Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster

Istnienie ubocznych efektów znieczulających (tj. efektów, które nie są natychmiast zauważalne, ale mogą mieć opóźnione konsekwencje behawioralne) jest ogólnie akceptowane, ale zrozumienie ich mechanizmów i czynników ryzyka pozostaje szczątkowe1^,2. Ich opóźniona manifestacja i subtelność ograniczają liczbę potencjalnie ważnych zmiennych, które można badać w modelach ssaków w rozsądnych ramach czasowych i przy akceptowalnych kosztach. Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) oferuje wyjątkowe korzyści w kontekście chorób neurodegeneracyjnych³ oraz do badań toksykologicznych⁴, które do tej pory nie zostały zastosowane do badania skutków ubocznych znieczulenia.

Opracowaliśmy seryjną tablicę anestezjologiczna (SAA), aby ułatwić wykorzystanie muszek owocowych w badaniach nad farmakodynamiką anestezjoterapii i farmakogenetyką. Kluczową zaletą SAA jest jednoczesna ekspozycja na identyczne warunki eksperymentalne wielu kohort. W połączeniu z eksperymentalną elastycznością muszek owocowych, wysoka przepustowość SAA pozwala na eksplorację zmiennych biologicznych i środowiskowych na skalę niemożliwą do osiągnięcia w modelach ssaków.

Zasadniczo, SAA to po prostu szereg połączonych miejsc znieczulających (komory wykonane z fiolek o pojemności 50 ml), przez które gaz nośny dostarcza substancje lotne. Pierwsza komora systemu zawiera wodę destylowaną, przez którą nawilżany jest gaz nośny (muchy są wrażliwe na odwodnienie) i kończy się prostym wskaźnikiem przepływu, który wskazuje przepływ gazu przez system. Drobne siatki umieszczone na otworach rurki łączącej oddzielają komory, aby zapobiec migracji much między komorami. Ilość miejsc "w szeregu" jest ograniczona oporami przepływu gazu niesprężonego (rurki, siatki).

Scharakteryzowaliśmy kinetykę tego prototypu SAA w poprzedniej publikacji⁵. Chociaż dokładne właściwości farmakokinetyczne będą się różnić w zależności od SAA, odpowiednie podstawy, które zostały przetestowane eksperymentalnie, są następujące: (i) początkowy przepływ 1,5-2 l/min równoważy wszystkie komory (całkowita objętość ±550 ml) z pożądanym stężeniem środka znieczulającego w ciągu 2 minut; (ii) stężenie pary środka znieczulającego dostarczanej do komór nie zmienia się znacząco między pierwszym a ostatnim miejscem, ponieważ ilość środka znieczulającego zawarta w objętości gazu w pojedynczej komorze (50 ml) znacznie przekracza ilość wchłoniętą przez dowolną liczbę much; oraz (iii) po zrównoważeniu komór przepływ gazu nośnego można zmniejszyć (50-100 ml/min lub mniej), aby uniknąć marnotrawstwa i zanieczyszczenia środowiska (lotne środki znieczulające mają właściwości gazów cieplarnianych). Minimalny przepływ niezbędny do utrzymania stężenia pary w stanie ustalonym zależy przede wszystkim od nieszczelności SAA, ponieważ pobieranie pary przez muchy jest znikome. W tych standardowych warunkach (2% izofluranu i przepływ gazu nośnego 1,5 l/min) muchy są znieczulane (tj. unieruchomione) we wszystkich pozycjach matrycy w ciągu 3-4 minut, z niezauważalnymi różnicami między pozycjami. VGA mogą być podawane przez kilka minut do godzin, a nasze typowe paradygmaty ekspozycji mieszczą się w zakresie od 15 minut do 2 godzin. Aby przepłukać system, parownik jest wyłączany, a przepływ jest utrzymywany do wymiany około 10 razy objętości zestawu (1,5 l/min przez 5 minut). Szybkość eliminacji środka znieczulającego będzie się różnić w zależności od ustawionej szybkości przepływu.

