Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Streszczenie

Większość bakterii, w tym prątki, wytwarza pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV). Ponieważ bakteryjne EV (bEV) zawierają podzbiór składników komórkowych, w tym metabolity, lipidy, białka i kwasy nukleinowe, kilka grup oceniło natywne lub rekombinowane wersje bEV pod kątem ich siły ochronnej jako kandydatów na szczepionki podjednostkowe. W przeciwieństwie do natywnych EV, rekombinowane EV są modyfikowane molekularnie tak, aby zawierały jeden lub więcej interesujących immunogenów. W ciągu ostatniej dekady różne grupy badały różne podejścia do generowania rekombinowanych pojazdów elektrycznych. Jednak tutaj przedstawiamy projektowanie, budowę i wzbogacanie rekombinowanych prątków EV (mEVs) w prątkach. W tym celu jako system modelowy wykorzystujemy Mycobacterium smegmatis (Msm), awirulentny prątek glebowy. Najpierw opiszemy generację i wzbogacanie natywnych pojazdów elektrycznych MSM. Następnie opisujemy projekt i budowę rekombinowanych mEV, które zawierają mCherry, czerwone fluorescencyjne białko reporterowe, lub EsxA (Esat-6), ważny immunogen Mycobacterium tuberculosis. Osiągamy to poprzez oddzielne łączenie N-końców mCherry i EsxA z C-końcem małego białka Msm Cfp-29. Cfp-29 jest jednym z niewielu obficie występujących białek MsmEVs. Protokół generowania i wzbogacania rekombinowanych mEV z Msm pozostaje identyczny z generowaniem i wzbogacaniem natywnych EV Msm.

Wprowadzenie

Pomimo rozwoju i podawania szerokiej gamy szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym, nawet do dnia dzisiejszego, ~30% wszystkich zgonów ludzi nadal występuje z powodu chorób zakaźnych¹. Przed pojawieniem się szczepionki przeciw gruźlicy (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - gruźlica była zabójcą numer jeden (populacja ~10 000 do 15 000/100 000)². Dzięki podawaniu BCG i łatwemu dostępowi do leków przeciwgruźliczych pierwszego i drugiego rzutu, do 2022 r. liczba zgonów związanych z gruźlicą dramatycznie spadła do ~1 miliona/rok do 2022 r. (tj. ~15-20/100 000 populacji¹). Jednak w populacjach endemicznych gruźlicy na świecie liczba zgonów związanych z gruźlicą nadal wynosi ~100-550/100 000 populacji¹. Podczas gdy eksperci dostrzegają kilka przyczyn prowadzących do tych zniekształconych liczb, ochrona za pośrednictwem BCG, która nie trwa nawet przez pierwszą dekadę życia, wydaje się być głównym powodem^3,4,5,6,7. W rezultacie, biorąc pod uwagę odnowione "Cele Zrównoważonego Rozwoju" ONZ i "Strategię Walki z Gruźlicą" WHO, podejmowane są wspólne globalne wysiłki na rzecz opracowania znacznie lepszej alternatywy dla szczepionki przeciwko BCG, która być może zapewni ochronę przed gruźlicą przez całe życie.

W tym celu, kilka grup obecnie ocenia zmodyfikowane/rekombinowane szczepy BCG, niepatogenne i atenuowane gatunki prątków inne niż BCG oraz kandydatów na podjednostki^8,9^{,10,11,12,13,14, 15,16,17,18}. Zazwyczaj szczepionki podjednostkowe to liposomy selektywnie załadowane kilkoma oczyszczonymi (~ 1-6) pełnowymiarowymi lub skróconymi białkami immunogennymi patogenu. Jednak ze względu na ich fałszywe fałdowanie w nienatywne konformacje i/lub losowe niefunkcjonalne interakcje między załadowanymi białkami, podjednostki często nie mają natywnych i germanowych epitopów, a zatem nie są wystarczająco przygotowane do układu odpornościowego^14,19,20.

W związku z tym, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) bakterii stały się obiecującą alternatywą^{21,22,23,24,25,26}. Zazwyczaj bakteryjne EV (bEV) zawierają podzbiór swoich składników komórkowych, w tym pewne porcje kwasów nukleinowych, lipidów oraz setki metabolitów i białek^27,28. W przeciwieństwie do liposomów, w których kilka oczyszczonych białek jest sztucznie ładowanych, bEV zawierają setki naturalnie obciążonych, natywnie pofałdowanych białek o lepszej skłonności do pobudzania układu odpornościowego, zwłaszcza bez wzmocnienia/pomocy adiuwantów i agonistów receptora Toll-podobnego (TLR)^27,28,29. To właśnie w tej linii badawczej my i inni zbadaliśmy użyteczność mykobakteryjnych EV jako potencjalnych wzmacniaczy podjednostek do BCG³⁰. Pomimo obaw, że bEV nie mają jednorodnych ładunków antygenowych, EV z atenuowanym Neisseria meningitidis skutecznie chroniły ludzi przed meningokokami serogrupy B^31,32.

Przynajmniej teoretycznie, najlepszymi EV, które mogłyby dobrze wzmocnić BCG, są EV wzbogacone o bakterie chorobotwórcze. Jednak wzbogacanie pojazdów elektrycznych generowanych przez chorobotwórcze prątki jest kosztowne, czasochłonne i ryzykowne. Ponadto pojazdy elektryczne generowane przez patogeny mogą być bardziej zjadliwe niż ochronne. Biorąc pod uwagę potencjalne ryzyko, przedstawiamy tutaj dobrze przetestowany protokół wzbogacania pojazdów elektrycznych generowanych przez osiowo hodowany Msm, awirulentny prątek.

Jednakże, pomimo kodowania kilku ortologów białek patogennych, prątki awirulentne nie mają kilku antygenów szczepionkowych/epitopów białek patogennych niezbędnych do wystarczającego przygotowania układu odpornościowego do ochrony³³. W związku z tym badaliśmy również konstruowanie i wzbogacanie rekombinowanych EV Msm za pomocą inżynierii molekularnej, tak aby znaczna część każdego patogennego białka będącego przedmiotem zainteresowania ulegającego ekspresji i translacji w Msm musiała dotrzeć do swoich EV. Postawiliśmy hipotezę, że jedno lub więcej z 10 najliczniejszych białek Msm EV po połączeniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania pomoże w takiej translokacji.

