Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) jest szeroko stosowana do badań biologicznych i toksykologicznych. Aby zwiększyć użyteczność much, opracowaliśmy instrument, seryjną matrycę anestezjologiczną, która jednocześnie wystawia wiele próbek much na działanie lotnych środków znieczulających ogólnie (VGA), umożliwiając zbadanie skutków ubocznych (toksycznych i ochronnych) VGA.
Artykuł metodologiczny
Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Lotne środki znieczulające (VGA) są stosowane na całym świecie u milionów ludzi w każdym wieku i przy różnych schorzeniach. Wysokie stężenia VGA (setki mikromolowe do niskich milimolowych) są niezbędne do osiągnięcia głębokiego i niefizjologicznego zahamowania funkcji mózgu, co dla obserwatora jest "znieczuleniem". Pełne spektrum skutków ubocznych wywoływanych przez tak wysokie stężenia środków lipofilowych nie jest znane, ale odnotowano interakcje z układem immunologiczno-zapalnym, chociaż ich znaczenie biologiczne nie jest zrozumiałe.
Aby zbadać biologiczne efekty VGA u zwierząt, opracowaliśmy system zwany seryjną tablicą anestezjologiczną (SAA), aby wykorzystać eksperymentalne zalety oferowane przez muszkę owocową (Drosophila melanogaster). SAA składa się z ośmiu komór ustawionych szeregowo i połączonych ze wspólnym dopływem. Niektóre części są dostępne w laboratorium, a inne można łatwo wyprodukować lub kupić. Waporyzator, który jest niezbędny do skalibrowanego podawania VGA, jest jedynym komercyjnie produkowanym komponentem. VGA stanowią tylko niewielki procent atmosfery przepływającej przez SAA podczas pracy, ponieważ większość (zwykle ponad 95%) to gaz nośny; Domyślnym przewoźnikiem jest AIR. Można jednak badać tlen i wszelkie inne gazy.
Główną przewagą SAA nad poprzednimi systemami jest to, że pozwala na jednoczesne wystawienie wielu kohort much na dokładnie miareczkowe dawki VGA. Identyczne stężenia VGA są osiągane w ciągu kilku minut we wszystkich komorach, zapewniając w ten sposób nierozróżnialne warunki eksperymentalne. Każda komora może pomieścić od jednej muchy do setek much. Na przykład SAA może jednocześnie badać osiem różnych genotypów lub cztery genotypy o różnych zmiennych biologicznych (np. mężczyzna kontra kobieta, stary kontra młody). Wykorzystaliśmy SAA do zbadania farmakodynamiki VGA i ich interakcji farmakogenetycznych w dwóch eksperymentalnych modelach much związanych z mutantami neurozapalno-mitochondrialnymi i urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI).
Wprowadzenie
Istnienie ubocznych efektów znieczulających (tj. efektów, które nie są natychmiast zauważalne, ale mogą mieć opóźnione konsekwencje behawioralne) jest ogólnie akceptowane, ale zrozumienie ich mechanizmów i czynników ryzyka pozostaje szczątkowe1,2. Ich opóźniona manifestacja i subtelność ograniczają liczbę potencjalnie ważnych zmiennych, które można badać w modelach ssaków w rozsądnych ramach czasowych i przy akceptowalnych kosztach. Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) oferuje wyjątkowe korzyści w kontekście chorób neurodegeneracyjnych3 oraz do badań toksykologicznych4, które do tej pory nie zostały zastosowane do badania skutków ubocznych znieczulenia.
Opracowaliśmy seryjną tablicę anestezjologiczna (SAA), aby ułatwić wykorzystanie muszek owocowych w badaniach nad farmakodynamiką anestezjoterapii i farmakogenetyką. Kluczową zaletą SAA jest jednoczesna ekspozycja na identyczne warunki eksperymentalne wielu kohort. W połączeniu z eksperymentalną elastycznością muszek owocowych, wysoka przepustowość SAA pozwala na eksplorację zmiennych biologicznych i środowiskowych na skalę niemożliwą do osiągnięcia w modelach ssaków.