Lotne środki znieczulające oddziałują na wiele wciąż niezidentyfikowanych celów, w tym na układ immunologiczno-zapalny⁶. Udział poszczególnych celów molekularnych w wynikach pierwotnych i ubocznych ("stan znieczulający" w porównaniu z długo- i krótkoterminowymi "skutkami ubocznymi") jest słabo poznany. Dlatego czuły, wysokowydajny system muchowy jest cenny dla informowania o eksperymentach na wyższych zwierzętach, pomimo oczywistych różnic między muchami a ssakami⁷. Niektóre różnice mogą być w rzeczywistości korzystne; Na przykład układ odpornościowy muchy różni się od układu odpornościowego zwierząt wyższych tym, że brakuje mu ramienia adaptacyjnego response⁸. Chociaż może się to wydawać ograniczeniem w zrozumieniu choroby u ludzi, oferuje wyjątkową okazję do zbadania interakcji VGA z wrodzoną odpowiedzią immunologiczno-zapalną w izolacji od odpowiedzi adaptacyjnej⁹. Pozwala to na badania farmakologicznego wpływu VGA na stan zapalny i jego modulację przez zróżnicowane podłoże genetyczne obecne w populacji.

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w protokole.

1. Budowa SAA

1. Wykonaj ramę, przycinając drewno i składając ramę, korzystając z wymiarów w Rysunek 1A.
2. Zmodyfikuj stożkowe nakrętki probówek o pojemności 50 ml.
   1. Wywierć dwa otwory w każdej nasadce za pomocą wiertła 9/32 cala. Przeszlifuj otwory, aby oczyścić postrzępiony plastik. Przeszlifuj górną część nasadki, aby zmatowić powierzchnię (pomaga to w przyczepności kleju).
   2. Przytnij pipety serologiczne o pojemności 5 ml na wymiar (3 cale dla dopływu i 1,5 cala dla odpływu), nacinając plastik, a następnie rozbijając go do czysta na linii nacięcia. Przeszlifuj końce odciętych/złamanych pipet.
   3. Przyklej siatkę do tubek (należy zapewnić odpowiedni czas schnięcia kleju). Przytnij siatkę do rozmiaru tuby po wyschnięciu kleju.
   4. Włóż rurki do otworów stożkowych nasadek tak, aby obie rurki wystawały (3/4 cala) ponad nasadkę; upewnij się, że rurka doprowadzająca sięga dłużej w głąb rurki niż odpływ (Rysunek 1B).
   5. Nałóż klej na górne części zaślepek wokół tubek, aby zabezpieczyć części razem (przed kontynuowaniem poczekaj na odpowiedni czas wyschnięcia kleju).
3. Przymocuj zaślepki do ramy i poprowadź rurkę (Rysunek 1C).
   1. Przymocuj samoprzylepne opaski kablowe do ramy (3.25 cala od siebie, od środka do środka).
   2. Przymocuj zaślepki do ramy za pomocą opasek zaciskowych; odetnij końcówki zawieszki z zamkiem błyskawicznym.
   3. Wytnij i połącz odcinki (9 cali) rurki Tygon z rurkami dopływu/odpływu na każdej zmodyfikowanej nasadce (Rysunek 1D). Zaczynając od górnego końca, najpierw przymocuj do dopływu, a następnie podłącz rurkę od odpływu do dopływu w następnej pozycji.
   4. Dodaj wskaźnik przepływu do najbardziej położonego za "dopływem" (pozycja 10, Rysunek 1E).
   5. Umieść stożkową rurkę o pojemności 50 ml w pierwszej pozycji i napełnij ją wodą tuż poniżej rurki dopływowej (Rysunek 1F).
4. Przygotuj interfejs dla waporyzatora. Wyjmij tłoki, wytnij nacięcia w dwóch strzykawkach dozujących 10 ml (1/2 głębokości x 1/4 szerokości, Rysunek 1G) i włóż je do wlotu i odpływu waporyzatora z nacięciami skierowanymi bezpośrednio w stronę przodu waporyzatora, aby wyrównać się z otworami (Rysunek 1H). Opcjonalnie: Przyklej zmodyfikowane strzykawki na miejsce. Jeśli jest to niedrogie, użyj komercyjnego kolektora (zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z jedną opcją).
5. Podłącz cały system. Użyj rurki Tygon, aby połączyć elementy ze sobą w następującej kolejności: zbiornik gazu nośnego z reduktorem > przepływomierzem specyficznym dla gazu > parownikiem > SAA (Rysunek 1C).
6. Wypełnij puste miejsca na tablicy pustymi probówkami stożkowymi o pojemności 50 ml. Włącz zbiornik gazu, otwórz przepływomierz na ~2 l/min i włącz parownik na 0%. Potwierdź przepływ gazu przez system, sprawdzając przepływomierz przed parownikiem i wskaźnik przepływu za ostatnią komorą SAA pod kątem przepływu. Alternatywnie, włóż dolny koniec rurki do wody i poszukaj bąbelków.
   UWAGA: Ponieważ system nie jest pod ciśnieniem, słup wody wyższy niż kilka centymetrów zatrzyma przepływ. Jeśli nie ma przepływu na dolnym końcu matrycy, sprawdź następujące elementy: parownik musi być włączony, aby umożliwić przepływ; sprawdzić, czy regulator zbiornika i przepływomierze umożliwiają przepływ; Sprawdź pozycje tablicy, aby upewnić się, że rurki są mocno przykręcone; i sprawdź, czy nie ma wycieków wokół kleju na zmodyfikowanych nasadkach.