Podczas gdy zaczynaliśmy standaryzować wzbogacanie mykobakteryjnych EVs (mEVs) w naszym laboratorium, w 2011 roku, Prados-Rosales et al. po raz pierwszy poinformowali o wizualizacji i wzbogacaniu mEVs in vitro³⁰. Później, w 2014 roku, ta sama grupa opublikowała zmodyfikowaną wersję swojej metody z 2011 roku³⁴. W 2015 roku Lee i in. opisali również niezależnie ustandaryzowaną metodę ponownego wzbogacania mEV z aksenicznych kultur prątków³⁵. Łącząc oba protokoły^34,35 i wprowadzając kilka naszych modyfikacji po dokładnej standaryzacji, opisujemy tutaj protokół, który pomaga rutynowo wzbogacać mEV z aksenicznych kultur prątków³⁶.

Tutaj szczególnie szczegółowo opisujemy wzbogacanie EV specyficznych dla Msm, które jest rozszerzeniem opublikowanego protokołu³⁶ dla wzbogacania EV mykobakteryjnych w ogóle. Szczegółowo opisujemy również, jak konstruować rekombinowane mEV (R-mEVs), które zawierają białko mCherry (jako czerwony reporter fluorescencyjny) i EsxA (Esat-6)^37,38,39 dominujący immunogen i potencjalny podjednostkę wakcynogenu Mycobacterium tuberculosis. Protokół wzbogacania R-mEV pozostaje identyczny z tym, który opisaliśmy dla wzbogacania natywnych EV od Msm.

