Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie urządzenia do deprywacji snu u myszy

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65157

⸱

22 września 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół przedstawia metodę konfiguracji opłacalnego urządzenia opartego na platformie rocker, używanego do wywoływania deprywacji snu u myszy. Okazało się, że urządzenie to skutecznie powoduje zakłócenia we wzorcach snu potwierdzonych przez elektroencefalogram (EEG), a także wywołuje zmiany metaboliczne i molekularne związane z brakiem snu.

Streszczenie

Zakłócenie rytmu okołodobowego odnosi się do desynchronizacji między zewnętrznym środowiskiem lub zachowaniem a endogennym zegarem molekularnym, co znacznie pogarsza zdrowie. Brak snu jest jedną z najczęstszych przyczyn zaburzeń rytmu okołodobowego. Różne metody (np. platformy na wodzie, delikatne obchodzenie się, komory z przesuwanymi prętami, obracające się bębny, wytrząsarki orbitalne itp.) zostały zgłoszone w celu wywołania deprywacji snu u myszy w celu zbadania jej wpływu na zdrowie. Obecne badanie przedstawia alternatywną metodę deprywacji snu u myszy. Zaprojektowano zautomatyzowane urządzenie oparte na platformie kołyskowej, które jest ekonomiczne i skutecznie zakłóca sen myszy trzymanych w grupach w regulowanych odstępach czasu. To urządzenie indukuje charakterystyczne zmiany deprywacji snu przy minimalnej reakcji na stres. W związku z tym metoda ta może okazać się przydatna dla badaczy zainteresowanych badaniem wpływu i mechanizmów leżących u podstaw braku snu na patogenezę wielu chorób. Co więcej, jest to ekonomiczne rozwiązanie, szczególnie gdy wymagane jest równoległe działanie wielu urządzeń do pozbawiania snu.

Wprowadzenie

Zakłócenie rytmu okołodobowego odnosi się do desynchronizacji między zewnętrznym środowiskiem lub zachowaniem a endogennym zegarem biologicznym. Jedną z najczęstszych przyczyn zaburzeń rytmu okołodobowego jest brak snu1. Brak snu nie tylko negatywnie wpływa na zdrowie człowieka, ale także znacznie zwiększa ryzyko wielu chorób, w tym raka2 i chorób sercowo-naczyniowych3. Jednak mechanizmy leżące u podstaw szkodliwych skutków deprywacji snu pozostają w dużej mierze nieznane, a ustanowienie modeli deprywacji snu jest niezbędne do pogłębienia naszej wiedzy w tym zakresie.

Opisano różne metody pozbawiania snu u myszy, takie jak korzystanie z platform wodnych4, delikatne obchodzenie się5, komory z przesuwanymi prętami6, obrotowe bębny7, oraz protokoły mieszania klatek5,8,9. Przesuwane komory prętowe automatycznie przesuwają pręty po dnie klatki, zmuszając myszy do przechodzenia po nich i pozostawania w stanie czuwania. Protokoły pobudzenia w klatkach polegają na umieszczeniu klatek na laboratoryjnych wytrząsarkach orbitalnych, co skutkuje skutecznym zakłóceniem snu. Chociaż metody te są automatyczne i skuteczne, mogą być kosztowne, gdy wiele urządzeń musi działać równolegle, szczególnie w przypadku konkretnych projektów badawczych, które obejmują dużą liczbę myszy pozbawionych snu, potrzebnych do okołodobowego profilowania genów. Z drugiej strony, platformy wodne i protokoły delikatnego obchodzenia się są tańszymi i prostszymi metodami powszechnie stosowanymi w celu wywołania deprywacji snu. Jednak platforma wodna nie pozwala na automatyczną kontrolę wcześniej określonych cykli deprywacji i odpoczynku10,11, a delikatne obchodzenie się z nim wymaga od badaczy ciągłej czujności, aby zakłócić sen. Dodatkowo, inne modalności, takie jak obracające się bębny, mogą być mylone przez izolację społeczną lub stres12.

