Method Article

Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

DOI:

10.3791/65145

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy produkcję i charakterystykę czynników bioaktywnych zawierających nanodyski. Nanodyski amfoterycyny B są traktowane jako przykład, aby opisać protokół w sposób krokowy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termin nanodysk odnosi się do dyskretnego typu nanocząsteczki składającej się z dwuwarstwowego lipidu, białka rusztowania i zintegrowanego czynnika bioaktywnego. Nanodyski są zorganizowane jako dwuwarstwa lipidowa w kształcie dysku, której obwód jest ograniczony białkiem rusztowania, zwykle należącym do rodziny wymiennych apolipoprotein. Liczne hydrofobowe czynniki bioaktywne zostały skutecznie rozpuszczone w nanodyskach poprzez ich integrację z hydrofobowym środowiskiem dwuwarstwy lipidowej cząstki, dając w dużej mierze jednorodną populację cząstek o średnicy 10-20 nm. Formulacja nanodysków wymaga precyzyjnego stosunku poszczególnych składników, odpowiedniego sekwencyjnego dodawania każdego składnika, a następnie sonikacji mieszaniny preparatu w kąpieli. Amfipatyczne białko rusztowania spontanicznie styka się i reorganizuje zdyspergowaną dwuwarstwę, tworząc mieszaninę lipidów i środków bioaktywnych, tworząc dyskretną, jednorodną populację cząstek nanodysku. Podczas tego procesu mieszanina reakcyjna przechodzi od nieprzezroczystego, mętnego wyglądu do sklarowanej próbki, która po pełnej optymalizacji nie daje osadu po odwirowaniu. Badania charakteryzacyjne obejmują określenie efektywności solubilizacji czynnika bioaktywnego, mikroskopię elektronową, chromatografię z filtracją żelową, spektroskopię absorbancji w ultrafiolecie widzialnym (UV/Vis) i/lub spektroskopię fluorescencyjną. Po tym zwykle przeprowadza się badanie aktywności biologicznej przy użyciu hodowanych komórek lub myszy. W przypadku nanodysków zawierających antybiotyk (tj. antybiotyk makrolidowo-polienowy amfoterycynę B), można zmierzyć ich zdolność do hamowania wzrostu drożdży lub grzybów w funkcji stężenia lub czasu. Względna łatwość formułowania, wszechstronność w odniesieniu do części składowych, wielkość cząstek w nanoskali, naturalna stabilność i rozpuszczalność w wodzie pozwalają na niezliczone zastosowania technologii nanodysków in vitro i in vivo. W niniejszym artykule opisano ogólną metodologię formułowania i charakteryzowania nanodysków zawierających amfoterycynę B jako hydrofobowy czynnik bioaktywny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powstające dyskoidalne lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) są naturalnie występującymi protoplastami znacznie obfitszego sferycznego HDL obecnego w ludzkim układzie krążenia. Te powstające cząstki, określane również jako pre-ß HDL, posiadają unikalne i charakterystyczne właściwości strukturalne1. Rzeczywiście, zamiast istnieć jako cząstka sferoidalna, powstające HDL mają kształt dysku. Szeroko zakrojone badania charakterystyki strukturalnej naturalnych i odtworzonych dyskoidalnych HDL wykazały, że składają się one z dwuwarstwy fosfolipidowej, której obwód jest ograniczony amfipatyczną wymienną apolipoproteiną (apo), taką jak apoA-I. W metabo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformacja, ekspresja i oczyszczanie składnika białka rusztowania

