Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65145

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy produkcję i charakterystykę czynników bioaktywnych zawierających nanodyski. Nanodyski amfoterycyny B są traktowane jako przykład, aby opisać protokół w sposób krokowy.

Streszczenie

Termin nanodysk odnosi się do dyskretnego typu nanocząsteczki składającej się z dwuwarstwowego lipidu, białka rusztowania i zintegrowanego czynnika bioaktywnego. Nanodyski są zorganizowane jako dwuwarstwa lipidowa w kształcie dysku, której obwód jest ograniczony białkiem rusztowania, zwykle należącym do rodziny wymiennych apolipoprotein. Liczne hydrofobowe czynniki bioaktywne zostały skutecznie rozpuszczone w nanodyskach poprzez ich integrację z hydrofobowym środowiskiem dwuwarstwy lipidowej cząstki, dając w dużej mierze jednorodną populację cząstek o średnicy 10-20 nm. Formulacja nanodysków wymaga precyzyjnego stosunku poszczególnych składników, odpowiedniego sekwencyjnego dodawania każdego składnika, a następnie sonikacji mieszaniny preparatu w kąpieli. Amfipatyczne białko rusztowania spontanicznie styka się i reorganizuje zdyspergowaną dwuwarstwę, tworząc mieszaninę lipidów i środków bioaktywnych, tworząc dyskretną, jednorodną populację cząstek nanodysku. Podczas tego procesu mieszanina reakcyjna przechodzi od nieprzezroczystego, mętnego wyglądu do sklarowanej próbki, która po pełnej optymalizacji nie daje osadu po odwirowaniu. Badania charakteryzacyjne obejmują określenie efektywności solubilizacji czynnika bioaktywnego, mikroskopię elektronową, chromatografię z filtracją żelową, spektroskopię absorbancji w ultrafiolecie widzialnym (UV/Vis) i/lub spektroskopię fluorescencyjną. Po tym zwykle przeprowadza się badanie aktywności biologicznej przy użyciu hodowanych komórek lub myszy. W przypadku nanodysków zawierających antybiotyk (tj. antybiotyk makrolidowo-polienowy amfoterycynę B), można zmierzyć ich zdolność do hamowania wzrostu drożdży lub grzybów w funkcji stężenia lub czasu. Względna łatwość formułowania, wszechstronność w odniesieniu do części składowych, wielkość cząstek w nanoskali, naturalna stabilność i rozpuszczalność w wodzie pozwalają na niezliczone zastosowania technologii nanodysków in vitro i in vivo. W niniejszym artykule opisano ogólną metodologię formułowania i charakteryzowania nanodysków zawierających amfoterycynę B jako hydrofobowy czynnik bioaktywny.

Wprowadzenie

Powstające dyskoidalne lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) są naturalnie występującymi protoplastami znacznie obfitszego sferycznego HDL obecnego w ludzkim układzie krążenia. Te powstające cząstki, określane również jako pre-ß HDL, posiadają unikalne i charakterystyczne właściwości strukturalne1. Rzeczywiście, zamiast istnieć jako cząstka sferoidalna, powstające HDL mają kształt dysku. Szeroko zakrojone badania charakterystyki strukturalnej naturalnych i odtworzonych dyskoidalnych HDL wykazały, że składają się one z dwuwarstwy fosfolipidowej, której obwód jest ograniczony amfipatyczną wymienną apolipoproteiną (apo), taką jak apoA-I. W metabolizmie ludzkich lipoprotein krążące powstające HDL gromadzą lipidy z komórek obwodowych i dojrzewają do sferycznych HDL w procesie, który jest zależny od kluczowych mediatorów białkowych, w tym transportera kasety wiążącej ATP A1 i lecytyny: acylotransferyz cholesterolu2. Proces ten stanowi kluczowy składnik odwrotnego szlaku transportu cholesterolu, który jest uważany za ochronny przed chorobami serca. Uzbrojeni w tę wiedzę i zdolność do rekonstytucji dyskoidalnych HDL, naukowcy zastosowali te cząstki jako interwencję terapeutyczną w leczeniu miażdżycy3. W istocie, wlew odtworzonego HDL (rHDL) do pacjentów wspomaga odpływ cholesterolu ze złogów płytki nazębnej i zwraca go do wątroby w celu przekształcenia w kwasy żółciowe i wydalenia z organizmu. Kilka firm biotechnologicznych/farmaceutycznych realizuje tę strategię leczenia4.

