Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65141

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Streszczenie

Zarodniki Bacillus subtilis zostały już zaproponowane do różnych zastosowań biotechnologicznych i immunologicznych; jednak istnieje coraz większa potrzeba rozwoju metodologii, które poprawiają wykrywanie antygenów unieruchomionych na powierzchni zarodników wraz z ich kwantyfikacją. Analizy oparte na cytometrii przepływowej były wcześniej proponowane jako szybkie, niezawodne i specyficzne podejścia do wykrywania znakowanych komórek B. subtilis. W niniejszym artykule proponujemy zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny skuteczności wyświetlania przeciwciała fluorescencyjnego (FA) na powierzchni zarodnika i ilościowego określenia liczby zarodników za pomocą kulek do liczenia.

W tym celu użyliśmy bromku etydyny jako markera DNA oraz przeciwciała znakowanego allofikocyjaniną (APC), które było sprzężone z zarodnikami, jako marker powierzchniowy. Kwantyfikacja zarodników została przeprowadzona przy użyciu kulek do liczenia, ponieważ technika ta wykazuje wysoką dokładność w wykrywaniu komórek. Znakowane zarodniki analizowano za pomocą cytometru przepływowego, który potwierdził sprzężenie. W rezultacie wykazano, że znakowanie DNA poprawiło dokładność oznaczania ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrywania kiełkujących zarodników. Zaobserwowano, że bromek etydyny nie był w stanie znakować uśpionych zarodników; Technika ta zapewnia jednak bardziej precyzyjne określenie liczby zarodników z białkiem fluorescencyjnym sprzężonym z ich powierzchnią, pomagając w ten sposób w rozwoju badań, które koncentrują się na wykorzystaniu zarodników jako platformy biotechnologicznej w różnych zastosowaniach.

Wprowadzenie

Bacillus subtilis to bakteria Gram-dodatnia w kształcie pałeczki, która jest w stanie wytwarzać spokojne zarodniki, gdy warunki środowiskowe nie pozwalają na wzrost komórek1. Zarodniki są niezwykle stabilnymi formami komórkowymi, a te należące do kilku gatunków, w tym B. subtilis, są szeroko stosowane jako probiotyki do użytku u ludzi i zwierząt2. Ze względu na swoją odporność i właściwości bezpieczeństwa, zarodnik B. subtilis, który wykazuje heterologiczne białka, został zaproponowany jako adiuwant błony śluzowej, system dostarczania szczepionki i platforma immobilizacji enzymatycznej3,4.

Aby uzyskać zarodniki z B. subtilis, konieczne jest wystawienie go na deprywację składników odżywczych za pomocą specjalnej pożywki hodowlanej. Po uzyskaniu i oczyszczeniu tych zarodników należy je określić ilościowo, aby poprawić wydajność testu5,6. W związku z tym stosuje się pewne metody do analizy stężenia uzyskanych zarodników. Można zastosować liczenie płytek i komorę Petroffa-Haussera, znaną również jako komora licząca. Ten ostatni został pierwotnie opracowany w celu określenia stężenia komórek krwi; Możliwe jest jednak wykorzystanie go w dziedzinie mikrobiologii do liczenia zarodników7,8. Pomimo tego, że jest to standardowa metoda stosowana do zliczania komórek, odczyt jest pracochłonny, ponieważ metoda ta jest całkowicie ręczna, a jej dokładność zależy od doświadczenia operatora.

Analizy oparte na cytometrii przepływowej (FC) były wcześniej proponowane jako szybkie, niezawodne i specyficzne metody wykrywania znakowanych komórek Bacillus spp. Zastosowanie kulek zliczających metodą cytometrii przepływowej zagwarantowało powtarzalność w liczeniu komórek w rutynowych badaniach (bezwzględna liczba limfocytów T CD4 i CD8) oraz w opracowywaniu badań z udziałem cząstek, które można wykryć i zliczyć za pomocą cytometrii przepływowej9. Godjafrey i Alsharif zasugerowali użycie koralików do liczenia do ilościowego oznaczania FC nieoznakowanych zarodników10. Opisano zastosowanie cytometrii przepływowej do monitorowania zarodnikowania u Bacillus spp. poprzez znakowanie DNA zarodnika10,11,12,13. Jeszcze w innym badaniu wykorzystano FC do oceny ilości fluorescencyjnie znakowanych białek na powierzchni zarodników15.

