Method Article

Automatyzacja przetwarzania pączków cytrusów w celu wykrywania patogenów na dalszych etapach procesu za pomocą inżynierii urządzeń

DOI:

10.3791/65159

⸱

April 21st, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

* These authors contributed equally

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy, wyprodukowaliśmy i zatwierdziliśmy urządzenie, które szybko przetwarza bogate w łyko tkanki z kory cytrusów i pączków. W porównaniu z obecnymi metodami, ekstraktor tkanek pączków (BTE) zwiększył przepustowość próbek i zmniejszył wymagane koszty pracy i sprzętu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny cytrusów o ograniczonym dostępie do łyka, takie jak wirusy, wiroidy i bakterie, są odpowiedzialne za niszczycielskie epidemie i poważne straty ekonomiczne na całym świecie. Na przykład wirus tristeza cytrusów zabił ponad 100 milionów drzew cytrusowych na całym świecie, podczas gdy "Candidatus Liberibacter asiaticus" kosztował Florydę 9 miliardów dolarów. Wykorzystanie testowanych pod kątem patogenów pąków cytrusowych do rozmnażania drzew ma kluczowe znaczenie dla zarządzania takimi patogenami. Program Ochrony Klonów Cytrusów (CCPP) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside wykorzystuje testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do testowania tysięcy próbek z drzew źródłowych pączków cytrusów każdego roku w celu ochrony cytrusów w Kalifornii i zapewnienia czystych jednostek rozmnażania dla National Clean Plant Network. Poważnym wąskim gardłem w wysokoprzepustowym wykrywaniu molekularnym wirusów cytrusowych i wiroidów jest etap przetwarzania tkanek roślinnych.

Właściwe przygotowanie tkanek jest kluczowe dla ekstrakcji wysokiej jakości kwasów nukleinowych i dalszego wykorzystania w testach PCR. Siekanie, ważenie, liofilizacja, mielenie i wirowanie tkanek roślinnych w niskich temperaturach w celu uniknięcia degradacji kwasów nukleinowych jest czasochłonne i pracochłonne oraz wymaga drogiego i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. W artykule przedstawiono walidację specjalistycznego instrumentu zaprojektowanego do szybkiego przetwarzania bogatych w łyko tkanek kory z pączków cytrusowych, nazwanego ekstraktorem tkanek pączków pączków (BTE). Aparat zauszny zwiększa przepustowość próbki o 100% w porównaniu z obecnymi metodami. Ponadto zmniejsza robociznę i koszty sprzętu. W tej pracy próbki zauszne miały wydajność DNA (80,25 ng/μl), która była porównywalna z protokołem ręcznego siekania CCPP (77,84 ng/μl). Ten instrument i protokół szybkiego przetwarzania tkanek roślinnych mogą przynieść korzyści kilku laboratoriom i programom diagnostycznym cytrusów w Kalifornii i stać się modelowym systemem przetwarzania tkanek dla innych wieloletnich upraw drzewiastych na całym świecie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny cytrusów o ograniczonym przenoszeniu łyka, takie jak wiroidy, wirusy i bakterie, spowodowały niszczycielskie epidemie i poważne straty ekonomiczne w każdym regionie świata produkującym cytrusy. Wiroidy cytrusowe są czynnikami ograniczającymi produkcję ze względu na choroby egzokorty i kacheksji, które wywołują w ważnych gospodarczo typach cytrusów, takich jak trójlistkowe, trójlistkowe hybrydy, mandarynki, klementynki i mandarynki1,2,3. W Kalifornii te wrażliwe na wiroidy rodzaje cytrusów są podstawą rosnącego i dochodowego rynku "łatwych do obierania", podążając za zmieniającym się trendem w preferencjach konsumentów dla owoców, które są łatwe do obrania, podzielone na segmenty i bez pestek4,5,6. W związku z tym wiroidy cytrusów są regulowane przez Kalifornijski Departament ds. Żywności i Rolnictwa (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140", a laboratoria Oddziału Diagnostyki Szkodników Roślin CDFA wykonują tysiące testów wiroidów cytrusów rocznie7,8,9,10. Wirus tristeza cytrusów (CTV) jest odpowiedzialny za śmierć ponad 100 milionów drzew cytrusowych od początku globalnej epidemii w latach 30. XX wieku3,9,10,11. W Kalifornii wżery po łodygach i trójlistkowe izolacje wirusa stanowią poważne zagrożenie dla wartego 3,6 miliarda dolarów kalifornijskiego przemysłu cytrusowego12,13,14. W związku z tym CDFA klasyfikuje CTV jako regulowanego szkodnika roślin klasy A, a laboratorium Agencji Zwalczania Tristeza w Środkowej Kalifornii (CCTEA) przeprowadza szeroko zakrojone badania terenowe i tysiące testów wirusów każdego roku15,16. Szacuje się, że bakteria "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) i choroba huanglongbing (HLB) spowodowały blisko 9 miliardów dolarów szkód ekonomicznych na Florydzie w wyniku 40% zmniejszenia areału upraw cytrusów, 57% spadku upraw cytrusów i utraty prawie 8 000 miejsc pracy17,18. W Kalifornii przewiduje się, że hipotetyczne zmniejszenie areału upraw cytrusów o 20% z powodu HLB spowoduje utratę ponad 8200 miejsc pracy i zmniejszenie produktu krajowego brutto stanu o ponad pół miliarda dolarów. W związku z tym Program Zapobiegania Szkodnikom i Chorobom Cytrusów wydaje ponad 40 milionów dolarów rocznie na badania mające na celu testowanie, wykrywanie i zwalczanie CLa z Kalifornii14,17,19,20.

