Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mysi model ostrego uszkodzenia płuc (ALI) wywołanego przez lipopolisacharyd (LPS) lub endotoksynę jest nadal jednym z najczęściej używanych modeli w badaniach na zwierzętach nad ostrym uszkodzeniem płuc lub ostrym stanem zapalnym. Obecnie najczęściej stosowanymi metodami w mysich modelach ostrego uszkodzenia płuc są dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS i tracheostomia w celu infuzji tchawicy LPS. Jednak pierwsza metoda nie jest ukierunkowana na płuca i uszkadza inne narządy, a druga metoda wywołuje uraz operacyjny, ryzyko infekcji i niski wskaźnik przeżycia. W tym przypadku zalecamy nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej jamy ustnej i gardła do wkraplania LPS u myszy. W tej metodzie LPS jest nieinwazyjnie wprowadzany do tchawicy przez jamę ustno-gardłową w celu wkroplenia do płuc za pomocą aparatu do intubacji dotchawiczej. Metoda ta nie tylko zapewnia celowanie w płuca, ale także pozwala uniknąć uszkodzeń i ryzyka śmierci zwierząt. Spodziewamy się, że podejście to znajdzie szerokie zastosowanie w dziedzinie ostrych uszkodzeń płuc.
Wprowadzenie
Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest częstym zespołem klinicznym. Pod wpływem różnych czynników chorobotwórczych przerwanie bariery fizjologicznej komórek nabłonka płuc i komórek śródbłonka naczyń krwionośnych prowadzi do zwiększonej przepuszczalności pęcherzyków płucnych, powodując w ten sposób zmniejszoną podatność płuc, obrzęk płuc i ciężką hipoksemię1. Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest najcięższą postacią ALI. Niekontrolowany stan zapalny i uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym są uważane za główne przyczyny ALI i cięższego ARDS2. Gdy komórki nabłonka pęcherzyków płucnych są bezpośrednio uszkodzone w wyniku urazu, aktywowany jest łańcuch odpowiedzi zapalnej makrofagów pęcherzyków płucnych, co prowadzi do stanu zapalnego w płucach3. Na całym świecie rocznie jest ponad 3 miliony pacjentów z ostrym ARDS, którzy stanowią około 10% przyjęć na oddziały intensywnej terapii; Dodatkowo śmiertelność w ciężkich przypadkach wynosi aż 46%4,5,6. W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia odpowiedniego modelu zwierzęcego ALI w celu zbadania jego patogenezy. Mysz jest najczęściej wykorzystywanym zwierzęciem doświadczalnym w badaniach ALI, ponieważ jej drogi oddechowe mogą dobrze symulować ludzkie drogi oddechowe w badaniach ALI. Ponadto ALI objawia się masywnym naciekiem komórek zapalnych, zwiększoną przepuszczalnością naczyń płucnych i obrzękiem płuc. Zmiany cytokin zapalnych w surowicy i stosunku masy płuc suchej do mokrej odzwierciedlają stopień ALI7.
Obecnie główne metody modelowania ALI wywołanego LPS u myszy obejmują donosową i chirurgiczną intubację tchawicy8,9. W tym miejscu proponujemy nową metodę dostarczania LPS do tchawicy poprzez nieinwazyjną intubację ustno-gardłową. Ta metoda wykorzystuje podświetlany intubator do znalezienia tchawicy myszy, a następnie dostarcza LPS do tchawicy i płuca. Ta metoda dostarcza LPS do płuc dokładniej niż metoda dostarczania donosowego. W porównaniu z chirurgiczną intubacją tchawicy ta metoda nie wymaga operacji, unika powodowania ran i zmniejsza ból u myszy10. Dlatego tę metodę można wykorzystać do stworzenia bardziej przekonującego mysiego modelu ALI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół eksperymentu na zwierzętach został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2021-11). Do niniejszego badania wykorzystano samce myszy C57/BL (20-25 g, 6-8 tygodni). Myszy były trzymane w komorze dla zwierząt i mogły swobodnie pić i jeść podczas eksperymentu.
1. Przygotowanie
- Upewnij się, że platforma do intubacji składa się z podstawy, pionu, spinacza do papieru, dwóch gumek i kilku sznurków. Weź sznurek, przełóż go przez dwa otwory w górnej części pionu i przywiąż odpowiednio dwa końce sznurka do małych występów w górnej części pionu.
UWAGA: Pozostaw miejsce na przejście głowy myszy między sznurkiem a dwoma otworami. - Przywiąż dwie gumki do każdego końca spinacza do papieru i przyklej spinacz do papieru z gumkami z tyłu pionu. Na koniec przymocuj pion do podstawy pod kątem 90° (Rysunek 1).