Zainspirowani metodą opartą na wytrząsarkach orbitalnych, zamierzamy wprowadzić protokół do stworzenia urządzenia opartego na platformie kołyskowej do deprywacji snu u myszy. Ta metoda jest tania, skuteczna, minimalnie stresująca, kontrolowana i zautomatyzowana. Obecny protokół pozwala nam stworzyć urządzenie oparte na platformie kołyskowej za około dziesięć razy tańsze niż w przypadku wytrząsarek orbitalnych, w oparciu o naszą dostępność. Urządzenie to skutecznie zakłócało sen u myszy trzymanych w grupach i indukowało charakterystyczne zmiany deprywacji snu przy minimalnej reakcji na stres. Będzie to szczególnie przydatne dla badaczy zainteresowanych badaniem wpływu i mechanizmów leżących u podstaw deprywacji snu na patogenezę wielu chorób, zwłaszcza gdy badanie obejmuje równolegle deprywację snu w wielu grupach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Laboratoryjną Komisję Etyki Dobrostanu Zwierząt Szpitala Renji, Szkoły Medycznej, Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju. W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J w wieku od 8 do 10 tygodni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Główne części wymagane do założenia urządzenia są wymienione w Rysunek 1A.

1. Przygotowanie urządzenia do deprywacji snu

  1. Przymocuj jeden koniec stalowego kanału z rowkiem o długości 50 cm na środku stalowego kanału z rowkiem o długości 40 cm za pomocą (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć konstrukcję w kształcie litery T; powtórz proces i wykonaj dwie takie struktury w kształcie litery T (Rysunek 1B-a).
  2. Spraw, aby dwie konstrukcje w kształcie litery T stały równolegle do góry w odległości 30 cm od siebie i połącz spody dwóch konstrukcji w kształcie litery T za pomocą 30 cm stalowego cylindra kompatybilnego ze (patrz Tabela materiałów) za pomocą (Rysunek 1B-b).
  3. Umieść stalową prostokątną platformę (20 × 25 cm) (patrz tabela materiałów) pomiędzy dwiema konstrukcjami w kształcie litery T (Rysunek 1B-c).
    UWAGA: Jeśli gotowe do użycia stalowe platformy prostokątne o określonym rozmiarze nie są dostępne, można je wykonać poprzez spawanie płaskich stali o grubości 2 mm.
  4. Przymocuj każdy koniec stalowego cylindra o długości 30 cm, kompatybilnego ze śrubą, przymocowanego do dwóch łożysk zamocowanych na każdej z konstrukcji w kształcie litery T w odległości 10 cm od góry (Rysunek 1B-d).
  5. Przymocuj mocowanie silnika (patrz Tabela materiałów) na jednej z konstrukcji w kształcie litery T w odległości 25 cm od góry za pomocą (Rysunek 1B-e).
    UWAGA: Alternatywnie można użyć kleju budowlanego do zabezpieczenia mocowania silnika na konstrukcji w kształcie litery T zamiast załóg.
  6. Zamontuj silnik (patrz tabela materiałów) na uchwycie silnika za pomocą (Rysunek 1B-f).
  7. Zabezpiecz wentylator chłodzący (patrz tabela materiałów) za pomocą pasków samoblokujących na konstrukcji w kształcie litery T pod silnikiem (Rysunek 1B-g).
  8. Przymocuj koniec łożyska korbowodu do rogu platformy skierowanego w stronę silnika za pomocą (Rysunek 1B-h).
  9. Przymocuj drugi koniec korbowodu do wału silnika za pomocą (Rysunek 1B-i).
  10. Wywierć dwa otwory 4 mm w każdym z czterech rogów plastikowego pojemnika lub standardowej klatki dla zwierząt (patrz Tabela materiałów) za pomocą wiertarki elektrycznej i wywierć dwa otwory 4 mm i dolny otwór 6 mm po lewej stronie klatki (Rysunek 1B-j).
  11. Przymocuj klatkę na prostokątnej platformie za pomocą samoblokujących się opasek przez otwory narożne ( Rysunek 1B-k).
  12. Wywierć otwór o średnicy 5 mm w nasadce probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą wiertarki elektrycznej i zatkaj otwór długą dyszą wyposażoną w zawór kulowy, aby zapobiec wyciekowi wody.
    UWAGA: Hydrożel byłby alternatywną opcją zaopatrzenia w wodę, jeśli dostosowanie butelek na wodę jest trudne.
  13. Zabezpiecz niestandardową butelkę z wodą po lewej stronie klatki za pomocą samoblokujących się opasek przez dwa otwory 4 mm, z dyszą przechodzącą przez otwór 6 mm (Rysunek 1B-l).
  14. Podłącz wyjściowe przewody elektryczne zasilacza do dwóch zacisków silnika (Rysunek 1B-l).
    UWAGA: Nie ma określonych wymagań dotyczących polaryzacji przy podłączaniu przewodów do zacisków silnika.
  15. Podłącz wejściowe przewody elektryczne adaptera zasilacza do stycznika czasowego (Rysunek 1B-m).