Jednocześnie, możliwość generowania tych cząstek w laboratorium wywołała lawinę działań badawczych, które doprowadziły do nowych zastosowań i nowych technologii. Jednym z głównych zastosowań jest wykorzystanie cząstek rHDL jako miniaturowej błony do przechowywania białek transbłonowych w środowisku podobnym do natywnego5. Do tej pory setki białek zostały z powodzeniem włączone do dyskoidalnego rHDL, a badania wykazały, że białka te zachowują zarówno natywną konformację, jak i aktywność biologiczną jako receptory, enzymy, transportery itp. Wykazano również, że cząstki te, określane jako "nanodyski", są podatne na charakterystykę strukturalną, często w wysokiej rozdzielczości6. Takie podejście do badań białek transbłonowych jest uznawane za lepsze od badań z micelami detergentowymi lub liposomami i w rezultacie szybko się rozwija. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że zgłoszono dwie różne metody, które są w stanie utworzyć rHDL. Metoda "dializy cholatowej"13 jest popularna w zastosowaniach związanych z włączaniem białek transbłonowych do dwuwarstwy rHDL5. Zasadniczo ta metoda formulacji polega na zmieszaniu dwuwarstwy tworzącej fosfolipid, białka rusztowania i białka transbłonowego będącego przedmiotem zainteresowania w buforze zawierającym detergent cholan sodu (lub deoksycholan sodu; masa cząsteczkowa miceli [MW] 4,200 Da). Detergent skutecznie rozpuszcza różne składniki reakcji, umożliwiając dializę próbki w stosunku do buforu pozbawionego detergentu. Na etapie dializy, gdy detergent jest usuwany z próbki, spontanicznie tworzy się rHDL. Gdy to podejście jest stosowane do uwięzienia białka transbłonowego będącego przedmiotem zainteresowania, cząsteczki produktu zostały nazwane nanodyskami5. Próby wykorzystania tej metody do włączenia małocząsteczkowych hydrofobowych środków bioaktywnych (MW <1000 Da) okazały się jednak w dużej mierze nieudane. W przeciwieństwie do białek transbłonowych, małocząsteczkowe środki bioaktywne są w stanie wydostać się z worka dializacyjnego wraz z detergentem, co znacznie zmniejsza ich skuteczność wprowadzania do rHDL. Problem ten został rozwiązany poprzez pominięcie detergentów w formulacji mixture14. Zamiast tego składniki są kolejno dodawane do wodnego buforu, zaczynając od dwuwarstwy tworzącej lipid, tworzącej stabilny czynnik bioaktywny zawierający rHDL, określany jako nanodysk. Inni używali rHDL do wprowadzania i transportu środków do obrazowania in vivo7. Ostatnio wyspecjalizowany rHDL składający się z rusztowania apolipoproteinowego i anionowego glicerofosfolipidu, kardiolipiny, został wykorzystany w badaniach nad wiązaniem ligandów. Cząstki te stanowią platformę do badań interakcji kardiolipiny z różnymi ligandami rozpuszczalnymi w wodzie, w tym z wapniem, cytochromem c i środkiem przeciwnowotworowym doksorubicyna8.

Niniejsze badanie skupia się na preparacji rHDL, która posiada stabilnie włączony hydrofobowy czynnik bioaktywny (tj. nanodysk). Zdolność tych środków do integrowania się ze środowiskiem lipidowym dyskoidalnych cząstek rHDL skutecznie nadaje im rozpuszczalność w wodzie. W związku z tym nanodyski mają potencjał do zastosowań terapeutycznych in vivo. Podczas formułowania nanodysków wymagane są określone warunki inkubacji/reakcji, aby skutecznie włączyć dyskretne hydrofobowe czynniki bioaktywne do cząsteczki produktu, a celem tego raportu jest dostarczenie szczegółowych informacji praktycznych, które można wykorzystać jako podstawowy szablon do tworzenia nowych cząstek nanodysków do określonych zastosowań. Tak więc w kontekście tego manuskryptu terminy nanodysk i nanodysk nie są zamienne. Podczas gdy nanodysk odnosi się do rHDL sformułowanego tak, aby zawierał białko transbłonowe osadzone w swojej dwuwarstwie lipidowej5, termin nanodysk odnosi się do rHDL opracowanego w celu włączenia hydrofobowych środków bioaktywnych o niskiej masie cząsteczkowej (< 1,000 Da), takich jak amfoterycyna B14.