Rysunek 1: Budowa SAA. (A) Schemat, z wymiarami, drewnianej ramy podtrzymującej SAA. (B) Schematyczny przekrój poprzeczny, wraz z pomiarami, zmodyfikowanej nasadki z rurkami dopływowymi i odpływowymi wykonanymi z pipet serologicznych o pojemności 5 ml. (C) Zmontowany SAA (odtworzony z Olufs et al.⁵) (D) Szczegóły zmodyfikowanej stożkowej nasadki o pojemności 50 ml pokazującej rurki doprowadzające i odpływowe. (E) Odpływ za (pozycja 10) ze wskaźnikiem przepływu. (F) Rura wypełniona wodą przed (pozycja 1) do nawilżania gazu nośnego. Czerwona strzałka wskazuje poziom wody. (G) Zmodyfikowana strzykawka dozująca o pojemności 10 ml do prowizorycznego kolektora. Czerwone kółko podkreśla wycięcie znajdujące się między oznaczeniami 8 ml i 10 ml (lub 1/2 cala x 1/4 cala). (H) Widok z tyłu parownika Tec7 pokazujący wkładanie i orientację zmodyfikowanych strzykawek. W tym widoku znajduje się tylko jedna strzykawka, która pokazuje po lewej stronie otwór (czerwona strzałka), który należy wyrównać z wycięciem zmodyfikowanej strzykawki. Uwaga: Niewspółosiowość tego wycięcia i otworu odpływowego zakłóci podawanie środka znieczulającego. Ta część jest potencjalnym słabym punktem w tym niestandardowym systemie. Jeśli dostępne są fundusze, należy użyć komercyjnego rozdzielacza. Skrót: SAA = szeregowa tablica anestezjologiczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przed ekspozycją na środek znieczulający

1. Dwadzieścia cztery godziny lub więcej przed ekspozycją na środek znieczulający, należy posortować kohorty much zgodnie z potrzebami eksperymentu przy użyciu preferowanej metody (np. CO₂ lub eteru).