Kluczowym elementem zarządzania wiroidami cytrusów, wirusami i bakteriami jest użycie testowanych przez patogeny materiałów rozmnożeniowych (np. budwood) do produkcji drzew. Testowane pod kątem patogenów pąki cytrusowe są produkowane i utrzymywane w ramach kompleksowych programów kwarantanny, które wykorzystują zaawansowane techniki eliminacji i wykrywania patogenów10,21. Program Ochrony Klonów Cytrusów (CCPP) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside każdego roku testuje tysiące próbek pączków z odmian cytrusów nowo importowanych do stanu i USA, a także drzew źródłowych pączków cytrusów, w celu ochrony cytrusów w Kalifornii i wspierania funkcji National Clean Plant Network for Citrus10, 17,22. Aby poradzić sobie z dużą liczbą testów cytrusów, wysokowydajne, niezawodne i ekonomiczne testy wykrywania patogenów są podstawowym elementem sukcesu programów takich jak CCPP7,10,22.

Podczas gdy molekularne testy wykrywania patogenów, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), pozwoliły na znaczny wzrost przepustowości w zakładowych laboratoriach diagnostycznych, z naszego doświadczenia wynika, że jednym z najbardziej krytycznych wąskich gardeł w implementacji protokołów o wysokiej przepustowości jest etap przetwarzania próbek tkanek roślinnych. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku cytrusów, ponieważ obecnie dostępne protokoły przetwarzania tkanek bogatych w łyko, takich jak ogonki liściowe i kora pączków, są pracochłonne, czasochłonne i wymagają drogiego i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Protokoły te wymagają ręcznego siekania, ważenia, liofilizacji, mielenia i wirowania w niskich temperaturach, aby uniknąć degradacji kwasów nukleinowych8,23,24. Na przykład w laboratorium diagnostycznym CCPP przetwarzanie próbek obejmuje (i) ręczne siekanie (6-9 próbek/h/operatora), (ii) liofilizację (16-24 h), (iii) proszkowanie (30-60 s) oraz (iv) wirowanie (1-2 h). Proces ten wymaga również specjalistycznych materiałów eksploatacyjnych (np. wytrzymałych rurek z zabezpieczeniem awaryjnym, kul szlifierskich ze stali nierdzewnej, adapterów, ostrzy, rękawic) oraz wielu kosztownych urządzeń laboratoryjnych (np. zamrażarki niskotemperaturowej, liofilizatora, rozdrabniacza tkanek, kriostacji ciekłego azotu, wirówki z chłodzeniem).

