Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Podsumowanie

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Streszczenie

Rośliny mykoheterotroficzne prezentują jedną z najbardziej ekstremalnych form zależności mikoryzowej, całkowicie utraciwszy swoją zdolność autotroficzną. Tak samo niezbędne jak każdy inny ważny zasób, grzyby, z którymi te rośliny są ściśle powiązane, są dla nich niezbędne. W związku z tym niektóre z najbardziej odpowiednich technik w badaniu gatunków mykoheterotroficznych to te, które umożliwiają badanie powiązanych grzybów, zwłaszcza tych zasiedlających korzenie i organy podziemne. W tym kontekście powszechnie stosuje się techniki identyfikacji grzybów endofitycznych zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Izolowanie endofitów grzybów zapewnia środki do ich morfologicznej identyfikacji, analizy ich różnorodności i utrzymania inokulum do zastosowań w symbiotycznym kiełkowaniu nasion orchidei. Wiadomo jednak, że w tkankach roślinnych występuje duża różnorodność grzybów nienadających się do hodowli. W związku z tym niezależne od kultury techniki identyfikacji molekularnej oferują szerszy zakres różnorodności i liczebności gatunków. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie wsparcia metodologicznego niezbędnego do wszczęcia dwóch postępowań wyjaśniających: zależnego od kultury i niezależnego postępowania wyjaśniającego. Jeśli chodzi o protokół zależny od hodowli, szczegółowo opisano procesy pobierania i utrzymywania próbek roślin z miejsc pobierania do obiektów laboratoryjnych, wraz z izolacją grzybów strzępkowych z podziemnych i powietrznych organów roślin mykoheterotroficznych, utrzymywaniem kolekcji izolatów, morfologicznie charakteryzowaniem strzępek za pomocą metodologii hodowli szkiełkowej oraz identyfikacją molekularną grzybów przez całkowitą ekstrakcję DNA. Szczegółowe procedury, obejmujące metodologie niezależne od hodowli, obejmują pobieranie próbek roślin do analiz metagenomicznych i całkowitą ekstrakcję DNA z achlorofilnych organów roślinnych przy użyciu komercyjnego zestawu. Wreszcie, do analiz sugerowane są również protokoły ciągłości (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], sekwencjonowanie) i przedstawiono tutaj techniki.

Wprowadzenie

Grzyby endofityczne to z definicji te, które zamieszkują wnętrze organów i tkanek roślin w niepozornych infekcjach (tzn. nie wyrządzając szkody swojemu gospodarzowi)^1,2. Grzyby te mogą neutralnie lub korzystnie wchodzić w interakcje z roślinami żywicielskimi, mogą nadawać odporność na patogeny i niekorzystne warunki środowiskowe oraz mogą przyczyniać się do syntezy korzystnych dla rośliny związków (np. czynników wzrostu i innych fitohormonów)^1,3. Endofity mikoryzowe to grzyby, które tworzą związki mikoryzowe z rośliną, biorąc udział w transferze składników odżywczych⁴. U Orchidaceae interakcja z endofitami mikoryzowymi ma fundamentalne znaczenie dla kiełkowania nasion u zdecydowanej większości gatunków i zakładania siewek u wszystkich roślin z rodziny⁵. W takich kontekstach storczyki mykoheterotroficzne reprezentują przypadek całkowitej zależności od swoich partnerów mikoryzowych, ponieważ są zależne od mineralnych składników odżywczych i przenoszenia związków węgla przez te grzyby podczas całego ich cyklu życia⁶. Dlatego izolacja i identyfikacja grzybów asocjacyjnych jest fundamentalną podstawą do badania mykoheterotroficznych strategii życiowych. Co więcej, niewiele wiadomo o roli endofitów grzybów w roślinach mykoheterotroficznych, a nawet o rzeczywistej różnorodności tych grzybów^7,8.

Badanie grzybów endofitycznych może być prowadzone za pomocą różnych technik, tradycyjnie opisywanych jako niezależne od kultury lub zależne, na przykład: (a) bezpośrednia obserwacja, (b) izolacja grzybów i identyfikacja morfologiczna i/lub molekularna, oraz (c) całkowita ekstrakcja DNA tkanek roślinnych i identyfikacja molekularna⁹. W bezpośredniej obserwacji (a) grzyby endofityczne mogą być badane jeszcze we wnętrzu komórek i tkanek roślinnych za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej⁹, ponieważ różne protokoły mikroskopowe są szczegółowo opisane przez Pena-Passos et al.¹⁰. Za pomocą metod izolacji (b) endofity grzybów można scharakteryzować zgodnie z ich koloniami, strzępkami i morfologią struktury rozrodczej lub odpornościowej. Ponadto, dzięki technikom izolacji, możliwe jest przeprowadzenie identyfikacji molekularnej izolatów poprzez ekstrakcję DNA, amplifikację sekwencji identyfikacji molekularnej (kody kreskowe lub odciski palców) oraz sekwencjonowanie¹¹. Ta ostatnia technika (c) umożliwia molekularną identyfikację grzybów endofitycznych podczas ekstrakcji DNA we wnętrzu tkanek roślinnych (metabarcoding), a następnie przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie¹².