Zasadniczo, SAA to po prostu szereg połączonych miejsc znieczulających (komory wykonane z fiolek o pojemności 50 ml), przez które gaz nośny dostarcza substancje lotne. Pierwsza komora systemu zawiera wodę destylowaną, przez którą nawilżany jest gaz nośny (muchy są wrażliwe na odwodnienie) i kończy się prostym wskaźnikiem przepływu, który wskazuje przepływ gazu przez system. Drobne siatki umieszczone na otworach rurki łączącej oddzielają komory, aby zapobiec migracji much między komorami. Ilość miejsc "w szeregu" jest ograniczona oporami przepływu gazu niesprężonego (rurki, siatki).
Scharakteryzowaliśmy kinetykę tego prototypu SAA w poprzedniej publikacji5. Chociaż dokładne właściwości farmakokinetyczne będą się różnić w zależności od SAA, odpowiednie podstawy, które zostały przetestowane eksperymentalnie, są następujące: (i) początkowy przepływ 1,5-2 l/min równoważy wszystkie komory (całkowita objętość ±550 ml) z pożądanym stężeniem środka znieczulającego w ciągu 2 minut; (ii) stężenie pary środka znieczulającego dostarczanej do komór nie zmienia się znacząco między pierwszym a ostatnim miejscem, ponieważ ilość środka znieczulającego zawarta w objętości gazu w pojedynczej komorze (50 ml) znacznie przekracza ilość wchłoniętą przez dowolną liczbę much; oraz (iii) po zrównoważeniu komór przepływ gazu nośnego można zmniejszyć (50-100 ml/min lub mniej), aby uniknąć marnotrawstwa i zanieczyszczenia środowiska (lotne środki znieczulające mają właściwości gazów cieplarnianych). Minimalny przepływ niezbędny do utrzymania stężenia pary w stanie ustalonym zależy przede wszystkim od nieszczelności SAA, ponieważ pobieranie pary przez muchy jest znikome. W tych standardowych warunkach (2% izofluranu i przepływ gazu nośnego 1,5 l/min) muchy są znieczulane (tj. unieruchomione) we wszystkich pozycjach matrycy w ciągu 3-4 minut, z niezauważalnymi różnicami między pozycjami. VGA mogą być podawane przez kilka minut do godzin, a nasze typowe paradygmaty ekspozycji mieszczą się w zakresie od 15 minut do 2 godzin. Aby przepłukać system, parownik jest wyłączany, a przepływ jest utrzymywany do wymiany około 10 razy objętości zestawu (1,5 l/min przez 5 minut). Szybkość eliminacji środka znieczulającego będzie się różnić w zależności od ustawionej szybkości przepływu.
Lotne środki znieczulające oddziałują na wiele wciąż niezidentyfikowanych celów, w tym na układ immunologiczno-zapalny6. Udział poszczególnych celów molekularnych w wynikach pierwotnych i ubocznych ("stan znieczulający" w porównaniu z długo- i krótkoterminowymi "skutkami ubocznymi") jest słabo poznany. Dlatego czuły, wysokowydajny system muchowy jest cenny dla informowania o eksperymentach na wyższych zwierzętach, pomimo oczywistych różnic między muchami a ssakami7. Niektóre różnice mogą być w rzeczywistości korzystne; Na przykład układ odpornościowy muchy różni się od układu odpornościowego zwierząt wyższych tym, że brakuje mu ramienia adaptacyjnego response8. Chociaż może się to wydawać ograniczeniem w zrozumieniu choroby u ludzi, oferuje wyjątkową okazję do zbadania interakcji VGA z wrodzoną odpowiedzią immunologiczno-zapalną w izolacji od odpowiedzi adaptacyjnej9. Pozwala to na badania farmakologicznego wpływu VGA na stan zapalny i jego modulację przez zróżnicowane podłoże genetyczne obecne w populacji.
Protokół
UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.
1. Konstrukcja SAA
- Wykonaj ramę, docinając drewno i montując konstrukcję zgodnie z wymiarami podanymi na Ryc. 1A.
- Zmodyfikuj nakrętki do probówek stożkowych o pojemności 50 mL.