To badanie miało na celu wykorzystanie komercyjnych koralików do liczenia, aby zapewnić standard odtwarzalności w odniesieniu do liczenia zdarzeń za pomocą cytometrii przepływowej. W tym miejscu sugerujemy użycie koralików zliczających do liczenia komórek w FC w celu udoskonalenia wyliczania zarodników i oceny skuteczności sprzężenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał na powierzchni zarodników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, instrumentów i oprogramowania użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Ustawienia cytometrii przepływowej

  1. Dostrojenie parametrów optycznych cytometru przepływowego połączonego z komputerem
    1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru.
    2. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometer | Startup i odczekaj kilka minut | Clean mode | Sit fluids.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza i zanieczyszczenia zostały usunięte podczas procesu inicjacji cytometru, przed nabywaniem próbek.
  2. Kontrola jakości
    1. Użyj odczynnika do kontroli jakości, aby dostosować napięcia fotopowielaczy i ocenić ich czułość.
      1. Przygotuj odczynnik do kontroli jakości w probówce polistyrenowej.
      2. W celu zdefiniowania linii bazowej przygotuj zawiesinę kulek, dodając 0,5 mL rozcieńczalnika (filtrowany PBS 10 mM, pH 7) i 3 krople kulek do oznakowanej probówki.
      3. Wymieszaj fiolkę z kulkami poprzez delikatne odwracanie.
    2. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometer | CST, aby połączyć się z interfejsem CST. Odczekaj kilka minut i obserwuj komunikat cytometer disconnected.
    3. Przymocuj probówkę polistyrenową zawierającą odczynnik do kontroli jakości do sondy cytometru przepływowego.
  3. Weryfikacja konfiguracji cytometru
    1. W oknie System Summary sprawdź, czy konfiguracja cytometru jest odpowiednia dla danego eksperymentu.
    2. Wybierz identyfikator partii kulek konfiguracyjnych (setup beads batch ID), aby zweryfikować, czy wybrany identyfikator partii (lot ID) zgadza się z aktualną partią kulek badawczych CS&T.
  4. Kontrola wydajności
    1. Wybierz opcję Check Performance i kliknij Run.
    2. Po zakończeniu kontroli wydajności wyświetlone zostaną wyniki. Przejrzyj raport Cytometer Performance Report. Kliknij Finish, aby zakończyć kontrolę wydajności, lub wyjmij probówkę z cytometru i przejrzyj wyniki w oknie System Summary.
    3. Odczytaj końcowy wynik analizy morfometrycznej i czułości fluorescencji, który pojawi się w sekcji | system summary| cytometer performance result| ze statusem: PASSED

2. Przygotowanie zarodników

  1. Po sporulacji przemyć spory 3x ultrawodą lodową, wykorzystując wirowanie przy 17 949 × g przez 10 min.
  2. Resuspendować osad uzyskany z ostatniego wirowania w 10 mL ultrawody.
  3. Autoklawować spory przez 45 min w temperaturze 121 ºC w celu inaktywacji komórek wegetatywnych.
    UWAGA: Wcześniejsze testy przeprowadzone przez nasz zespół, porównujące różne metody inaktywacji, wykazały, że warunki opisane w punkcie 2.3 charakteryzują się wysoką wydajnością, nie wykazując tworzenia kolonii w metodzie analizy przez wysiew na podłożu agar LB.