Dostępne są różne metody pozyskiwania odpowiednich białek rusztowania. Możliwy jest zakup białek rusztowania od producentów [np. apoA-I(SRP4693) lub apoE4 (A3234)], jednak czynnikiem ograniczającym może być koszt. Preferowanym podejściem jest ekspresja rekombinowanych białek rusztowania w Escherichia coli. Publikowane są protokoły dla ludzkiego apoA-I9, apoE410, a także białka hemolimfy owadów apolipophorin-III11. Na potrzeby opisanych w niniejszym dokumencie eksperymentów wykorzystano rekombinowaną ludzką domenę N-końcową (NT) apoE4 (aminokwasy 1-183). Sekwencję nukleotydową kodującą ludzki apoE4-NT zsyntetyzowano i wstawiono do wektora ekspresyjnego pET-22b (+) bezpośrednio przylegającego do kodowanej wektorowo sekwencji lidera pelB. Konstrukt ten prowadzi do ekspresji białka fuzyjnego sekwencji lidera pelB-apoE4-NT. Po syntezie białek sekwencja lidera pełkotu bakteryjnego kieruje nowo zsyntetyzowane białko do przestrzeni peryplazmatycznej, gdzie peptydaza lidera rozszczepia sekwencję pelB. Powstałe w ten sposób białko apoE4-NT, bez znaczników sekwencji lub ogonków, następnie ucieka z bakterii i gromadzi się w pożywce hodowlanej11,12, upraszczając dalsze przetwarzanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transformacja, ekspresja i oczyszczanie składnika białka rusztowania