Protokół

1. Warunki wzrostu Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli i ich pochodnych

1. media
   1. Bulion w płynie Middlebrook 7H9
      1. Przygotować 20% roztwór podstawowy Tween-80 poprzez wstępne podgrzanie wymaganej objętości podwójnie destylowanej wody (ddw) w szklanej zlewce do ~45-50 ^oC w kuchence mikrofalowej, dodać wymaganą objętość Tween-80 za pomocą odpowiedniego cylindra miarowego i ciągle mieszać na małym mieszadle magnetycznym, aby doprowadzić 20% Tween-80 do jednolitego roztworu. Przefiltrować 20% Tween-80 przez filtr utylizacji 0,22 μm i przechowywać bladożółty roztwór podstawowy w temperaturze 4 ^oC.
         UWAGA: Wszystkie ślady Tween-80 w cylindrze miarowym muszą zostać przeniesione do zlewki w celu uzyskania dokładnego końcowego zagęszczenia. Przygotowanego wywaru Tween-80 nie należy sterylizować w autoklawie. Przefiltrować (użyć 0,22 μM), wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 ^oC.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania bulionu 7H9. Zawiesić 4,7 g proszku 7H9 w 900 ml ddw. Dodać 2 ml glicerolu, wymieszać zawartość i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 ^oC, 15 psi przez 20 min.
         UWAGA: Nie dodawaj Middlebrook ADC enrichment (ADC) i Tween-80 przed autoklawowaniem.
      3. Po ostygnięciu autoklawowanego podłoża do temperatury pokojowej (RT, tj. ~25 ^oC), w standardowej komorze bezpieczeństwa biologicznego typu A2 aseptycznie dodać 10x zapas 100 ml ADC (końcowy 1x) i 2,5 ml (końcowy 0,05%) 20% Tween-80. Przefiltrować mieszaninę przez jednorazowy filtr 0,22 μm i przechowywać bardzo jasnożółtawozielony, przezroczysty roztwór podstawowy w temperaturze 4 ^oC.
         UWAGA: pH podłoża musi wynosić od ~ 6,6 do 6,8 (jeśli <6,4 lub >7,0, wyrzuć i przygotuj świeże). Przechowywać w temperaturze 4 ^oC (stabilnie przez 3-4 tygodnie). Zaleca się dwukrotne filtrowanie mediów 7H9 (po dodaniu ADC i Tween-80) przez dwie niezależne jednorazowe jednostki filtrujące 0,22 μm.
   2. Płynny bulion Sautona (z minimalną ilością podłoża)
      1. Rozpuścić L-asparaginę (0,4% w/v) i kwas cytrynowy (0,2% w/v) w 950 ml ddw. Dodać po 1 ml świeżo przygotowanego 1000 razy więcej (w ddw) dwuzasadowego fosforanu potasu (bezbarwnego; bulion 10 g/20 ml; końcowy 1x 0,5 g/l); siarczan magnezu siedmiowodny (bezbarwny; bulion 10 g/20 ml; końcowy 1x 0,5 g/l); i cytrynian żelazowo-amonowy (bardzo jasnobrązowy; zapas 1,6 g/40 ml; końcowy 1x 0,04 g/l) i dobrze wymieszać na mieszadle magnetycznym.
         UWAGA: W najlepszym przypadku akcje 1,000x mogą mieć 2 tygodnie; jeśli jest starszy, przygotuj świeże buliony; przechowuj je w RT w ciemności (np. w szafce/półce). Jeśli cytrynian żelazowo-amonowy jest ciemnobrązowy, wyrzuć go i spraw, aby był świeży. Najlepiej jest dodać trzy sole w kolejności podanej w kroku 1.1.2.1. Mieszaj roztwór za każdym razem przed dodaniem każdego roztworu soli.
      2. Zmierz i zanotuj pH za pomocą pH-metru; upewnij się, że wynosi około 3,1 do 3,2. Jeśli pH jest wyższe niż 3,7, wyrzuć bulion i przygotuj świeże. Aby dostosować pH do 7,4, użyj tylu kropli wodorotlenku sodu 10 N, ile jest to wymagane. Monitoruj końcowe pH, ciągle mieszając roztwór/pożywkę w mieszadle magnetycznym.
      3. Dodać 4,76 ml glicerolu, 0,25 ml 20% Tween-80 (końcowe 0,005%, patrz również uwaga dotycząca kroku 2.2.1.3), a dopiero potem uzupełnić objętość do 1 l. Następnie przefiltruj i wysterylizuj dwukrotnie 1 l pożywki za pomocą dwóch oddzielnych filtrów utylizacyjnych 0,22 μm. Przechowywać klarowne, bezbarwne podłoże w temperaturze 4 ^oC (stabilne przez 2 tygodnie).
         UWAGA: Dopiero po dostosowaniu pH do 7,4 dodaj glicerol. W przeciwnym razie nośnik zmieni kolor na mętny biały. Jeśli jest mętny, wyrzuć go (nie próbuj podgrzewać) i przygotuj świeży. Do wszystkich preparatów mEVs używaj świeżo przygotowanych Sauton's.
   3. Baza agarowa Middlebrook 7H11
      1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania. Zawiesić 19 g proszku 7H11 w 900 ml ddw. Dodać 5 ml glicerolu, zamieszać na mieszadle magnetycznym do uzyskania jednolitej zawiesiny (bladozielone; pH 6,6 do 6,8; jeśli >7,2, wyrzucić i przygotować świeże) i autoklawować w temperaturze 121 ^oC, 15 psi i przez 20 min.
         UWAGA: Nie dodawaj ADC i 0.05% Tween-80 przed autoklawowaniem.
      2. Gdy pożywka ostygnie do ~50 ^oC, aseptycznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego typu A2 dodać 100 ml ADC (doprowadzonego do RT) i 2,5 ml 20% (final 0,05%) Tween-80 (doprowadzonego do RT). Natychmiast dozować w sposób aseptyczny do szalek Petriego.
         UWAGA: Płytki są stabilne w temperaturze 4 ^oC przez co najmniej 4-6 tygodni. Upewnij się, że talerze są w temperaturze pokojowej przez noc przed zawinięciem talerzy do przechowywania w 4 ^oC. W przeciwnym razie wilgoć zostanie uwięziona w płytkach podczas inkubacji w temperaturze 37 ^oC.