Ponadto, izolaty grzybów mogą być stosowane w próbach kiełkowania symbiotycznego, przy użyciu nasion z autotroficznych lub mykoheterotroficznych storczyków. Przykładem takiego zastosowania jest badanie przeprowadzone przez Sisti et al.¹³, opisujące kiełkowanie i początkowe etapy rozwoju protokormu u Pogoniopsis schenckii, mykoheterotroficznej storczyki, w połączeniu z niektórymi jej izolatami, zawierającymi niemikoryzowe grzyby endofityczne. Zastosowany protokół kiełkowania symbiotycznego jest szczegółowo opisany i przedstawiony w filmie autorstwa Pena-Passos et al.¹⁰. Izolowanie grzybów w połączeniu z różnymi organami roślinnymi pozwala na różnorodne badania dotyczące natury interakcji roślina-grzyb (np. w celu zrozumienia ekologicznych lub fizjologicznych aspektów związku, a także dociekania dotyczące przenoszenia składników odżywczych z grzybów do rośliny)⁹.

Metodologie przedstawione w sekcji 1 opierają się na zbiorze próbek narządów pochodzących z podziemi, ponieważ te organy są najtrudniejsze do pobrania, a są one bardzo interesujące, ponieważ kolonizują je endofity mikoryzowe. Jednak oba zawarte protokoły (kroki 1.1 i 1.2) mogą być stosowane do innych mykoheterotroficznych organów roślinnych (np. kłączy, łodyg kwiatowych i owoców). Metodologia zbierania opisana w kroku 1.1 jest przeznaczona do izolowania grzybów endofitycznych (sekcja 2) w celu charakterystyki morfologicznej (sekcje 4 i 5) i/lub całkowitej ekstrakcji DNA w celu identyfikacji izolatu (sekcja 6). Z drugiej strony, metodologia pobierania opisana w kroku 1.2 jest przypisana wyłącznie do całkowitej ekstrakcji DNA z tkanek roślinnych do technik metabarcodingu (sekcja 7). W rozdziale 3 przedstawiono cztery metody przechowywania i konserwacji grzybów strzępkowych, dwie do przechowywania krótkotrwałego (3-6 miesięcy) i dwie pozostałe odpowiednie do przechowywania długoterminowego (>1 rok). Charakterystyka morfologiczna (sekcje 4 i 5) może być związana z identyfikacją molekularną w celu jej wzmocnienia i dostarczenia ważnych informacji na temat makro- i mikromorfologii grzybów. Rysunek 1 podsumowuje opisane poniżej zbiorowe metodologie.

Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie prezentowanych metod. Zbieranie roślin i izolacja, konserwacja i identyfikacja molekularna grzybów za pomocą metodologii zależnych i niezależnych od kultur. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Pobieranie próbek roślin

1. Pobieranie próbek do metod zależnych od kultury
   1. Ostrożnie wykop podziemne organy; mogą to być korzenie, łodygi, kłącza lub organy spichrzowe rośliny, która ma być zebrana. Oprócz gleb o dużej zagęszczeniu, próbki te należy pobierać ręcznie.
      UWAGA: Stosowanie na tym etapie narzędzi takich jak kielnie lub szufelki jest niewskazane, ponieważ może to uszkodzić delikatne struktury roślin mykoheterotroficznych i spowodować zanieczyszczenie tkanek grzybami nieendofitycznymi.
   2. Zbierz jak najwięcej podziemnych organów. Próbki należy przechowywać w papierowych torebkach wewnątrz schłodzonego pojemnika (np. pudełka z pianki polistyrenowej lub torby termicznej z lodem). Jeśli zbierane są również organy powietrzne, należy je transportować oddzielnie od naziemnych.
2. Pobieranie próbek do metod niezależnych od hodowli
   1. Ostrożnie wykop korzenie rośliny, która ma zostać zebrana, zgodnie z tymi samymi zaleceniami wskazanymi w UWAGA z kroku 1.1.1.
   2. Zbierz jak najwięcej podziemnych organów. Zebrane próbki należy przechowywać w krioprobówkach wewnątrz ciekłego azotu (opcja pożądana) lub używać probówek wirówkowych otoczonych suchym lodem (opcja alternatywna). Utrzymuj narządy powietrzne oddzielnie, jeśli zostały zebrane.

2. Izolacja grzybów endofitycznych związanych z organami roślinnymi¹⁴

UWAGA: Każdy materiał, roztwór i odczynnik użyty w tej sekcji musi być sterylny. Te, których nie można kupić już wysterylizowanych, należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.

