Artykuł metodologiczny

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/65141

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarodniki Bacillus subtilis zostały już zaproponowane do różnych zastosowań biotechnologicznych i immunologicznych; jednak istnieje coraz większa potrzeba rozwoju metodologii, które poprawiają wykrywanie antygenów unieruchomionych na powierzchni zarodników wraz z ich kwantyfikacją. Analizy oparte na cytometrii przepływowej były wcześniej proponowane jako szybkie, niezawodne i specyficzne podejścia do wykrywania znakowanych komórek B. subtilis. W niniejszym artykule proponujemy zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny skuteczności wyświetlania przeciwciała fluorescencyjnego (FA) na powierzchni zarodnika i ilościowego określenia liczby zarodników za pomocą kulek do liczenia.

W tym celu użyliśmy bromku etydyny jako markera DNA oraz przeciwciała znakowanego allofikocyjaniną (APC), które było sprzężone z zarodnikami, jako marker powierzchniowy. Kwantyfikacja zarodników została przeprowadzona przy użyciu kulek do liczenia, ponieważ technika ta wykazuje wysoką dokładność w wykrywaniu komórek. Znakowane zarodniki analizowano za pomocą cytometru przepływowego, który potwierdził sprzężenie. W rezultacie wykazano, że znakowanie DNA poprawiło dokładność oznaczania ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej w celu wykrywania kiełkujących zarodników. Zaobserwowano, że bromek etydyny nie był w stanie znakować uśpionych zarodników; Technika ta zapewnia jednak bardziej precyzyjne określenie liczby zarodników z białkiem fluorescencyjnym sprzężonym z ich powierzchnią, pomagając w ten sposób w rozwoju badań, które koncentrują się na wykorzystaniu zarodników jako platformy biotechnologicznej w różnych zastosowaniach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus subtilis to bakteria Gram-dodatnia w kształcie pałeczki, która jest w stanie wytwarzać spokojne zarodniki, gdy warunki środowiskowe nie pozwalają na wzrost komórek1. Zarodniki są niezwykle stabilnymi formami komórkowymi, a te należące do kilku gatunków, w tym B. subtilis, są szeroko stosowane jako probiotyki do użytku u ludzi i zwierząt2. Ze względu na swoją odporność i właściwości bezpieczeństwa, zarodnik B. subtilis, który wykazuje heterologiczne białka, został zaproponowany jako adiuwant błony śluzowej, system dostarczania szczepionki i platforma immobilizacji enzymatycznej3,4.

Aby uzyskać zarodniki z B. subtilis, konieczne jest wystawienie go na deprywację składników odżywczych za pomocą specjalnej pożywki hodowlanej. Po uzyskaniu i oczyszczeniu tych zarodników należy je określić ilościowo, aby poprawić wydajność testu5,6. W związku z tym stosuje się pewne metody do analizy stężenia uzyskanych zarodników. Można zastosować liczenie płytek i komorę Petroffa-Haussera, znaną również jako komora licząca. Ten ostatni został pierwotnie opracowany w celu określenia stężenia komórek krwi; Możliwe jest jednak wykorzystanie go w dziedzinie mikrobiologii do liczenia zarodników7,8. Pomimo tego, że jest to standardowa metoda stosowana do zliczania komórek, odczyt jest pracochłonny, ponieważ metoda ta jest całkowicie ręczna, a jej dokładność zależy od doświadczenia operatora.

Analizy oparte na cytometrii przepływowej (FC) były wcześniej proponowane jako szybkie, niezawodne i specyficzne metody wykrywania znakowanych komórek Bacillus spp. Zastosowanie kulek zliczających metodą cytometrii przepływowej zagwarantowało powtarzalność w liczeniu komórek w rutynowych badaniach (bezwzględna liczba limfocytów T CD4 i CD8) oraz w opracowywaniu badań z udziałem cząstek, które można wykryć i zliczyć za pomocą cytometrii przepływowej9. Godjafrey i Alsharif zasugerowali użycie koralików do liczenia do ilościowego oznaczania FC nieoznakowanych zarodników10. Opisano zastosowanie cytometrii przepływowej do monitorowania zarodnikowania u Bacillus spp. poprzez znakowanie DNA zarodnika10,11,12,13. Jeszcze w innym badaniu wykorzystano FC do oceny ilości fluorescencyjnie znakowanych białek na powierzchni zarodników15.