   4. Rosół Miller Luria Bertani (LB) i baza agarowa
      1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przygotowania. Aby przygotować bulion LB, zawieś 25 g proszku w 1,000 ml ddw i delikatnie mieszaj przez 5 minut w szklanej zlewce na mieszadle magnetycznym. Po uzyskaniu jednolitej zawiesiny podwielokrotność należy rozdzielić na butelki z pożywką (np. 300 ml w butelce z podłożem o pojemności 500 ml) i w autoklawie. Aby przygotować agar LB, zawiesić 40 g proszku w 1,000 ml ddw i autoklawie (12 g proszku w 300 ml ddw w szklanej butelce o pojemności 500 ml).
2. Warunki wzrostu
   UWAGA: Wszystkie etapy pracy z hodowlą bakterii muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego (typ A2). Wszystkie kultury muszą być przetwarzane za pomocą sterylnych probówek, kolb i końcówek pipet.
   1. Dzień 1
      1. Dodać po 1 ml glicerolu MSM (z zamrażarki -80 ^oC) do 2 x 10 ml (w sterylnych stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml) świeżo autoklawowanego, schłodzonego i wstępnie ogrzanego (~37 ^oC) bulionu 7H9, trzykrotnie zamieszać, zamknąć pokrywki i inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 ^oC i 200-220 obr./min (wytrząsarka inkubatora).
         UWAGA: Aby wyhodować Mycobacterium tuberculosis (Mtb), wykonaj podobne kroki, ale inkubuj probówki 50 ml przez 4-6 dni w temperaturze 37 ^oC i 120-150 obr./min (wytrząsarka inkubatora) w ustawieniach BSL3. Przestrzegaj WSZYSTKICH międzynarodowych wytycznych i praktyk bezpieczeństwa biologicznego dotyczących patogenów BSL3 i grupy ryzyka 3 podczas obchodzenia się z Mtb i jego kulturami oraz ich wyrzucania. Używaj komory bezpieczeństwa biologicznego typu B2 do obsługi Mtb i jego kultur.
   2. Dzień 2
      1. Gdy OD₆₀₀ (A_600nm; densytometr komórkowy) osiągnie ~1,0, odwiruj kultury Msm przez 10 minut przy 3,200 × g i RT (wirówka stołowa). Usunąć supernatanty za pomocą sterylnych końcówek do pipet o pojemności 1 ml.
         UWAGA: Powyższy krok pozostaje taki sam dla kultur Mtb, z wyjątkiem tego, że liczba dni wynosi 4-7. Należy pamiętać, aby nie dotykać osadu bakteryjnego końcówką pipety.
      2. Mycie: Do każdej pożywki Msm dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki Sauton (w temperaturze pokojowej) (krok 1.1.2) i delikatnie zawiesić za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Za pomocą sterylnych końcówek do pipet uzupełnić objętość do 10 ml (w każdej) tym samym podłożem. Odwirować zawiesiny przez 10 minut przy stężeniu 3 200 × g i RT i odrzucić supernatanty. Powtórz ten krok jeszcze raz.
         UWAGA: Powyższy krok pozostaje taki sam dla kultur Mtb.
      3. Ponownie zawiesić dwukrotnie umyte komórki Msm w 20 ml (każda) wstępnie podgrzanych komórek Saautona (wstępnie podgrzanych w inkubatorze na płytce lub wytrząsarce) i zmierzyć gęstość optyczną komórek przy 600 nm. Zaszczepić wymaganą objętość kultur Msm w sterylnych 1 l kolbach Erlenmeyera zawierających ~ 330 ml sterylnych Sautonów tak, aby końcowa wartość OD₆₀₀ wynosiła ~ 0,05,
         UWAGA: Ponowne zawieszenie musi zawsze rozpoczynać się od małej objętości. Jeśli końcowa objętość zostanie bezpośrednio dodana do osadu w pojedynczym kroku, komórki pozostaną jako rozproszone granulki (wskaźnik złego zawieszenia). Jedynym sposobem rozwiązania tego problemu jest odkręcenie kultur i ponowne wykonanie ponownego zawieszenia zgodnie z zaleceniami. Powyższy krok pozostaje taki sam dla kultur Mtb.
   3. Dzień 2/3
      1. Inkubować kulturę o objętości 330 ml w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i w temperaturze 37 ^oC, aż poziom OD₆₀₀ kultury osiągnie ~0,3. Następnie umyj komórki raz (podobnie jak w kroku 1.2.2.2, ale z równą objętością), a następnie ponownie zawieś granulkę w tej samej objętości. Rozprowadzić 50 ml ponownie zawieszonych kultur każda do sześciu sterylnych 1 l sterylnych kolb Erlenmeyera, z których każda zawiera 280 ml sterylnych, wstępnie podgrzanych Sautonów z 1/10 normalnie używanej (0,05%) Tween-80, tj. 0,005% (patrz również uwaga do kroku 2.2.1.3, aby zrozumieć, dlaczego 1/10^{). Ostateczna} średnica zewnętrzna₆₀₀ musi wynosić ok. 0,05,
         UWAGA: W przypadku kultur Mtb zamiast kolb Erlenmeyera należy używać butelek rolkowych (o pojemności 1/2/4 L). Dostosuj objętość kultury w każdej butelce w taki sposób, aby kultura przechowywana na aparacie rolkowym nie docierała do ujścia butelki. Rzeczywista objętość w butelce rolkowej będzie zależeć od pojemności butelki rolkowej.
      2. Inkubować każdą z 330 ml kultur w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i 37 ^oC, aż OD₆₀₀ osiągnie 2,0 do 2,5 (~15-18 h).
         UWAGA: W przypadku kultur Mtb upewnij się, że ostateczny OD₆₀₀ wynosi ~1,0-1,2 (zajmuje ~5-8 dni).