  1. Transformacja bakteryjna BL21 z plazmidem zawierającym apoE4-NT
    1. Rozmrażać probówkę z kompetentnymi komórkami BL21 (DE3) na lodzie przez 10 minut.
    2. Gdy cały lód się rozpuści, delikatnie i ostrożnie odpipetować 50 μl komórek do probówki transformacyjnej na lodzie.
    3. Dodać 5 μl zawierających 50 ng plazmidowego DNA (sekwencja, patrz Tabela Uzupełniająca 1) do mieszaniny komórek. Ostrożnie przesuń probówkę cztery lub pięć razy, aby wymieszać. Nie wirować.
    4. Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.
    5. Szok termiczny mieszaniny dokładnie w temperaturze 42 °C przez 10 s.
    6. Ułóż na lodzie na 5 minut.
    7. Odpipetować 950 μl pożywki S.O.C. do probówki w temperaturze pokojowej.
    8. Umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na 60 minut z oscylacją ustawioną na 250 obr./min.
    9. Dokładnie wymieszaj komórki, strzepując i odwracając, a następnie rozprowadź 100 μl roztworu komórkowego na 20 ml bulionu Luria + płytki selekcyjnej z agarem potraktowanej ampicyliną w stężeniu 0,1 mg/ml.
    10. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy wyrosną widoczne kolonie.
  2. Za pomocą pipetora elektronicznego przenieść 25 ml sterylnej pożywki NZCYM do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 250 ml w temperaturze pokojowej i dodać ampicylinę do końcowego stężenia roboczego 0,1 mg/ml.
  3. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej przenieść jedną pojedynczą kolonię z płytki selekcyjnej zawierającej odpowiednio przekształcony szczep bakteryjny i dodać bezpośrednio do kolby zawierającej 25 ml pożywki NZCYM + ampicyliny.
  4. Umieścić 25 ml kolby do hodowli nasion NZCYM w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C z oscylacją orbitalną ustawioną na 250 obr./min.
    UWAGA: Zaleca się, aby ta kultura nasion była uprawiana przez noc, aby osiągnąć odpowiednie stężenie bakterii (~1,5-2,0 jednostek gęstości optycznej), mierzone za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali = 600 nm.
  5. Przenieść 250 ml sterylnej pożywki NZCYM do czterech kolb z przegrodami o pojemności 1 l i dodać antybiotyk ampicylinowy do stężenia roboczego 0,1 mg/ml.
  6. W sterylnych warunkach przenieść 5 ml nasyconej kultury nasion do każdej z czterech kultur o pojemności 250 ml zawierających kolby i umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C z oscylacją orbitalną ustawioną na 250 obr./min.
    UWAGA: W tym momencie kultura będzie określana jako kultura ekspandacyjna, a wykładniczy wzrost będzie monitorowany za pomocą spektrofotometru UV1800. Wzrost może postępować do momentu, gdy gęstość optyczna kultury przy 600 nm (OD600) osiągnie wartość między 0,6-0,8.
  7. Gdy kultura ekspandująca osiągnie pożądaną wartość OD600 wynoszącą 0,6-0,8, dodać 59,6 mg izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do każdej 250 ml kultury zawierającej kolbę dla końcowego stężenia 1 mM w celu wywołania ekspresji białka. W tym momencie kultura ekspansji jest określana jako kultura wyrażenia. Rozpocząć odciąganie pokarmu przez okres 5 godzin.
  8. Pod koniec 5-godzinnego okresu odciągania wyjąć cztery kolby z inkubatora do wytrząsania i odpipetować 125 ml do sześciu butelek wirówkowych o pojemności 250 ml (łącznie 750 ml).
  9. Zrównoważyć każdą butelkę wirówki, aby upewnić się, że całkowita masa mieści się w zakresie ±0,5 mg od siebie.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby zapewnić bezpieczną pracę wirówki.
  10. Przygotuj urządzenie wirówkowe, najpierw przestawiając wyłącznik zasilania do pozycji włączonej. Kliknij przycisk oznaczony "Set/Actual" i ustaw parametry na "JA-14", "9,400 x g", 20.00 min i 4 °C za pomocą odpowiednich pokręteł.
  11. Załaduj sześć zrównoważonych butelek wirówkowych do wirnika wirówki o odpowiedniej wielkości i umieść w wirówce, upewniając się, że przestrzegane są wszystkie określone parametry bezpieczeństwa.
    UWAGA: Kontynuuj ten krok, aż wszystkie hodowle komórek bakteryjnych zostaną odwirowane i zebrane supernatanty.
  12. Przefiltrować wyizolowany supernatant bakteryjny przez filtr próżniowy lub równoważne urządzenie wyposażone w filtr 0,45 mikrona, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń.
  13. Oczyszczanie heparyną rekombinowanego białka rusztowania apoE4-NT
    UWAGA: Procedurę oczyszczania kolumny przeprowadza się w temperaturze pokojowej.
    1. Zrównoważyć kolumnę heparyny hi-trap, nakładając 10 objętości kolumny (50 ml) 10 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,2 i eluując z szybkością 5 ml / min.
    2. Nakładać wzbogaconą pożywkę apoE4-NT do kolumny z szybkością 2,5 ml/min, aż do nałożenia całej objętości 1 l pożywki i odrzucić przepływ.
    3. Przepłukać kolumnę 10 objętościami kolumny (50 ml) 10 mM buforu fosforanu sodu o pH 7,2 i odrzucić przepływ.
    4. Eluować pożądane białko apoE4-NT przez nałożenie trzech objętości kolumny (15 ml) buforu elucyjnego (10 mM buforu fosforanu sodu + 1,5 M NaCl, pH 7,2) do kolumny i zebrać eluat.
  14. Dializa eluatu apoE4-NT
    1. Przygotuj odcinek rurki do dializy (wymiary użytego przewodu do dializy to 22 cm długości, 12 mm średnicy wewnętrznej i 10 000 MWCO) poprzez dokładne namoczenie w destylowanej wodzie dejonizowanej (ddi) przez 10 minut.
    2. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10 mM fosforanu sodu + 150 mM NaCl, pH 7,2) w 1 litrowej zlewce plastikowej lub równoważnej.
    3. Używając rurki do dializy clamp, zaciśnij jeden koniec namoczonego przewodu do dializy, upewniając się, że zacisk jest zabezpieczony i żadna ciecz nie może się wydostać.
    4. Włożyć wąski lejek z szyjką do otwartego końca rurki do dializy i wlać 15 ml eluatu apoE4-NT do rurki dializy.
      UWAGA: Na tym etapie konieczne jest sprawdzenie, czy nie ma wycieków.
    5. Wyjąć lejek i zacisnąć koniec rurki dializacyjnej za pomocą innego zacisku rurki do dializy.
    6. Umieścić piankowy pływak do dializy na jednym z uszczelnionych końców rurki do dializy i umieścić zmontowany przewód do dializy w zlewce zawierającej 1 l buforu PBS.
    7. Umieść mieszadło magnetyczne na dnie zlewki i ustaw regulator mieszania na "niski", upewniając się, że nie powstaje wir.
    8. Po zakończeniu dializy zdekantować retentat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się, aby dializa była przeprowadzana w temperaturze 4 °C przez noc.

