Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65152

⸱

1 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Streszczenie

Szczepionki adiuwantowe z nanoemulsją przyciągnęły dużą uwagę ze względu na ich mały rozmiar cząstek, wysoką stabilność termiczną i zdolność do wywoływania prawidłowych odpowiedzi immunologicznych. Niezbędne jest jednak opracowanie szeregu kompleksowych protokołów oceny odpowiedzi immunologicznej na nowatorską szczepionkę z adiuwantem nanoemulsyjnym. Dlatego w artykule tym przedstawiono rygorystyczną procedurę określania charakterystyki fizykochemicznej szczepionki (za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej [TEM], mikroskopii sił atomowych [AFM] i dynamicznego rozpraszania światła [DLS]), stabilności antygenu i systemu szczepionkowego (za pomocą szybkiego testu wirówkowego, testu stabilności termodynamicznej, SDS-PAGE i western blot) oraz swoistej odpowiedzi immunologicznej (IgG1, IgG2a i IgG2b). Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą ocenić dokładnie ochronne działanie nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym w śmiertelnym modelu myszy MRSA252. Dzięki tym protokołom można zidentyfikować najbardziej obiecujący adiuwant szczepionki nanoemulsyjnej pod względem skutecznego potencjału adiuwantowego. Ponadto metody te mogą pomóc w optymalizacji nowych szczepionek pod kątem przyszłego rozwoju.

Wprowadzenie

Staphylococcus aureus (MRSA) oporny na metycylinę jest oportunistycznym patogenem o jednym z najwyższych wskaźników infekcji na oddziałach intensywnej terapii (OIOM)1, oddziałach kardiologii i oddziałach oparzeń na całym świecie. MRSA wykazuje wysokie wskaźniki infekcji, śmiertelności i szerokiej oporności na leki, co stwarza duże trudności w leczeniu klinicznym2. Na Globalnej Liście Priorytetowej Bakterii Opornych na Antybiotyki opublikowanej przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) w 2017 roku, MRSA znalazł się w kategorii najbardziej krytycznej3. W związku z tym pilnie potrzebna jest szczepionka przeciwko zakażeniu MRSA.

Aluminiowy adiuwant jest używany od dłuższego czasu, a mechanizm pomocniczy adiuwanta jest stosunkowo jasny, bezpieczny, skuteczny i dobrze tolerowany4. Adiuwanty aluminiowe są obecnie szeroko stosowanym rodzajem adiuwanta. Powszechnie uważa się, że antygeny zaadsorbowane na cząsteczkach soli glinu mogą poprawić stabilność i zwiększyć zdolność miejsca wstrzyknięcia do wychwytywania antygenów, zapewniając dobre wchłanianie i powolne uwalnianie5. Obecnie główną wadą adiuwantów aluminiowych jest to, że nie mają one efektu adiuwantowego lub wykazują tylko słabe działanie adiuwantowe na niektóre antygeny kandydujące na szczepionkę6. Ponadto adiuwanty aluminiowe wywołują reakcje nadwrażliwości IgE-zależnej od 5. Dlatego konieczne jest opracowanie nowych adiuwantów w celu stymulowania silniejszej odpowiedzi immunologicznej.

