Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Podsumowanie

Ta metoda opisuje enkapsulację antygenu wścieklizny w biodegradowalne mikrocząstki polimerowe o właściwościach strukturalnych i materiałowych, które umożliwiają pulsacyjne uwalnianie po określonym opóźnieniu. Test immunoenzymatyczny (ELISA) oceny antygenu pobranego z rdzenia cząstki potwierdza obecność nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w wyniku wytwarzania cząstek.

Streszczenie

Obecne wytyczne dotyczące profilaktyki poekspozycyjnej wścieklizny wymagają wielokrotnych zastrzyków podawanych przez kilka tygodni. Może to być nieproporcjonalnie uciążliwe dla osób mieszkających w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie występuje większość śmiertelnych przypadków narażenia na wściekliznę. Zbadano różne strategie dostarczania leków w celu skondensowania schematów szczepień do jednego wstrzyknięcia poprzez enkapsulację antygenów w cząsteczkach polimerowych. Jednak silne czynniki stresogenne podczas procesu enkapsulacji mogą powodować denaturację kapsułkowanego antygenu. W artykule opisano metodę kapsułkowania antygenu wirusa wścieklizny (RABV) w mikrocząstkach polimerowych, które wykazują regulowane uwalnianie pulsacyjne. Ta metoda, określana jako Cząstki Równomiernie Upłynnione i Uszczelnione w celu Encapulate Drugs (PULSED), generuje mikrocząstki za pomocą miękkiej litografii do tworzenia odwróconych form polidimetylosiloksanu (PDMS) z wielofotonowej, wydrukowanej w 3D formy wzorcowej. Folie z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) są następnie formowane tłocznie w formach PDMS w celu wytworzenia cylindrów o otwartej powierzchni, które są napełniane skoncentrowanym RABV za pomocą piezoelektrycznego robota dozującego. Te mikrostruktury są następnie uszczelniane poprzez podgrzanie górnej części cząstek, co pozwala materiałowi płynąć i tworzyć ciągłą, nieporowatą barierę polimerową. Po wytworzeniu stosuje się test immunoenzymatyczny (ELISA) specyficzny do wykrywania nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w celu potwierdzenia wysokiego odzysku antygenu immunogennego z mikrocząstek.

Wprowadzenie

Szczepienie jest niezwykle skutecznym narzędziem opieki zdrowotnej, które zapobiegło ponad 37 milionom zgonów w latach 2000-2019¹. Pomimo tej skuteczności, choroby, którym można zapobiegać poprzez szczepienia, nadal stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia na świecie, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), gdzie wysokie wskaźniki nieszczepień i niedostatecznych szczepień przyczyniają się do 1,5 miliona zgonów rocznie, którym można zapobiec dzięki szczepieniom². Wścieklizna nie jest wyjątkiem od tych dysproporcji. Pomimo swojego statusu najbardziej śmiertelnej choroby znanej ludzkości, prawie zawsze śmiertelnej, wścieklizna jest w pełni uleczalna i jest klasyfikowana jako zwalczona w wielu krajach o wysokich dochodach. Zamiast tego ciężar wścieklizny jest nieproporcjonalnie duży dla ludzi żyjących w częściach Azji i Afryki, gdzie choroba ma niszczące skutki dla ludzi i zwierząt gospodarskich^3,4.

Szczepienie ma kluczowe znaczenie dla zarządzania globalnym wpływem wścieklizny⁵. Koszt szczepień uniemożliwia powszechne stosowanie profilaktyki przedekspozycyjnej (PrEP), biorąc pod uwagę ogólnie niską częstość występowania choroby. Ponadto w krajach o niskich i średnich dochodach użyteczność profilaktyki poekspozycyjnej (PEP) jest ograniczona przez presję społeczno-ekonomiczną wywieraną na pacjentów poszukujących opieki zdrowotnej. Czynniki logistyczne, takie jak odległość do punktów dostępu do opieki zdrowotnej, utracone zarobki podczas leczenia, koszt leczenia, wizyty zakłócające codzienne czynności i zapominanie, powodują, że wskaźniki przestrzegania PEP wynoszą zaledwie 60%^6,7. Ten wysoki wskaźnik odejść pacjentów stanowi okazję do udoskonalenia podejść w celu wyeliminowania luk w szczepieniach przeciwko wściekliźnie w celu zwalczania choroby.

Systemy szczepień pojedynczym wstrzyknięciem (SI), które kontrolują uwalnianie antygenów, zostały zbadane jako sposoby na uzyskanie pełnej immunizacji w jednym wstrzyknięciu. Wyeliminowanie konieczności wielokrotnych wizyt u lekarza zmniejsza obciążenia, które uniemożliwiają pacjentom poszukiwanie odpowiedniej opieki. Aby osiągnąć szczepienie SI, antygen jest zwykle zamknięty w biodegradowalnej matrycy polimerowej, która często przybiera postać mikrocząstek do wstrzykiwań. Po wstrzyknięciu polimer ulega degradacji i uwalnia sekwestrowany antygen. Do tej pory prowadzono dwie podstawowe strategie uwalniania w celu osiągnięcia szczepienia przeciwko SI. W jednym podejściu antygen jest uwalniany w sposób ciągły przez dłuższy czas. Chociaż miało to na celu zwiększenie immunogenności pojedynczego wstrzyknięcia, nie jest jasne, czy takie podejście jest wystarczające do wywołania ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi wścieklizny (RABV) u ludzi⁸. W drugim antygen jest uwalniany po z góry określonym opóźnieniu, aby naśladować konwencjonalny i sprawdzony schemat szczepienia typu prime-boost. Suszenie rozpyłowe i metody wytwarzania mikrocząstek oparte na emulsji/rozpuszczalniku wykazują tę pierwszą strategię i zostały wykorzystane do skutecznego enkapsulacji zarówno szczepionek modelowych⁹, jak i wysoce stabilnych antygenów, takich jak tetanus toxoid¹⁰. Jednak te metody enkapsulacji obejmują stresory, w tym ciepło, oddziaływanie rozpuszczalnika i siły fizyczne, które mogą denaturować antygeny¹¹.

Cząsteczki Równomiernie Upłynnione i Zamknięte w Celu Encapulate Drugs (PULSED) to niedawno opracowana metoda wytwarzania, która może być wykorzystana do kapsułkowania leków biologicznych w biodegradowalne mikrocząsteczki. Mikroformowanie służy do generowania cząstek, które są wypełniane płynnym ładunkiem i podgrzewane, aby umożliwić polimerowi ponowne rozpłynięcie się i pełne zamknięcie centralnego magazynu ładunku w ciągłej warstwie biodegradowalnego polimeru. Ta mikrostruktura powoduje pulsacyjne uwalnianie ładunku po czasie zależnym od szybkości degradacji powłoki polimerowej¹². Ten manuskrypt demonstruje enkapsulację inaktywowanego RABV w mikrocząstkach składających się z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), biodegradowalnego polimeru stosowanego w wielu zatwierdzonych przez FDA preparatach ¹³, przy użyciu metody wytwarzania PULSED do enkapsulacji stabilnego antygenu RABV ocenianego za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Łącząc cząstki PLGA o różnej masie cząsteczkowej i/lub grupach końcowych, podejście to może naśladować obecny przebieg szczepienia przeciwko wściekliźnie po pojedynczym wstrzyknięciu.