- Wywierć w każdej nakrętce dwa otwory wiertłem o średnicy 9/32 in. Przeszlifuj otwory, aby usunąć poszarpane krawędzie plastiku. Przeszlifuj górną część nakrętki, aby zmatowić powierzchnię (ułatwia to przyleganie kleju).
- Dotnij pipety serologiczne 5 mL do odpowiedniej długości (3 in dla dopływu i 1,5 in dla odpływu), nacinając plastik, a następnie przełamując go wzdłuż linii nacięcia. Przeszlifuj końce dociętych/przełamanych pipet.
- Przyklej siatkę do rurek (odczekaj odpowiedni czas schnięcia kleju). Po wyschnięciu kleju dotnij siatkę do rozmiaru rurki.
- Włóż rurki w otwory w stożkowych nakrętkach tak, aby obie rurki wystawały (3/4 in) ponad nakrętkę; upewnij się, że rurka dopływowa sięga głębiej do wnętrza probówki niż rurka odpływowa (Ryc. 1B).
- Nałóż klej na górną część nakrętek wokół rurek, aby trwale połączyć elementy (odczekaj odpowiedni czas schnięcia kleju przed kontynuacją).
- Zamocuj nakrętki do ramy i poprowadź przewody (Ryc. 1C).
- Zamocuj do ramy samoprzylepne uchwyty do kabli (w odstępach 3,25 in od środka do środka).
- Przymocuj nakrętki do ramy za pomocą opasek zaciskowych; krótko przytnij wystające końce opasek.
- Dotnij i podłącz odcinki (9 in) węży Tygon do rurek dopływowych i odpływowych w każdej zmodyfikowanej nakrętce (Ryc. 1D). Zaczynając od końca górnego, podłącz najpierw do dopływu, a następnie kolejno łącz wąż z odpływu do dopływu następnej pozycji.
- Dodaj wskaźnik przepływu do ostatniego „dopływu” w układzie (pozycja 10, Ryc. 1E).
- Umieść probówkę stożkową 50 mL w pierwszej pozycji i napełnij ją wodą do poziomu tuż poniżej rurki dopływowej (Ryc. 1F).
- Przygotuj elementy przyłącza do parownika. Wyjmij tłoki, wytnij wcięcia w dwóch strzykawkach dozujących o pojemności 10 mL (głębokość 1/2 in x szerokość 1/4 in, Ryc. 1G) i włóż je do dopływu i odpływu parownika tak, aby wcięcia były skierowane przodem do parownika w celu wyrównania z otworami (Ryc. 1H). Opcjonalnie: Przyklej zmodyfikowane strzykawki na miejscu. Jeśli budżet na to pozwala, użyj komercyjnego kolektora (zobacz jedną z opcji w Tabeli materiałów).
- Podłącz cały system. Użyj węży Tygon, aby połączyć komponenty w następującej kolejności: butla z gazem nośnym z regulatorem > przepływomierz specyficzny dla gazu > parownik > SAA (Ryc. 1C).
- Wypełnij wolne pozycje w macierzy pustymi probówkami stożkowymi 50 mL. Otwórz butlę z gazem, ustaw przepływomierz na ~2 L/min i ustaw parownik na 0%. Potwierdź przepływ gazu w systemie, sprawdzając przepływomierz przed parownikiem oraz wskaźnik przepływu za ostatnią komorą SAA. Alternatywnie, zanurz koniec wylotowego węża w wodzie i sprawdź, czy pojawiają się pęcherzyki powietrza.
UWAGA: Ponieważ system nie jest ciśnieniowy, słup wody wyższy niż kilka centymetrów zatrzyma przepływ. Jeśli na końcu macierzy nie ma przepływu, sprawdź następujące elementy: parownik musi być włączony, aby umożliwić przepływ; sprawdź, czy regulator butli i przepływomierze pozwalają na przepływ; upewnij się, że nakrętki w pozycjach macierzy są mocno dokręcone; sprawdź, czy wokół kleju na zmodyfikowanych nakrętkach nie ma wycieków.