Adiuwanty nanoemulsyjne to koloidalne systemy dyspersyjne składające się z oleju, wody, środków powierzchniowo czynnych i kosurfaktantów7. Ponadto adiuwanty są stabilne termodynamicznie i izotropowe, mogą być sterylizowane w autoklawie lub stabilizowane przez szybkie wirowanie i mogą powstawać spontanicznie w łagodnych warunkach przygotowania. Kilka adiuwantów emulsyjnych (takich jak seria MF59, NB001-002, seria AS01-04 itp.) jest obecnie dostępnych na rynku lub w fazie badań klinicznych, ale ich rozmiary cząstek są większe niż 160 nm8. W związku z tym nie można w pełni wykorzystać zalet preparatów leczniczych w skali nano (1-100 nm) (tj. dużej powierzchni właściwej, małego rozmiaru cząstek, efektu powierzchniowego, wysokiej energii powierzchniowej, efektu małego rozmiaru i efektu tunelowania makrokwantowego). W niniejszym protokole stwierdzono, że nowy adiuwant oparty na technologii nanoemulsji o średnicy 1-100 nm wykazuje dobrą aktywność adiuwantową9. Przetestowaliśmy białko antygenu szczepionkowego HI podjednostki rekombinacji (mutant α-hemolizyny [Hla] i czynnik determinujący powierzchnię jonów Fe B [IsdB] podjednostka N2 aktywnego fragmentu białka fuzyjnego); Ustanowiono szereg procedur w celu zbadania właściwości fizycznych i stabilności, oceny swoistej odpowiedzi przeciwciał po podaniu domięśniowym oraz przetestowania ochronnego działania szczepionki przy użyciu mysiego modelu zakażenia układowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie podręcznika o użytkowaniu i opiece nad zwierzętami doświadczalnymi i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego. Do niniejszego badania wykorzystano samice myszy Balb/c w wieku 6-8 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie białka antygenu MRSA HI

  1. Uzyskać klony IsdB i Hla ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów), przeprowadzić amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu amplifikacji genów IsdB i Hla oraz podwiązać ich produkty do plazmidu PGEX-6P-2 (uzyskanego komercyjnie; patrz tabela materiałów). Ekran z wektorem Xl/niebieski szczep Escherichia coli10.
  2. Przekształć dodatni klon w kompetentne komórki E. coli BL21 (patrz Tabela Materiałów) i amplifikuj za pomocą hodowli rekinów10.
  3. Wyrazić antygen i wyizolować po indukcji za pomocą zestawów do izolacji izopropylo-β-D-1-merkaptogalaktopiranozydu i chromatografii multimodalnej (MMC)11(patrz tabela materiałów).
  4. Scharakteryzuj białko antygenowe i oczyść je za pomocą w pełni zautomatyzowanego oczyszczacza11.
    1. Białka znakowane S-transferazą gutationu (GST) oczyszczają się z powinowactwa z oczyszczonych lizatów przy użyciu dostępnej na rynku żywicy chromatograficznej powinowactwa (patrz tabela materiałów).
    2. Oczyść rekombinowane białka za pomocą MMC11.
    3. Usuń endotoksynę metodą separacji faz Triton X-11411. Krótko mieszać 1% Triton X-114 z rekombinowanym eluatem białkowym w temperaturze 0 °C przez 5 minut, aby uzyskać jednorodny roztwór, i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić powstanie dwóch faz.
  5. Użyj metody badania endotoksyn bakteryjnych11 z zestawami żółwi (patrz tabela materiałów), aby wykryć stężenie endotoksyny. Endotoksyna dla antygenu białkowego wynosi 0,06 EU/μg, czyli mniej niż norma międzynarodowa (1,5 EU/μg)10.
    1. Wykonaj test zakłóceń, aby wyeliminować możliwy wpływ badanego produktu na wykrywanie endotoksyn11.
      UWAGA: Zgodnie z Załącznikiem 2020 do Farmakopei Chińskiej 12, zawartość endotoksyn powinna być mniejsza niż 5 EU/dawkę. Czułość lizatu limulusa (λ0,25 EU/ml) i maksymalny efektywny współczynnik rozcieńczenia wynoszący 33,3 obliczono12 na podstawie MVD = cL/λ, gdzie L jest wartością graniczną endotoksyny bakteryjnej dla badanego artykułu, c jest stężeniem roztworu badanego artykułu, a gdy L jest wyrażone w EU/m, c jest równe 1,0 mg/mL. λ jest znakowaną czułością (EU/ml) odczynnika do kraba podkowiastego w metodzie żelowej.
  6. Rekombinuj antygen (48 kDa, oznaczony przez 12% elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu [SDS-PAGE]) w stężeniu 1,5 mg/ml w sterylnej wodzie bez endotoksyny lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (metoda dichloranu sodu)11.
    UWAGA: Czas szczytu białka wynosił 13,843 min, czystość 99,4% (metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej), a białko przechowywano w temperaturze -70 °C10. Jako matrycę PCR wykorzystano genomowe DNA wyekstrahowane ze szczepu S. aureus MRSA252 (patrz tabela materiałów). Gen IsdB amplifikowano przy użyciu startera 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    C-39 i podkład odwrotny 59-TTTTCCTTTTGCGG
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Gen Hla amplifikowano przy użyciu startera przedniego PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) i startera odwrotnego PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTTC).