2. Preparat czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

  1. Przygotowanie podwielokrotności fosfolipidów
    1. Zważyć 5 mg odpowiedniego fosfolipidu (np. dimyrystoylfosfatydylocholiny [DMPC]) i przenieść do szklanej probówki.
    2. Rozpuścić 5 mg fosfolipidu, dodając 300 μl CHCl3 i 100 μlCH3OH, uzyskując całkowity stosunek 3:1 v/v.
    3. Odparować rozpuszczalnik organiczny, umieszczając szklaną probówkę pod delikatnym strumieniem gazuN2 na 10-15 minut, tak aby wzdłuż ścianek dolnej części probówki utworzyła się cienka warstwa wysuszonego fosfolipidu.
  2. Liofilizacja podwielokrotności fosfolipidów
    1. Przygotować podwielokrotności fosfolipidów do liofilizacji, przykrywając szklany otwór probówki parafilmem.
    2. Dokonać perforacji parafilmu za pomocą igły 24 G około 10-15 razy.
    3. Umieść perforowane porcje w odpowiednim pojemniku do liofilizacji i upewnij się, że gumowa pokrywka jest prawidłowo uszczelniona.
    4. Podłącz pojemnik do liofilizacji do kolektora próżniowego znajdującego się w górnej części maszyny do liofilizacji i upewnij się, że wszystkie inne zawory są szczelnie zamknięte.
    5. Włącz maszynę do liofilizacji, przestawiając wyłącznik zasilania i naciskając przycisk inicjalizacji próżni.
    6. Gdy system osiągnie całkowitą próżnię, kliknij przycisk inicjalizacji chłodzenia, aby rozpocząć proces liofilizacji.
      UWAGA: Zaleca się, aby próbki pozostawić do liofilizacji przez noc.
  3. Formulacja nanodysków amfoterycyny-B (amp-B)
    1. Odpipetować 0,45 ml PBS do liofilizowanej podwielokrotności fosfolipidów i wirować przez ~30 s w celu rozproszenia lipidu.
      UWAGA: Otrzymana próbka będzie nieprzezroczysta i mętna.
    2. Odmierzyć pipetą 50 μl 20 mg/ml roztworu podstawowego ampB (20 mg ampB rozpuszczonego w 1 ml dimetylosulfotlenku [DMSO], przechowywanego w temperaturze -20 °C w zamkniętym naczyniu bursztynowym) do rozproszonej próbki fosfolipidów i zawirować.
      UWAGA: Przy wyborze rozpuszczalnika, który ma być użyty do przygotowania roztworu podstawowego hydrofobowego środka bioaktywnego, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie: 1) rozpuszczalność środka bioaktywnego oraz 2) mieszalność rozpuszczalnika z buforem wodnym zastosowanym w preparacie. Chociaż DMSO jest często używane15,16,17,18,19, dimetyloform20,21 lub tetrahydrofuran22 również zostały z powodzeniem zastosowane23.
    3. Odpipetować 0,5 ml białka rusztowania apoE4-NT (stężenie ~4 mg/ml) do szklanej probówki zawierającej zdyspersjonowany fosfolipid i ampB. Ostateczna objętość próbki powinna wynosić około 1 ml.
    4. Kąpiel sonikować próbkę w temperaturze 24 °C, aż roztwór się klaruje (zwykle 10-15 min).
  4. Wirowanie nanodysków
    1. Przenieść oczyszczony roztwór ampB-nanodysku do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.
    2. Umieść probówkę w wirniku mikrowirówki stołowej z dodatkiem rurki równoważącej umieszczonej dokładnie naprzeciwko.
    3. Dokręcić nakrętkę wirnika i zamknąć pokrywę wirówki.
    4. Zaprogramuj wirówkę tak, aby wirowała przez 10 minut z prędkością ~11 000 x g, korzystając z odpowiednich pokręteł znajdujących się z przodu mikrowirówki.
      UWAGA: W tym momencie może być widoczna kulka. Osad ten składa się z nieinkorporowanego fosfolipidu i/lub ampB.
    5. Usunąć supernatant i przenieść go do innej czystej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
  5. Dializa próbki ampB-nanodysku
    1. Przygotuj odcinek rurki do dializy (wymiary użytego przewodu do dializy to 3 cm długości, średnica wewnętrzna 16 mm i 10 000 MWCO) poprzez dokładne namoczenie w wodzie ddi przez 10 minut.
    2. Przygotować 1 l PBS roztwór buforowy (10 mM fosforanu sodu + 150 mM NaCl, pH 7,2) w 1 l plastikowej zlewce lub równoważnej zlewce.
    3. Używając rurki do dializy clamp, zaciśnij jeden koniec namoczonego przewodu do dializy, upewniając się, że zacisk jest zabezpieczony i żadna ciecz nie może się wydostać.
    4. Włożyć lejek z wąską szyjką do otwartego końca rurki dializacyjnej i przenieść próbkę ampB-nanodysku do rurki dializy.
    5. Wyjąć lejek i zacisnąć koniec rurki dializacyjnej za pomocą innego zacisku rurki do dializy.
    6. Umieścić piankowy pływak do dializy na jednym z uszczelnionych końców rurki do dializy i umieścić zmontowany przewód do dializy w zlewce zawierającej 1 l buforu PBS.
    7. Umieść mieszadło magnetyczne na dnie zlewki i ustaw regulator mieszania na "niski", upewniając się, że nie powstaje wir. Pozostawić dializę do kontynuowania przez noc w temperaturze 4 °C.