3. Ilościowe oznaczanie autoklawowanych przetrwalników za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Należy pobrać 50 µL autoklawowanych przetrwalników i inkubować je w ciemności z bromkiem etydynyum (EtBr, 10 mg/mL rozpuszczony w wodzie) przy czynniku rozcieńczenia 0,05% v/v przez 30 min (Rysunek 1A).
  2. Przetrwalniki należy przemyć 3x w 1x soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) poprzez wirowanie przy 17 949 × g przez 10 min, a następnie ponownie zawiesić w 1x PBS.
  3. Należy dodać 10 µL kulek, zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania.
  4. Próbkę należy przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z opisem w kroku 4.
    ​UWAGA: Należy podkreślić, że kulki powinny być pipetowane jak najhomogenicznie, ponieważ w przypadku niewłaściwego wykonania tego kroku zaobserwowano rozbieżności w obliczeniach.

4. Analiza z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

  1. Zaloguj się do oprogramowania Cytometer.
  2. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometer | Clean mode | Sit fluids.
  3. Dostosuj obszar roboczy, aby określić parametry analizy w cytometrii przepływowej.
    1. Zdefiniuj bramki (gates) dla analiz (Rysunek 2).
      1. Zdefiniuj strategię bramkowania w oparciu o charakterystykę morfometryczną i fluorescencyjną cząstek na podstawie kontroli negatywnej (nieznakowane przetrwalniki).
    2. Aby określić morfometrię komórek, wybierz Dotplot graphic dla analizy parametrów FSC-A na osi x oraz SSC-A na osi y.
    3. Aby określić fluorescencję, wybierz wykresy FL3 Dotplot na osi y, używając FL5 na osi x, i utwórz bramki w czterech kwadrantach.
  4. Użyj probówki polistyrenowej z korkiem o wymiarach 12 x 75 mm zawierającej nieznakowane próbki, wcześniej znakowane jednobarwnie EtBr, jednobarwnie APC oraz wielobarwnie EtBr+ APC.
  5. Bardzo delikatnie wymieszaj zawartość probówki z kontrolą negatywną i podłącz ją do sondy cytometru przepływowego.
  6. Kliknij Acquire.
  7. Ustaw moc laserów, przechodząc do Cytometer | Parameters | FSC (375) and SSC (275).
  8. Ustaw próg (threshold) na (500) w Cytometer | Threshold.
  9. Aby usunąć autofluorescencję, przeanalizuj próbkę bez barwnika zawierającą tylko przetrwalniki.
  10. Dostosuj napięcia dla detektorów filtrów: FL3 (603) i FL5 (538), aby odróżnić populacje negatywne i pozytywne w odniesieniu do wybranej fluorescencji w kontrolach. Cytometer | Parameters.
  11. Cytometer | Compensation | Ustaw FL5/FL3 setup offset na 1.0.
  12. Po analizie morfometrycznej i fluorescencyjnej skonfiguruj urządzenie do akwizycji 30 000 zdarzeń: Experiment | Experiment layout | Acquisition |30,000 events….
  13. Po dostosowaniu parametrów przeprowadź akwizycję danych dla próbek znakowanych i zawierających kulek (beads) w cytometrze przepływowym.
  14. Oblicz stężenie przetrwalników zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z równania (1).
    Równowaga statyczna w liczeniu komórek; wzór: A=(X/Y)×(N/V); schemat; obliczenia naukowe.    (1)
    UWAGA: W niniejszym badaniu metodę ilościową z użyciem kulek porównano z analizą w komorze liczbowej Petroffa-Haussera. Dodatkowo porównano znakowanie przetrwalników autoklawowanych z znakowaniem przetrwalników nieautoklawowanych.