2. Przygotowanie szczepionki nanoemulsyjnej

  1. Zgodnie ze stosunkiem masowym 1:6:3 (w/w), dodać kolejno trzy rodzaje substancji pomocniczych (mirystynian izopropylu, polioksyetylenowy olej rycynowy i glikol propylenowy; patrz Tabela materiałów) do roztworu białka antygenu HI (10 mg / ml) i dobrze wymieszać. Następnie dodawać stopniowo wysterylizowaną czystą wodę, aż do uzyskania końcowej objętości 10 ml i mieszać przy 500 obr./min i 25 °C przez około 20 min.
    UWAGA: Nanoemulsja przygotowana w tym protokole ma objętość 10 ml, a masy trzech substancji pomocniczych wynoszą odpowiednio 0,34 g, 2 g i 1 g. Roztwór białkowy jest tutaj roztworem roboczym, o stężeniu 10 razy większym niż roztwór końcowy.
  2. Przygotować szczepionkę z adiuwantem nanoemulsyjnym (1 mg/ml białka) metodami emulgowania o niskiej energii13 w celu uzyskania klarownego i przezroczystego płynnego roztworu.
    UWAGA: Ślepą próbę nanoemulsji (BNE) przygotowano podobnymi metodami, z tą różnicą, że wodę zastąpiono HI. Typowa metoda emulgowania polega na podgrzaniu fazy zewnętrznej i wewnętrznej do około 80 °C w celu emulgacji, a następnie na ich stopniowym mieszaniu i schładzaniu. W tym procesie zużywa się dużą ilość energii, a na końcu uzyskuje się emulsję.

