowanie. Wybierz opcję Nucleic acid, następnie opcję DNA i ustaw jednostkę stężenia na ng/µL.
  2. Nanieś 1 µL wody dejonizowanej na detektor spektrofotometru i przeprowadź kalibrację, wybierając opcję Blank. Po odczycie delikatnie przetrzyj detektor miękką chusteczką higieniczną.
  3. W polu nazwy próbki wpisz kod izolatu próbki przeznaczonej do pomiaru i nanieś 1 µL próbki na detektor urządzenia. Wybierz opcję Measure; program wygeneruje wykres oraz tabelę z wynikami.
  4. Powtarzaj krok 8.3, aż wszystkie próbki zostaną odczytane. Zaleca się zapisanie tabeli z wygenerowanymi wynikami w celu archiwizacji i analizy: wybierz opcję Reports oraz lokalizację zapisu pliku .xml.
  5. Nanieś 5 µL wody dejonizowanej na detektor, odczekaj kilka minut, a następnie delikatnie przetrzyj go miękką chusteczką higieniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W protokole izolacji, w przypadku stwierdzenia kontaminacji wodą użytą do ostatniego płukania oraz wykrycia zanieczyszczenia w szalkach Petriego z zaszczepionymi fragmentami, można podjąć różne działania w zależności od rodzaju kontaminantu (Tabela 1). Procedurę tę należy powtórzyć od początku w przypadku silnie sporulujących grzybów, które wykazują również przyspieszony wzrost, oraz intensywnie namnażających się bakterii opornych na wybrane antybiotyki. Natomiast jeśli k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powierzchowna dezynsekcja próbek roślin jest jednym z najbardziej krytycznych etapów w przedstawionym protokole. Brak zanieczyszczeń w naczyniach PDA kroplami z ostatniego mycia jest wysoce pożądany. Bakterie są często obserwowane jako zanieczyszczenia w naczyniach izolacyjnych, zwykle bardziej niż grzyby zarodnikujące w powietrzu, biorąc pod uwagę, że bakterie endofityczne są również powszechne w tkankach roślinnych 3,11. W związku z tym niezbędne jest dodanie a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy za dofinansowanie z FAPESP (2015/26479-6) i CNPq (447453/2014-9). JLSM dziękuje CNPq za dotacje na produktywność (303664/2020-7). MPP dziękuje Capes (stypendium magisterskie, proces 88887.600591/2021-00) i CNPq.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taśma(dowolnej firmy, do montażu taśmy klejącej w analizach mikromorfologicznych)
AmpicylinaSigma-AldrichA5354(do montażu fragmentów roślin; można stosować inne antybiotyki - sprawdź krok 2.2.1)
Autoklaw(od dowolnej firmy, do sterylizacji materiałów w wielu etapach)
Agar bakteriologicznySigma-AldrichA1296(dla wielu kroków)
Roztwory C1, C2, C3, C4, C5 i C6Qiagen12888-50(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)
Wirówka   Merck/Eppendorf5810 G(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Probówki wirówkoweMerckCLS430828(do pobierania próbek)
ChloroformSigma-AldrichC2432(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Czerwień kongijskaSupelco75768(do barwienia strzępek)
CryotubesMerckBR114831do wiele kroków)
EtanolSupelco100983Konieczne będzie przeprowadzenie odpowiednich rozcieńczeń (dla wielu etapów)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-Aldrich3609(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Bibuła filtracyjnaMerckWHA10010155(dla wielu etapów)
Szklane probówkiMerckCLS7082516(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
Wata szklanaSupelco20411(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
GlukozaSigma-AldrichG8270Lub dekstroza (do kriokonserwacji w wermikulicie)
GlicerolSigma-AldrichG5516Lub gliceryna (do kriokonserwacji w wermikulicie, do przygotowania LPCB)
IzopropanolSigma-Aldrich563935(do całkowitej ekstrakcji DNA z grzybów izolaty)
Kwas mlekowySigma-Aldrich252476(do przygotowania LPCB - barwienie strzępek)
Roztwór błękitu laktofenolowego (LPCB)Sigma-Aldrich61335(do barwienia strzępek)
Okap(klasa I, z dowolnej firmy, do wielu kroków)
Mikroskopz dowolnej firmy, do obserwacji strzępek)
MB Spin KolumnyQiagen12888-50(do kupienia z zestawem DNeasy PowerSoil)
Błękit metylowy (niebieski bawełniany)Sigma-AldrichM5528(do przygotowania LPCB - barwienie strzępkami)
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)MerckHS4323(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Probówka do mikrowirówek (2 ml)BR780546Merck(do wielu etapów)
Olej mineralny(do konserwacji izolatów grzybów)
WorkiŚredni rozmiar 150 mm x 200 mm (do pobierania próbek)
Szalka Petriego (szkło, 120 mm x 20 mm)Merck/PyrexSLW1480/10D(autoklawowalne, do hodowli grzybów, preferuj wyższe)
Szalka Petriego (szkło, 50 mm x 17 mm)Merck/AldrichZ740618(do oczyszczania izolatów grzybów); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowane)
Szalka Petriego (szkło, 80 mm x 15 mm)Merck/BrandBR455732do montażu fragmentów roślin); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, &napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowalne)
FenolSigma-AldrichP1037(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów, do przygotowania LPCB)