2. Indukcja deprywacji snu

  1. Naciskaj skrajnie prawy przycisk ze znakiem plus na lewej i prawej połówce stycznika czasowego (patrz Tabela Materiałów), odpowiednio, aż "M" pojawi się na licznikach mechanicznych po obu stronach (Rysunek 1C-a).
  2. Naciskaj środkowe przyciski ze znakiem plus po lewej i prawej połowie stycznika czasowego, aż na licznikach mechanicznych po obu stronach pojawi się "5M" (Rysunek 1C-b).
  3. Naciskaj skrajny lewy przycisk ze znakiem plus po lewej połowie stycznika czasowego, aż na lewym liczniku mechanicznym pojawi się "15M" (Rysunek 1C-c).
    UWAGA: Stycznik czasowy będzie wtedy włączony na 15 minut i wyłączony na 5 minut w trybie cyklicznym.
  4. Umieść myszy w klatce z wodą i jedzeniem ad libitum.
  5. Zasilić stycznik czasowy i wentylator chłodzący zasilaniem.
    UWAGA: Platforma będzie się teraz kołysać z prędkością 10 obr./min.
  6. Waż każdą mysz według czasu Zeitgeber 0 (ZT0) każdego dnia.
    UWAGA: Światło jest włączone od 8 rano (ZT0) do 8 wieczorem (ZT12).

3. Doustny test tolerancji glukozy

  1. Zmierz poziom glukozy na czczo u myszy na czczo, pobierając próbki krwi z żył ogonowych.
  2. Każdej myszy (2 g/kg masy ciała) wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór glukozy za pomocą strzykawek o pojemności 1 ml.
  3. Zbierz próbki krwi przez żyłę ogonową i zbadaj poziom glukozy we krwi odpowiednio po 15 minutach, 30 minutach, 60 minutach i 120 minutach po wstrzyknięciu glukozy.
  4. Po teście umieść myszy z powrotem w klatce z jedzeniem i wodą ad libitum.

4. Pobieranie tkanek mózgowych

  1. Odetnij głowy myszom po odpowiednim znieczuleniu, wystawiając je na działanie izofluranu (2%) przez 3-5 minut.
  2. Odsłoń czaszkę i wykonaj 1 cm pionowe nacięcie na czaszce za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  3. Usuń czaszkę za pomocą hemostatów komarów (patrz Tabela materiałów), aby odsłonić tkankę mózgową.
  4. Delikatnie wysuń cały mózg z jamy czaszkowej za pomocą zakrzywionej pęsety.
    UWAGA: Tkanka mózgowa powinna zostać usunięta zgodnie z lokalnymi zasadami.
  5. Umyć tkankę mózgową zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS, 4 °C).
  6. Zatrzaskowo zamrozić nienaruszoną tkankę mózgową w ciekłym azocie i przenieść tkankę do -80 °C w celu długotrwałego przechowywania .
    UWAGA: Przy przechowywaniu w temperaturze -80°C zamrożona tkanka mózgowa jest stabilna przez co najmniej 6 miesięcy.