3. Charakterystyka fizyczna i stabilność szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym

  1. Wielkość cząstek, potencjał zeta i charakterystyka wskaźnika dyspersji polimeru (PDI).
    1. Przygotować 100 μl szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym i rozcieńczyć 50-krotnie wodą do wstrzykiwań. Dodać 2 ml próbki do wykrycia.
    2. Obserwuj wielkości cząstek, potencjał zeta i PDI w temperaturze 25 °C za pomocą Nano Zetasizera (ZS; patrz Tabela Materiałów).
  2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Rozcieńczyć 10 μl szczepionki nanoemulsyjnej 50-krotnie wodą, umieścić na pokrytej węglem siatce miedzianej o oczkach 100 i zabarwić 1% kwasem fosfowolframowym (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć nadmiar roztworu kwasu fosfatungstycznego za pomocą bibuły filtracyjnej.
    3. Obserwować morfologię pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (patrz tabela materiałów). Zbadaj, czy gotowe produkty są prawie stabilne i okrągłe w polu widzenia mikroskopu elektronowego i czy wykazują dobrą dyspersję.
  3. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
    1. Rozcieńczyć 10 μl szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym 50-krotnie wodą, upuść 10 μl wstępnie rozcieńczonych próbek na płytkę krzemową i umieść w inkubatorze sterowanym termostatem o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
    2. Rozpylaj przygotowaną platynę na silikon przez 40 s i ostudź do temperatury pokojowej.
    3. Obserwować właściwości morfologiczne przygotowanych próbek pod skaningowym mikroskopem elektronowym o wysokiej rozdzielczości (patrz tabela materiałów). Określ, czy próbki są prawie stabilne, kuliste i dobrze rozproszone w polu widzenia pod mikroskopem elektronowym.
  4. Stabilność morfologiczna
    1. Umieścić 1 ml próbek szczepionki nanoemulsyjnej w probówkach do mikrowirówek i ocenić stabilność świeżych próbek, wirując przez 30 minut przy 13 000 x g w temperaturze pokojowej (25 °).
    2. Obserwować wygląd tych świeżych próbek, a następnie przeprowadzić badanie stabilności termodynamicznej w sześciu cyklach temperaturowych (jeden cykl: przechowywać w temperaturze 4 °C przez 48 godzin, w temperaturze 25 °C przez 48 godzin i w temperaturze 37 °C przez 48 godzin).
    3. Po odwirowaniu odstawić próbki na 15 minut w celu ustalenia, czy występuje efekt Tyndalla (czy próbka jest przezroczysta i przezroczysta w świetle) i czy nastąpiła deemulgacja (wykazana przez klarowne rozwarstwienie po demulgacji).
  5. SDS-PAGE i western blot
    1. Wstrząsnąć próbkami, wymieszać roztwór 0,6 ml bezwzględnego etanolu i 0,3 ml szczepionki i odwirować (13 000 x g, 30 min w temperaturze pokojowej, 25 °C).
    2. Przenieść sklarowanie osadu roztworu do czystej probówki i rozpuścić osad w 0,3 ml wody. Otrzymać roztwory sklarowanego osadu i osadu (zarówno ślepą próbę nanoemulsji, jak i szczepionki) po potraktowaniu absolutnym etanolem i roztworem wody destylowanej i przeprowadzić to samo 50-krotne rozcieńczenie.
    3. Wymieszać 2,5 ml żelu rozdzielającego A i 2,5 ml żelu rozdzielającego B (patrz tabela materiałów), dodać 50 μl 10% nadsiarczanu amonu i szybko umieścić roztwór w szklanej płytce za pomocą pipety. Wymieszaj 1 ml skoncentrowanego żelu A i 1 ml zagęszczonego żelu B, dodaj 20 μl 10% nadsiarczanu amonu do szklanej płytki, włóż grzebień o odpowiedniej wielkości i poczekaj na zestalenie.