3. Działanie SAA

1. Przenieść muchy z fiolek z żywnością do pustych probówek stożkowych o pojemności 50 ml (bez CO₂ ).
   1. Policz i zapisz wszelkie martwe muchy przed ekspozycją.
2. Odkręć i przykręć stożkowe probówki o pojemności 50 ml z muchami do SAA.
3. Włącz gaz nośny i ustaw żądane natężenie przepływu.
   UWAGA: Zwykle używamy 1-2 l/min.
4. Ustaw parownik znieczulający na żądane stężenie.
   UWAGA: Zazwyczaj używamy 2% dla izofluranu i 3,5% dla sewofluranu, które są dawkami równoważnymi u ssaków¹⁰.
5. Wystaw muchy na żądany czas (min: 15 min).
   UWAGA: Zalecany jest minimalny czas ekspozycji wynoszący 15 minut, aby uniknąć możliwej zmienności równowagi między pozycjami SAA. W tym systemie potrzeba 2-3 minut, aby środki znieczulające zrównoważyły się we wszystkich pozycjach.
6. Pod koniec ekspozycji przepłukać system strumieniem świeżego gazu (parownik ustawiony na 0%) z prędkością 1,5 l/min przez 5 minut, co odpowiada około 10-krotności objętości całkowitej objętości SAA.

4. Lista kontrolna przed rozpoczęciem eksperymentu

1. Całkowicie otwórz reduktor wysokiego ciśnienia (na górze zbiornika powietrza), a następnie zamknij go o pół obrotu, aby zapewnić przepływ gazu nośnego.
2. Postępuj zgodnie z rurkami dla każdej linii do i) przepływomierzy i ii) parownika (upewnij się, że dopływ/odpływ jest prawidłowo podłączony) oraz iii) sprawdź poziom środka znieczulającego w parownikach.
3. Po załadowaniu komór obiektami sprawdź, czy powietrze/gaz przepływa za pomocą testu pęcherzykowego lub wskaźnika przepływu.
   UWAGA: Niektóre waporyzatory nie pozwalają na przepływ powietrza, gdy pokrętło jest w pozycji wyłączonej.
4. Gdy przepływa gaz, upewnij się, że zarówno przepływomierz, jak i wskaźnik przepływu za przepływem wskazują przepływ.
5. Pod koniec eksperymentu pozwól na 4-5 minut przepływu powietrza, aby wypłukać środek znieczulający.

Link do filmu SAA znajduje się tutaj: Perouansky Research Methods - Zakład Anestezjologii - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Nasze laboratorium wykorzystało SAA do (i) badania wpływu genotypu na behawioralną wrażliwość na środki znieczulające5; (ii) badanie przesiewowe mutantów mitochondrialnych pod kątem ubocznych skutków znieczulenia11; oraz (iii) zbadanie farmakodynamiki izofluranu i sewofluranu w odniesieniu do wyników w urazowym uszkodzeniu mózgu (TBI)12,13,14,15,16,17. Opublikowane wyniki jednoznacznie pokazują, że podłoże genetyczne wpływa na farmakodynamikę klinicznie stosowanych VGA zarówno w odniesieniu do konwencjonalnego fenotypu znieczulenia, jak i ubocznych skutków toksyczności znieczulającej, a także ochrony tkanek5,11,13,14,15.

Reprezentatywny przykład 1 (Rysunek 2):Genetyczny dryf odporności na toksyczność izofluranu wykryty przez wiarygodnie odtwarzalne warunki eksperymentalne
Odkrycie stopniowej zmiany ilościowej w śmiertelności wywołanej przez VGA wśród oddzielnie hodowanych muszek ND2360114 jest przykładem użyteczności wiarygodnych porównań farmakodynamiki znieczulenia w grupach eksperymentalnych przy użyciu SAA. ND23 to gen kodujący podjednostkę w rdzeniu kompleksu I mETC (analogicznie do Ndufs8 u ssaków)18. Mutacje w tej podjednostce są przyczyną zespołu Leigha, śmiertelnej choroby mitochondrialnej. Zaobserwowaliśmy stopniowe osłabienie fenotypu śmiertelności wywołanej izofluranem w czasie w różnych homozygotycznych stadach ND2360114 hodowanych jednocześnie w standardowych warunkach laboratoryjnych (tj. bez ekspozycji na VGA). Ta ewolucyjna adaptacja do toksyczności izofluranu nastąpiła przy braku jakiejkolwiek ekspozycji na VGA i jest prawdopodobnie efektem ubocznym "przetrwania najlepiej przystosowanych" w obrębie zmutowanych stad. Ta stopniowa zmiana wrażliwości izofluranu pozostałaby nierozpoznana, gdyby nie nasza pewność, że warunki eksperymentalne były identyczne we wszystkich testach i w czasie. Wnioskujemy, że selekcja faworyzuje modyfikatory działania ND2360114, z przypadkowym wzrostem odporności na toksyczność izofluranu. Ponieważ stan zapalny w ośrodkowym układzie nerwowym odgrywa ważną rolę w patogenezie zespołu Leigha, obserwowana ewolucja oporności może być spowodowana zmianami adaptacyjnymi we wrodzonej odpowiedzi immunologiczno-zapalnej, przy czym oporność na toksyczność izofluranu jest przypadkowym produktem ubocznym.