Rysunek 1: Konstrukcja SAA. (A) Schemat, wraz z wymiarami, drewnianej ramy podtrzymującej SAA. (B) Schematyczny przekrój poprzeczny, wraz z wymiarami, zmodyfikowanej nakrętki z rurkami dopływowymi i odpływowymi wykonanymi z pipet serologicznych 5 mL. (C) Złożony układ SAA (reprodukowany z Olufs et al.5) (D) Szczegóły zmodyfikowanej nakrętki stożkowej 50 mL pokazującej rurki dopływowe i odpływowe. (E) Odpływ dolny (pozycja 10) z wskaźnikiem przepływu. (F) Górna rurka (pozycja 1) wypełniona wodą w celu nawilżenia gazu nośnego. Czerwona strzałka wskazuje poziom wody. (G) Zmodyfikowana strzykawka dozująca 10 mL służąca jako prowizoryczny rozdzielacz. Czerwone koło zaznacza wycięcie znajdujące się między oznaczeniami 8 mL a 10 mL (lub 1/2 in x 1/4 in). (H) Widok z tyłu waporyzatora Tec7 pokazujący włożenie i orientację zmodyfikowanych strzykawek. Na tym widoku znajduje się tylko jedna strzykawka, aby pokazać po lewej stronie otwór (czerwona strzałka), który musi być wyrównany z wycięciem w zmodyfikowanej strzykawce. Uwaga: Niewłaściwe ustawienie tego wycięcia i otworu odpływowego zaburzy podawanie środka anestetycznego. Ta część jest potencjalnie słabym punktem w tym systemie wykonanym na zamówienie. Jeśli dostępne są fundusze, należy użyć komercyjnego rozdzielacza. Skrót: SAA = serial anesthesia array (szeregowy układ anestezji). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Przed ekspozycją na środki znieczulające
- Na dwadzieścia cztery godziny lub więcej przed ekspozycją na środek anestetyczny, posegreguj kohorty much zgodnie z potrzebami eksperymentu, stosując preferowaną metodę (np. CO2 lub eter).
3. Obsługa SAA
- Przenieść muchy z fiolek z pożywką do pustych probówek stożkowych o pojemności 50 mL (bez użycia CO2).
- Policzyć i odnotować liczbę martwych much przed ekspozycją.
- Zdjąć nakrętki i przykręcić probówki stożkowe 50 mL z muchami do SAA.
- Włączyć gaz nośny i ustawić żądany przepływ.
UWAGA: Zazwyczaj stosujemy przepływ 1-2 L/min. - Ustawić parowar anestetyka na pożądane stężenie.
UWAGA: Zazwyczaj stosujemy 2% dla izofluranu i 3,5% dla sewofluranu, co odpowiada równoważnym dawkom u ssaków10. - Poddać muchy ekspozycji przez określony czas (minimum: 15 min).
UWAGA: Zaleca się minimalny czas ekspozycji wynoszący 15 min, aby uniknąć możliwej zmienności w wyrównaniu stężenia w poszczególnych pozycjach SAA. W tym systemie wyrównanie anestetyków we wszystkich pozycjach trwa 2-3 min. - Po zakończeniu ekspozycji przepłukać system świeżym strumieniem gazu (parowar ustawiony na 0%) z przepływem 1,5 L/min przez 5 min, co odpowiada około 10-krotnej objętości całkowitej SAA.
4. Lista kontrolna przed rozpoczęciem eksperymentu
- Całkowicie otwórz regulator wysokiego ciśnienia (na górze zbiornika z powietrzem), a następnie przymknij go o pół obrotu, aby zapewnić przepływ gazu nośnego.
- Prześledź przewody dla każdej linii do i) przepływomierzy oraz ii) parownika (upewnij się, że wlot i wylot są prawidłowo podłączone) i iii) sprawdź poziom środka anestetycznego w parownikach.
- Po umieszczeniu obiektów w komorach sprawdź, czy powietrze/gaz przepływa, wykonując test bąbelkowy lub sprawdzając wskaźnik przepływu.