    4. Do rozcieńczonej próbki otrzymanej w kroku 3.5.2 dodać łącznie 5 μl 5-krotnego roztworu buforowego obciążającego białko i gotować próbkę przez 5 minut.
    5. Dodać 10 μl podgrzanego białka do odpowiedniego dołka i dodać 5 μl markera białkowego do dołka markerowego.
    6. Podłącz elektrodę, włącz miernik elektroforezy (patrz Tabela materiałów) i ustaw napięcie na 300 V. Wyłącz zasilanie, gdy elektroforeza osiągnie 1 cm od spodu gumy PAGE.
    7. Usuń żel i spłucz ddH2O. Dodaj jasnoniebieski roztwór barwiący Coomassie G-250 (patrz Tabela Materiałów) przez 10 minut. Wylej roztwór barwiący i spłucz żel dwukrotnie ddH2O.
    8. Dodaj dostępny w handlu roztwór do odbarwiania i podgrzewaj żel w kuchence mikrofalowej przez 1 minutę. Potrząsaj żelem przez 10 minut i wielokrotnie zmieniaj roztwór odbarwiający, aż tło żelu będzie czyste. Następnie należy wykonać obrazowanie żelowe (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Western blot został wstępnie przetworzony, jak opisano w krokach 3.5.1-3.5.6.
    9. Namocz trzy bloki bibuły filtracyjnej buforem transferowym do elektroforezy. Namocz membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu przez 30 s i przenieś za pomocą półsuchego żelowego przyrządu do przenoszenia (dwie warstwy bibuły filtracyjnej, membrana PVDF, żel do elektroforezy i jedna warstwa bibuły filtracyjnej). Użyj napięcia 23 V, aby przenieść membranę przez 23 minuty.
    10. Usuń membranę PVDF i po przeniesieniu przemyj ją jednorazowo buforowanym roztworem soli fizjologicznej 20 (TBST).
    11. Umieścić membranę PVDF w roztworze uszczelniającym (5% odtłuszczony roztwór mleka w proszku) i uszczelnić przez noc w temperaturze 4 °C.
    12. Usuń membranę PVDF i umyj ją trzykrotnie TBST lub po 10 minut.
    13. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (od uodpornionych myszy z dodatnią surowicą). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe11 (patrz Tabela Materiałów) do przetestowania 500-krotnie (100-krotnie) za pomocą TBST. Umieścić zablokowaną membranę PVDF w przeciwciałie pierwszorzędowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    14. Usuń membranę PVDF i umyj ją trzykrotnie TBST przez 10 minut każde.
    15. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (patrz tabela materiałów). Rozcieńczyć kozie przeciwciało wtórne przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim znakowane fosfatazą alkaliczną (AP) 5,000 razy za pomocą TBST. Umieścić membranę PVDF w przeciwciałie drugorzędowym i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
    16. Usuń membranę PVDF i przemyj ją czterokrotnie TBST przez 10 minut każde.
    17. Zanurzyć membrany PVDF w mieszaninie (tylko tyle, aby namoczyć membranę) substratu AP nitro niebieskiego tetrazolu (NBT) i BCIP (sól 5-bromo-4-chloro-3'-indolilofosforanu p-toluidyny) (patrz tabela materiałów) w celu barwienia. Pozytywny wynik to purple.
      UWAGA: Wyniki muszą być przezroczystym fioletowym pasmem, a pasek próbki i masa cząsteczkowa antygenu powinny znajdować się w tej samej oznakowanej pozycji.