- Wybierz kaniulę o odpowiednim rozmiarze i długości. W przypadku myszy o wadze 20−30 g można użyć cewnika 22 G (o długości 2,5−3,8 cm)11. Zamontuj kaniulę na wstrzykiwaczu kaniuli i włącz światło pióra (Rysunek 2).
- Przygotuj małe kleszcze chirurgiczne i pipetę Pasteura, dezynfekując je 70% alkoholem.
2. Przygotowanie badanego związku
- Odważyć i rozpuścić 3 mg LPS w 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,2) w celu utworzenia roztworu LPS o stężeniu 3 mg/ml.
- Zważyć i rozpuścić 10 mg pentobarbitalu sodu w 1 ml soli fizjologicznej, aby uzyskać 1% roztwór pentobarbitalu sodu. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
3. Nieinwazyjne wkraplanie ustno-gardłowe
- Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 1% pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg12,13. Określ głębokość znieczulenia na podstawie braku reakcji na odruch prostujący.
- Umieść znieczuloną mysz na platformie intubacyjnej. Przymocuj górne przednie zęby za pomocą gwintu, a dwa przednie stopy za pomocą gumek (Rysunek 3).
- Wyciągnij język pęsetą i przytrzymaj go lewą ręką. Powoli popychaj kaniulę wzdłuż ust, prawą ręką do góry, do nagłośni żuchwy. Użyj światła wstrzykiwacza kaniuli, aby znaleźć tchawicę i powoli włóż ją do tchawicy (Rysunek 4).
- Po wprowadzeniu kaniuli do tchawicy należy powoli wyjąć wstrzykiwacz intubacyjny i pozostawić kaniulę w środku. Włóż pipetę Pasteura do złącza kaniuli i naciśnij głowicę (Rysunek 5).
UWAGA: Jeśli klatka piersiowa myszy wybrzusza się, oznacza to, że intubacja się powiodła (Rysunek 6). - Po udanej intubacji dotchawiczej wkraplaj myszom 3 mg/ml LPS w dawce 3 mg/kg przez kaniulę za pomocą mikrostrzykawki z płaską główką14,15 (Rysunek 7).
- Po zakończeniu wyjmij kaniulę i mikrostrzykawkę. Zdejmij mysz z rusztowania i umieść ją osobno w klatce, aby mogła dojść do siebie. Obserwuj stan oddechowy myszy, dopóki nie wyzdrowieje i nie odzyska przytomności.
UWAGA: Po 12 godzinach od wkroplenia tchawicy LPS należy poddać myszy eutanazji zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez komisję etyczną ds. zwierząt. Testy TNF-α w surowicy oraz pomiary masy płuc na sucho i mokro przeprowadzono przy użyciu standardowych procedur.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zaproponowaną metodę podawania LPS myszom zweryfikowano poprzez ocenę ekspresji cytokiny zapalnej TNF-α oraz stosunku masy suchej do mokrej płuc 12 h po podaniu LPS. W eksperymencie ujęto cztery grupy: kontrolną pustą (bez żadnego leczenia), intubację chirurgiczną16, podanie donosowe17,18 oraz nieinwazyjną intubację orofaringealną (n = 6). W porównaniu z grupą kontrolną pustą, poziomy TNF-α w surowicy w gru...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Początkowo zajrzeliśmy do jamy ustnej, aby znaleźć lokalizację tchawicy19. Jednak podczas tego procesu odkryliśmy, że tchawica myszy C57/BL jest wąska, co utrudnia znalezienie właściwej lokalizacji tą metodą bez pomocy sprzętu takiego jak endoskop20. Po dalszych badaniach odkryliśmy, że światło z lampy intubatora może przenikać przez powierzchnię ciała, umożliwiając operatorowi określenie położenia kaniuli21.
Aby sprawdzić...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (No.: 81903902), China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), Sichuan Science and Technology Program (No.: 2020YJ0172) oraz Xinglin Scholar Research Premotion Project Uniwersytetu Chengdu TCM (No: QJRC2022053).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lipopolisacharyd | MERK | L4130 | |
| Strzykawki mikrolitrowe | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | Do dostarczania kaniuli | |
| LPS Mouse | RWD Life Science | 803-03008-00 | Kaniula myszy |
| Zestaw do intubacji myszy | RWD Life Science | 903-03027-00 | W tym podstawa, pion, intubator, kleszcze chirurgiczne i niektóre sznurki |
| Pipeta Pasteura | Biosharp nauki przyrodnicze | BS-XG-03 | Aby zweryfikować powodzenie intubacji |
| Pentobarbital sodu | Beijing Chemical Co., Chiny | 20220918 | Aby znieczulić myszy |
Bibliografia
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96(2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999(2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530(2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62(2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C. Repeated orotracheal intubation in mice. Journal of Visualized Experiments. (157), e60844(2020).
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601(2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