UWAGA: Niektóre parowniki nie pozwalają na przepływ powietrza, gdy pokrętło znajduje się w pozycji off. - Gdy gaz przepływa, potwierdź, że zarówno przepływomierz, jak i wskaźnik przepływu znajdujący się w dół strumienia wskazują przepływ.
- Po zakończeniu eksperymentu zapewnij przepływ powietrza przez 4-5 min w celu usunięcia środka anestetycznego.
Wyniki
Link do filmu SAA znajduje się tutaj: Perouansky Research Methods - Department of Anesthesiology - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Nasz zespół wykorzystał SAA do: (i) badania wpływu genotypu na behawioralną wrażliwość na środki znieczulające5; (ii) przesiewowego badania mutantów mitochondrialnych pod kątem działań ubocznych środków znieczulających11; oraz (iii) badania farmakodynamiki izofluranu i sewofluranu w odniesieniu do wyników po urazach czaszkowo-mózgowych (TBI)12,13,14,15,16,17. Opublikowane wyniki jednoznacznie wykazują, że tło genetyczne wpływa na farmakodynamikę stosowanych klinicznie lotnych anestetyków (VGA) zarówno w odniesieniu do konwencjonalnego fenotypu znieczulenia, jak i działań ubocznych toksyczności środków znieczulających, a także ochrony tkanek5,11,13,14,15.
Reprezentatywny przykład 1 (Rycina 2):Dryf genetyczny w odporności na toksyczność izofluranu wykryty dzięki wiarygodnie powtarzalnym warunkom eksperymentalnym
Odkrycie stopniowej ilościowej zmiany w śmiertelności indukowanej przez VGA wśród oddzielnie hodowanych much ND2360114 jest przykładem użyteczności wiarygodnych porównań farmakodynamiki anestetyków pomiędzy grupami eksperymentalnymi z wykorzystaniem SAA. ND23 jest genem kodującym podjednostkę w rdzeniu Kompleksu I mETC (analogicznie do Ndufs8 u ssaków)18. Mutacje w tej podjednostce są przyczyną zespołu Leigh, śmiertelnej choroby mitochondrialnej. Zaobserwowaliśmy stopniowe osłabienie fenotypu śmiertelności indukowanej izofluranem w czasie w różnych homozygotycznych liniach ND2360114 hodowanych jednocześnie w standardowych warunkach laboratoryjnych (tj. bez ekspozycji na VGA). Ta adaptacja ewolucyjna do toksyczności izofluranu wystąpiła w nieobecności jakiejkolwiek ekspozycji na VGA i jest prawdopodobnie skutkiem ubocznym mechanizmu „przeżycia najlepiej przystosowanych” w obrębie linii mutantów. Ta stopniowa zmiana wrażliwości na izofluran pozostałaby niezauważona, gdybyśmy nie mieli pewności, że warunki eksperymentalne były identyczne we wszystkich analizach i w czasie. Wnioskujemy, że selekcja faworyzuje modyfikatory efektów ND2360114, co wiąże się z przypadkowym zwiększeniem odporności na toksyczność izofluranu. Ponieważ stan zapalny w ośrodkowym układzie nerwowym odgrywa ważną rolę w patogenezie zespołu Leigh, zaobserwowana ewolucja oporności może wynikać ze zmian adaptacyjnych w odporności wrodzonej i odpowiedzi zapalnej, przy czym oporność na toksyczność izofluranu jest przypadkowym produktem ubocznym.