Protokół

1. Generowanie wzorca formy cząsteczkowej

UWAGA: Proces drukowania 3D może być wykonany na dowolnej drukarce 3D o wystarczającej rozdzielczości przestrzennej; jednak obecny protokół opisuje proces dla wielofotonowej drukarki 3D.

1. Projektowanie struktur mikrocząstek za pomocą programu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
   UWAGA: Specyfikacje projektowe są następujące: 308 cząstek (średnica = 400 μm, wysokość = 500 μm i grubość ścianki = 100 μm) jest ułożonych w układzie 22 na 14, z odstępami między nimi 600 μm. Wzór zawiera również czteroramienną gwiazdę i pięcioramienną gwiazdę jako elementy odniesienia znajdujące się bezpośrednio na zewnątrz tablicy (rysunek uzupełniający 1).
2. Wyeksportuj ostateczny projekt jako plik STL (Supplementary Coding File 1) i prześlij plik do oprogramowania zdolnego do zdefiniowania parametrów druku, jak pokazano poniżej. Następnie zapisz go jako plik kompatybilny z drukarką 3D (patrz Spis materiałów).
   UWAGA: Odległość krojenia = 5 μm, odległość kreskowania = 1 μm, kontur skorupy = 50 μm, liczba warstw bazowych = 5 μm, rusztowanie = puste, tryb skanowania = galvo, oś z = mikroskop z-drive, prędkość skanowania = 100 000, moc = 100.
3. Podłoże do druku krzemowego należy poddać wstępnej obróbce (patrz tabela materiałów) za pomocą procesu czyszczenia plazmowego (gaz:_O2; moc: 200 watów; temperatura: 25 °C; przepływ: 20; czas: 5 min), a następnie natychmiast zanurzyć podłoże w roztworze 30 ml etanolu i 60 μl metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu na szklanej szalce Petriego. Przykryj folią aluminiową i pozostaw do inkubacji na noc.
   UWAGA: Ten krok zwiększa przyczepność wydruku do podłoża, co jest ważne podczas separacji PDMS (krok 2.6).
4. Prześlij plik do druku do wielofotonowej drukarki 3D, nałóż żywicę drukarską na obrabiane podłoże, załaduj soczewkę 10x (patrz tabela materiałów) i wydrukuj mikrostruktury.
5. Po zakończeniu zanurz wydruk w octanie eteru metylowego glikolu propylenowego (patrz tabela materiałów) na 45 minut, aby usunąć nienaświetlony fotorezyst, a następnie zanurz wydruk w alkoholu izopropylowym na 5 minut. Po utwardzeniu formy wzorcowej należy wystawić ją na działanie światła UV o długości fali 254 nm przez 120 min.
   UWAGA: Jeśli jest dostępne, światło UV w zakresie od 405 do 365 nm może być używane przez ~20 minut do późniejszego utwardzania wydrukowanych struktur.

2. Wytwarzanie pleśni z polidimetylosiloksanu (PDMS)

1. Potraktuj powierzchnię wydrukowanej w 3D formy wzorcowej, umieszczając ją w komorze próżniowej zawierającej szklane szkiełko z 40 μl silanu trichloro(1H,1H,2H,2H,-perfluorooktylu) (patrz Tabela materiałów) dodanego do powierzchni. Pociągnij podciśnienie (ciśnienie względne: -20 cali. Hg) dla 1 godz.
   UWAGA: Ten krok zapewnia łatwe oddzielanie podczas wyjmowania z formy (krok 2.6).
2. Podczas obróbki powierzchni formy wzorcowej należy dokładnie wymieszać bazę prepolimerową z polidimetylosiloksanu (PDMS) ze środkiem utwardzającym prepolimer PDMS w stosunku 9:1 (na każdą formę wzorcową potrzeba co najmniej 10 g materiału). Po dokładnym wymieszaniu przenieś nieutwardzony PDMS do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wiruj przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
3. Po zakończeniu obróbki powierzchni umieść formę wzorcową w naczyniu z folii aluminiowej i wylej nieutwardzony PDMS na wierzch formy, upewniając się, że elementy są całkowicie zanurzone. Umieść naczynie z folii aluminiowej w komorze próżniowej i pociągnij podciśnienie (ciśnienie względne: -20 cali). Hg) przez 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
4. Wyjmij naczynie z folii aluminiowej z komory próżniowej. Umieść przekładki o średnicy 800 μm na końcach formy wzorcowej i nałóż czysty szkiełko na formę główną, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Użyj spinaczy do segregatorów, aby zacisnąć formę i suwak razem, lokalizując siłę zacisku na przekładkach (rysunek uzupełniający 2).
5. Umieść strukturę w piekarniku ustawionym na 120 °C na co najmniej 4 godziny, aby utwardzić prepolimer w formach PDMS.
6. Wyjmij strukturę z piekarnika, ostrożnie zwolnij spinki do segregatora i ostrożnie oddziel formę wzorcową od utwardzonej formy PDMS za pomocą żyletki.
   UWAGA: Wydrukowana w 3D forma wzorcowa może być ponownie wykorzystana do wygenerowania dodatkowych form PDMS.

3. Produkcja folii PLGA

1. Odważyć 450 mg PLGA (patrz tabela materiałów) i umieścić go na nieprzywierającym arkuszu polimerowym o wymiarach 76 mm na 76 mm w pierścieniowej podkładce o grubości 250 μm i średnicy wewnętrznej 50,8 mm. Umieść drugi nieprzywierający arkusz polimeru nad PLGA i ściśnij stos między dwoma aluminiowymi blokami za pomocą c-clamp 101,6 mm do dokręcenia palcami.
   UWAGA: 502H PLGA został użyty wyłącznie w tym badaniu; jednak inne typy PLGA są kompatybilne z tym procesem.
2. Umieść zespół c-clamped w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C na 30 minut w próżni, przy ciśnieniu względnym -30 in.Hg. Następnie wyjmij zespół i mocno dokręć zacisk przed umieszczeniem go z powrotem w piekarniku próżniowym na kolejne 30 minut.
   UWAGA: Głównym celem stosowania próżni jest uniknięcie degradacji PLGA, która jest przyspieszana w wysokich temperaturach.
3. Wyjmij zestaw z piekarnika i pozwól mu ostygnąć przez 4 godziny w eksykatorze.
4. Po ostygnięciu poluzuj zacisk, usuń folię PLGA z nieprzywierających arkuszy polimerowych i umieść folię na oznakowanej szalce Petriego. Przechowywać szalkę Petriego w eksykatorze do późniejszego wykorzystania.