Jak w każdej branży, inżynieria sprzętu i automatyzacja procesów są kluczem do obniżenia kosztów, zwiększenia przepustowości i zapewnienia wysokiej jakości, jednolitej jakości produktów i usług. Przemysł cytrusowy potrzebuje tanich urządzeń do przetwarzania tkanek, które wymagają minimalnych umiejętności w obsłudze i jako takie są łatwe do przeniesienia do laboratoriów diagnostycznych i działań terenowych, aby umożliwić wysoką wydajność przetwarzania próbek w celu szybkiego wykrywania patogenów na dalszych etapach. Technology Evolving Solutions (TES) i CCPP opracowały (tj. zaprojektowały i wyprodukowały) oraz zatwierdziły (tj. przetestowały próbki cytrusów i porównały ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi) tani (tj. wyeliminował potrzebę specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego) przyrząd do szybkiego przetwarzania tkanek cytrusowych bogatych w łyko (tj. pączków), nazwany ekstraktorem tkanek pączków (BTE). Jak widać na Rysunek 1, BTE zawiera podstawowy komponent do zasilania i sterowania, a także wyjmowaną komorę do przetwarzania pączków cytrusowych. Komora zausznego aparatu słuchowego składa się z tarczy szlifierskiej zaprojektowanej specjalnie do usuwania bogatych w łyko tkanek kory z pączków cytrusów. Rozdrobniona tkanka kory jest szybko wyrzucana przez otwór suwakowy do strzykawki zawierającej bufor ekstrakcyjny, filtrowana i przygotowywana do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych bez żadnej dodatkowej obróbki lub przygotowania (Rysunek 1). System BTE zawiera również aplikację do śledzenia próbek bez użycia papieru oraz zintegrowaną aplikację do ważenia, które rejestrują informacje o przetwarzaniu próbki w internetowej bazie danych w czasie rzeczywistym.

System BTE zwiększył laboratoryjną zdolność diagnostyczną CCPP o ponad 100% i konsekwentnie produkuje ekstrakty z tkanek cytrusowych odpowiednie do oczyszczania wysokiej jakości kwasów nukleinowych i dalszego wykrywania patogenów cytrusów przenoszonych przez przeszczepy za pomocą testów PCR. Mówiąc dokładniej, BTE skróciło czas przetwarzania tkanek z ponad 24 godzin do ~3 minut na próbkę, zastąpiło instrumenty laboratoryjne kosztujące ponad 60 000 USD (Rysunek 2, kroki 2-4) i umożliwiło przetwarzanie większych rozmiarów próbek.

Ten artykuł przedstawia dane dotyczące wysokoprzepustowego przetwarzania tkanek kory cytrusów BTE, ekstrakcji kwasów nukleinowych i wykrywania patogenów z próbkami pączków cytrusów z drzew źródłowych, w tym wszystkimi odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi odpowiednio z CCPP Rubidoux Quarantine Facility i Lindcove Foundation Facility. Przedstawiamy również zmiany przepustowości i czasu przetwarzania w porównaniu z obecną procedurą laboratoryjną (Rysunek 2). Ponadto praca ta zapewnia szczegółowy, krok po kroku protokół dla laboratoriów testujących patogeny cytrusów i pokazuje, w jaki sposób aparat zauszny może wspierać funkcje czystego materiału szkółkowego, badań i programów zwalczania.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Ekstraktor tkanek Budwood. Aparat zauszny zawiera podstawowy komponent do zasilania i sterowania, a także wyjmowaną komorę do przetwarzania pączków cytrusowych. Komora zauszna składa się z tarczy szlifierskiej specjalnie zaprojektowanej do usuwania bogatych w łyko tkanek kory z pączków cytrusowych. Rozdrobniona tkanka kory jest szybko wyrzucana przez otwór ślizgowy do strzykawki, filtrowana i przygotowywana do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych bez dodatkowej obsługi lub przygotowania. Skrót: BTE = ekstraktor tkanek budwood. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Porównanie krok po kroku między konwencjonalną procedurą laboratoryjną ręcznego siekania a przetwarzaniem BTE. Przetwarzanie zauszne obejmuje wysokoprzepustową obróbkę tkanki kory cytrusów, ekstrakcję kwasów nukleinowych i wykrywanie patogenów. Czas dla każdego kroku jest podany w nawiasach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie próbek pączków cytrusów do wysyłki