1. Powierzchowna dezynsekcja organów roślinnych
   1. Umyć pobrane próbki (etap 1.1.2) pod bieżącą wodą i usunąć jak najwięcej podłoża i innych zanieczyszczeń, jakie mogą znajdować się w próbkach.
   2. Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym umyte próbki należy utrzymywać zanurzone w 70% etanolu przez 1 minutę (można użyć zlewki lub szklanego słoika).
   3. Przenieść próbki do innego pojemnika z podchlorynem sodu z 2% aktywnym chlorem na 3 minuty.
   4. Przenieść próbki do pojemnika z 70% etanolem i pozostawić w zanurzeniu przez 1 minutę. Następnie umyj próbki kolejno w dwóch pojemnikach wodą destylowaną.
2. Instalacja fragmentów roślin w pożywce hodowlanej
   UWAGA: Każdy krok opisany w kroku 2.2 musi być wykonany wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
   1. Przed montażem należy przygotować szalki Petriego (o średnicy 8-10 cm) z 19,5 g/l pożywki do hodowli agarowych z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) + 7 g/l agaru bakteriologicznego + 3 ml/l antybiotyków (np. streptomycyny, penicyliny, tetracykliny, ampicyliny).
   2. Utrzymywać szalki Petriego z pożywką w temperaturze 36 °C przez 24 godziny przed ich użyciem, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczenia. Wyrzuć naczynia zanieczyszczone koloniami bakterii lub grzybów.
      UWAGA: Dodanie antybiotyków do pożywki jest niezbędne na tym etapie, ponieważ narządy są silnie zakażone bakteriami, które mogą hamować rozwój grzybów. Sprawdź, czy antybiotyki mogą być podgrzewane podczas autoklawowania; niektóre antybiotyki należy dodać po schłodzeniu pożywki do około 36 °C (przed umieszczeniem jej w naczyniach).
   3. Natychmiast po powierzchownym odynczeniu próbek, nadal w okapie z przepływem laminarnym, w PDA, zaszczepić kilka kropli wody destylowanej z ostatniego pojemnika używanego do mycia próbek. Ten etap jest ważny dla oceny skuteczności powierzchownej dezynsekcji próbek.
   4. W pustym naczyniu z autoklawizem umieść próbki i za pomocą podpalonego skalpela i kleszczy pokrój próbki na grubość około 0,2 cm.
   5. W razie potrzeby należy przeciąć cylindryczne próbki wzdłużnie na dwie połowy, aby wzmocnić powierzchnię stykającą się z medium. Aby lepiej wyeksponować owoce i inne bardziej kuliste narządy, dokładnie posiekaj lub pokrój struktury. Nasiona mogą być również ważnym źródłem grzybów, więc upewnij się, że podzielony na sekcje owoc wystawia je na działanie podłoża.
      UWAGA: Do izolacji endofitów grzybów należy używać tylko zdrowych narządów, bez uszkodzeń tkanek lub sygnałów możliwych chorób lub infekcji chorobotwórczych.
   6. Rozprowadź pięć fragmentów podziemnych organów na szalkach Petriego za pomocą PDA + antybiotyk. Upewnij się, że fragmenty są jak najdalej od siebie, a także nie dotykają krawędzi naczynia. Nie układaj żadnych fragmentów na podłożu. Przygotować repliki każdego zainstalowanego narządu, jako środek ostrożności na wypadek zanieczyszczenia.
   7. Uszczelnić szalki Petriego folią spożywczą i przechowywać je w ciemności w temperaturze 25-27 °C (najlepiej w inkubatorze) przez 5 dni.
3. Rachunek częstotliwości izolacji (IF)¹¹
   1. Po 5 dniach inkubacji fragmentów narządów oblicz IF, zgodnie z liczbą inkubowanych fragmentów, które prezentują rosnące kolonie grzybów, podzieloną przez całkowitą liczbę inkubowanych fragmentów, zgodnie z następującym równaniem:
      
4. Oczyszczanie izolatów grzybów przez prążkowanie i subkulturowanie
   UWAGA: Każdy krok opisany w kroku 2.4 musi być wykonany wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
   1. Przygotować szalki Petriego (o średnicy 5 cm) z agarem o sile 5-7 g/l (AA; tylko agar bakteriologiczny). Naczynia należy przechowywać przez 24 godziny w temperaturze 36 °C, aby wyeliminować potencjalnie zanieczyszczone.
   2. Zidentyfikuj każdą wyhodowaną kolonię grzybów za pomocą kodu i wyznacz jej marginesy na dolnej stronie naczynia (można to zrobić za pomocą trwałego markera). Różnicuj kolonie według koloru, wzoru wzrostu, tekstury i formatu marginesów.
   3. Za pomocą autoklawizowanej drewnianej wykałaczki, używając cienkiej końcówki, odzyskaj niewielką ilość grzybni z kolonii grzybów. Skoncentruj się najlepiej na obrzeżach kolonii i wybierz obszar jak najdalej od innej kolonii, unikając odzyskiwania więcej niż jednego rodzaju kolonii na raz.
   4. Używając tej samej wykałaczki z grzybnią na końcu, naciąć AA, tworząc trzy prążki (rowki). Upewnij się, że każde prążki znajdują się w odległości 1 cm od drugiego, a krawędzie naczynia. Napisz odpowiedni kod (używając papieru samoprzylepnego i ołówka), zamknij naczynia i utrzymuj je w inkubacji w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 3 dni.
   5. Przygotuj szalki Petriego (o średnicy 8 cm) z 39 g/l PDA. Na tym etapie nie jest konieczne dodawanie antybiotyków.
   6. Po inkubacji szalek AA skrupulatnie obserwuj je pod światło (z lampy lub okna), dążąc do zidentyfikowania drobnych strzępek tworzących poszczególne kolonie. Określ obszar pojedynczej kolonii na każdej szalce, używając trwałego markera na spodniej stronie szalki Petriego.
   7. W okapie z przepływem laminarnym użyj autoklawowanej wykałaczki, aby przeciąć część pożywki zawierającej kolonię i przenieś naciętą objętość na środek nowej naczynia PDA.
   8. Zidentyfikuj szalki Petriego za pomocą kodów izolatów, uszczelnij szalki folią spożywczą i utrzymuj je w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 7-14 dni.

3. Zachowanie oczyszczonych izolatów grzybów

UWAGA: Każdy materiał, roztwór i odczynnik użyty w tej sekcji musi być sterylny. Te, których nie można kupić już wysterylizowanych, należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.