Porcelana moździerzSigma-AldrichZ247464(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Tłuczek porcelanowySigma-AldrichZ247502(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)MiliporP2182(dla wielu kroków)
Rurki PowerBeadQiagen12888-50(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)
Szybki montaż podłoże (Entellan)Sigma-Aldrich1.0796(do hodowli szkiełka grzybowego)
Żel krzemionkowySupelco717185(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS9888(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771Sól sodowa laurylosiarczanu (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Podchloryn sodu (z 2% aktywnym chlorem)(produkt handlowy, do powierzchownego usuwania
zanieczyszczeń)Zestaw do ekstrakcji DNA z gleby (zestaw DNeasy PowerSoil)Qiagen12888-50(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Spektrofotometr - Nanodrop 2000/2000cThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Mikroskopstereoskopowy(=mikroskop preparacyjny, dowolnej firmy, do analiz makromorfologicznych)
TetracyklinaSigma-AldrichT7660(do instalacji fragmentów roślin)
TermoblokMerck/EppendorfEP5362000035(lub z innych firm)
Homogenizator tkankowy i lizer komórkowySPEX SamplePrep2010 Geno / Grinder - Automatyczny homogenizator tkanek i lizer komórkowy (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Błękit toluidynowy OSigma-Aldrich / Harleco364-M(do barwienia strzępek)
TrehalozaSigma-AldrichT9531(do kriokonserwacji w wermikulicie)
Roztwór podstawowy Tris (Tris)Sigma-AldrichT1699(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Niełuskane ziarna(do krioprezerwacji)
Prętlitery U (lub adaptacja - sprawdź krok 5.4.1, do hodowli szkiełka grzybowego)
WermikulitDrobna granulometria (do kriokonserwacji w wermikulicie)
VortexerSigma-Aldrich/BenchMixerBMSBV1000(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1625(do kriokonserwacji w wermikulicie)
klejąca ( z przepływem laminarnym świetlny( papierowe ( ryżu szklany w kształcie

Bibliografia

  1. de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
  2. Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
  3. Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
  4. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
  5. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  6. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  7. Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
  8. Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
  9. Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
  10. Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777(2022).
  11. Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257(2014).
  12. de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774(2016).
  13. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).
  14. Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
  15. Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
  16. Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. Fungi from orchid mycorrhizas. Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).
  17. Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069(2020).
  18. Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
  19. Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
  20. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  21. Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
  22. Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
  23. Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
  24. Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
  25. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  26. Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
  27. Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
  28. Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
  29. Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
  30. Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
  31. McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
  32. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  33. Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
  34. Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
  35. Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
  36. Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
  37. Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
  38. Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
  39. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  40. Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
  41. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  42. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  43. Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
  44. Metzker, M. L. Sequencing technologies-the next generation. Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:

Juliana Lishcka Sampaio Mayer

to:

Juliana Lischka Sampaio Mayer

Tagi

Izolacja grzyb wmetody zale ne od hodowlimetody niezale ne od hodowlimetoda hodowli na szkie kukie kowanie symbiotyczneanaliza metagenomicznamikroskopia wietlna

Powiązane artykuły