4. Generowanie cząstek PLGA

1. Powierzchnię formy PDMS należy potraktować zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 2.1.
2. Za pomocą pęsety i/lub skalpela wyciąć i umieścić część folii PLGA o grubości 250 μm, mniej więcej wielkości matrycy, na poddanej obróbce formie PDMS.
3. Nałóż czysty szklany szkiełko mikroskopowe na folię PLGA i formę PDMS i zaciśnij elementy razem, umieszczając zacisk sprężynowy bezpośrednio na matrycy i folii PLGA.
4. Umieść zaciśnięty zespół formy w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C i pociągnij próżnię z ciśnieniem względnym -30 cali. Hg dla 1 h.
   UWAGA: Czas potrzebny do uformowania cząstek zależy od PLGA i może wynosić od 1 do 12 godzin.
5. Wyjmij zaciśnięty zespół formy z piekarnika i pozwól mu pasywnie ostygnąć w temperaturze pokojowej przez około 15 minut lub do ostygnięcia w dotyku.
6. Za pomocą żyletki delikatnie dociśnij formę PDMS do układu cząstek PLGA, aby je rozdzielić. Przechowuj cząstki PLGA w eksykatorze do wykorzystania w przyszłości.

5. Koncentracja i oczyszczanie antygenu

1. Rozmrozić jedną podwielokrotność dostępnego w handlu antygenu RABV (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej.
2. Zmontuj zestaw filtracji, umieszczając dwa odśrodkowe filtry spinowe z odcięciem masy cząsteczkowej 100 kDa (MWCO; patrz tabela materiałów) w dwóch probówkach zbiorczych.
3. Wstępnie zwilż dwa odśrodkowe filtry wirowe, dodając 500 μl wody UltraClean.
4. Wirować filtry przy 2 400 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej w temperaturze pokojowej.
5. Usuń wodę zarówno z górnej, jak i dolnej komory zestawu filtracyjnego za pomocą pipety 200 μl.
   UWAGA: Nie pozwól, aby wstępnie zwilżony filtr wirowy wyschł.
6. Dodać 400 μl wody destylowanej do górnej komory każdego filtra wirowego, następnie dodać 100 μl rozmrożonego antygenu RABV i wymieszać z pipetą.
   UWAGA: To badanie skoncentrowało antygen około pięciokrotnie i zmniejszyło stężenie substancji pomocniczych <100 kDa o ~50-krotnie.
7. Załaduj dwa odśrodkowe filtry wirowe do wirówki stołowej, upewniając się, że filtry są skierowane do środka wirówki. Zaznacz, która strona filtra jest skierowana w stronę środka wirówki.
   UWAGA: W przypadku nieprawidłowego zorientowania roztwory nie będą odpowiednio filtrowane/stężone.
8. Odwirować filtry przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
9. Pobrać filtry z wirówki. Probówki zbiorcze będą zawierały filtrat, podczas gdy filtry będą zawierały skoncentrowaną próbkę (rysunek uzupełniający 3A).
10. Usunąć filtrat z probówek zbiorczych za pomocą pipety i wyrzucić.
11. Do każdego filtra dodać 450 μl przefiltrowanej wody destylowanej i wymieszać zagęszczoną próbkę z wodą, pipetując sześć razy w górę i w dół.
12. Odwirować oba filtry wirowe po raz drugi przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że filtry są skierowane do środka wirówki w tej samej orientacji, co w kroku 5.7.
13. Pobrać jednostki filtrujące z wirówki i, tak jak poprzednio, usunąć i wyrzucić filtrat z każdej probówki za pomocą pipety.
14. Wyjmij filtry wirowe z probówek zbiorczych i przykryj obudowy filtrów za pomocą górnej części probówek zbiorczych (rysunek uzupełniający 3B).
15. Umieść dolną część obudów filtra wirowego bezpośrednio na wirze i wiruj z prędkością 3 000 obr./min przez 30 sekund, trzymając obudowy filtra pionowo i pod kątem 45° (rysunek uzupełniający 3C).
    UWAGA: Ten krok ma na celu ponowne zawieszenie antygenu RABB, który utworzył osad podczas procesu wirowania.
16. Ostrożnie zdejmij nasadkę probówek zbiorczych z obudów filtra wirowego. Umieść osłony filtra z powrotem w dostarczonych probówkach zbiorczych i uruchom szybkie wirowanie (2-3 s), aby zebrać objętość, która mogła zostać uwięziona w nasadce.
    UWAGA: To szybkie wirowanie należy wykonać w mikrowirówce stołowej. Filtry powinny być styczne do wirówki, w przeciwieństwie do poprzedniej konfiguracji, aby zapewnić, że żaden roztwór nie zostanie utracony przez filtry.
17. Odwrócić każdą jednostkę filtra wirowego do nowej probówki zbiorczej dostarczonej z zestawem filtrów wirowych (patrz tabela materiałów) i odwirować przez 2 minuty przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej w celu zebrania skoncentrowanych próbek.
18. Skonsolidować skoncentrowane próbki z dwóch probówek zbiorczych w jedną probówkę zbiorczą. Zmierz i zapisz wynikową objętość.
    UWAGA: Otrzymana próbka będzie miała 5 razy początkowe stężenie antygenu niż podstawa, będzie miała małe stężenie substancji pomocniczej (<100 kDa) około 50 razy niższe niż podstawowa próbka i będzie lekko mlecznobiała. Całkowita objętość powinna wynosić około 44-48 μL.
19. Przechowywać 5 razy bardziej skoncentrowany, dwukrotnie umyty antygen w temperaturze 4 °C do czasu dozowania, ale nie dłużej niż 16 godzin. Przed napełnieniem cząstek tym roztworem należy odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Roztwór można rozcieńczyć przy użyciu wody destylowanej w celu uzyskania nominalnego stężenia docelowego do dozowania.

6. Wypełnianie cząstkami

1. Przefiltruj próżniowo 500 ml wody dejonizowanej przez filtr próżniowy 0,22 μm, a następnie odgazuj roztwór, stosując próżnię (ciśnienie względne: -20 cali). Hg) podczas sonikacji przez 20 min.
2. W tym czasie należy przymocować kapilary dozownika piezoelektrycznego (PDC; patrz Tabela materiałów) do dozownika piezoelektrycznego.
3. Zalać maszynę zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów) i umieścić szkiełko z cząstkami PLGA w obszarze dozowania.
4. Ustaw "Znajdź docelowe punkty odniesienia", uruchom, a następnie ustaw "Podłoże docelowe", zgodnie z rysunkiem uzupełniającym 4.
5. Załaduj 25 μl skoncentrowanego antygenu na płytkę źródłową i załaduj ją do maszyny. Za pomocą PDC odessać 10 μl skoncentrowanego antygenu do końcówki dozującej, umyć zewnętrzną część końcówki, a następnie skalibrować wyrównanie dozowania (rysunek uzupełniający 5).
6. Wprowadź "Parametry konfiguracji docelowej" i kliknij przycisk Uruchom (rysunek uzupełniający 6).
7. Po zakończeniu usuń wypełnione cząstki i sprawdź, czy są wypełnione pod stereoskopem.
8. Przejdź bezpośrednio do następnego kroku w protokole.