1. Konserwacja metodą Castellaniego lub w oleju mineralnym (3-6 miesięcy)^11,15
   1. Przygotuj 2 ml mikroprobówek wirówkowych z 0,5 ml wody destylowanej lub zawierających 0,5 ml oleju mineralnego (w zależności od wybranej metody). Upewnij się, że probówki są autoklawowane puste, a autoklawowana woda i olej są dodawane do probówek wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
   2. W okapie z przepływem laminarnym umieść szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami już wyhodowanymi w PDA (39 g/l) na 7-14 dni. Za pomocą autoklawizowanej wykałaczki wytnij małe prostopadłościany (0,5 cm x 0,5 cm w górnej części) z podłoża zawierającego brzegi grzybni.
   3. Umieść od czterech do sześciu prostopadłościanów w probówkach mikrowirówek z wodą destylowaną (metoda Castellaniego) lub olejem mineralnym. Probówki należy przechowywać w ciemności, w temperaturze 25 °C tak długo, jak jest to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.
      UWAGA: Unikaj dodawania zbyt wielu prostopadłościanów do probówek i zapełniania ich, co może zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia. Możliwe jest utrzymywanie rur w stanie schłodzonym, co może sprzyjać dłuższemu przechowywaniu niektórych izolatów. Currah et al.¹⁶ zalecają przechowywanie replik izolatów grzybów mikoryzowych z tropikalnych storczyków zarówno w lodówce, jak i w temperaturze 25 °C, ponieważ mogą one zostać utracone podczas przechowywania w chłodni.
   4. Odzyskaj prostopadłościan i umieść go na środku nowego naczynia PDA, aby wyhodować przechowywany izolat.
2. Kriokonserwacja w niełuskanych ziarnach ryżu (>1 rok)¹⁷
   1. Niełuskane ziarna ryżu umyć pod bieżącą wodą i gotować je, aż łuska ryżu zacznie się otwierać. Rozprowadzić ugotowane ziarna w szklanych probówkach z nakrętką i dwukrotnie w autoklawie w odstępie 24 godzin.
   2. W okapie z przepływem laminarnym umieść szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami już wyhodowanymi w PDA (39 g/l) na 7-14 dni. Używając autoklawowanej wykałaczki, odzyskaj pięć małych fragmentów strzępek z brzegów grzybni i zaszczep je w probówce zawierającej autoklawowane ziarna ryżu.
      UWAGA: Zaszczepianie strzępek w różnych punktach i na różnych głębokościach rurki gwarantuje, że izolat skolonizuje niełuskane ziarna ryżu w krótszym czasie.
   3. Inkubować probówki w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 14 dni. Mieszaj rurki, wirując je co 3 dni, aby ziarna były zindywidualizowane.
   4. Po zaobserwowaniu wzrostu grzybów w ziarnach ryżu, rozprowadź ziarna na autoklawowanej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną w celu wchłonięcia wilgoci, na bibułze, aby ziarna mogły wyschnąć. Przechowywać w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 2-3 dni.
   5. Przygotuj krioprobówki z 1/3 żelu krzemionkowego na dnie i 1/3 waty szklanej nad krzemionką. Na koniec rozprowadź 1/3 ziaren ryżu z wyhodowaną grzybnią. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 24 godziny.
   6. Po 24 godzinach przechowywać krioprobówki w temperaturze -80 °C tak długo, jak to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.
3. Kriokonserwacja w wermikulicie przy użyciu krioprotektantu (>1 rok)¹⁸
   1. Przygotować płynną pożywkę hodowlaną złożoną z 0,2% ekstraktu drożdżowego i 2% glukozy w wodzie destylowanej. Dostosuj pH do 5 i przeprowadź autoklawow.
   2. Rozprowadzić 0,2 g wermikulitu (użyć drobnej granulometrii) w krioprobówkach z zakrętką i autoklawować. Dodać 0,8 ml autoklawowanego płynnego podłoża do krioprobówek zawierających wermikulit.
   3. W okapie z przepływem laminarnym umieść szalki Petriego z oczyszczonymi izolatami już wyhodowanymi w PDA (39 g/l) na 7-14 dni. Używając autoklawizowanej wykałaczki, odzyskaj od trzech do pięciu fragmentów strzępek z brzegów grzybni i zaszczepij wzdłuż probówki zawierającej wermikulit + płynną pożywkę hodowlaną. Pamiętaj, aby zidentyfikować krioprobówki odpowiednim kodem izolatu.
      UWAGA: Zaszczepianie strzępek w różnych punktach i głębokościach krioprobówki gwarantuje, że izolat skolonizuje wermikulit w krótszym czasie.
   4. Przechowuj krioprobówki w ciemności w temperaturze 25-27 °C, dopóki nie zaobserwuje się kolonizacji większości ziaren wermikulitu, co zwykle trwa około 14 dni.
   5. Przygotować roztwór krioprotektantu składający się z 5% glicerolu i 5% trehalozy w wodzie destylowanej i zalać go w autoklawie. Poczekaj, aż roztwór ostygnie przed użyciem.
   6. Po skolonizowaniu wermikulitu w krioprobówkach przez odpowiedni izolat grzybów, rozprowadzić 0,4 ml krioprotektantu w każdej probówce i przechowywać krioprobówki w lodówce w temperaturze 4 °C przez 48 godzin. Następnie należy utrzymywać krioprobówki w temperaturze -80 °C tak długo, jak to konieczne, przestrzegając ograniczeń czasowych metody.