2. Wzbogacanie Msm mEVs poprzez zastosowanie wirowania w gradiacji gęstości

1. Dzień 4
   1. Odwirować ~2 litry kultur Msm w połowie fazy wykładniczej w sterylnych butelkach wirówek o pojemności 6 x 400 ml w temperaturze 4 ^oC przez 20 minut przy ~ 8 000 × g (wirówka podłogowa). Zebrać zużytą pożywkę/supernatant kulturowy w dwóch wstępnie schłodzonych, autoklawowanych 1 l kolbach Erlenmeyera i przechowywać porcję osadu do wszelkich procedur analitycznych (takich jak SDS-PAGE i western blotting - nieszczegółowo opisane tutaj).
      UWAGA: Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane w niskiej temperaturze (~ 4 °C), aby lepiej zachować integralność mEV. Pojazdy mEV są dość stabilne w temperaturze pokojowej, ale chłodzenie jest koniecznością dla długoterminowej stabilności (wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest zalecane). Podczas wzrostu kultur aksenicznych mEV odłączają się od powierzchni Msm/Mtb i gromadzą się w supernatantze/zużytej pożywce hodowlanej.
   2. Przefiltrować supernatant kultury Msm najpierw przez jednostkę filtrującą 0,45 μm, a następnie przez jednostkę filtrującą 0,22 μm, aby usunąć wszelkie ślady bakterii.
      UWAGA: Bezpośrednia filtracja przez filtry 0,22 μm często powoduje dławienie jednostek filtrujących (ponieważ osad bakteryjny może zostać zakłócony podczas wykonywania kroku 2.1.1.). Aby wytworzyć supernatanty kultur Mtb, należy przeprowadzić trzy filtracje kultur Mtb (tj. pierwszy etap filtracji za pomocą jednorazowej jednostki filtrującej 0,45 μm; dwa kolejne etapy filtracji za pomocą jednorazowych jednostek filtrujących 0,22 μm) przed przeniesieniem filtratów hodowlanych do ustawień BSL-2.
2. Dzień 4/5
   1. Za pomocą koncentratorów membranowych o masie 30 kDa zagęścić filtrat kulturowy Msm (~2 l) do ~ 38 ml poprzez odwirowanie filtratu hodowlanego w temperaturze 4 ^oC, 20 min i w temperaturze 3 200 × g.
      1. Koncentratory należy najpierw umyć sterylnym, zimnym ddw (~15 ml) (prać w temperaturze 4 ^oC, 5 min i w temperaturze 3 200 × g).
      2. Przemyć ~15 ml wstępnie przefiltrowanego, zimnego Saauton (takie same warunki jak w przypadku wody (2.2.1.1.)), aby usunąć wszelkie ślady chemikaliów (używanych podczas produkcji).
      3. Ponieważ ~130 centrikonów (jeśli tylko jedno użycie) jest technicznie wymaganych do zagęszczenia ~ 2 l filtratu hodowlanego, w razie potrzeby należy użyć ponownie centrikonów co najmniej 3-4 razy. Wykonaj następujące kroki: zagęścić 15 ml do 0,5 do 1,0 ml (postępuj zgodnie z krokiem 2.2.1), przenieść koncentrat do czystej, autoklawowanej i zimnej probówki ultrawirówkowej o pojemności 38 ml, a następnie ponownie przenieść pozostały nieskoncentrowany filtrat hodowlany do używanych wirikonów w celu powtórzenia stężenia.
         UWAGA: Użycie koncentratorów 24, 30 kDa do zagęszczenia 2 L filtratu hodowlanego zajmie do 6 godzin. Po zagęszczeniu filtratu hodowlanego, Tween-80 również ulega zagęszczeniu i może zablokować koncentrator. Użycie Tween-80 do 0,005% final (zamiast 0,05%) w mediach Sauton pomaga zapobiec tej blokadzie. Zmniejszone stężenie Tween-80 nie wpływa na równomierne zawieszenie Msm podczas wzrostu i nie powoduje zlepiania się komórek Msm. Ponieważ jednak ogniwa Mtb zbijają się przy 0,005% Tween-80, użyj 0,05% Tween-80 dla EV specyficznych dla Mtb.
   2. Przenieść skoncentrowany filtrat z kultury Msm (~38 ml) do czystej, umytej (z ddw) i wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej z polipropylenu o pojemności 40-50 ml i poddać dwuetapowemu wirowaniu, najpierw w temperaturze 4 000 × g, a następnie w temperaturze 15 000 × g, w obu etapach w temperaturze 4 ^oC przez 20 minut (w celu usunięcia wszystkich zanieczyszczeń). Do tego samego użyj wirówki podłogowej.
3. Dzień 5/6
   1. Przenieść supernatant do wstępnie schłodzonej probówki ultrawirówkowej z polipropylenu o pojemności 38,5 ml i wirować w ultrawirówce o masie 100 000 × g przez 4 godziny w temperaturze 4 ^oC.
      UWAGA: Przy tej prędkości najlepiej sprawdza się łyżka wahadłowa. Upewnij się, że probówka ultrawirówki jest napełniona po brzegi i masz ważącą probówkę ultrawirówki o równoważnej wadze. Jeśli któraś z probówek zostanie przyklejona do wiadra wahadłowego po odwirowaniu (co następuje z powodu kondensacji), za pomocą kleszczy delikatnie wyjmij ją z wirnika. Wytarcie skondensowanej wilgoci znajdującej się na zewnętrznej powierzchni ultrawirówki przed ultrawirowaniem zapobiega przywieraniu.
   2. Przechowywać supernatant w wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 ml (patrz uwaga). Odwrócić probówkę ultrawirówki na świeżym, niestrzępiącym się bibułze chłonnym, aby usunąć ślady supernatantu. Zawiesić osad w 600 μl roztworu buforowego HEPES (50 mM HEPES i 150 mM NaCl, pH 7,4; przed użyciem wysterylizować filtr).
      UWAGA: Supernatant należy zapisać tylko jako kopię zapasową. Natywna pastylka mEV ma postać galaretowatej plamki o średnicy 5-7 mm, matowej, szarożółtej do półprzezroczystej. Jeśli nie jest widoczna żadna osadka, powtórzyć krok 2.3.1, ponownie używając zapisanego supernatantu. Jeśli po powtórzeniu kroku 2.3.1 nie pojawi się żadna kulka, odrzuć i uruchom ponownie od kroku 1.2. Ponowne zawieszenie granulatu wymaga czasu. Zaleca się dodanie buforu HEPES i pozostawienie go na noc w temperaturze 4 ^oC w celu łatwego wymieszania. Zawiesić delikatnie, ale wielokrotnie pipetując (użyć końcówek P200 dla lepszego wymieszania) aż do uzyskania jednolitego wymieszania.
4. Dzień 6
   1. Zawieszony osad należy poddać wirowaniu w gradiencie gęstości opartym na "jodiksanolu".
      1. Zawiesiny zawiesiny ułożyć na dnie 13 ml czystej, umytej (ddw) i wstępnie schłodzonej, ultraprzezroczystej probówki ultrawirówkowej z polipropylenu i delikatnie wymieszać (użyć pipety o pojemności 1 ml) z ~ 4 ml obojętnego roztworu "jodiksanolu" o gradiencie gęstości obojętnej (dostępny w handlu jako roztwór ~60% w/v). Po ułożeniu warstwami zawieszonego osadu na dnie probówki (maksymalnie do 5 ml), a następnie nałożyć na niego po 1 ml (w/v) 40%, 30%, 20% i 10% podzapasów "jodiksanolu" w odpowiedniej kolejności (przygotować zapasy cząstkowe (z buforem HEPES) z 60% zapasu). Następnie dodaj 4 ml 6% subbulu (przygotowanego z 60% bulionu z buforem HEPES) na górze, aby napełnić probówkę.
         UWAGA: Przygotuj gradient tuż przed użyciem; Nigdy nie przechowuj i nie używaj.
      2. Ostrożnie (bez wstrząsania) zważyć probówkę w szklanej zlewce i delikatnie przenieść ją do wahliwego wirnika kubełkowego.
         UWAGA: Ważenie jest konieczne do zważenia za pomocą atrapy rurki (również ważonej).
      3. Poddać go ultrawirowaniu w temperaturze 141 000 × g przez 16 godzin w temperaturze 4 ^oC.
5. Dzień 7
   1. Ostrożnie wyjąć probówkę (patrz uwaga do kroku 2.3.1) i zebrać frakcje 1 ml do świeżo autoklawowanych probówek mikrowirówek; zwrócić uwagę na^4-tą do^6-tą frakcję, która zwykle zawiera Msm mEVs.
      UWAGA: MEV z tych frakcji zwykle frakcjonują się na trzy lub cztery pasma mEVs (jeden to główne pasmo), które mają matowy biały kolor. R-mEV zawierające frakcję mCherry ulegają frakcji od^{5 do 7} i mają kolor od ciemnofioletowego do purpurowego. Mtb EV zazwyczaj frakcjonują się w 5^{do 7 frakcji}. Separacja mEV w gradiencie zależy od zastosowanego stężenia gradientu i tego, jak dobrze gradient jest warstwowy. Jeśli mEV pękną częściowo, mogą ulegać frakcji we wcześniejszych frakcjach. Alternatywnie, jeśli osad otrzymany po kroku 2.3.2 nie zostanie dobrze zawieszony, pęcherzyki tworzą gęste mikrogranulki, które frakcjonują się jako późniejsze frakcje. Zalecamy dokładne zbieranie frakcji tylko wtedy, gdy użytkownik chce ocenić, która z frakcji o pojemności 1 ml zawiera mEV. Użytkownicy mogą chcieć dzielić na mniejsze lub większe frakcje w zależności od swojej wygody. Kiedy używamy ich do pewnych zastosowań, na przykład testując je jako potencjalną podjednostkową dawkę przypominającą szczepionki BCG, ograniczamy nasze zbieranie mEV do mniej niż 250 μl frakcji (w których frakcjonowane są mEV), tak abyśmy mogli specjalnie zebrać tylko pasma mEVs i przetworzyć je zgodnie ze wskazaniami w 2.7.5. Pomaga to skuteczniej usuwać wszelkie ślady jodiksanolu, które mogą przeszkadzać w naszych dalszych eksperymentach.
6. Dzień 8
   1. Zebrać frakcje zawierające mEVs, rozcieńczyć buforem HEPES do 38 ml i powtórzyć ultrawirowanie w temperaturze 4 o C przez 16 godzin w temperaturze 100 000 × g. Ponownie zawiesić osad (jak w kroku 2.3.2 z tymi samymi środkami ostrożności) albo w buforze HEPES, albo w dowolnym buforze, którego wymagają dalsze eksperymenty (nie szczegółowo opisane tutaj), takie jak szacowanie białka, analizy nano-śledzące, barwienie ujemne, transmisyjna mikroskopia elektronowa, western blotting i znakowanie złotem immunologicznym.
      UWAGA: Aby uzyskać lepsze wymieszanie, należy sonikować probówkę zawierającą mEV przez 10 minut za pomocą ultradźwiękowego sonikatora w kąpieli wodnej. Sonikacja przez dłuższy czas może zainicjować pękanie i utratę nienaruszonych mEV. Jeśli jest dobrze zawieszony, sonikacja nie jest konieczna. Wszystkie kroki od 2.1 do 2.6 są identyczne, co wzbogaca pojazdy elektryczne generowane przez Mtb.