Rycina 2: Zmienność śmiertelności indukowanej toksycznością izofluranu w wyniku presji ewolucyjnej u much ND2360114. Siedem linii (A-G) wyizolowanych z jednej populacji poprzez kojarzenie pojedynczych par, rozmnożonych i przebadanych pod kątem śmiertelności po 24 h (PM24) po 2 h ekspozycji na 2% izofluranu (w wieku 10-13 dni) wykazuje zmienność fenotypową pochodzącą z jednej populacji. Dane przedstawiono na wykresach pudełkowych z wąsami. Pudełka reprezentują drugi i trzeci kwartyl danych, a wąsy sięgają minimum i maksimum punktów danych. Średnią i medianę zaznaczono odpowiednio symbolem „+” oraz liniami poziomymi. Procentową śmiertelność poszczególnych powtórzeń (N) przedstawiono jako kółka. N = 3-4 fiolki po 20-50 much/fiolka. Wartość P dla zwykłej jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA; p = 0,012 wskazuje na istotną różnicę między średnimi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Reprezentatywny przykład 2 (Rysunek 3): Ilustracja wysokoprzepustowej aplikacji SAA w celu ujawnienia wpływu tła genetycznego na farmakodynamikę izofluranu
Jako przykład wysokiej przepustowości systemu, Rysunek 3 ilustruje efekty identycznej ekspozycji na izofluran (15 min 2% izofluranu) przed urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI)16, zgodnie z protokołem badającym przeciwstresowe uwarunkowanie anestetyczne (AP) w tym modelu muchy13,15,19. Odczytem jest śmiertelność 24 h po TBI skorygowana o naturalny ubytek (MI24). W tym modelu wszystkie muchy odzyskały mobilność (tj. przeżyły) w ciągu 30 min po TBI, a śmiertelność odnotowana w MI24 była wynikiem wtórnego uszkodzenia mózgu (sBI). W czterech liniach much AP z użyciem izofluranu zredukowało MI24 w różnym stopniu, co wskazuje, że reaktywność na AP jest cechą ilościową. Ponieważ odpowiedź zapalna jest istotnym czynnikiem w zachorowalności wynikającej z sBI, AP może obejmować modulację układu odpornościowego20.
Rysunek 3: Wpływ tła genetycznego na supresję śmiertelności (MI24) poprzez prekondycjonowanie izofluranem. Prekondycjonowanie much przez 15 min 2% izofluranem (kolor fioletowy) zmniejszyło indeks śmiertelności po 24 h (MI24) w szczepach w1118 i y1w1118 (p < 0.0001 oraz p = 0.036, odpowiednio). MI24 nie był istotnie niższy w prekondycjonowanych liniach Oregon R (OR) i Canton S (CS) (p = 0.16 oraz p = 0.27, odpowiednio). Dane przedstawiono na wykresach pudełkowych z wąsami. Pudełka reprezentują drugi i trzeci kwartyl danych, a wąsy sięgają do minimalnych i maksymalnych punktów danych. Średnia i mediana są oznaczone odpowiednio symbolem „+” oraz liniami poziomymi. Wartości MI24 dla poszczególnych powtórzeń (N) przedstawiono jako okręgi. N = 15-33 fiolek zawierających 30-40 much/fiolka dla much poddanych TBI. N = 2-15 fiolek zawierających 30-40 much/fiolka dla nieleczonych kontroli. Wartości P pochodzą z nieparzystego, dwustronnego testu t Student’a. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
Do krytycznych etapów budowy SAA należy zapewnienie szczelnych złączek, aby uniknąć wycieku znieczulającego mieszaniny gazów. SAA musi być umieszczony w dygestorium, aby uniknąć zanieczyszczenia przestrzeni laboratoryjnej. Wszystkie elementy, począwszy od butli z gazem nośnym, a skończywszy na wskaźniku przepływu za SAA, należy sprawdzić zgodnie z listą kontrolną.
Inne metody podawania VGA muszkom są skomplikowane w obsłudze (inebriometr)21, mają niskąprzepustowość22, nie pozwalają na jednoczesną ekspozycję wielu populacji23, nie pozwalają na precyzyjną kontrolę stężenia środka znieczulającego21 lub mają odczyt, który jest trudny do przełożenia na klinicznie akceptowane terminy24.
Obecna wersja SAA opiera się na komercyjnym waporyzatorze, a zatem badania toksykologiczne ograniczają się do lotnych środków znieczulających. W przypadku stosowania z innymi substancjami lotnymi, waporyzator może być używany "poza wskazaniami" po kalibracji wyjścia. Alternatywnie można zastosować inną metodę odparowywania substancji lotnych, która wymagałaby dedykowanych pomiarów w celu miareczkowania stężeń leku, jak opisano wcześniej25.