4. Charakterystyka makromorfologiczna grzybów strzępkowych (morfologia kolonii)

1. Utrzymuj fotograficzny rejestr grzybni wyhodowanej na każdej szalce Petriego z 39 g/l PDA przez 7-14 dni. Pamiętaj, aby zarejestrować obie strony kolonii, górną i dolną (odwrotną). Jeśli naczynia mają być chętnie używane w sekcji 6 lub nie są konserwowane, otwórz naczynia podczas ich fotografowania, aby uzyskać lepsze zdjęcia.
2. Jeśli interesują nas dane ilościowe dotyczące morfologii kolonii, subkultura replikuje izolaty i utrzymuje je w tych samych warunkach wzrostu i przez stały okres, aby zarejestrować średnicę kolonii i obliczyć tempo wzrostu (zwykle w mm/h).
   UWAGA: Bardziej wyrafinowane wyniki ilościowe można osiągnąć, używając różnych typów pożywek hodowlanych do porównania¹⁹ i biorąc pod uwagę narzędzia statystyczne do przetwarzania danych.
3. Obserwuj kolonie również pod mikroskopem stereoskopowym, aby zidentyfikować cechy morfologiczne i sfotografować w powiększeniu. Oceń kolonie zgodnie z ich cechami makromorfologicznymi, jak opisano w sekcji wyników. Zapoznaj się z różnymi źródłami bibliograficznymi, aby pomóc w kategoryzacji i powiązaniu makromorfologii z identyfikacją molekularną i/lub morfologiczną.

5. Charakterystyka mikromorfologiczna grzybów strzępkowych (morfologia strzępek)

UWAGA: Techniki mikromorfologiczne są porównane w sekcji dyskusji, biorąc pod uwagę ich możliwe zastosowania i wady.

1. Hoduj izolaty na szalkach Petriego z 39 g/l PDA przez 7-14 dni. W celu oceny przypuszczalnych grzybów mikoryzowych storczyków, hoduj izolaty na agarze z mączki kukurydzianej o gramaturze 17 g / l (CMA; lub innym podłożu ograniczającym składniki odżywcze) przez 3-7 dni¹⁹.
2. Mocowanie drażnienia
   1. Pracuj wewnątrz okapu z przepływem laminarnym. Umieść kroplę wybranej plamy (krok 5.5) na czystym szkiełku podstawowym.
   2. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki lub innego sterylnego materiału ostrożnie usuń strzępki z wyhodowanego izolatu i umieść je w kropli plamy. Umieść szkiełko nakrywkowe (najlepiej pod początkowym kątem 45°, aby uniknąć pęcherzyków powietrza) i przeanalizuj pod mikroskopem świetlnym.
3. Taśma klejąca mount
   UWAGA: Technika ta jest zwykle stosowana w kulturach grzybów, które mają być łatwo stosowane w sekcji 6 lub nie są konserwowane, ponieważ taśmy klejącej nie można sterylizować w autoklawie, a po zastosowaniu metody mogą wystąpić zanieczyszczenia.
   1. Umieść kroplę wybranej plamy (krok 5.5) na czystym szkiełku podstawowym. Wytnij pasek przezroczystej taśmy klejącej w rozmiarze, który dobrze pasuje do szkiełka i centralnej plamy.
   2. Skieruj lepką powierzchnię paska na powierzchnię grzybni. Nie naciskaj i spróbuj zebrać strzępki, nie przyklejając ich zbyt wiele.
   3. Przyklej taśmę do szkiełka podstawowego, upewniając się, że plama styka się z zebranymi strzępkami. Umieść kroplę wody nad taśmą i umieść szkiełko nakrywkowe. Przeanalizuj szkiełko pod mikroskopem świetlnym.
4. Hodowla szkiełkowa grzybów strzępkowych²⁰
   1. Wewnątrz dużej szalki Petriego (najlepiej o średnicy >9 cm) umieść: bibułę filtracyjną w dolnej części, szklany pręt w kształcie litery U lub adaptację (celem jest zapewnienie podniesienia szkiełka), jedno szkiełko podstawowe i dwa szkiełka nakrywkowe. Wyższe szalki Petriego ułatwiają manipulację. Zestawy szalek Petriego należy sterylizować w autoklawie, po jednym dla każdego izolatu.
   2. Przygotować małą objętość 39 g/l PDA lub 17 g/l CMA, dodać 10 g/l agaru bakteriologicznego i autoklaw (objętość na jedną szalkę Petriego wystarcza na ponad 30 izolatów). Pożywki używane w hodowli szkiełek muszą być twardsze niż zwykłe podłoża. Autoklaw 100 ml wody destylowanej.
   3. Pracuj wewnątrz okapu z przepływem laminarnym. Umieść płynne podłoże na szalce Petriego, tworząc warstwę o wysokości około 0,5 cm. Niech podłoże stężeje. Po zestaleniu użyj sterylnego skalpela, aby wyciąć kwadraty podłoża o wymiarach 1 cm x 1 cm.
   4. Otwórz zestaw szalek Petriego w okapie z przepływem laminarnym i użyj flamastrowanych kleszczy, aby uporządkować materiał autoklawowany wewnątrz naczynia. Ułóż materiał w ponumerowanej kolejności, jak pokazano na Rysunek 2A, umieszczając kwadrat pożywki hodowlanej na szkiełku podstawowym. Przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego na podłożu należy przejść do kroku 5.4.5.
   5. Użyj autoklawizowanej wykałaczki, aby odzyskać strzępki z izolatu i ostrożnie przetrzyj cztery boczne powierzchnie podłoża umieszczonego na szklanym szkiełku. Umieść autoklawizowane szkiełko nakrywkowe na podłożu za pomocą palnych kleszczy.
   6. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby umieścić autoklawowaną wodę w bibule filtracyjnej, aby utworzyć wilgotną komorę. Użyj objętości, aby nasycić papier bez nadmiaru wody. Uszczelnić szalkę Petriego folią spożywczą i oznaczyć ją odpowiednim kodem izolatu. Trzymaj naczynia w ciemności w temperaturze 25-27 °C przez 3-7 dni.
   7. Oceń wzrost strzępek na szkiełku podstawowym i szkiełku nakrywkowym. Z każdego zestawu do hodowli szkiełek podstawowych wytwarza się dwa szkiełka, jedno z użyciem szkiełka podstawowego ze strzępkami i autoklawowanego szkiełka nakrywkowego, drugie z użyciem szkiełka nakrywkowego ze strzępkami i kolejnego szkiełka
   podstawowego.
   8. Po zaobserwowaniu wzrostu strzępek, ostrożnie odłącz kwadrat podłoża od szkiełka podstawowego (Rysunek 2B), zamontuj oba szkiełka za pomocą wybranej plamy (krok 5.5) i przeanalizuj pod mikroskopem świetlnym. Pamiętaj, aby zidentyfikować kod izolacji na szkiełku. Aby wykonać szkiełka półtrwałe, uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.
   9. Aby uzyskać trwałe szkiełka, po zabarwieniu ostrożnie zmyj barwnik z przylegających strzępek i pozostaw szkiełko do wyschnięcia. Zamontuj za pomocą medium do szybkiego montażu (szczegóły przeczytaj Pena-Passos et al.¹⁰).
      UWAGA: Wadą wytwarzania trwałego szkiełka tą techniką jest to, że zarodniki i struktury, które nie przylegają do szkła, mogą zostać umyte.
5. Metody barwienia i obserwacja strzępek
   1. Laktofenol bawełniany niebieski (LPCB)²¹: Dodaj 20 ml kwasu mlekowego, 40 ml glicerolu i 20 ml wody destylowanej. Rozpuść 20 g kryształów fenolu w tym roztworze, delikatnie podgrzewając. Rozpuścić 0,05 g błękitu metylowego (błękitu bawełnianego lub 2 ml 1% roztworu wodnego). LPCB można również łatwo nabyć już przygotowane.
      UWAGA: Fenol jest wysoce toksyczny i lotny; Manipuluj nim wyłącznie pod wyciągiem i noś rękawice.
   2. Błękit toluidynowy O¹⁰(TBO): Przygotować 0,05% TBO w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 6,8).
   3. Kongo red^22,23,24: Przygotuj roztwór 1% czerwieni Kongo w wodzie destylowanej i przefiltruj go. Inkubować przez 5-10 minut. Barwnik ten może być również stosowany do mikroskopii fluorescencyjnej²⁵.
   4. Obserwując i fotografując strzępki grzybów pod mikroskopem świetlnym, należy zapoznać się z różnymi źródłami bibliograficznymi, które pomogą zidentyfikować struktury (sprawdź dyskusję).