3. Budowa i wzbogacanie rekombinowanych mEVs.

UWAGA: Jednym z 10 najliczniejszych białek (zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas) Msm EVs jest Cfp-29³⁰. Biorąc pod uwagę jego mały rozmiar (29 kDa), prostą strukturę drugorzędową⁴⁰, lokalizację na membranie⁴¹ oraz skłonność do wydzielania do zużytych pożywek w kulturach aksenicznych (np. jako białko filtratu hodowlanego; wydzielane zarówno przez Msm, jak i Mtb^42,43, tutaj został wykorzystany do dostarczenia czerwonego reportera fluorescencyjnego i interesującego białka (EsxA_Mtb) do mEV. Aby to osiągnąć,

1. Zastosuj odpowiednie startery do przodu i do tyłu (Tabela 1; kompatybilne do bezpośredniego klonowania do wektora wahadłowego, takiego jak pMV261) do amplifikacji cfp-29 z Msm. Używając ~50 ng genomowego DNA Msm o wysokiej masie cząsteczkowej (~>20 kb) jako matrycy, amplifikuj fragment genu cfp-29 metodą PCR za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności (takiej jak Phusion lub Q5). Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dla PCR.
   UWAGA: Zaprojektuj niezbędne miejsca ograniczeń w starterach, aby łatwo sklonować do dowolnego alternatywnego wektora wahadłowca. Warunki i objętość PCR będą się różnić w zależności od rodzaju i marki użytej polimerazy DNA do korekty. Objętość mieszaniny reakcyjnej będzie się różnić w zależności od ilości matrycy DNA i ilości polimerazy DNA do korekty. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi warunków PCR, powodzenia amplifikacji i eliminacji niespecyficznego wyżarzania starterów.
2. PCR oczyścić eluowany amplikon za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania PCR i sprawdzić długość amplikonu za pomocą standardowej elektroforezy w żelu agarozowym. Strawić oczyszczony amplikon.
   1. Oszacuj ilość oczyszczonego amplikonu na spektrofotometrze. Użyj co najmniej 2 μg amplikonu cfp-29 do trawienia.
   2. Trawić najpierw BstB1 w temperaturze 65 ^oC przez 1 godzinę (rodzaj i ilość buforu i enzymu - zgodnie z zaleceniami producenta), obniżyć temperaturę reakcji do RT, a następnie trawić HindIII przez 1 godzinę w temperaturze 37 ^oC (rodzaj i ilość buforu i enzymu - zgodnie z zaleceniami producenta).
   3. PCR oczyścić i wymyć strawiony amplikon w 50 μl autoklawowanego ddw wolnego od nukleaz
   .
   4. Oszacować stężenie i wydajność strawionego amplikonu za pomocą spektrofotometru. Przechowywać w temperaturze -20 ^oC do momentu założenia podwiązania. UWAGA: Po PCR sprawdź długość amplikonu (~798 + 50 pz) i uzyskaj przez elektroforezę 10 μl mieszaniny reakcji PCR na 1% żelu agarozowym. Chociaż podwójne trawienie nie jest możliwe w przypadku tej kombinacji enzymów, kompatybilny bufor zapobiegnie wielokrotnemu oczyszczaniu PCR i późniejszej utracie strawionego amplikonu. Stężenie strawionego amplikonu różni się w zależności od zestawu używanego do oczyszczania PCR. Zmienia się również w zależności od długości (w bp) wszelkich alternatywnych wektorów z wyboru.
3. Zastosuj startery do przodu i do tyłu (Tabela 1), polimerazę korygującą DNA i ~ 50 ng genomowego DNA Mtb, amplikon specyficzny dla znacznika esxA lub esxA-3X FLAG. Użyj ~ 5 ng odpowiedniego plazmidowego DNA do amplifikacji mCherry metodą PCR. Szczegóły dotyczące plazmidu i sekwencji znajdują się w pliku uzupełniającym 1.
   UWAGA: Użyj łącznika Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine^44,45(G4S) linker między cfp-29 a mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; przed rozpoczęciem mCherry, linker G4S pomaga mCherry nie ulegać fałszywym niefunkcjonalnym fałdom (w tym tym napędzanym przez Cfp-29). Zapoznaj się z sekwencjami cfp-29, promotora hsp60, mCherry i esxA w pliku uzupełniającym 1. Plazmidy służące jako szablony dla mCherry są dostępne w różnych repozytoriach/bankach plazmidów. Dostępne są różne wersje (nieznacznie zmienione sekwencje) mCherry, które będą wymagały zmienionych sekwencji starterów do przodu i do tyłu. Startery (Tabela 1) pomagają w amplifikacji mCherry wymienionej w pliku uzupełniającym 1. Fuzja N-końca mCherry/esxA/esxA::3XFLAG z C-końcowym końcem Cfp-29 działa dobrze.
4. Trawić 1 μg DNA amplikonów mCherry/esxA/esxA::3XFLAG i oczyszczać strawione DNA.
   1. Każdy amplikon należy trawić dwukrotnie za pomocą HindIII i HpaI przez 1 godzinę w temperaturze 37 ^oC (lub zgodnie z zaleceniami producenta).
   2. Należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR oraz zaleceń producenta dotyczących oczyszczania strawionego amplikonu. Eluować wytrawiony amplikon w 50 μl autoklawizowanego ddw wolnego od nukleaz
   .
   3. Oszacować stężenie i wydajność strawionego amplikonu za pomocą spektrofotometru. Przechowywać w temperaturze -20 ^oC do momentu założenia podwiązania.
5. Trawić 2 μg pMV261-Kan^R (plik uzupełniający 1) lub odpowiedni wektor klonowania z wybranym enzymem lub enzymami.
   1. Trawić najpierw BstB1 w temperaturze 65 ^oC przez 1 godzinę (rodzaj i ilość buforu i enzymu - zgodnie z zaleceniami producenta), obniżyć temperaturę reakcji do RT, a następnie trawić HindIII przez 1 godzinę w temperaturze 37 ^oC (rodzaj i ilość buforu i enzymu - zgodnie z zaleceniami producenta).
   2. Żel oczyszczać i eluować w 50 μl autoklawowanego ddw wolnego od nukleaz
   .
   3. Oszacuj stężenie i wydajność strawionego wektora za pomocą spektrofotometru. Przechowywać w temperaturze -20 ^oC do momentu ustawienia podwiązania.
      UWAGA: Jednoetapowe klonowanie dwóch fragmentów jest możliwe przy użyciu powyższych starterów dla pMV261. Każdy alternatywny wektor wahadłowca, który przetrwa jako episom, będzie działał. Plazmidy integracyjne również będą działać, ale wydajność białka rekombinowanego będzie stosunkowo mniejsza na komórkę.
6. Zwiąż i przekształć się w kompatybilny szczep E. coli.
   1. Do podwiązania użyj 125 ng wektora. Stosować odpowiednio strawione amplikony mCherry/esxA/esxA::3XFLAG w stosunku molowym 1:3. Ligację należy przeprowadzić przez noc przy użyciu ligazy DNA T4 (ilość zgodna z zaleceniami producenta) w temperaturze 16 °C w chłodzonej kąpieli wodnej obiegowej.
      UWAGA: Używaj odpowiednich kontroli, takich jak wektor tylko z ligazą DNA T4 i bez niej, do oceny wydajności trawienia i przewidywania skuteczności powodzenia klonowania.
   2. przekształcenie