To badanie miało na celu wykorzystanie komercyjnych koralików do liczenia, aby zapewnić standard odtwarzalności w odniesieniu do liczenia zdarzeń za pomocą cytometrii przepływowej. W tym miejscu sugerujemy użycie koralików zliczających do liczenia komórek w FC w celu udoskonalenia wyliczania zarodników i oceny skuteczności sprzężenia fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał na powierzchni zarodników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, instrumentów i oprogramowania używanych w tym protokole.

1. Ustawienie cytometrii przepływowej

  1. Wyrównanie parametrów optycznych cytometru przepływowego sprzężonego z komputerem
    1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru.
    2. Z obszaru roboczego oprogramowania wybierz Cytometr | Uruchom i poczekaj kilka minut | Tryb czyszczenia | Płyny do siedzenia.
      UWAGA: Pęcherzyki powietrza i przeszkody zostały usunięte podczas procesu inicjacji cytometru, przed pobraniem próbki.
  2. Kontrola jakości
    1. Użyj odczynnika do kontroli jakości, aby wyregulować napięcia lamp fotopowielacza i ocenić ich czułość.
      1. Przygotuj odczynnik kontroli jakości w tubie polistyrenowej.
      2. W celu zdefiniowania linii podstawowej należy przygotować kulki zawiesiny, dodając 0,5 ml rozcieńczalnika (10 mM przefiltrowanego PBS, pH 7) i 3 krople kulek do oznakowanej probówki.
      3. Wymieszać fiolkę z kulkami przez delikatne odwrócenie.
    2. Z obszaru roboczego oprogramowania wybierz Cytometr | CST, aby połączyć się z interfejsem CST. Poczekaj kilka minut i obserwuj komunikat cytometr odłączony.
    3. Podłącz rurkę polistyrenową zawierającą odczynnik do kontroli jakości do sondy cytometru przepływowego.
  3. Weryfikacja konfiguracji cytometru
    1. W oknie Podsumowanie systemu sprawdź, czy konfiguracja cytometru jest odpowiednia dla eksperymentu.
    2. Wybierz identyfikator partii ściegów nastawczych, aby sprawdzić, czy wybrany identyfikator partii ściegów nastawczych jest zgodny z bieżącą partią ściegów badawczych CS&T.
  4. Kontrola wydajności
    1. Wybierz opcję Sprawdź wydajność i kliknij Uruchom.
    2. Po zakończeniu kontroli wydajności zostaną wyświetlone wyniki wydajności. View Raport z działania cytometru. Kliknij przycisk Zakończ, aby zakończyć kontrolę działania, lub wyjmij rurkę z cytometru i przejrzyj wyniki w oknie Podsumowanie systemu.
    3. Obserwuj końcowy wynik morfometrycznej i fluorescencyjnej analizy czułości, który pojawi się w | podsumowanie systemu| wynik działania cytometru| ze statusem: ZALICZONE

2. Przygotowanie zarodników

  1. Po zarodnikowaniu przepłukać zarodniki 3x ultraczystą, lodowatą wodą, odwirowując w stężeniu 17 949 × g przez 10 min.
  2. Zawiesić osad otrzymany z ostatniego wirowania w 10 ml ultraczystej wody.
  3. Autoklawować zarodniki przez 45 minut w temperaturze 121 ºC w celu inaktywacji komórek wegetatywnych.
    UWAGA: Poprzednie testy przeprowadzone przez naszą grupę, porównujące różne metody inaktywacji, wykazały, że warunki wymienione w kroku 2.3 wykazywały wysoką skuteczność, wykazując brak tworzenia kolonii w metodzie analizy posiewu na pożywce agarowej LB.