Rysunek 2: Procedury hodowli preparatów grzybów strzępkowych. (A) Schematyczna konfiguracja zestawu do hodowli preparatów, gdzie liczby wskazują kolejność rozmieszczenia elementów. (B) Oderwanie kwadratu pożywki hodowlanej po zaobserwowaniu wzrostu strzępek na szkiełku podstawowym i szkiełku nakrywkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Całkowita ekstrakcja DNA z izolatów grzybów (domowy protokół²⁶ z modyfikacjami ²⁷)

UWAGA: Każdy materiał, roztwór i odczynnik użyty w tej sekcji musi być sterylny. Te, których nie można kupić już wysterylizowanych, należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Przez cały czas trwania protokołu należy nosić rękawice i wykonywać niektóre etapy w dygestorium.

1. Przygotować bufor ekstrakcyjny: 1% dodecylosiarczan sodu (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 25 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Hoduj oczyszczone izolaty w 39 g/l PDA przez 7-14 dni.
2. Ostrożnie zeskrobać grzybnię z izolatu za pomocą szpatułki lub łyżki i przenieść fragmenty do autoklawizowanego moździerza, unikając przenoszenia pożywki hodowlanej z agregatem strzępek. Używając porcelanowego tłuczka, zmiel grzybnię ciekłym azotem na drobny proszek. Nie pozwól, aby mielona grzybnia stopiła się, dodając azot, aby tego uniknąć.
3. Dodać 1 ml buforu ekstrakcyjnego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i umieścić zmieloną próbkę do oznaczenia 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj zawartość probówek do homogenizacji.
4. Mieszać probówki w wirze przez 5 s i umieścić je w termobloku w temperaturze 65 °C na 20 minut. Ostrożnie homogenizować zawartość przez odwrócenie co 7-10 minut.
5. Odwirować probówki o sile 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść 800 μl z fazy nadrzędnej do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml, dodać do probówek 800 μl fenolu i wymieszać zawartość przez inwersję.
   UWAGA: Fenol jest wysoce toksycznym i lotnym odczynnikiem; Może powodować rumień, zgorzel i martwicę tkanek. Wdychany może powodować duszność i kaszel. Wchłanianie ogólnoustrojowe może uszkodzić wątrobę, nerki i ośrodkowy układ nerwowy. Manipuluj fenolem wyłącznie wewnątrz dygestorium i noś rękawice.
   UWAGA: Od następnego kroku używaj rękawiczek i postępuj zgodnie z protokołem wewnątrz dygestorium.
6. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść 800 μl z fazy górnej do nowej probówki o pojemności 2 ml, ostrożnie unikając przenoszenia zawartości fazy dolnej.
7. Dodać 400 μl fenolu i 400 μl chloroformu do probówek i wymieszać zawartość przez odwrócenie. Odwirować je przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Chloroform jest wysoce toksycznym i lotnym odczynnikiem; W kontakcie ze skórą może powodować podrażnienia i urazy, a w przypadku wdychania wpływa na ośrodkowy układ nerwowy i krążeniowo-oddechowy, wątrobę i nerki. Manipulować chloroformem wyłącznie wewnątrz dygestorium i nosić rękawice.
8. Odzysk 800 μl lub mniej z fazy nadrzędnej do nowej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 800 μl chloroformu, wymieszać zawartość przez odwrócenie i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Na tym etapie żadne pozostałości z fazy gorszej nie mogą być przenoszone do nowych probówek. Dlatego należy zachować szczególną ostrożność podczas odzyskiwania fazy nadrzędnej.
9. Przenieś 600-800 μl z fazy górnej do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 450 μl izopropanolu. Wymieszać zawartość przez odwrócenie i inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.
10. Odwirować probówki o stężeniu 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant za pomocą mikropipety. Uważaj, aby nie wyrzucić granulatu osadzonego na dnie tuby.
11. Dodać 500 μl 80% etanolu i wirować przez 5 minut. Powtórzyć dwa razy w przypadku, gdy osad nie jest sklarowany.
12. Usunąć etanol za pomocą mikropipety i suszyć granulki w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut. Dodać 30-50 μl wody dejonizowanej, eluując osad za pomocą mikropipety.
13. Utrzymywać probówki w temperaturze 4 °C przez noc do całkowitej elucji DNA i zamrażać zawartość w temperaturze -20 °C.