  1. Transformacja bakteryjna BL21 z plazmidem zawierającym apoE4-NT
    1. Rozmrażać probówkę z kompetentnymi komórkami BL21 (DE3) na lodzie przez 10 minut.
    2. Gdy cały lód się rozpuści, delikatnie i ostrożnie odpipetować 50 μl komórek do probówki transformacyjnej na lodzie.
    3. Dodać 5 μl zawierających 50 ng plazmidowego DNA (sekwencja, patrz Tabela Uzupełniająca 1) do mieszaniny komórek. Ostrożnie przesuń probówkę cztery lub pięć razy, aby wymieszać. Nie wirować.
    4. Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.
    5. Szok term....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces formułowania nanodysku czynnika bioaktywnego
W opisanej procedurze formulacji ampB-nanodysku reakcję uważa się za zakończoną, gdy wygląd próbki przechodzi od mętnego do przezroczystego (Rysunek 1). Ta zmiana wskazuje, że uformowały się nanodyski i że czynnik bioaktywny został rozpuszczony. Często środki bioaktywne pochłaniają światło w widzialnym zakresie długości fali (np. ampB, kurkumina, luteina, koenzym Q10) iw takich przypadkach próbka przyjmuje kolor środka.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formułowanie środka bioaktywnego zawierającego nanodyski zapewnia wygodną metodę rozpuszczania nierozpuszczalnych w inny sposób związków hydrofobowych. Ponieważ nanodyski są w pełni rozpuszczalne w środowisku wodnym, stanowią one użyteczną metodę dostarczania dla szerokiego zakresu cząsteczek hydrofobowych (Tabela 1). Należą do nich małe cząsteczki, leki naturalne i syntetyczne, fitoskładniki, hormony itp. Strategia recepturowania jest zwykle zgodna ze standardowym protokołem, który musi uwzględniać właś.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z National Institutes of Health (R37 HL-64159).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amfoterycyna BCayman Chemical Company11636ND Preparat i Preparat standardowy
AmpicylinaFisher ScientificBP17925Transformation & Ekspansja
ApoE4-NT PlasmidGenScriptN/ATransformacja
Baffled Flask NewBrunswick ScientificN/AEkspansja i Wyrażenie
BL21 kompetentna E coliNew England BiolabsC2527IButelki
wirówki transformacyjnejNalgene3140-0250Ekspresja
ChloroformFisher ScientificG607-4ND Preparat
DMSOSigma Aldrich472301Standardowa prepartacja
DymyrystoylfosfatydylocholinaAvanti Lipidy850345PND Formulacja
Kolba ErlenmeyeraBellco BiotechnologyN/AEkspansja i Expression
Falcon TubesSarstedt Ag & CoD51588Test żywotności drożdży
Szklane probówki borokrzemianoweVWR47729-570ND Formulacja
GraphPad (oprogramowanie)DotmaticsN/ATest żywotności drożdży
Podgrzewana kąpiel sonikacyjnaVWRN/AND
Formulaton Moduł grzewczy i azotowyThermo ScientificTS-18822ND Formulacja
HiTrap Heparyna HP (5 ml)GE Healthcare17-0407-03Oczyszczanie
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd Fisher ScientificBP1755Expression
J-25 WirówkaBeckman CoulterJ325-IM-2Expression
JA-14 RotorBeckman Coulter339247Expression
LiofilizatorLabconco7755030ND Formulacja
MetanolFisher ScientificA452-4ND Formulacja
Gaz azotowyPraxairUN1066ND Formulacja
NZCYM mediaRPI Research ProductsN7200-1000.0Ekspansja i Wyrażenie
Pet-22B wektorGenScriptN/ATransformacja
szalka PetriegoFisher ScientificFB0875718Transformacja & Ekspansja
Kuwet kwarcowychFisher Brand14385 928AAnaliza spektralna
Inkubator wstrząsającyNew Brunswick ScientificM1344-0004Transformacja, ekspansja i Boje Expression
Slide-A-LyzerThermo Scientific66430Oczyszczanie
Rurki do dializy SnakeSkinThermo Scientific68100
Oczyszczanie Rurki do dializy SnakeSkinThermo Scientific88243Oczyszczanie
Chlorek soduFisher ScientificS271Oczyszczanie
Fosforan sodu dwuzasadowyFisher ScientificS374-500Oczyszczanie
Fosforan sodu jednozasadowyFisher ScientificBP329-500Oczyszczanie
Widma / POR Ważone zamknięciaSpectrum Przemysł medyczny132736Oczyszczanie
SpektrofotometrShimadzu UV-1800220-92961-01Analiza spektralna
Wirówkastołowa Beckman Coulter366816ND Formulacja
UVProbe 2.61 (oprogramowanie)ShimadzuN/AAnaliza spektralna
Filtr próżniowyMillipore9004-70-0Ekspresja i Oczyszczająca
pompa próżniowaGAST Manufacturing IncDOA-P704-AAEkspresja i Oczyszczanie
VortexFisher Scientific12-812ND Preparat
drożdżowyNieBY4741Test żywotności drożdży
Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstrozaBD242820Test żywotności drożdży
dotyczy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanodisk FormulationBioactive NanodisksAmphotericin B NanodisksScaffold ProteinLipid Bilayer NanoparticlesDrug Delivery NanodisksUV Visible SpectroscopyDialysis TubingYeast Growth InhibitionHydrophobic Bioactive Agents

Related Articles