Poza wskaźnikami przepływu nie ma alarmów (np. jeśli zbiorniki zostaną opróżnione, przepływ przez SAA zostanie przerwany). W zależności od intensywności użytkowania, SAA może wymagać czyszczenia, dokręcania i ewentualnej wymiany wężyka Tygon. Przeprowadziliśmy "konserwację" naszego oryginalnego SAA dwa razy w ciągu 7 lat użytkowania.
Ta metoda znieczulania muszek owocowych pozwala na wykorzystanie zestawu narzędzi genetycznych dostępnych dla badaczy Drosophila w systemie o wysokiej przepustowości. Wiele kohort much o różnych populacjach (np. genotypie, wiek, płeć) może być jednocześnie narażonych na identyczne stężenia znieczulające i pożądaną kombinację gazu nośnego (powietrze,O2,N2O, gazy szlachetne) odpowiednią do danego pytania badawczego.
Pokazujemy tutaj, że SAA był przydatny do ujawnienia nieoczekiwanych zmian w odporności na toksyczność izofluranu w linii muchowej ND2360114 i że standardowe laboratoryjne linie muchowe różnią się reakcją na AP. Zidentyfikowanie tych wyników było możliwe dzięki ścisłej kontroli warunków eksperymentalnych i wysokiej przepustowości SAA.
SAA można dostosować do badania wpływu innych lotnych związków organicznych (LZO) na owady (np. pszczoły miodne). W przypadku lotnych związków organicznych o prężności par zbliżonej do lotnych środków znieczulających (izofluran: 240 mmHg w temperaturze 20 °C) można by stosować konwencjonalne parowniki, ale wydajność musiałaby być skalibrowana. Komercyjny waporyzator do desfluranu jest podgrzewany, co potencjalnie zapewnia dodatkową elastyczność.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Markowi G. Perkinsowi, Pearce Laboratory, Department of Anesthesiology, University of Wisconsin-Madison, za zbudowanie prototypu SAA. Prace są wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (NIGMS) z R01GM134107 oraz przez fundusz badawczo-rozwojowy Wydziału Anestezjologii Uniwersytetu Wisconsin-Madison.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szeregowa tablica anestezjologiczna: Pipety serologiczne | |||
| 5 ml | Polistyren Fisher Scientific | 13-676-10C | , Pipeta serologiczna 5 |
| ml Probówki stożkowe | Fisher Scientific | 1495949A | Polipropylen, 50 ml |
| Podkładka montażowa do opasek kablowych | Grainger | 6EEE6 | 1,25 cala dł. x 1 cala szer. x 0,28 cala wystrzykawka |
| dozująca | Grainger | 5FVE0 | 10 ml z siatką |
| o oczkach 1 mm | |||
| Wskaźnik przepływu | Grainger | 8RH52 | 5/16 do 1/2 cala rozmiar połączenia, styl koła łopatkowego |
| Rurka Tygon | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, ściana: 1/16 |
| Drewniana rama | 10 stóp 2 cale x 3/4 cala | ||
| Opaska zaciskowa | >5 cala | ||
| < strong>Interfejs waporyzatora (budżetowa alternatywa dla kolektora):< / mocny> | |||
| dozujący strzykawka | Grainger | 5FVE0 | 10 mL z połączeniem Luer-Lock |
| Komercyjna kolektor i waporyzatory: < / mocny> | |||
| 1/4 cala równe złącze kolczaste Y | Somni Scientific | BF-9000 | |
| 1/8 cala NPT do 1/4 calowy kolanko kolczaste (plastikowe) | Somni Scientific | BF-9004 | |
| AIR 0-4 LPM Przepływomierz z czarnym pokrętłem | Somni Scientific | FP-4002 | |
| Pomocniczy wspornik montażowy przepływomierza | Somni Scientific | NonInvPart | |
| Medical Air, 1/8 cala NPT męski x DISS męski | Somni Scientific | GF-11012 | |
| System anestezjologiczny TT-2 stołowy, wbudowany system podwójnego zaworu przełączającego. Zawiera rurkę oznaczoną kolorami 6' X2. (Waporyzator nie jest dołączony) | Somni Scientific | TT-17000 | |
| Tec 7 Waporyzator izofluranowy | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Waporyzator specyficzny dla środka (Isoflurane) |
| Waporyzator Sevoflurane Tec 7 | Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Waporyzator specyficzny dla środka (Sevoflurane) |
Bibliografia
- Jevtovic-Todorovic, V., et al. Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. The Journal of Neuroscience. 23 (3), 876-882 (2003).