4. Ocena odpowiedzi immunologicznej przeciwciał na tę szczepionkę po podaniu domięśniowym

UWAGA: Myszy zostały uodpornione przez domięśniowe wstrzyknięcie szczepionki nanoemulsyjnej zgodnie z opublikowanym raportem11. Myszom podawano PBS jako kontrolę negatywną. Po 1 tygodniu od zakończenia trzech szczepień pobrano surowicę od myszy11. Poziomy IgG w surowicy i podklasy IgG1, IgG2a i IgG2b oznaczono ilościowo za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

  1. Otoczka antygenowa: Rozcieńczyć antygen białkowy HI do 10 μg/ml roztworem powlekającym i dodać do płytki ELISA w stężeniu 100 μl/basenik. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Roztwór powlekający przygotowuje się przez rozpuszczenie 1,6 g bezwodnego węglanu sodu i 2,9 g wodorowęglanu sodu w 1 l wody dejonizowanej.
  2. Uszczelnianie: Umyj płytkę (trzy cykle, każdy cykl 300 μL). Dodać 300 μl roztworu uszczelniającego do każdej studzienki i uszczelnić studzienki na 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Roztwór uszczelniający przygotowuje się przez dodanie Tween-20 i albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do PBS. Zawartość BSA w roztworze PBST wynosi 1%.
  3. Rozcieńczenie surowicy: Rozcieńczyć próbkę surowicy myszy 100 razy PBST (pobrać 3 μl surowicy i dodać ją do 297 μl PBST i wirować) i użyć 100 μl dla każdej próbki surowicy. Rozcieńczyć dodatnią surowicę i ujemną surowicę kontrolną 100 razy PBST, dodając 4 μl do 396 μl PBST, a następnie mieszając przez wirowanie.
  4. Rozcieńczenie o podwójnym stosunku: Dodać 200 μl wyżej rozcieńczonej surowicy doświadczalnej do pierwszego rzędu powlekanej płytki ELISA i dodać 100 μl PBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem pierwszego idwunastego rzędu. Wykonać rozcieńczenie 1:2 kolejno od pierwszego rzędu: ustawić pipetę na 100 μl, przenieść 100 μl z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszać pipetą 10 razy.
  5. Rozcieńczyć surowicę do wiersza 11 w różnych proporcjach i wylać 100 μl płynu.
  6. Dodać rozcieńczoną ujemną i dodatnią surowicę do odpowiednich studzienek w wierszu 12 zgodnie z szablonem próbki (patrz tabela 1) -100 μl/basenik.
  7. Uszczelnić płytki ELISA folią spożywczą i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG-HRP (patrz tabela materiałów) PBST w stosunku 1:10 000.
  9. Umyj płytkę (trzy cykle, każdy cykl 300 μL). Następnie dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
  10. Barwienie i zakończenie: Umyć płytkę (pięć cykli, każdy cykl 300 μL). Dodać roztwór barwiący 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) (100 μl; patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C przez 10 minut z dala od światła, a następnie natychmiast zakończyć reakcję za pomocą 50 μl 2 M H2SO4.
  11. Wykryj wartość gęstości optycznej (OD450) za pomocą markera enzymatycznego (odczytaj wartość OD450 w ciągu 15 minut po zakończeniu).