3. Kwantyfikacja zarodników w autoklawie za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Weź 50 μl autoklawowanych zarodników i inkubuj je chronione przed światłem bromkiem etydyny (EtBr, 10 mg / ml rozcieńczony w wodzie) przy współczynniku rozcieńczenia 0,05% v/v przez 30 minut (Rysunek 1A).
  2. Przemyć zarodniki 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) przez odwirowanie w stężeniu 17 949 × g przez 10 minut i ponownie zawiesić w 1x PBS.
  3. Dodać 10 μl kulek, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania.
  4. Analizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego zgodnie z opisem w kroku 4.
    UWAGA: Należy podkreślić, że kulki powinny być pipetowane tak jednorodnie, jak to możliwe, ponieważ w obliczeniach zaobserwowano rozbieżności, gdy ten krok nie został dobrze wykonany.

4. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zaloguj się do oprogramowania cytometru.
  2. Z obszaru roboczego oprogramowania wybierz Cytometr | Tryb czyszczenia | Usiądź płyny.
  3. Dostosuj do obszaru roboczego, aby określić analizę w cytometrii przepływowej.
    1. Zdefiniuj bramki dla analiz (Rysunek 2).
      1. Zdefiniuj strategię bramkowania w oparciu o charakterystyki morfometryczne i fluorescencyjne cząstek w oparciu o kontrolę ujemną (nieoznaczone zarodniki).
    2. Aby określić morfometrię komórki, wybierz grafikę Dotplot do analiz parametrów FSC-A na osi x i SSC-A na osi y.
    3. Aby określić fluorescencję, wybierz wykresy FL3 Dotplot na osi y za pomocą FL5 na osi x i utwórz bramki w czterech kwadrantach.
  4. Użyj rurki polistyrenowej z korkiem o wymiarach 12 x 75 mm zawierającej nieoznakowane próbki, uprzednio oznaczone jednokolorowym EtBr, jednokolorowym APC i wielokolorowym EtBr+ APC.
  5. Bardzo delikatnie wymieszać probówkę zawierającą kontrolę ujemną i podłączyć ją do sondy cytometru przepływowego.
  6. Kliknij Nabierz.
  7. Ustaw moc laserów, przechodząc do Cytometr | Parametry | FSC (375) i SSC (275).
  8. Ustaw próg na (500) Cytometr | Próg.
  9. Aby usunąć autofluorescencję, przeanalizuj bezbarwną próbkę zawierającą tylko zarodniki.
  10. Dostosuj napięcia dla detektorów filtrujących: FL3 (603) i FL5 (538), aby rozróżnić populacje ujemne i dodatnie w odniesieniu do wybranej fluorescencji w kontrolach. Cytometr | Parametry.
  11. Cytometr | Odszkodowanie | Ustaw przesunięcie konfiguracji FL5/FL3 na 1.0.
  12. Po morfometrii i analizie fluorescencyjnej skonfiguruj urządzenie do akwizycji 30 000 zdarzeń | Eksperyment | Układ eksperymentu | Akwizycja |30 000 zdarzeń....
  13. Po dostosowaniu parametrów należy pozyskać dane dla próbek, które są oznaczone i zawierają kulki w cytometrze przepływowym.
  14. Obliczyć stężenie zarodników zgodnie z instrukcjami producenta, stosując równanie (1).
    figure-protocol-1 (1)
    UWAGA: W tym badaniu metodę kwantyfikacji kulek porównano z analizą w komorze liczącej Petroffa-Haussera. Ponadto porównano znakowanie zarodników w autoklawie z znakowaniem zarodników nieautoklawowanych.