7. Uszczelnianie i zbieranie cząstek

1. Umieść blok ze stali nierdzewnej (patrz tabela materiałów) na płycie grzejnej. Umieść dwa szkiełka mikroskopowe na bloku ze stali nierdzewnej tak, aby były równoległe. Upewnij się, że blok ze stali nierdzewnej jest wypoziomowany, a następnie włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę tak, aby temperatura powierzchni stali nierdzewnej wynosiła 200 °C. Sprawdź temperaturę płyty grzejnej przed uszczelnieniem.
2. Zawieś napełnione cząstki PLGA nad płytą grzejną, umieszczając je na dwóch szklanych szkiełkach, a następnie natychmiast uruchom timer na 18 s.
   UWAGA: Czas i ciepło potrzebne do uszczelnienia cząstek będzie się różnić w zależności od właściwości chemicznych PLGA użytego do wytworzenia cząstek. Niestandardowy uchwyt na slajdy wydrukowany w 3D może być używany do obsługi slajdów w bezpiecznej odległości od płyty grzejnej. Plik STL jest dostarczany jako uzupełniający plik kodowania 2.
3. Po uszczelnieniu wyjmij matrycę cząstek z płyty grzejnej i zawieś ją nad stołem laboratoryjnym, umieszczając matrycę cząstek na dwóch oddzielnych szklanych szkiełkach. Pozostaw cząsteczki do ostygnięcia przez 1 minutę.
4. Po schłodzeniu cząstki można zebrać za pomocą skalpela, patrząc przez stereoskop. Przytrzymaj skalpel z ostrzem pod kątem 45° do szkiełka i dociśnij podstawę cząstki, aby oddzielić ją od szkiełka.
5. Po zebraniu użyj skalpela, aby przenieść cząstki do 0,5 ml niskobiałkowych probówek wiążących (patrz tabela materiałów). Następnie napełnij probówki 250 μl 1x fosforanowego roztworu buforowego (PBS) zawierającego 30 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 mg/ml glukozy.
   UWAGA: Roztwór glukozy o stężeniu 30 mg/ml i 1 mg/ml glukozy przygotowany w PBS utrzyma stabilność antygenu RABB.
6. Zmiażdż cząsteczki pod stereoskopem za pomocą pęsety z cienką końcówką. Upewnij się, że antygen RABV w rdzeniu cząstki jest dostępny do rozpuszczenia w otaczającym roztworze. Próbki należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie można ocenić siłę działania antygenu za pomocą testu ELISA. Próbki muszą zostać poddane testowi ELSIA w ciągu 7 dni od przygotowania.

8. Ocena antygenu za pomocą testu ELISA

UWAGA: Nie pozwól, aby mikropłytki wyschły w żadnym momencie. Zawsze układaj talerze w stosy i zawsze przykrywaj górną płytę plastikową uszczelką, pustą płytą lub pokrywką, aby uniknąć wyschnięcia.

1. Przygotować zgodnie z instrukcjami zawartymi w pliku uzupełniającym 1.
2. Przygotować 5 ml roztworu powlekającego (bufor węglanowo-wodorowęglanowy, pH 9,6) o stężeniu 2,5 μg/ml, dodając 25 μl przeciwciała powlekającego do 4975 μl buforu powlekającego o pH 9,4-9.6.
   UWAGA: 5 ml jest potrzebne do pokrycia 96 studzienek po 50 μl każdy (z dodatkową objętością na straty po pipetowaniu). Zwiększ całkowitą objętość o 5 ml dla każdej dodatkowej płytki ELISA.
3. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 50 μl roztworu powlekającego do każdej studzienki mikropłytki. Roztwór należy użyć do powlekania natychmiast po jego przygotowaniu.
4. Delikatnie postukaj wzdłuż krawędzi płytki na dłoni w rękawiczce, aby upewnić się, że dno każdej studzienki jest równomiernie pokryte płynem.
5. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i umieścić ją w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, a następnie przenieść na noc do 4 °C.
6. Wyjmij płytki z chłodni i umyj je trzykrotnie 200 μl buforu do płukania w każdej studzience.
7. Usuń bufor do przemywania i wlej 300 μl buforu blokującego do każdej studzienki.
   UWAGA: W przypadku uruchamiania wielu płytek z tymi samymi próbkami powtórzonymi na różnych płytkach, ważne jest, aby postępować płyta po płytce (tj. wypełnić płytkę 1 materiałem przed przejściem do płytki 2, a następnie do płytki 3 i tak dalej). Nie należy nakładać materiału X na wszystkie płyty, a następnie materiał Y itp., ponieważ zwiększyłoby to ryzyko wyschnięcia studzienek. Po ostatnim etapie płukania bufor do płukania powinien pozostać w dołkach płytki i zostać wyrzucony tylko bezpośrednio przed dodaniem próbek do płytki. Należy użyć plastikowej pokrywy z 96 dołkami, aby przykryć wszystkie dołki płytki ELISA, do których nie są dozowane od razu, a pokrywę należy sekwencyjnie przesuwać, aby odsłonić dodatkowe studzienki, które mają zostać wypełnione materiałem.
8. Uszczelnić płytki samoprzylepną folią z tworzywa sztucznego (patrz tabela materiałów) i umieścić je w inkubatorze na 60 ± 5 minut w temperaturze 37 ± 2 °C.
9. Przygotować krzywą wzorcową i próbki do badań do oceny podczas tej inkubacji.
   UWAGA: Oceniany antygen musi być wstępnie rozcieńczony w buforze rozcieńczalnika w zalecanym rozcieńczeniu 0,125 j.m./ml, z nadmiarem objętości wynoszącym co najmniej 40 μl w celu uwzględnienia strat związanych z pipetowaniem. Wszystkie próbki ocenia się w dwóch powtórzeniach (dwie kontrpróby techniczne) na każdej płytce ELISA. W przypadku krzywej standardowej w kolumnach 2 i 3 każdej płytki testu ELISA należy uwzględnić dwukrotny szereg rozcieńczeń wynoszący łącznie osiem punktów. Serię rozcieńczeń można przeprowadzić dla wszystkich innych próbek z odpowiednią liczbą punktów w oparciu o przewidywaną ilość ocenianego antygenu. Chociaż mniej rygorystyczne w przypadku większej przepustowości, rozcieńczenie pojedynczej próbki może być stosowane jako alternatywa dla opisanego powyżej posiewu. Jednakże oczekiwane stężenie pojedynczego rozcieńczenia musi mieścić się w zakresie krzywej wzorcowej.
10. W 96-dołkowych płytkach z białkiem o niskim wiązaniu lub probówkach białkowych o niskim wiązaniu (patrz Tabela materiałów) należy wykonać serię dwukrotnego rozcieńczenia każdej próbki wzdłuż kolumn płytki.
11. Załadować początek serii rozcieńczeń w wierszu A dla każdej odpowiedniej próbki z prędkością dwukrotnie większą od wymaganej objętości końcowej (na płytkę wymagane jest 100 μl próbki na studzienkę, więc wszystkie studzienki w A2-A11 powinny zawierać co najmniej 240 μl próbki, z dodatkową objętością 40 μl w celu uwzględnienia strat związanych z pipetowaniem).
12. Załadować 120 μl buforu rozcieńczalnika do wszystkich innych studzienek na płytce białkowej o niskim poziomie wiązania, z wyłączeniem kolumn 1 i 12 (tj. B2 do H11).
13. Za pomocą pipety wielokanałowej załadowanej 10 końcówkami należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie, przenosząc 120 μl próbki z punktu A2-A11 do punktu B2-B11 i kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, aby wymieszać, unikając rozpryskiwania i pęcherzyków. Powtórz ten proces, przesuwając się w dół płyty wzdłuż kolumn, aż do studzienek H2-H11. Pozostałe 120 μl objętości zasysanej z ostatniego rzędu studzienek należy wyrzucić.
    UWAGA: Próbki są teraz gotowe do analizy. Jeżeli do tego czasu faza blokowania nie zostanie zakończona, należy upewnić się, że próbki są przechowywane na lodzie.
14. Na końcu etapu inkubacji przemyć płytki trzykrotnie 200 μl buforu do przemywania wodą.
15. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl buforu rozcieńczalnika do kolumn 1 i 12 jako "ślepe próby".
16. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl z każdego dołka 96-dołkowej płytki białkowej o niskim stopniu wiązania zawierającej rozcieńczenia próbki na przemytą płytkę ELISA. Powtórz te czynności dla wszystkich uruchamianych płytek ELISA.
17. Uszczelnić płytki samoprzylepną folią z tworzywa sztucznego i umieścić je w inkubatorze na 60 ± 5 minut w temperaturze 37 ± 2 °C.
18. Przygotować roztwór przeciwciała wykrywającego (patrz tabela materiałów) o stężeniu 0,2 μg/ml, dodając 4,4 μl roztworu przeciwciała do 10,995,6 μl buforu rozcieńczalnika i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Łącznie 11 ml jest potrzebne na 96 studzienek po 100 μl każdy (z dodatkową objętością na straty po pipetowaniu). Zwiększ całkowitą objętość o 11 ml dla każdej dodatkowej ocenianej płytki ELISA. Roztwór należy zużyć natychmiast po przygotowaniu.
19. Na końcu etapu inkubacji przemyć płytki pięciokrotnie 200 μl buforu do przemywania wodą.
20. Odessać pozostały bufor do przemywania i dozować 100 μl roztworu przeciwciała wykrywającego do każdego dołka na mikropłytce za pomocą pipety wielokanałowej.
21. Uszczelnić płytki samoprzylepną folią z tworzywa sztucznego i umieścić je w inkubatorze na 60 ± 5 minut w temperaturze 37 ± 2 °C.
22. Przygotować koniugat pod koniec etapu inkubacji przeciwciał detekcyjnych, dodając 4,4 μl roztworu sprzężonego streptawidyny-peroksydazy (patrz tabela materiałów) do 10 995,6 μl buforu do przemywania .
    UWAGA: Łącznie 11 ml potrzeba na 96 dołków po 100 μl każdy (z dodatkową objętością do pipetowania wielokanałowego). Zwiększ całkowitą objętość o 11 ml dla każdej dodatkowej ocenianej płytki ELISA.
23. Umyj płytki pięciokrotnie 200 μl buforu do mycia.
24. Odessać pozostały bufor do przemywania i dozować 100 μl sprzężonego roztworu do każdej studzienki.
25. Uszczelnić płytki samoprzylepną folią z tworzywa sztucznego i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 60 ± 5 minut w temperaturze 37 ± 2 °C.
26. Przygotowanie podłoża podczas ostatniego etapu mycia zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Na każdą płytkę rozpuścić jedną tabletkę dichlorowodorku o-fenylenodiaminy (OPD; patrz tabela materiałów) w 9 ml wody dejonizowanej w ciemności, a następnie uzupełnić 1 ml 10x stabilnego buforu nadtlenkowego. Należy dostosować liczbę tabletek i całkowitą objętość roztworu (10 ml) w zależności od liczby ocenianych płytek.
27. Umyj płytki pięciokrotnie 200 μl buforu do mycia.
28. Dozować 100 μl substratu do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
29. Uszczelnij płytki samoprzylepną folią z tworzywa sztucznego i pozostaw je na stole na 10-20 minut, chronione przed światłem, za pomocą folii aluminiowej.
    UWAGA: Monitoruj wizualnie rozwój kolorów, aby uniknąć nasycenia.
30. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i natychmiast do odczytanej płytki w celu uzyskania absorbancji przy 492 nm i absorbancji odniesienia 620 nm.
31. Przeanalizować dane, stosując skorygowany odczyt absorbancji (odczyt przy 492 nm minus odczyt przy 620 nm) i odjąć średnią z próby ślepej od wszystkich próbek. Użyj metody interpolacji sigmoidalnej 4PL, aby przeliczyć wartości absorbancji na IU/ml. Na koniec pomnożyć przez 250 μl (całkowita objętość próbki), aby przeliczyć na IU.
    UWAGA: Tę analizę można przeprowadzić za pomocą oprogramowania do analizy danych.