5. Ocena efektów in vivo nowych szczepionek uzupełniających

UWAGA: Ochronne działanie tej szczepionki nanoemulsyjnej zostało ocenione na komercyjnie uzyskanym modelu myszy z MRSA252 śmiertelnego (patrz Tabela materiałów). Zgodnie z poprzednimi wynikami naszej grupy badawczej14, 1 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mysz to najlepsza dawka do oceny ochronnego działania śmiertelnego modelu infekcji bakteryjnej MRSA252.

  1. Odzyskiwanie szczepu: Zaopatrzyć się w probówkę z zamrożonym MRSA252, zaszczepić bakterie na płytkach Muellera Hintona (MH) (A) (patrz Tabela Materiałów) metodą "metody trzyliniowej" i hodować przez noc w temperaturze 37 °C. Wykonać kroki "metody trójliniowej", jak opisano poniżej:
    1. Trzymając pierścień zaszczepiający w prawej ręce, kauteryzuj go i schładzaj, aby uzyskać pierścień płynu bakteryjnego.
    2. Trzymaj płytkę agarową w lewej ręce (trzymając pokrywkę na stole) nad przednim lewym obszarem płomienia alkoholu lamp, tak aby talerz był skierowany w stronę płomienia, zapobiegając przedostawaniu się bakterii do powietrza. Prawą ręką przesuwaj pierścień zaszczepiający zakażonych bakterii tam iz powrotem po powierzchni agaru w gęsty, ale niezachodzący na siebie sposób, pokrywając obszar około 1/5-1/6 całej płytki, która jest pierwszą strefą.
      UWAGA: Pierścień inokulacyjny i agar powinny stykać się delikatnie pod kątem 30°-40°; Uszkodzenia agaru można uniknąć, przesuwając go siłą nadgarstka.
    3. Kauteryzuj nadmiar bakterii na pierścieniu inokulacyjnym (to, czy kauteryzować, czy sterylizować każdy obszar, zależy od ilości bakterii w próbce). Po schłodzeniu powtórz przedostatnie rzędy 2-3 na końcu i narysuj drugi obszar (około 1/4 powierzchni talerza).
    4. Po zakończeniu drugiej strefy kauteryzuj pierścień i narysuj trzecią strefę w ten sam sposób, aby wypełnić całą płytkę.
    5. Po narysowaniu linii umieścić płytkę na pokrywie naczynia, oznaczyć płytkę i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny, aby obserwować rozmieszczenie kolonii na powierzchni agaru. Skoncentruj uwagę na tym, czy pojedyncza kolonia jest izolowana, i obserwuj cechy kolonii (takie jak rozmiar, kształt, przezroczystość i pigmentacja).
  2. Aktywacja bakteryjna: Następnego dnia weź dwie kolby do wytrząsania o pojemności 50 ml i dodaj do każdej z nich 20 ml pożywki MH (B) (patrz tabela materiałów). Wybierz dwie pojedyncze kolonie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl i dodaj je do wytrząsarek. Inkubować kolonie przez noc przy 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
  3. Aktywacja wtórna: Następnego dnia wziąć dwie kolby do wytrząsania o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 20 ml pożywki MH (B). Usunąć 200 μl roztworu bakteryjnego z wytrząsarki zawierającej pierwsze aktywowane bakterie, dodać do dwóch nowych kolb zawierających 20 ml pożywki MH (B) i inkubować w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 5 godzin.
  4. Zebrać drugi aktywowany roztwór bakteryjny do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, rozdzielić przy 3 000 x g przez 20 minut i wyrzucić supernatant.
  5. Ponownie zawiesić wytrącone bakterie w 40 ml soli fizjologicznej.
  6. Zmierz wartość OD600 roztworu bakteryjnego i dostosuj do 1 za pomocą soli fizjologicznej. W tym czasie ilość bakterii w MRSA252 w naszym eksperymencie wynosiła 2 x 109 CFU/ml.
  7. Rozcieńczyć roztwór bakteryjny OD600 1 do stężenia 1 x 10 9 jtk/ml.
  8. Losowo podziel 48 myszy Balb/c na cztery grupy (n=12).
    UWAGA: Grupa I: grupa PBS; Grupa II: grupa kontrolna BNE; Grupa III: grupa naiwnych antygenów [białkowych]; Grupa IV: grupa szczepionek z adiuwantem nanoemulsyjnym.
  9. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu.
  10. Naświetlić myszy lampą fizjoterapeutyczną na podczerwień (patrz tabela materiałów) przez około 1 minutę, aby spowodować rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły ogonowej.
  11. Rzuć wyzwanie myszom, wstrzykując rozcieńczony roztwór bakteryjny (krok 5.7) do żyły ogonowej, 100 μl na mysz.
  12. Umieść myszy pod lampą fizjoterapeutyczną na podczerwień, aż będą mogły wrócić do normalnej aktywności.
  13. Obserwuj i rejestruj przeżywalność myszy co 12 godzin przez 10 dni.
  14. Myszy należy poddać eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oceniono protokół przygotowania szczepionki z adiuwantem w postaci nanoemulsji oraz testy in vitro i in vivo tej szczepionki. Do określenia kluczowych parametrów, takich jak potencjał zeta i rozmiar cząstek na powierzchni próbki, wykorzystano TEM, AFM oraz DLS (Rysunek 1). Analiza SDS-PAGE i western blotting wykazały, że ilość antygenu w osadzie i nadsączu nie uległa istotnej degradacji po wirowaniu, co wskazało na to, że szczepionka pozostała nienaruszona strukturalnie, sp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