5. Oszacowanie wskaźnika sprzężenia białek na powierzchni zarodników za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zebrać przez odwirowanie 50 μl zarodników (103/μL) 17,949 × g przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić z 25 μl 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karmodiimidu (EDC) (300 mM)).
  2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 25 μl N-hydroksysulfosuccinimidu (NHS) (50 mM) do zawiesiny zarodników i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  4. Przemyj zarodniki 3x za pomocą 1x PBS przez odwirowanie, jak opisano w kroku 5.1.
  5. Dodać białko fluorescencyjne i pozostawić próbki na noc w temperaturze 15 °C.
    UWAGA: Białko fluorescencyjne użyte w tej pracy było znakowanym APC przeciwciałem anty-ludzkim przeciwko IL-10. Przeciwciało to wykorzystano jako model do badań, chociaż zastosowanie innych cząsteczek fluorescencyjnych jest możliwe, ponieważ EDC/NHS promują kowalencyjną ligację między grupami -COOH i -NH2 obecnymi w białkach na powierzchni zarodników.
  6. Umyj zarodniki zgodnie z krokiem 5.3.
  7. Dodać 10 mg/ml bromku etydyny rozcieńczonego w stosunku 1:50, a następnie pozostawić na 1 godzinę na lodzie i chronić przed światłem (Rysunek 1B).
  8. Umyj zarodniki zgodnie z krokiem 5.3.
  9. Powtórz krok 4.
  10. Aby określić fluorescencję, zmień parametry FL3 na osi X i FL5 na osi Y wykresu kropkowego.
  11. Analizować próbkę za pomocą cytometru przepływowego z niebieskim laserem (488 nm) przy FL3 (filtr 670 LP) i czerwonym laserem (633 nm) w FL5 (filtr 660/20), jak opisano w kroku 4.
    UWAGA: Te same próbki analizowano pod kątem immunofluorescencji na szkiełkach pod mikroskopem, w zakresie powiększenia 1000 x i przy użyciu następujących filtrów: FITC 480/30 nm (zielony) i TRITC 540/25 nm (czerwony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W próbkach zarodników w autoklawie (AS) wykryto 2 × 103 zarodniki/μl i 1 × 103 zarodniki/μl za pomocą odpowiednio koralików liczących i metody Petroffa-Haussera (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 1: Ogólny schemat oznaczania ilościowego zarodników. (A) Zarodniki znakowane EtBr i (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody, takie jak liczenie kolonii na płytkach, są nie tylko czasochłonne, ale także wymagają żywotnych komórek i nie pozwalają na ilościowe określenie inaktywowanych zarodników5. Komora Petroffa-Haussera jest alternatywną metodologią, ale do jej wykonania wymaga doświadczonego mikroskopisty. Cytometria przepływowa okazała się przydatną alternatywą w tym celu.

Genovese i wsp.12 opisali zastosowanie cytometrii przepływowej do ilościoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas z zasobami z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Autorzy dziękują Programowi Rozwoju Technologicznego w Narzędziach dla Zdrowia PDTIS-FIOCRUZ za korzystanie z jego obiektów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(N-hydroksysukcynimid) (NHS)Sigma130672
Przeciwciało antyfluorescencyjne anty-ludzkieBioLegend501410APC anty-ludzkie przeciwciało
fluorescencyjne IL-10 Anty-mysie przeciwciało fluorescencyjneThermo ScientificA32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II  Cytometr przepływowy
FACSDiva Cytometr Konfiguracja i Zestaw kulek śledzących (do użytku z oprogramowaniem BD FACSDiva v 6.x)BD642412Odczynnik kontroli jakości
BD FACSDiva Software v. 6.1.3Wirówka programowaBD643629
MegaFuge 8RThermo Scientific75007213
Counting BeadsBD340334TruCount Tubes
Eclipse 80iNikonFluorescencyjny Microsope
Bromek etydynyLudwig Biotec
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma-AldrichA4503
Mikroprobówki plastikoweEppendorf
Rurka polistyrenowaFalcon352008Probówka polistyrenowa 5 mL, 12 x 75 mm, bez pokrywki, niesterylna
BD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bacillus Subtilis SporesFluorescent Antibody LabelingCounting BeadsEthidium Bromide StainingDormant SporesGerminated SporesSurface Antigen DetectionFluorescent Protein Coupling

Powiązane artykuły