7. Całkowita ekstrakcja DNA z organów roślinnych do metodologii metabarcoding (zestaw komercyjny)

UWAGA: Dla poniższej metodologii, konieczne jest zakupienie komercyjnego zestawu wskazanego w Tabeli Materiałów jako zestaw do ekstrakcji DNA z gleby. Każdy materiał, roztwór i odczynnik użyty w tej sekcji musi być sterylny. Te, których nie można kupić już wysterylizowanych, należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Zdecydowanie zaleca się noszenie rękawiczek podczas całego protokołu, a kroki można wykonywać w kapturze z przepływem laminarnym. Opisany protokół został zmodyfikowany z De Souza et al.¹², z protokołu opisanego przez producenta.

1. Za pomocą porcelanowych tłuczków i moździerzy zmielić korzenie zebrane zgodnie z krokiem 1.2 w ciekłym azocie, redukując próbki do drobnego proszku. Dodać 0,3 g zmielonych próbek do probówek PowerBead i delikatnie zamieszać do homogenizacji.
2. Dodaj 60 μl roztworu C1 (dołączonego do zestawu) do probówek PowerBead i wymieszaj zawartość przez odwrócenie. Za pomocą homogenizatora tkankowego i lizera komórkowego (tabela materiałów) mocno przymocuj rurki do odpowiedniego wspornika, podłącz podporę do wiru i uruchom sprzęt z maksymalną prędkością przez 10-20 min.
   UWAGA: W przypadku wytrącenia się roztworu C1, należy go podgrzać w temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Odwirować probówki o masie 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C. Przenieść 500 μl supernatantu do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml. Przenoszona zawartość może być cząstkami stałymi.
4. Dodać 250 μl roztworu C2 do probówek i mieszać w wirze przez 5 s. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie wirować w temperaturze 10 000 x g przez 1-2 minuty w temperaturze 25 °C.
5. Przenieść ponad 600 μl supernatantu do nowych probówek o pojemności 2 ml, unikając osadu. Dodać 200 μl roztworu C3 i mieszać na wirze przez 5 s.
6. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie odwirowywać w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C. Na tym etapie należy upewnić się, że supernatant nie jest cząstkami stałymi.
7. Przenieść ponad 750 μl supernatantu do nowych probówek o pojemności 2 ml, unikając osadu. Dobrze homogenizować roztwór C4, dodać 1,100 μl roztworu C4 do supernatantu i mieszać w wirze przez 5 s.
8. Załadować 675 μl z zawartości probówek w kolumnach wirowych MB na filtr i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C. Wyrzucić płynną zawartość.
9. Powtórz poprzedni krok dwa razy, aż cała zawartość każdej probówki zostanie przetworzona. Następnie dodać 500 μl roztworu C5 do środka filtra znajdującego się w górnej kolumnie probówki i odwirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C.
10. Wyrzuć płynną zawartość i ponownie odwiruj w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku. Ostrożnie przenieś górną kolumnę kolumny wirowej MB do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml, unikając kapania płynnej zawartości kolumny.
11. Dodać 85-100 μl roztworu C6 do środka filtra i odczekać 1 minutę. Wirować przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze 25 °C i wyrzucić kolumnę wirową MB. Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.

8. Kwantyfikacja DNA w spektrofotometrze (sprawdź Tabelę Materiałów)

1. Za pomocą wskazanego spektrofotometru otwórz oprogramowanie. Wybierz opcję Kwas nukleinowy, wybierz opcję DNA i ustaw stężenie na ng/μL.
2. Dodaj 1 μl wody dejonizowanej do detektora spektrofotometru i skalibruj, wybierając opcję Blank. Po odczytaniu delikatnie przetrzyj detektor miękką bibułą.
3. Nazwać próbkę terenową kodem izolatu próbki, która ma zostać odczytana, i umieścić 1 μl jej w detektorze sprzętowym. Wybierz opcję Zmierz; Generowany jest wykres i tabela z wynikami.
4. Powtarzaj krok 8.3, aż wszystkie próbki zostaną odczytane. Zaleca się zapisanie tabeli z wygenerowanymi wynikami do ewidencji i analizy: należy wybrać opcję Raporty oraz lokalizację, w której zostanie zapisany plik .xml.
5. Dodaj 5 μl wody dejonizowanej do detektora, odczekaj kilka minut i delikatnie przetrzyj go miękką bibułą.