      1. Rozmrażać podwielokrotności komórek NEB5α kompetentnych chemicznie (~100 μl na transformację) na lodzie przez 15 minut. Delikatnie wymieszać dwukrotnie za pomocą sterylnej końcówki pipety. Dodaj mieszankę ligacyjną (do 20 μl) do zimnych, kompetentnych komórek.
      2. Delikatnie wymieszaj komórki pipety + podwiązane DNA. Inkubuj mieszankę na lodzie przez dodatkowe 30 minut.
      3. Zapewnić szok cieplny w temperaturze 42 °C (w obiegowej łaźni wodnej) przez 60 s i natychmiast przenieść z powrotem do lodu na dodatkowe 15 minut.
      4. Odzyskaj przekształcone komórki, dodając 1 ml bulionu SOC (2% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM_MgSO4 i 20 mM glukozy) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 200 obr./min.
      5. Odwiruj odzyskane bakterie w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (3000 × g, RT i 10 minut), wyrzuć supernatant, ponownie zawieś osad w 200 μl sterylnej, wstępnie podgrzanej, świeżo przygotowanej pożywki LB i rozprowadź zawiesinę na świeżo nalanych płytkach agarowych LB Miller zawierających wymagane antybiotyki w odpowiednich stężeniach.
      6. Inkubować szalki Petriego w inkubatorze płytkowym nastawionym na 37 ^°C.
7. Badanie przesiewowe (nieszczegółowo opisane tutaj) pod kątem potencjalnych klonów, zweryfikuj (na bazie PCR/enzymów restrykcyjnych kolonii)⁴⁶ i zsekwencjonuj je (sekwencjonowanie Sangera), aby potwierdzić fuzję.
8. Ekstrahować plazmidowe DNA (~200 ng/1-2 μL; dowolny dostępny na rynku zestaw) potwierdzonego klonu (tło E. coli) i przekształcić go w świeżo wytworzone elektrokompetentne komórki Msm.
9. Przygotowanie ogniw elektrokompetentnych Msm
   1. Świeżo wyhoduj Msm (jak w krokach 1.2.1 i 1.2.2). Umyj świeżo wyhodowany Msm jak w krokach 1.3.3 i 1.3.4 (z wyjątkiem użycia 7H9 + ADC + Tween-80 (bogaty) zamiast Sautona).
   2. Dodać podwielokrotność przemytych komórek Msm do końcowego OD₆₀₀ o wartości ~0,05 w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml zawierającej 150 ml pożywki bogatej.
   3. Inkubować w wytrząsarce inkubatora z prędkością 200 obr./min i temperaturze 37 ^oC, aż kultura OD₆₀₀ osiągnie ~0,8 do 1,0 (~12-14 h).
   4. Przenieść kulturę do schłodzonej butelki wirówkowej o pojemności 400 ml i inkubować na lodzie przez 60-90 minut. Następnie osadzać komórki w temperaturze 4 ^oC przez 15 minut w temperaturze 4 000 × g.
   5. Umyj komórki dwukrotnie (każde przemycie 150 ml, w temperaturze 4 000 × g, 4 ^oC i 15 min) lodowatym, sterylnym (autoklawowanym) 10% glicerolem.
      UWAGA: Z każdym praniem pellet staje się luźny. Należy zachować ostrożność podczas wyrzucania całego supernatantu (po każdym praniu). W przeciwnym razie większość komórek zostanie utracona w odrzuconym supernatancie.
   6. Umyj komórki jeszcze raz 75 ml lodowatego, sterylnego 10% glicerolu zawierającego 0,005% Tween-80.
   7. Zawiesić osad komórkowy w 7,5 ml 10% glicerolu z 0,005% Tween-80 i podwielokrotnym na 400 μl podwielokrotności.
      UWAGA: Chociaż ogniwa elektrokompetentne Msm są kompetentne przez co najmniej 4 miesiące, najlepsze wyniki dają świeżo przygotowane ogniwa elektrokompetentne. Podczas korzystania ze starych, kompetentnych komórek, kilka nieróżowych kolonii (białych) pojawia się jako fałszywe transformanty. Im starsze kompetentne komórki, tym więcej białych kolonii.
10. Przekształcenie MSM
    1. Rozmrozić podwielokrotność komórek kompetentnych Msm na lodzie.
       UWAGA: Rozmrażanie w temperaturze pokojowej i przekształcanie takich ogniw daje mniejszą wydajność.
    2. Dodaj 1-2 μl plazmidowego DNA (łącznie ~200 ng) do zimnych, kompetentnych komórek, delikatnie wymieszaj sterylną końcówką pipety o pojemności 1 ml i przenieś do wstępnie schłodzonej, sterylnej kuwety do elektroporacji o średnicy 2 mm.
    3. Przenieś zamkniętą kuwetę z kompetentnymi komórkami Msm + mieszanką plazmidowego DNA do myszy elctroporatora, delikatnie zamknij pokrywę i zastosuj impuls (typ rozpadu wykładniczego) przy 2,5 kV (napięcie), 25 μF (pojemność) i 1000 Ω (rezystancja).
    4. Natychmiast dodać 1 ml wstępnie podgrzanego, sterylnie bogatego (7H9 + ADC + Tween-80) podłoża do kuwety, delikatnie wymieszać sterylną końcówką pipety o pojemności 1 ml i przenieść całą zawartość do sterylnej probówki o pojemności 10 ml.
    5. Inkubować zawartość przez 3 godziny w wytrząsarce inkubatora ustawionej na 37 ^oC i 200 obr./min. Odwirować zawartość w probówce mikrowirówki (4 000 × g, RT i 10 min), wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 200 μl sterylnego, wstępnie ogrzanego, bogatego podłoża i rozprowadzić zawiesinę na świeżo nalanych płytkach agarowych 7H11 zawierających ADC, Tween-80 i wymagane antybiotyki w odpowiednich stężeniach.
       UWAGA: W przypadku Msm, w razie potrzeby, należy użyć higromycyny, kanamycyny i apramycyny w końcowych stężeniach odpowiednio 50 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml. Msm sam w sobie NIE jest oporny na te antybiotyki. Antybiotyki te należy stosować tylko w przypadku stosowania plazmidów z odpowiednimi genami oporności do selekcji/wzrostu transformantów/rekombinowanych kolonii Msm.
    6. Inskubować szalki Petriego w inkubatorze płytkowym nastawionym na 37 ^oC. Zazwyczaj transformanty pojawiają się między 3 a 5 dniami.
       UWAGA: Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest toksyczne dla Msm, transformanty mogą pojawić się później lub nie pojawić się. W takich przypadkach należy sklonować obcięte wersje o pełnej długości.
    7. Uzupełnij zapasy glicerolu w powstających koloniach Msm po sprawdzeniu, czy klony są dodatnie (tak samo jak w kroku 3.7)
11. Aby wzbogacić R-mEV zawierające białka mCherry lub EsxA, najpierw hoduj R-Msm wykazujące ekspresję mCherry lub exsA lub esxA::3X FLAG, wykonując kroki od 1.2.1 do 1.2.3, a następnie postępuj zgodnie z krokami od 2.1 do 2.6, aby wzbogacić R-mEV. R-mEV eluują się do 4-7^frakcji po okręcie gradientu gęstości (krok 2.5). Granulki R-mEVs są osadzane po pierwszym etapie ultrawirowania (2.3.1). Po wykonaniu czynności identycznych jak w kroku 2.3.1 upewnij się, że R-mEV są widoczne jako ciemnofioletowe do purpurowego osadu o średnicy 5-7 mm w dolnej środkowej części ultrawirówki.
12. Wykonaj zachodnie analizy⁴⁷ (nie jest to tutaj szczegółowe), aby wykryć interesujące białka w wzbogaconych R-mEVs.