Wyniki

Uszczelnianie i napełnianie cząstek to dwa najbardziej krytyczne kroki w tym protokole. Cząstki wypełniono solą sodową fluoresceiny, aby wykazać idealne wypełnienie i kilka typowych błędów. Sól sodową fluoresceiny zastosowano zamiast antygenu RABV w celu ułatwienia wizualizacji. Podczas napełniania ważne jest, aby dozować roztwór na dno rdzeni cząstek, a następnie odczekać wystarczająco dużo czasu, aby rozpuszczalnik/woda odparowały. Po zakończeniu, magazyn substancji rozpuszczonej pozostaje na dnie rdzenia cząstki (Rysunek 1A). Po napełnieniu bardzo ważne jest, aby prawidłowo uszczelnić cząstki. Rysunek 1B pokazuje kilka wyników (udanych i nieudanych) procesu uszczelniania. Po 12 sekundach czasu uszczelniania pozostaje wyraźna ścieżka od środka cząstki na zewnątrz cząstki, co pokazuje, że cząstka nie jest całkowicie uszczelniona. I odwrotnie, jeśli pozostawi się go do uszczelnienia na 36 s, PLGA prawie całkowicie się topi, co skutkuje mikrostrukturą o płytkim profilu. Idealną morfologię można zwizualizować, gdy cząstki są zgrzewane przez 18 i 24 s, ponieważ zawierają ładunek całkowicie zamknięty w polimerze, zachowując jednocześnie strukturę cząstek. Rysunek 1C pokazuje kilka potencjalnych rezultatów po wypełnieniu i uszczelnieniu. Podczas dozowania, jeśli rozpuszczalnik nie dotrze do dna cząstek, pozostawia substancję rozpuszczoną wysuszoną w środku rdzenia cząstki (nieprawidłowo wypełnioną); Chociaż cząstki te mogą nadal uszczelniać, słabe załadowanie ładunku może ograniczyć wydajność załadunku. Jeśli cząstki są wypełnione zbyt dużą ilością ładunku (przepełnione), proces uszczelniania zostaje zahamowany, ponieważ ładunek zapobiega przepływowi PLGA przez otwór. Po prawidłowym napełnieniu i uszczelnieniu cząstki o tej geometrii są na tyle małe, że z łatwością mieszczą się w igle o masie 19 G. Co więcej, 10 cząstek konsekwentnie przepływało przez igłę 19 G (100% ± 0%) po wstrzyknięciu lepkiego roztworu, takiego jak 2% karboksymetyloceluloza (rysunek uzupełniający 7).