IsdB, białko powierzchniowe zakotwiczone w ścianie komórkowej bakterii i regulowane żelazem, odgrywa ważną rolę w procesie otrzymywania żelaza hemowego15. Hla, toksyna alfa, jest jedną z najskuteczniejszych toksyn bakteryjnych znanych w MRSA i może tworzyć pory w komórkach eukariotycznych i zakłócać adhezje i komórki nabłonkowe16. W naszym badaniu skonstruowano nowe białko antygenu rekombinacyjnego MRSA (HI) i poddano go ekspresji za pomocą technologii inż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z tą pracą.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez nr 2021YFC2302603 Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin, nr 32070924 i 32000651 NSFC oraz nr 2019jcyjA-msxmx0159 programu projektowego Fundacji Nauk Przyrodniczych w Chongqing.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5424-Mała wirówka szybkoobrotowaFA-45-24-11Eppendorf, Niemcy 
Płytki 96-dołkoweCorning Incorporated, USACLS3922
AFM Dimension FastScanBRUKER, Niemcy 
null Lampa alkoholowaShenzhen Yibaxun Technology Co., ChinyYBS-AA-11408
Myszy Balb/c Pekin HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP / NBTFuzhou Maixin Biotechnology Development Company, ChinyBCIP / NBT
Bio-Rad 6.0 czytnik mikropłytekBio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USAnull
BL21 Kompetentna komórkaMerck millipore, Niemcy70232-3CN
BSA-100GSigma-Aldrich, USAB2064-100G
Wirówka 5810 REppendorf, Niemcy 
Coomassie jasnoniebieski roztwór barwiący G-250MIKX, ChinyDB236
Roztwór do odbarwianiaBOSTER, ChinyAR0163-2
Kultywator stojący z ogrzewaniem elektrycznym HH-B11-420Fabryka urządzeń medycznych Yuejin w Szanghaju, ChinyAparatura do
Fabryka instrumentów Beijing Liuyi, ChinyDYCZ-25D
Gel imageTanon, USAnull
Żywica glutationowo-sefrozowa GSTMei5bio, chińskażywica
H2SO4Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, Chiny7664-93-9
Białko rekombinowane HITrzeci Wojskowy Uniwersytet Medyczny, Chiny110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgGBiodragon, ChinyBF03001
HRP- Koza anty-mysia IgG1Biodragon, ChinyBF03002R
HRP- Koza anty-mysia IgG2aBiodragon, ChinyBF03003R
HRP- Koza anty-mysia IgG2bBiodragon, ChinyBF03004R
Pętla inokulacyjnaHaimen Feiyue Co., LTD, ChinyYR-JZH-1UL
Klony IsdB i HlaShanghai Jereh Biotechnology Co, Chinynull
Izopropylowa gałka muszkatołowa (adiuwant farmaceutyczny)SEPPIC, Francjanull
isopropylo-β-D-1-merkaptogalaktopiranozydfdbio, ChinyFD3278-1
LB pożywka bulionowaPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chiny02-136
Lampa do fizjoterapii InffraredGuangzhou Runman Medical Equipment Co., Chiny7600
Niskotemperaturowa wirówka z chłodzeniemEppendorf, Niemcy 
Malvern NANO ZSMalvern Instruments Ltd., Wielka Brytanianull
MH(A) mediumPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD,Chiny02-051
MH(B) mediumPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD,Chiny02-052
Myjka do mikropłyt 405 LSRSBio Tek Instruments,Inc Highland  Park, USAnull
Mini-TBC Kompaktowy instrument do przenoszenia foliiBeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, Chiny1658030
pakowanie MMCTOSOH (SHANGHAI) CO., LTD
0022818 MRSA252USA, ATCCnull
Spektrofotometr ultrafioletowy NanodropThermo Scientific, USAnull
Nowe białko FlashTM dowolna strona KD Zestaw żelu do elektroforezy białekDAKEWE, Chiny8012011
PBSbiosharp, Chinynull
PCR, wzmacniacztermiczny cykler, USA
pGEX-targetShanghai Jereh Biotechnology Co, ChinyB3528G
Kwas fosfowolframowyG-CLONE, ChinyCS1231-25g
pipetaEppendorf, Niemcy 
polioksyetylowany olej rycynowy (adiuwant farmaceutyczny)Aladdin, ChinyK400327-1kg
Przeciwciało pierwotneLaboratorium domowej roboty: z zaszczepionych myszy z dodatnią surowicązerowąSzczegółowe informacje można znaleźć w odnośniku 11
Glikol propylenowy (adiuwant farmaceutyczny)Sigma-Aldrich, USAP4347-500ML
Marker białkowyThermo Scientufuc, USA26616
MEMBRANA TRANSFEROWA PVDFInvitrogen, USA88518
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOL, JaponiaJSM-IT800
Pentobarbital soduMerck, NiemcyTc-P8411
Talos L120C TEMThermo Fisher, USAzerowy
roztwór kolorystyczny TMBTIAN GEN, ChinyPA107-01
Zestawy żółwiXiamen Bioendo Technology Co., LTDES80545
Tween-20Macklin, Chiny9005-64-5
54240004955811000398 elektroforezy zerowa chromatograficzna powinowactwanull rekombinowany plazmid genu null 3120000844

Bibliografia

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020(2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310(2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372(2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052(2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212(2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088(2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477(2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919(2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena odpowiedzi immunologicznejmiano przeciwciatransmisyjna mikroskopia elektronowamikroskopia si atomowychdynamiczne rozpraszanie wiat aSDS PAGEWestern blottest ELISA
Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.