3. Analiza spektralna próbek ampB-nanodisk

  1. Inicjalizacja spektrofotometru, po której następuje automatyczne wygaszanie
    1. Włącz spektrofotometr, przestawiając wyłącznik zasilania i połącz się z odpowiednim komputerem pomocniczym, naciskając przycisk oznaczony "Sterowanie komputerem".
    2. Na komputerze pomocniczym otwórz oprogramowanie oznaczone "UVProbe 2.61" i połącz się ze spektrofotometrem, klikając przycisk oznaczony "Połącz" w lewym dolnym rogu.
    3. Kliknij przycisk oznaczony Spectrum na górnym pasku narzędzi w oprogramowaniu UVProbe.
    4. Kliknij przycisk oznaczony Metoda na górnym pasku narzędzi.
    5. Kliknij kartę Pomiar i wprowadź "500" w polu tekstowym Start znajdującym się w sekcji "Zakres długości fali (nm)" i "300" w polu tekstowym "Koniec".
    6. Kliknij menu rozwijane obok zakładki oznaczonej Szybkość skanowania i ustaw ją na Średnia.
    7. Przygotować próbkę ślepą, przenosząc 1 ml DMSO do dwóch kuwet kwarcowych (QS 1.000).
    8. Załaduj obie kuwety do odpowiednich portów próbki spektrofotometru, kliknij przycisk Autoblank i zarejestruj widmo od 300-500 nm, klikając Start w lewym dolnym rogu.
  2. Przygotowanie i analiza spektralna wzorca ampB
    1. Przygotować wzorzec ampB o stężeniu 20 μg/ml, wyjmując kuwetę z przedniego portu próbki i dodając 20 μl roztworu podstawowego ampB o stężeniu 1 mg/ml (łącznie 20 μg ampB).
    2. Załaduj kuwetę z powrotem do portu próbki spektrofotometru i kliknij przycisk Start, aby zarejestrować absorbancję próbki.
    3. Wyjmij kuwetę z portu próbki i przelej zawartość płynu do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady.
    4. Dokładnie wypłucz kuwetę trzema płukaniami wody dejonizowanej, a następnie trzema płukaniami 70% etanolu.
  3. Przygotowanie i analiza spektralna próbki ampB-nanodysku z przerwanymi
    1. Przygotować rozbitą próbkę ampB-nanodysku (zawierającą 20 μg/ml w postaci ampB) przez pipetowanie 20 μl 1 mg/ml nanodysku ampB do 1 ml DMSO. Inkubować przez co najmniej 1 minutę przed rejestracją widma.
    2. Załaduj kuwetę do przedniego portu próbki spektrofotometru i kliknij przycisk Start, aby zarejestrować absorbancję próbki.
  4. Przygotowanie i analiza spektralna ślepej próby buforowej PBS
    1. Przygotować ślepą próbę buforową PBS, przenosząc 1 ml buforu PBS do dwóch kuwet kwarcowych (QS 1,000).
    2. Załaduj kuwety do odpowiednich portów próbki spektrofotometru, kliknij przycisk Autoblank i zarejestruj widmo w zakresie 300-500 nm.
  5. Przygotowanie i analiza spektralna niezakłóconej próbki ampB-nanodysku
    1. Przygotować niezakłóconą próbkę ampB-nanodysku (zawierającą 20 μg/ml w postaci ampB), wyjmując kuwetę z przedniego portu próbki i wprowadzając 20 μl próbki ampB-nanodysku o masie 1 mg/ml do buforu PBS.
    2. Załaduj kuwetę z powrotem do portu próbki spektrofotometru, kliknij przycisk Start i zapisz sample spectrum.
      UWAGA: Wszystkie odpady chemiczne należy utylizować w odpowiednio oznakowanym pojemniku na odpady zgodnie z przyjętymi wytycznymi.