5. Wyznaczenie indeksu sprzęgania białek na powierzchni zarodników z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

  1. Odwirowanie w celu odzyskania 50 µL zarodników (103/µL) 17,949 × g przez 10 min, a następnie resuspender w 25 µL 1-etylo-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidu (EDC) (300 mM)).
  2. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Dodaj 25 µL z Ndodaj N-hydroksysukcynimid (NHS) (50 mM) do zawiesiny zarodników i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  4. Przemyć przyrzeczniki 3 krotnie za pomocą 1x PBS poprzez wirowanie, zgodnie z opisem w kroku 5.1.
  5. Dodaj białko fluorescencyjne i pozostaw próbki przez noc w temperaturze 15 °C.
    UWAGA: Białkiem fluorescencyjnym wykorzystanym w niniejszej pracy było przeciwciało anty-human IL-10 znakowane APC. Przeciwciało to posłużyło jako model badawczy, choć możliwe jest zastosowanie innych cząsteczek fluorescencyjnych, ponieważ EDC/NHS wspomagają kowalencyjne wiązanie grup -COOH i -NH22 grupy obecne w białkach na powierzchni zarodnika.
  6. Przemyć zarodniki zgodnie z krokiem 5.3.
  7. Dodać 10 mg/mL bromku etydyny rozcieńczonego w stosunku 1:50, następnie pozostawić na 1 h na lodzie, w ciemności (Rycina 1B).
  8. Przemyć zarodniki zgodnie z opisem w kroku 5.3.
  9. Powtórz krok 4.
  10. Aby wyznaczyć fluorescencję, należy zmienić parametry FL3 na Oś X i FL5 na Oś Y wykresu punktowego.
  11. Przeanalizuj próbkę za pomocą cytometru przepływowego z użyciem laser niebieski (488 nm) w FL3 (filtr 670 LP) oraz laser czerwony (633 nm) w FL5 (filtr 660/20), zgodnie z opisem w kroku 4.
    UWAGA: Te same próbki poddano analizie immunofluorescencji na preparatach pod mikroskopem, przy powiększeniu 1 000 x, stosując następujące filtry: FITC 480/30 nm (zielony) oraz TRITC 540/25 nm (czerwony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W próbkach z autoklawowanymi sporami (AS) wykryto odpowiednio 2 × 103 spor/µl i 1 × 103 spor/µl przy użyciu kulek do liczenia oraz metody Petroffa-Haussera (Rycina 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tradycyjne metody, takie jak liczenie kolonii na płytkach, są nie tylko czasochłonne, ale także wymagają żywotnych komórek i nie pozwalają na ilościowe określenie inaktywowanych zarodników5. Komora Petroffa-Haussera jest alternatywną metodologią, ale do jej wykonania wymaga doświadczonego mikroskopisty. Cytometria przepływowa okazała się przydatną alternatywą w tym celu.

Genovese i wsp.12 opisali zastosowanie cytometrii przepływowej do ilościoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas z zasobami z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Autorzy dziękują Programowi Rozwoju Technologicznego w Narzędziach dla Zdrowia PDTIS-FIOCRUZ za korzystanie z jego obiektów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(N-hydroksysukcynimid) (NHS)Sigma130672
Przeciwciało antyfluorescencyjne anty-ludzkieBioLegend501410APC anty-ludzkie przeciwciało
fluorescencyjne IL-10 Anty-mysie przeciwciało fluorescencyjneThermo ScientificA32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  Cytometr przepływowy
FACSDiva Cytometr Konfiguracja i Zestaw kulek śledzących (do użytku z oprogramowaniem BD FACSDiva v 6.x)BD642412Odczynnik kontroli jakości
BD FACSDiva Software v. 6.1.3Wirówka programowaBD643629
MegaFuge 8RThermo Scientific75007213
Counting BeadsBD340334TruCount Tubes
Eclipse 80iNikonFluorescencyjny Microsope
Bromek etydynyLudwig Biotec
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma-AldrichA4503
Mikroprobówki plastikoweEppendorf
Rurka polistyrenowaFalcon352008Probówka polistyrenowa 5 mL, 12 x 75 mm, bez pokrywki, niesterylna
BD

Bibliografia

  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodniki Bacillus subtilisznakowanie przeciwciałami fluorescencyjnymikoraliki do zliczaniabarwienie bromkiem etydynyzarodniki uśpionezarodniki wykiełkowanedetekcja antygenów powierzchniowychsprzęganie białek fluorescencyjnych
Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.