Rysunek 1: Typowe problemy z procesem napełniania i uszczelniania. (A) Obrazy pokazują parowanie rozpuszczalnika po jednym cyklu napełniania, gdzie cząstki są ładowane 6 nL soli sodowej fluoresceiny 100 mg/ml rozpuszczonej w wodzie. (B) Reprezentatywne obrazy cząstek 502H PLGA usuniętych z procesu uszczelniania w 0, 12, 18, 24 i 36 s. (C) Różne wyniki procesu uszczelniania, gdy cząstki są prawidłowo napełnione, nieprawidłowo lub przepełnione. Obrazy są generowane przez ustawianie ostrości wielu obrazów i łączenie ich za pomocą oprogramowania do ustawiania ostrości. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przetwarzanie antygenu przez filtr wirowy przed załadowaniem go do cząsteczek jest ważne z dwóch powodów. Po pierwsze, wirowanie służy do usunięcia podstawowych substancji pomocniczych z roztworu szczepionki, które mogą ograniczać zdolność ładowania cząstek przy jednoczesnym zachowaniu antygenu RAPV. Obecny protokół oczyszcza antygen około 50-krotnie. Po drugie, antygen jest również skoncentrowany podczas tego procesu. Rysunek 2A pokazuje mikrofotografię nienaruszonych wirionów RABV w skoncentrowanej próbce antygenu. Antygen ten jest około 4,4 razy bardziej skoncentrowany niż początkowy roztwór podstawowy (Rysunek 2B). Ilość antygenu początkowo załadowanego do odśrodkowych filtrów spinowych może być zmieniona w celu modulowania osiągniętego końcowego stężenia krotności. Na przykład załadowanie 40 μl podstawowego antygenu daje około 1,75-krotne stężenie. Rysunek uzupełniający 8 pokazuje znaczenie wirowania (krok 5.15) w procesie zagęszczania. Zaniedbanie wirowania lub niewłaściwe wirowanie próbek ogranicza proces zagęszczania.

Rysunek 2: Stężenie antygenu. Stężenie antygenu przez filtrację odśrodkową wykazane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (A) i potwierdzone testem ELISA (B). Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Analiza statystyczna jest wykonywana przy użyciu wielokrotnych testów porównawczych Tukeya z jednoczynnikową ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3A przedstawia skoncentrowany antygen wypełniony w nieuszczelnione i uszczelnione cząstki. Chociaż do cząstek ładowana jest znaczna ilość antygenu (0,0469 ± 0,0086 IU), materiał ten stanowi <90% pojemności cząstek, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na obciążenie dodatkowego antygenu. Co ciekawe, nieuszczelnione cząstki zawierają tylko 0,0396 ± 0,0077 IU, co stanowi tylko 85% ± 16% całkowitej załadowanej ilości. Chociaż jest to statystycznie nieistotna strata, część antygenu RABV mogła ulec denaturacji podczas wielokrotnego nawadniania i suszenia w procesie napełniania. Po uszczelnieniu 69% ± 5% antygenu pozostaje zamknięte w formie bioaktywnej. Chociaż sugeruje to, że podczas procesu uszczelniania dochodzi do znacznych strat spowodowanych stresem termicznym, większość inaktywowanego antygenu wirusowego pozostaje nienaruszona (Rysunek 3B). Kokapsułkowanie stabilizujących substancji pomocniczych wraz z antygenem jest jedną z możliwych strategii dalszego zwiększania stabilności antygenu w całym procesie wytwarzania i wcześniej odnosiło sukcesy w przypadku innych inaktywowanych antygenów wirusa^14,15.

Rysunek 3: Bioaktywny antygen RABV po wytworzeniu cząstek. (A) Obrazy pokazują nieuszczelnione i zapieczętowane cząstki zawierające antygen RAPV. (B) Stabilność antygenu w procesie wytwarzania cząstek (n = 4). Kontrola ładowania jest generowana przez dozowanie antygenu bezpośrednio do roztworu. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Podziałka = 200 μm. Analiza statystyczna jest wykonywana przy użyciu wielokrotnych testów porównawczych Tukeya z jednoczynnikową ANOVA. *p < 0,05. Obrazy są generowane przez ustawianie ostrości wielu obrazów i łączenie ich za pomocą oprogramowania do ustawiania ostrości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wymiary cząstki, odniesienia i tablicy. Rysunek przedstawia właściwości geometryczne czteroramiennej gwiazdy referencyjnej (A), cylindrycznej mikrocząstki (B), pięcioramiennej gwiazdy odniesienia (C) oraz układu cząstek z odniesieniami (D) wyświetlanych w oprogramowaniu CAD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Ten rysunek pokazuje przekrój struktury umieszczonej w piecu w celu utwardzenia form PDMS. Strzałki wskazują miejsca, w których stosowane są zaciski segregatora. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Właściwa technika skutecznego odzyskiwania skoncentrowanego antygenu. Pod koniec pierwszego wirowania zagęszczona próbka oznaczona czerwonym kółkiem (A) jest zatrzymywana w filtrze, podczas gdy filtrat jest zbierany na dnie probówki zbiorczej (większa rurka zewnętrzna). W celu ponownego zawieszenia granulowanego antygenu, odśrodkowy zespół filtrujący jest zamykany za pomocą rurki zbiorczej (B) w celu przygotowania do wirowania. Podczas wirowania końcówka rurki pozostaje w kontakcie z podkładką wirową, a koniec nasadki obraca się, utrzymując kąt 45° z podkładką wirową (C). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

>Rysunek uzupełniający 4: Programowanie przed uruchomieniem dozownika piezoelektrycznego. (A) Ustaw "Znajdź punkty odniesienia celu", przechodząc z zakładki "Główne" do Konfiguracja robota > Różne >Div. Funkcja > Znajdź punkty odniesienia celu. Użyj przycisków podświetlonych na niebiesko, aby ustawić znaczniki powiernicze. Najpierw wybierz opcję Naucz się szablonu i narysuj ramkę wokół zaufanego znaku zainteresowania, sprawdź poprawność szablonu, klikając Wyszukaj szablon i zapisz szablon. Zrób to dla czteroramiennych i pięcioramiennych gwiazd i zapisz nazwy plików zgodnie z instrukcjami w sekcji Użyj dwóch różnych obrazów szablonów. Następnie upewnij się, że wszystkie parametry w czarnych skrzynkach są zgodne. Załaduj powiernika z czteroramienną gwiazdą za pomocą szablonu obciążenia (zielone pole). Zapisz program "Znajdź docelowe punkty odniesienia", wybierając opcję Lista zadań (pomarańczowe pole). (B) Skonfiguruj Uruchom, przechodząc do zakładki Konfiguracja robota > Zadania, a następnie załaduj sekwencję zadań pokazaną w niebieskim polu, dodając zadania z listy zadań (czarne pole) przy użyciu opcji Zadanie w Uruchom (zielone pole). Na koniec zapisz zadanie (pomarańczowe pole). (C) Skonfiguruj "Podłoże docelowe", przechodząc do konfiguracji robota > Podłoże docelowe, a następnie dodaj cel (niebieskie pole). (D) Wprowadź pokazane tutaj parametry i wybierz Zapisz (niebieskie pole). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