4. Analiza żywotności drożdży

UWAGA: Przeprowadzono testy żywotności drożdży w celu oceny biologicznej aktywności ampB i określenia, czy proces formułowania lub włączania do nanodysków wpłynął na aktywność hamującą wzrost drożdży.

  1. Sformułować dwie próbki ampB-nanodysków (objętość końcowa = 1 ml) zawierające 1 mg ampB na 5 mg DMPC i 0,1 mg ampB na 5 mg DMPC zgodnie z poprzednio opisaną metodą (2.3-2.4.1).
    UWAGA: Aby uzyskać 1 mg/ml i 0,1 mg/ml ampB na 5 mg DMPC, należy odpipetować odpowiednio 50 μl i 5 μl z 20 mg/ml ampB w zapasie DMSO do każdej fiolki z próbką.
  2. Przygotowanie nasyconej kultury drożdży
    1. Przenieś 25 ml sterylnego podłoża z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Użyj sterylnej pętli inokulacyjnej, aby przenieść pojedynczą kolonię Saccharomyces cerevisiae (BY4741) do 25 ml pożywki YPD.
    3. Wyhodować drożdże w inkubatorze z wytrząsaniem, ustawionym na 30 °C, z oscylacją ustawioną na 200 obr./min przez 18 godzin.
  3. Przygotowanie indywidualnych próbek do oznaczania zahamowania wzrostu
    1. Przenieść 5 ml sterylnej pożywki YPD do 30 sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 13 ml.
    2. Poddać działaniu trzy zestawy probówek hodowlanych, dodając 20, 10 i 5 μl próbki ampB-nanodysku o stężeniu 1 mg/ml, reprezentującej odpowiednio 20, 10 i 5 μg ampB.
    3. Potraktuj trzy zestawy probówek hodowlanych, dodając 20, 10 i 5 μl próbki ampB-nanodysku o stężeniu 0,1 mg/ml, reprezentującej odpowiednio 2, 1 i 0,5 μg ampB.
    4. Traktować cztery zestawy probówek hodowlanych, dodając 20 μl PBS, DMSO, kontrolnego rHDL (bez ampB) lub 20 μg ampB w DMSO.
      UWAGA: Każdy zestaw probówek hodowlanych stanowi niezależną replikę. W związku z tym stosowanie tych metod daje ogólną wartość n równą n = 3.
  4. Inicjalizacja testu żywotności drożdży
    1. Rozpocząć eksperyment od zaszczepienia każdej próbki 100 μl (2% obj./obj.) nasyconej kultury drożdży
    2. Hodować drożdże w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 30 °C, z oscylacją ustawioną na 200 obr./min przez maksymalnie 18 godzin.
  5. Pomiary żywotności drożdży
    1. Włącz spektrofotometr, przestawiając przełącznik zasilania, a następnie kliknij przycisk oznaczony Go To WL i ustaw wartość na 600 nm.
    2. Przenieś 1 ml sterylnego podłoża YPD do dwóch plastikowych kuwet, załaduj do odpowiednich portów próbki na spektrofotometrze i kliknij przycisk Autoblank.
    3. Przenieś 1 ml każdej próbki do plastikowej kuwety, upewniając się, że za każdym razem wymieniasz kuwety i załaduj kuwetę do przedniego portu próbki spektrofotometru.
    4. Zmierz i zapisz gęstość optyczną każdej próbki przy długości fali 600 nm i wyrzuć każdą zużytą kuwetę do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces formulacji nanodysków z substancją bioaktywną
W opisanym procesie formulacji nanodysków z ampB reakcję uznaje się za zakończoną, gdy wygląd próbki zmienia się z mętnego na klarowny (Rysunek 1). Zmiana ta wskazuje na utworzenie się nanodysków oraz rozpuszczenie substancji bioaktywnej. Często substancje bioaktywne absorbują światło w zakresie widzialnym (np. ampB, kurkumina, luteina, koenzym Q10) i w takich przypadkach próbka przyjmuje kolor danej substan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Formułowanie środka bioaktywnego zawierającego nanodyski zapewnia wygodną metodę rozpuszczania nierozpuszczalnych w inny sposób związków hydrofobowych. Ponieważ nanodyski są w pełni rozpuszczalne w środowisku wodnym, stanowią one użyteczną metodę dostarczania dla szerokiego zakresu cząsteczek hydrofobowych (Tabela 1). Należą do nich małe cząsteczki, leki naturalne i syntetyczne, fitoskładniki, hormony itp. Strategia recepturowania jest zwykle zgodna ze standardowym protokołem, który musi uwzględniać właś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amfoterycyna BCayman Chemical Company11636ND Preparat i Preparat standardowy