5. Wykrywanie ekspresji genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

  1. Rozmrozić tkanki mózgowe w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
  2. Przenieś tkankę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wyekstrahuj całkowite RNA za pomocą metody opartej na TRIzolu13.
  3. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów) po ekstrakcji RNA.
  4. Wykonaj odwrotną transkrypcję całkowitego RNA (1 μg) na komplementarne DNA (cDNA) za pomocą komercyjnego zestawu14.
  5. Mierz poziomy ekspresji genów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono uznane urządzenie do deprywacji snu u myszy w Rycina 1DW 7. dniu po rozpoczęciu deprywacji snu wykonano monitorowanie elektroencefalograficzne (EEG) i elektromiograficzne (EMG)16 wykazano, że urządzenie znacząco skróciło czas trwania snu i wydłużyło czas czuwania u myszy (Rysunek 2A-D). Tymczasem obecny protokół znacząco zwiększył akumulację adenozyny oraz poziomy mRNA dla Homer1a w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysie modele deprywacji snu są niezbędne do badania wpływu zakłóceń snu na różne choroby, w tym choroby sercowo-naczyniowe21, schorzenia psychiczne22 i zaburzenia neurologiczne23. Wśród istniejących strategii deprywacji snu u myszy najczęściej stosowane są podejścia fizyczne, które polegają na powtarzających się krótkotrwałych przerwach w śnie 5,7,12. Te fiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82230014, 81930007, 82270342), Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), Komisji Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030), SHWSRS (2023-62), Shanghai Clinical Research Center for Aging and Medicine (19MC1910500) oraz Podyplomowego Programu Innowacji Bengbu Kolegium Medyczne (Byycxz21075).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlAxygenMCT-150-C-S Probówka
wirówkowa 50 mlNEST602002
Zestaw ELISA adenozynyTechnologia RuifanRF8885
Klatka dla zwierzątZeYa techMJ2
GlukometrYuYue580
C57BL/6J MyszyJieSiJie Zwierzę laboratoryjneNie dotyczyWiek: 8-10 tygodni
KorbowódShengXiang TechN/ADługość:  20 cm
Wentylatorchłodzący LiMingEFB0805VHNapięcie zasilania: 5 V; Pobór mocy: 1,2 W; Przepływ powietrza: 26,92 cfm; Wymiary: 40 mm * 40 mm * 56 mm
Zestaw ELISA kortykosteronuElabscienceE-OSEL-M0001
System rejestracji i analizy EEG/EMGPinnacle Technology8200-K1-iSE3
IsofluraneRWD20071302
hemostatyki komarówFST13011-12Instrument chirurgiczny
Silnik i mocowanie silnikaMingYangMY36GP-555Napięcie zasilania: 24 V DC; Średnica wału: 8 mm; Maksymalny wyjściowy moment obrotowy: 100 Kgf.cm; Maksymalna prędkość wyjściowa: 10 obr./min
NanoDrop 2000cThermo ScientificNanoDrop 2000c
Adapter Power brickMingYangQiYe-0243Napięcie wejściowe: 110-220V ac; Napięcie wyjściowe: 24 V DC; Prąd wyjściowy: 2 A; Długość: 2 m
Zestaw komercyjny qPCR Aparatura pomiarowa qPCRVazymeQ711-02
qPCRRoche480
Platforma prostokątna przymocowana za pomocą przykręcanego stalowego cylindraDostosowaneNie dotyczySzerokość: 20 cm; długość: 25 cm; długość cylindra: 30 cm, grubość: 2 mm
Zestaw komercyjny do odwróconego RNA do cDNAVazymeR323-01
Śruba i nakrętkaGuwanjiN/AŚrednica wewnętrzna: 6 mm, 12 mm
Cylinder stalowy kompatybilny zeDostosowaneNie dotyczyDługość: 300 mm
Kanały stalowe szczelinoweDostosowane Nie dotyczyDługość: 400 mm lub 500 mm, grubość: 2 mm
Stycznik czasowyLiXiangDH48S-SNapięcie zasilania: 110-220 V ac; Mierzone jednostki: godziny, minuty, sekundy; Konfiguracja styków: DPDT
TRIzolVazymeR401-01

Bibliografia

  1. Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292(2023).
  2. Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
  3. Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
  4. Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
  5. Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90(2019).
  6. Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
  7. Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
  8. Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35(2022).
  9. Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
  10. Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
  11. Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559(2016).
  12. Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
  13. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  14. Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
  15. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  16. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
  17. Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
  18. Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
  19. Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
  20. Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
  21. Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
  22. Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430(2014).
  23. Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017(2020).
  24. Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
  25. Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
  26. Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rytm oko odobowyplatforma ko ysz cadeprywacja snu u myszyzautomatyzowana deprywacja snumonitorowanie EEGmonitorowanie EMGekspresja gen w zegarowychtolerancja glukozyodpowied stresowa
Ustanowienie urządzenia do deprywacji snu u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.