Wyniki

W protokole izolacji, biorąc pod uwagę, że występuje zanieczyszczenie wodą użytą podczas ostatniego prania, a zanieczyszczenie jest również wykrywane na szalkach Petriego z zaszczepionymi fragmentami, mogą być podjęte różne działania, w zależności od rodzaju zanieczyszczenia (Tabela 1). Procedurę tę należy powtórzyć od początku w przypadku silnie zarodnikujących zanieczyszczeń grzybowych, które również wykazują przyspieszony wzrost, oraz intensywnie namnażających się bakt...

Dyskusja

Powierzchowna dezynsekcja próbek roślin jest jednym z najbardziej krytycznych etapów w przedstawionym protokole. Brak zanieczyszczeń w naczyniach PDA kroplami z ostatniego mycia jest wysoce pożądany. Bakterie są często obserwowane jako zanieczyszczenia w naczyniach izolacyjnych, zwykle bardziej niż grzyby zarodnikujące w powietrzu, biorąc pod uwagę, że bakterie endofityczne są również powszechne w tkankach roślinnych ^3,11. W związku z tym niezbędne jest dodanie a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma			(dowolnej firmy, do montażu taśmy klejącej w analizach mikromorfologicznych)
Ampicylina	Sigma-Aldrich	A5354	(do montażu fragmentów roślin; można stosować inne antybiotyki - sprawdź krok 2.2.1)
Autoklaw			(od dowolnej firmy, do sterylizacji materiałów w wielu etapach)
Agar bakteriologiczny	Sigma-Aldrich	A1296	(dla wielu kroków)
Roztwory C1, C2, C3, C4, C5 i C6	Qiagen	12888-50	(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)
Wirówka	Merck/Eppendorf	5810 G	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Probówki wirówkowe	Merck	CLS430828	(do pobierania próbek)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Czerwień kongijska	Supelco	75768	(do barwienia strzępek)
Cryotubes	Merck	BR114831	do wiele kroków)
Etanol	Supelco	100983	Konieczne będzie przeprowadzenie odpowiednich rozcieńczeń (dla wielu etapów)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Bibuła filtracyjna	Merck	WHA10010155	(dla wielu etapów)
Szklane probówki	Merck	CLS7082516	(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
Wata szklana	Supelco	20411	(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Lub dekstroza (do kriokonserwacji w wermikulicie)
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lub gliceryna (do kriokonserwacji w wermikulicie, do przygotowania LPCB)
Izopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(do całkowitej ekstrakcji DNA z grzybów izolaty)
Kwas mlekowy	Sigma-Aldrich	252476	(do przygotowania LPCB - barwienie strzępek)
Roztwór błękitu laktofenolowego (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(do barwienia strzępek)
Okap			(klasa I, z dowolnej firmy, do wielu kroków)
Mikroskop			z dowolnej firmy, do obserwacji strzępek)
MB Spin Kolumny	Qiagen	12888-50	(do kupienia z zestawem DNeasy PowerSoil)
Błękit metylowy (niebieski bawełniany)	Sigma-Aldrich	M5528	(do przygotowania LPCB - barwienie strzępkami)
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)	Merck	HS4323	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Probówka do mikrowirówek (2 ml)	BR780546	Merck	(do wielu etapów)
Olej mineralny			(do konserwacji izolatów grzybów)
Worki			Średni rozmiar 150 mm x 200 mm (do pobierania próbek)
Szalka Petriego (szkło, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoklawowalne, do hodowli grzybów, preferuj wyższe)
Szalka Petriego (szkło, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(do oczyszczania izolatów grzybów); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowane)
Szalka Petriego (szkło, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	do montażu fragmentów roślin); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, &napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowalne)
Fenol	Sigma-Aldrich	P1037	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów, do przygotowania LPCB)
Porcelana moździerz	Sigma-Aldrich	Z247464	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Tłuczek porcelanowy	Sigma-Aldrich	Z247502	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)	Milipor	P2182	(dla wielu kroków)
Rurki PowerBead	Qiagen	12888-50	(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)
Szybki montaż podłoże (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(do hodowli szkiełka grzybowego)
Żel krzemionkowy	Supelco	717185	(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Sól sodowa laurylosiarczanu (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Podchloryn sodu (z 2% aktywnym chlorem)			(produkt handlowy, do powierzchownego usuwania
zanieczyszczeń)Zestaw do ekstrakcji DNA z gleby (zestaw DNeasy PowerSoil)	Qiagen	12888-50	(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Spektrofotometr - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Mikroskop			stereoskopowy(=mikroskop preparacyjny, dowolnej firmy, do analiz makromorfologicznych)
Tetracyklina	Sigma-Aldrich	T7660	(do instalacji fragmentów roślin)
Termoblok	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(lub z innych firm)
Homogenizator tkankowy i lizer komórkowy	SPEX SamplePrep		2010 Geno / Grinder - Automatyczny homogenizator tkanek i lizer komórkowy (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)
Błękit toluidynowy O	Sigma-Aldrich / Harleco	364-M	(do barwienia strzępek)
Trehaloza	Sigma-Aldrich	T9531	(do kriokonserwacji w wermikulicie)
Roztwór podstawowy Tris (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Niełuskane ziarna			(do krioprezerwacji)
Pręt			litery U (lub adaptacja - sprawdź krok 5.4.1, do hodowli szkiełka grzybowego)
Wermikulit			Drobna granulometria (do kriokonserwacji w wermikulicie)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	Y1625	(do kriokonserwacji w wermikulicie)