Wyniki

Używamy M. smegmatis (Msm) jako modelowego prątka, aby zademonstrować wzbogacenie zarówno natywnych, jak i rekombinowanych mEVs (R-mEVs). Ten schematycznie podsumowany protokół wzbogacania mEVs (Rysunek 1) działa również dla wzbogacania R-mEV Msm i natywnych EV Mtb (z niewielkimi modyfikacjami, jak w uwagach do protokołu 1.2). Wizualizacja wzbogaconych mEV wymaga ich ujemnego barwienia pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym³⁶ (Rysunek 2A

Dyskusja

Ponieważ opracowanie nowej szczepionki przeciw gruźlicy, która jest lepsza i może zastąpić BCG, pozostaje ogromnym wyzwaniem, jako alternatywa, kilka grup dąży do odkrycia różnych podjednostkowych szczepionek przeciwgruźlicowych, które mogą zwiększyć siłę działania BCG i wydłużyć jej czas ochrony^48,49. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie bakteryjnymi EV (bEV) jako potencjalnymi podjednostkami i naturalnymi adiuwantami^50,51<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznego typu A2	Thermo Fisher Scientific, USA		1300
	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		komórkowy NEB
	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Kwas cytrynowy	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Dwuzasadowy fosforan potasu	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Podwójnie destylowana woda	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Kuwety do elektroporacji	Bio-Rad, USA		mm
Elektroporator	Bio-Rad, USA		Elektroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, Wielka Brytania		Królik poliklonalny
cytrynian żelazowo-amonowy	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Wirówka podłogowa	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Szkło	Borosil, INDIE		1 L Kolby Erlenmeyera
Glicerol	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
HEPES i chlorek	soduSigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Wytrząsarki inkubatorowe	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Luria Bertani Bulion i Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Mieszadło magnetyczne	Tarsons, INDIE		Tarsons
specyficzne dla wiśni Abcam	, Wielka Brytania		Monoklonalna
kuchenka mikrofalowa	LG, INDIE		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Bulion	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Bulion
Middlebrook Wzbogacanie ADC	BD, USA		BBL Wzbogacanie ADC Middlebrook
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB	, USA		pochodna DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Dostępny jako 60% roztwór podstawowy (w wodzie)
Zestaw do oczyszczania PCR	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH-metr	Mettler Toledo, Stany Zjednoczone		Mettler Toledo
Mini zestaw plazmidowego DNA	Hi Media, INDIE		Hi Media
Inkubator płytkowy	Thermo Fisher Scientific, USA		Nowa seria
Plazmid pMV261	Addgene, USA * *    plazmid    jest    Nie    więcej dostępne w tym banku		plazmidów Wahadłowiec wektor
Korekta Polimeraza DNA	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polimeraza
Q5 Korekta Polimeraza DNA	NEB, USA		NEB
Chłodzona kąpiel wodna obiegowa	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Baza agarowa	BD, USA		BBL Siedem H11 Bulion SOC na bazie agaru
	Hi Media, INDIA		Hi Media
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
T4 Ligaza DNA	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
Ultrawirówka	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Probówki do ultrawirówek - 14 ml	Beckman Coulter, USA		Typ poliallomerowy – typ ultra przezroczysty w wirniku SW40Ti
Probówki do ultrawirówek - 38 ml	Beckman Coulter, USA		Typ polipropylenowy– typ mętny do wirnika SW28
Ultradźwiękowy sonikator do czyszczenia kąpieli wodnej	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - model stołowy
0,22 i mikro; m Filtry jednorazowe	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone		Nunc-Nalgene
30-kDa Koncentratory Centricon	Merck, Stany Zjednoczone		Filtry odśrodkowe Amicon Ultra - Millipore
3X FLAG przeciwciało	Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone		Sigma Aldrich
400 mL Butelki wirówkowe	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Probówki	wirówkoweCorning, USA		Sterylne, wstępnie zapakowane
Bacteria
Szczep
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alfa (pochodna DH5α).
Msm wyrażający cfp29::mCherry	To badanie		MC2  155
Msm wyrażający cfp29::esxA	To badanie		MC2  155
Msm wyrażający cfp29::esxA::3X FLAG	To badanie		MC2  155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Uniwersytet Harvarda, USA&		nbsp; MC2  Rozdział 155