Rysunek 2: Zmienność śmiertelności spowodowanej toksycznością izofluranu w wyniku presji ewolucyjnej u muchówek ND2360114. Siedem linii (A-G) wyizolowanych z pojedynczej populacji poprzez kojarzenia pojedynczej pary, rozszerzonych i przetestowanych pod kątem śmiertelności 24 godzin (PM24) po 2-godzinnej ekspozycji na 2% izofluranu (w wieku 10-13 dni) wykazuje zmienność fenotypu wynikającą z pojedynczej populacji. Dane wyświetlane jako wykresy pudełkowe i wąsów. Pola reprezentują drugi i trzeci kwartyl danych, przy czym wąsy rozciągają się do minimalnych i maksymalnych punktów danych. Średnia i mediana są oznaczone odpowiednio znakiem "+" i liniami poziomymi. Procentowa śmiertelność poszczególnych powtórzeń (N) jest pokazana jako okręgi. N = 3-4 fiolki po 20-50 much w fiolce. Wartość P dla zwykłej jednokierunkowej analizy ANOVA; p = 0,012 wskazuje na istotną różnicę między średnimi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywny przykład 2 (Rysunek 3): Ilustracja wysokoprzepustowego zastosowania SAA w celu ujawnienia wpływu tła genetycznego na farmakodynamikę izofluranu
Jako przykład wysokiej przepustowości systemu, Rysunek 3 ilustruje skutki identycznej ekspozycji na izofluran (15 min 2% izofluranu) przed urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI)16, protokół testujący wstępne kondycjonowanie anestezjologiczne (AP) w tym modelu muchy13,15,19. Odczyt to śmiertelność 24 godziny po TBI skorygowanym o naturalne wyczerpanie (MI24). W tym modelu wszystkie muchy odzyskały mobilność (tj. były żywe) w ciągu 30 minut po TBI, a śmiertelność zarejestrowana w MI24 była wynikiem wtórnego uszkodzenia mózgu (sBI). W czterech liniach muchowych AP z izofluranem zmniejszył MI24 w różnym stopniu, co wskazuje, że reakcja na AP jest cechą ilościową. Ponieważ odpowiedź zapalna jest ważnym czynnikiem chorobowości na sBI, AP może wiązać się z modulacją układu odpornościowego20.

Rysunek 3: Wpływ tła genetycznego na tłumienie śmiertelności (MI24) poprzez wstępne kondycjonowanie izofluranem. Kondycjonowanie wstępne muchy z 15 minutami 2% izofluranu (fioletowy) zmniejszyło wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach (MI24) w szczepach w1118 i y1w1118 (odpowiednio p < 0,0001 i p = 0,036). MI24 nie był istotnie niższy w wstępnie kondycjonowanych liniach Oregon R (OR) i Canton S (CS) (odpowiednio p = 0,16 i p = 0,27). Dane wyświetlane jako wykresy pudełkowe i wąsów. Pola reprezentują drugi i trzeci kwartyl danych, przy czym wąsy rozciągają się do minimalnych i maksymalnych punktów danych. Średnia i mediana są oznaczone odpowiednio znakiem "+" i liniami poziomymi. Wartości MI24 poszczególnych kontrprób (N) są pokazane jako okręgi. N = 15-33 fiolki po 30-40 much na fiolkę dla much leczonych TBI. N = 2-15 fiolek po 30-40 much/fiolkę dla nieleczonych kontroli. Wartości P z niesparowanego, dwustronnego testu t-Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.