AmpicylinaFisher ScientificBP17925Transformation & Ekspansja
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformacja
Baffled Flask NewBrunswick ScientificN/AEkspansja i Wyrażenie
BL21 kompetentna E coliNew England BiolabsC2527IButelki
wirówki transformacyjnejNalgene3140-0250Ekspresja
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Preparat
DMSOSigma Aldrich472301Standardowa prepartacja
DymyrystoylfosfatydylocholinaAvanti Lipidy850345PND Formulacja
Kolba ErlenmeyeraBellco BiotechnologyN/AEkspansja i Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Test żywotności drożdży
Szklane probówki borokrzemianoweVWR47729-570ND Formulacja
GraphPad (oprogramowanie)DotmaticsN/ATest żywotności drożdży
Podgrzewana kąpiel sonikacyjnaVWRN/AND
Formulaton Moduł grzewczy i azotowyThermo ScientificTS-18822ND Formulacja
HiTrap Heparyna HP (5 ml)GE Healthcare17-0407-03Oczyszczanie
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 WirówkaBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LiofilizatorLabconco7755030ND Formulacja
MetanolFisher ScientificA452-4ND Formulacja
Gaz azotowyPraxairUN1066ND Formulacja
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Ekspansja i Wyrażenie
Pet-22B wektorGenScriptN/ATransformacja
szalka PetriegoFisher ScientificFB0875718Transformacja & Ekspansja
Kuwet kwarcowychFisher Brand14385 928AAnaliza spektralna
Inkubator wstrząsającyNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformacja, ekspansja i Boje Expression
Slide-A-LyzerThermo Scientific66430Oczyszczanie
Rurki do dializy SnakeSkinThermo Scientific68100
Oczyszczanie Rurki do dializy SnakeSkinThermo Scientific88243Oczyszczanie
Chlorek soduFisher ScientificS271Oczyszczanie
Fosforan sodu dwuzasadowyFisher ScientificS374-500Oczyszczanie
Fosforan sodu jednozasadowyFisher ScientificBP329-500Oczyszczanie
Widma / POR Ważone zamknięciaSpectrum Przemysł medyczny132736Oczyszczanie
SpektrofotometrShimadzu UV-1800220-92961-01Analiza spektralna
Wirówkastołowa Beckman Coulter366816ND Formulacja
UVProbe 2.61 (oprogramowanie)ShimadzuN/AAnaliza spektralna
Filtr próżniowyMillipore9004-70-0Ekspresja i Oczyszczająca
pompa próżniowaGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAEkspresja i Oczyszczanie
VortexFisher Scientific12-812ND Preparat
drożdżowyNieBY4741Test żywotności drożdży
Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstrozaBD242820Test żywotności drożdży
dotyczy

Bibliografia

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119(2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704(2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195(2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454(2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022(2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777(2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065(2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28(2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66(2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Formułowanie nanodyskówbioaktywne nanodyskinanodyski z amfoterycyną Bbiałko rusztowaniowenanocząsteczki lipidowej dwuwarstwynanodyski do dostarczania lekówspektroskopia UV-Vismembrana dializacyjnahamowanie wzrostu drożdżyhydrofobowe substancje bioaktywne
Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.