>Rysunek uzupełniający 5: Ładowanie antygenu i kalibracja wyrównania dozowania. (A) Przejdź do zakładki Konfiguracja dyszy > Wykonaj zadanie i zasysaj 10 μL antygenu do końcówki dozującej, wybierając TakeProbe10 μL (skrzynka) i klikając DO (skrzynka). (B) To otwiera odrębne okno. Wybierz studzienkę, do której załadowano skoncentrowany antygen i wybierz OK (niebieskie pole). (C) Po odessaniu antygenu umyj końcówkę, wybierając niebieskie pole, i powtórz to płukanie jeszcze dwa razy. Wybierz kamerę (ramka) i określ objętość upuszczania, wybierając opcję upuszczania głośności (zielona ramka). Upewnij się, że tworzy się stabilna kropla z odchyleniem standardowym objętości (%) <2 (pomarańczowa ramka). (D) Wykonanie tych kroków otworzy kamerę Snap Drop Cam; wybierz Obraz (niebieskie pole) z menu rozwijanego i wybierz Kreator kamery z głowicą dyszy. Spowoduje to otwarcie nowego okna. Szybko wykonaj następną sekwencję kroków. (E) Upewnij się, że cel określony na rysunku uzupełniającym 4 jest załadowany, a następnie wybierz opcję Przenieś do celu (niebieskie pole). Dostosuj krople do 15 i wybierz Punktowy (czarne pole). Po wykryciu natychmiast wybierz opcję Przenieś (zielone pole). Upewnij się, że wybrano opcję Automatyczne wyszukiwanie i usuń rozmiar cząstek = 12, a następnie kliknij Start (pomarańczowe pola). Jeśli automatyczne wykrywanie nie powiedzie się, powtórz ten proces po przejściu do innego obszaru na slajdzie (fioletowe pole). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

>Rysunek uzupełniający 6: Programowanie tablicy wykrywania i rozpoczęcie biegu. (A) Przejdź do Ustawień celu > Celu, a następnie wypełnij parametry pokazane w niebieskim polu. (B) Następnie przejdź do zakładki "Ustawienia pola" i wprowadź 20 w polu nr. pola kropli (niebieska ramka), wybierz studzienkę (ramka), a następnie wybierz cele/cząstki, do których chcesz dozować (zielona ramka). Wybierając inną studzienkę i ponownie wybierając cele/cząstki, podczas jednego cyklu wykonywane są dodatkowe cykle napełniania. (C) Na ekranie głównym upewnij się, że wybrano bieg i cel utworzone na rysunku uzupełniającym 5. (D) Przejdź do zakładki "Uruchom" i wybierz Rozpocznij bieg (niebieskie pole). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 7: Wstrzykiwalność mikrocząstek. (A-C) Stereoskopowe obrazy mikrocząsteczek wypełnione solą sodową fluoresceiny i zamknięte w igle 19 G. (D) W sumie 10 cząstek wstrzyknięto przez igłę 19 G przy użyciu 2% roztworu karboksymetylocelulozy (n = 8). Podziałka = 1 mm. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Potencjalne problemy z koncentracją antygenu. Czerwona linia wskazuje oczekiwany wzrost koncentracji. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu wielokrotnych testów porównawczych Tukeya z jednoczynnikową ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przygotowanie i roztworów dla RABV ELISA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 1: plik STL zawierający tablicę cząstek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodowania 2: plik STL zawierający geometrię dla niestandardowego uchwytu do szkiełek używanych do uszczelniania cząstek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Możliwa jest zmiana geometrii cząstek w zależności od potrzeb; Jednak w przypadku konstrukcji cylindrycznych autorzy zalecają zachowanie stosunku 5:4:1 wysokości do średnicy:grubości ścianki opisanego w protokole. Ten współczynnik kształtu zapewnia, że obecna jest wystarczająca ilość materiału PLGA, aby uszczelnić cząstki i pozostać wystarczająco wytrzymałym mechanicznie do przenoszenia. Wymiary i kształty cząstek można łatwo zmieniać podczas procesu CAD, co umożliwia generowanie niezliczonych geometrii. Połączenie elastyczności CAD z drukiem 3D umożliwia szybką iterację projektów mikrocząstek. Chociaż protokół ten wykorzystuje wielofotonową drukarkę 3D, każda drukarka 3D o specyfikacji umożliwiającej wydrukowanie wymiarów mikrostruktury w odpowiednim materiale może być użyta do wygenerowania początkowej formy wzorcowej. Co więcej, fotolitografia była wcześniej wykorzystywana do tworzenia podobnych struktur w układach znacznie większych niż te wytworzone w tym protokole; Jednak nakład pracy, opóźnienia w zamawianiu niestandardowych fotomasek i dostępność sprzętu spowolniłyby iteracyjny proces projektowania¹⁶. Wreszcie, wytwarzanie form wzorcowych można zlecić firmom pobierającym opłaty za usługi, jeśli nie jest możliwe wyprodukowanie formy wzorcowej we własnym zakresie. Niezależnie od drukarki 3D lub metody użytej do wygenerowania form wzorcowych, przyczepność wydruku do podłoża ma kluczowe znaczenie dla dalszych etapów. W szczególności, jeśli przyczepność jest niewystarczająca podczas generowania formy PDMS, wydrukowane cząstki pozostaną w formie PDMS, co będzie wymagało ręcznego usunięcia wydrukowanych cząstek i zniszczenia formy wzorcowej.

Kolejnym krytycznym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest wypełnianie cząstkami. Mikrocząstki mają ograniczoną zdolność napełniania, dlatego filtracja jest stosowana nie tylko w celu zagęszczenia antygenu RABB, ale także w celu usunięcia podstawowych substancji pomocniczych, które w przeciwnym razie zajęłyby dużą część objętości rdzenia mikrocząsteczki. Biorąc jednak pod uwagę duży rozmiar antygenu RABV (około 60 nm × 180 nm)¹⁷, możliwe jest częściowe osadzenie antygenu na etapach wirowania. Z tego powodu ważne jest, aby po odwirowaniu ponownie zawiesić antygen przez pipetowanie lub wirowanie, aby osiągnąć wysoki odzysk antygenu RABB. Wysoce skoncentrowany roztwór jest idealny do dozowania, ponieważ skraca cykle dozowania, a tym samym ogranicza degradację antygenu podczas napełniania. Jednak lepkość jest głównym ograniczeniem piezoelektrycznych robotów dozujących tworzących stabilną kroplę, więc dozowanie roztworu o bardzo wysokim stężeniu może nie być możliwe lub wskazane. Rozcieńczanie roztworu wypełniającego jest najłatwiejszym sposobem na osiągnięcie stabilnego tworzenia kropli, ale należy wziąć pod uwagę stabilność antygenu w dodatkowych cyklach napełniania potrzebnych do osiągnięcia pożądanego obciążenia i dłuższy czas potrzebny do napełnienia cząstek.

Ograniczenia
Metoda ta wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu do produkcji początkowych form oraz specjalistycznego przyrządu do napełniania do produkcji mikrocząstek. Chociaż zapotrzebowanie na drukarkę 3D o rozdzielczości drukowania zdolnej do generowania początkowych form wzorcowych może zostać zniwelowane przez podejście oparte na opłatach za usługę, dostęp do piezoelektrycznego robota dozującego jest ograniczony. Zakup piezoelektrycznego robota dozującego wymaga znacznej inwestycji początkowej, często w wysokości od 80 000 do 200 000 USD, w zależności od marki, przepustowości i możliwości. Chociaż kilka innych metod napełniania jest potencjalną alternatywą, metody te nie zostały zwalidowane przy użyciu antygenu^{RABV 12}.