- Vutskits, L., Xie, Z. Lasting impact of general anaesthesia on the brain: Mechanisms and relevance. Nature Reviews Neuroscience. 17 (11), 705-717 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
- Olufs, Z. P. G., Loewen, C. A., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Genetic variability affects absolute and relative potencies and kinetics of the anesthetics isoflurane and sevoflurane in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 8, 2348(2018).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Yamaguchi, M., Yoshida, H. Drosophila as a model organism. In Drosophila Models for Human Diseases., edited by. , Springer. Singapore. 1-10 (2018).
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster-From microbial recognition to whole-organism physiology. Nature Reviews Immunology. 14 (12), 796-810 (2014).
- Shaughnessy, M. R., Hofmeister, E. H. A systematic review of sevoflurane and isoflurane minimum alveolar concentration in domestic cats. Veterinary Anaesthesia and Analgesia. 41 (1), 1-13 (2014).
- Olufs, Z. P. G., Ganetzky, B., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Mitochondrial complex I mutations predispose Drosophila to isoflurane neurotoxicity. Anesthesiology. 133 (4), 839-851 (2020).
- Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
- Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Lasarev, M. R., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Ageing and genetic background influence anaesthetic effects in a D. melanogaster model of blunt trauma with brain injury. British Journal of Anaesthesia. 125 (1), 77-86 (2020).
- Scharenbrock, A. R., Schiffman, H. J., Olufs, Z. P. G., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Interactions among genetic background, anesthetic agent, and oxygen concentration shape blunt traumatic brain injury outcomes in Drosophila melanogaster. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6926(2020).
- Fischer, J. A., Olufs, Z. P. G., Katzenberger, R. J., Wassarman, D. A., Perouansky, M. Anesthetics influence mortality in a Drosophila model of blunt trauma with traumatic brain injury. Anesthesia & Analgesia. 126 (6), 1979-1986 (2018).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Katzenberger, R. J., et al. A method to inflict closed head traumatic brain injury in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (100), e52905(2015).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-nuclear interactions affecting lifespan and neurodegeneration in a Drosophila model of Leigh syndrome. Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Johnson-Schlitz, D., et al. Anesthetic preconditioning of traumatic brain injury is ineffective in a Drosophila model of obesity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 381 (3), 229-235 (2022).
- Li, H., et al. Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice. Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).
- Leibovitch, B. A., Campbell, D. B., Krishnan, K. S., Nash, H. A. Mutations that affect ion channels change the sensitivity of Drosophila melanogaster to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 10 (1), 1-13 (1995).
- Tinklenberg, J. A., Segal, I. S., Guo, T. Z., Maze, M. Analysis of anesthetic action on the potassium channels of the Shaker mutant of Drosophila. Annals of the New York Academy of Sciences. 625, 532-539 (1991).
- Gamo, S., Ogaki, M., Nakashima-Tanaka, E. Strain differences in minimum anesthetic concentrations in Drosophila melanogaster. Anesthesiology. 54 (4), 289-293 (1981).
- Campbell, J. L., Nash, H. A. The visually-induced jump response of Drosophila melanogaster is sensitive to volatile anesthetics. Journal of Neurogenetics. 12 (4), 241-251 (1998).
- Perouansky, M., Hentschke, H., Perkins, M., Pearce, R. A. Amnesic concentrations of the nonimmobilizer 1,2-dichlorohexafluorocyclobutane (F6, 2N) and isoflurane alter hippocampal theta oscillations in vivo. Anesthesiology. 106 (6), 1168-1176 (2007).
Przedruki i uprawnienia