Przyszłe zastosowania
Znaczna część kapsułkowanego antygenu RABV pozostała stabilna w procesie uszczelniania. W teorii, poprzez włączenie tego antygenu do cząstek złożonych z różnych typów PLGA, które naśladują czas podawania profilaktyki poekspozycyjnej, wszystkie dawki można podać w jednym wstrzyknięciu. Wyeliminowanie konieczności powtórnych wizyt w szpitalu w celu podania dodatkowych dawek poprawi przestrzeganie zaleceń przez pacjentów, co przełoży się na lepsze wyniki leczenia. Ponadto, po wykazaniu zdolności do zachowania reaktywności ELISA wysoce złożonego inaktywowanego wirusa wścieklizny, prawdopodobne jest, że inne antygeny, w tym szczepionki podjednostkowe, byłyby zgodne z tą metodą enkapsulacji. Stosowanie innych profilaktycznych antygenów z mikrocząstkami PULSED może uratować miliony istnień ludzkich w krajach o niskich i średnich dochodach poprzez zwiększenie wskaźników szczepień w populacjach niedostatecznie zaszczepionych. Aby to osiągnąć, szczepionki muszą jednak pozostać stabilne nie tylko poprzez kapsułkowanie, ale także uwalnianie, co może być trudne, ponieważ ładunek będzie poddawany podwyższonym temperaturom i potencjalnie kwaśnemu mikrośrodowisku ze względu na ciepło ciała i produkty degradacji PLGA¹⁸. Przyszłe prace będą koncentrować się na stabilizowaniu strategii antygenu poprzez uwalnianie, co otworzy potencjał dla platformy szczepień jednoiniekcyjnych, która ma szerokie zastosowanie w zapobieganiu wielu chorobom zakaźnym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &mikro; m Filtr PES	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
0,25 mm Podkładki	regulacyjne McMaster Carr	98090A935
0,75 cala Spiner Clips	Zszywki	480114
10 mL	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL  Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	uchwyt w końcu odpadnie. Użyj szczypiec, aby wyregulować, gdy tak się stanie.
Igła 19 G	EXCELINT	26438
25 mL  Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy	Fisherbrand	13-678-11
3-(trimetoksysilil) metakrylan propylu	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 ml  Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym	Eppendorf	22431081
50 mL Probówki wirówkowe	Corning
50 ml  Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy	Fisherbrand	13-678-11F
Aceton	Fisher	AC268310010
Blok aluminiowy	McMaster Carr	9057K175
Folia aluminiowa	VWR	89079-069
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Przeciwciało przeciwko wirusowi wścieklizny, przeciwciało wolne od surowicy, klon 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciw wirusowi wścieklizny, klon D1-25, biotynylowane	Fisherbrand	14-388-100
Karboksymetyloceluloza	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, filtr, stojak	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0,65 ml probówka do mikrowirówki z zatrzaskiem o niskim poziomie wiązania	Corning	3206
Costar 1,7 mL Probówka do mikrowirówek z zatrzaskiem o niskim poziomie wiązania		3207
Opis	Nanoscribe		Oprogramowanie służące do definiowania parametrów drukowania dla drukarki 3D Nanoscribe to krok 1.2. Oprogramowanie dostarczone z drukarką.
Eksykator	Fisher Scientific	10529901	Lub równoważny
Zszywki	dwustronne	649280
DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14200075
etanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Pipety wielokanałowe, 30 do 300 i mikro; L	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 0,1 – 10 i mikro; L	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 100 – 1000 µ L	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 2 – 20 µ L	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 20 – 200 µ L	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand  Elitarny zestaw pipet	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand  Kontroler pipet	Fisherbrand	FB14955202
Szklana szalka Petriego, 90 mm	VWR	470313-346
Szkiełka szklane	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Oprogramowanie służące do ustawiania ostrości obrazów stosu
IP-Q Resin	Nanoscribe		Żywica drukarki jest kompatybilna z soczewką 10x i służy do drukowania dużych mikrostruktur na termoparze Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD	Amazon	5053485896236	Lub równoważny
Pudełko na szkiełka mikroskopowe	Millipore Sigma	Z374385-1EA	Lub odpowiednik
Nanoscribe Photonic Professional GT2 z 10-krotnym obiektywem	Nanoscribe
Oprogramowanie NanoWrite	Nanoscribe		używane do interfejsu z drukarką 3D nanoscrive. Oprogramowanie dostarczane z drukarką.
Nunc MaxiSorp 96-dołkowa płytka z płaskim dnem	Invitrogen	44-2404-21
Tabletki z substratem OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)	Fisherbrand	02-707-432
Folia do owijania Parafilm M, 4 w.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 z powłoką typu 3	Sicion	P-2020
PDMS Formy cząsteczkowe	Rice University	n/a	Nie dotyczy- Cząstki wynoszą 400 μ m średnicy o grubości ścianki 100 μ m i wysokości 500 μ m, co daje średnicę wewnętrzną 200 μm. Tablice to 14 x 22 cząstki rozmieszczone w odstępach 600 μ m od siebie. Gwiazdy 4- i 5-ramienne są używane jako fiducialia, pozycjonowane 600 μ m po prawej i lewej stronie prawego górnego i lewego górnego rogu tablicy.
Szalka Petriego	Fisher Scientific	08-757-100D
Przebija stabilny bufor podłoża nadtlenkowego (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Plastikowe kubki	Fisher Scientific	S04170
Folia PLGA, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
eteru monometylowego glikolu propylenowego	Millipore Sigma 484431
Fibries Antigen	Chiron Behring i Bharat Biotech International		Material zostały nabyte poprzez zawarcie z firmą umowy o transferze materiałów.
Żyletki	VWR	55411-050
Skalpel	VWR	21899-530 i 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 z PCD 60	Sicion		lub równoważny
Taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych	Thermo Scientific	15036
Silicon Wafer	University Wafer	1025
Zaciski sprężynowe	IRWIN
Blok ze stali nierdzewnej	McMaster Carr	9083K12
Streptawidyna− Polimer peroksydazy, ultraczuły	Fisherbrand	02-707-404
Sylgard 184	DOW	2646340
Arkusz teflonowy	McMaster Carr	9266K12	Służy do produkcji folii PLGA. Musi być pokrojony na kawałki o odpowiedniej wielkości.
Arkusz teflonowy o grubości 0,8 mm	McMaster Carr	9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooktyl) Pęseta silanowa	Sigma	448931-10G
	Pixnor	ESD-16
UltraPure Woda destylowana	Fisher Scientific	10977015
Piec UV, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	Lub równoważny
eksykator próżniowy	Bel-Art	F420100000	Pamiętaj, że będziesz potrzebować dwóch z nich. Jeden będzie używany wyłącznie do wstępnej obróbki próbek trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo) silanu, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Piec próżniowy o temperaturze 120 stopni Celsjusza; C	VWR	97027-664	Lub równoważny
odkurzacz, CRVpro4	Welch	3041-01	Lub równoważne
Drewniane depresory języka	Mikroskopia elektronowa Nauki	72320