  1. Wyślij Technology Evolving Solutions arkusz kalkulacyjny z informacjami o drzewach, aby mogli je załadować na swój serwer WWW (ostatecznie użytkownik utworzy nowe drzewa).
  2. Użyj aplikacji TES tracker w aplikacji telefonicznej, aby wybrać drzewo i przytrzymaj znacznik obroży do komunikacji bliskiego zasięgu (NFC) do telefonu, aby załadować informacje o drzewie do tagu.
  3. Włóż trzy do czterech próbek pączków cytrusów do plastikowego uchwytu na torbę kompatybilnego z BTE i zamknij pokrywką.
    1. Upewnij się, że długość pąka nie przekracza 8 cali i nie jest mniejsza niż 5 cali.
      1. Jeśli długość jest większa niż 8 cali, użyj sterylnej jednorazowej żyletki lub nożyc do przycinania odkażonych 10% roztworem wybielacza (1% podchlorynu sodu), aby ją skrócić.
      2. Jeśli długość jest mniejsza niż 5 cali, zbierz inną próbkę pączków, aby umieścić ją w torbie.
    2. Upewnij się, że wszelkie narośla pachowe lub duże ciernie zostały usunięte ręcznie lub przy użyciu 10% narzędzi tnących zdezynfekowanych wybielaczem (1% podchlorynu sodu).
      UWAGA: Ten krok jest ważny, aby pączek był łatwiejszy do manewrowania w otworze komory.
    3. Upewnij się, że nie ma próbek pączków, które mają zakrzywione elementy. Jeśli tak, usuń je za pomocą 10% narzędzi tnących odkażonych wybielaczem (1% podchlorynu sodu) i umieść w workach zausznych tylko proste części próbki.
      UWAGA: Zakrzywione budwood jest bardzo trudne do manewrowania w instrumencie, co skutkuje nierównym paskowaniem kory.
  4. Użyj aplikacji TES tracker w aplikacji na telefon, aby zeskanować znacznik obroży NFC drzewa i połączyć go z tagiem klipsa NFC na torbie na próbkę.
  5. Zwróć uwagę na grubość pączka, ponieważ określa ona sposób, w jaki operator usunie bogatą w łyko korę pączków w komorze zausznej.
    1. Jeśli pączek ma grubość poniżej 0,20 cala, należy zachować ostrożność podczas usuwania pąków, ponieważ przędzące się nici o dużej prędkości w komorze sproszkowają całe pączki do rdzenia, poza warstwę kory i do niebogatych w łyko tkanek drewna i rdzenia.
    2. Wybierz grubsze pąki, ponieważ łatwiej jest usunąć tkanki kory, unikając tkanek pączków niebogatych w łyko.
  6. Umieść próbki w izolowanym pojemniku transportowym z kilkoma wkładami z lodu.

2. Ustawienie w dygestorium

UWAGA: Preferowane jest używanie aparatu zausznego wewnątrz dygestoria. Zmniejszy to ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego tkanek roślinnych i zanieczyszczenia laboratoryjnego.

  1. Zdezynfekować za pomocą butelki z rozpylaczem 10% (1% podchlorynu sodu).
    1. Spryskaj powierzchnię kaptura i pozostaw wybielacz na około 1 minutę, a następnie wytrzyj go ręcznikiem papierowym.
    2. Spryskaj ręcznik papierowy roztworem wybielacza. Wytrzyj podstawę TE, elementy wagi (wagę, osłonę powietrzną i wieżę) oraz marker.
  2. Rozpakuj zestaw strzykawek na liczbę próbek do przetworzenia i umieść je w zakrytym pudełku kartonowym.
  3. Miej pod ręką paczkę wacików na zewnątrz okapu na wypadek, gdyby były potrzebne.
  4. Przygotuj wagę.
    1. Zdejmij wieżę obciążnika z wagi i przytrzymaj przycisk zasilania, aby ją włączyć. Umieść wieżę na środku wagi po tym, jak waga wyświetla 0.
    2. Nasuń osłonę powietrzną wagi na przód wagi.
  5. Przygotuj podstawę ekstraktora bibułkowego, przestawiając przełącznik z tyłu. Upewnij się, że przełącznik po lewej stronie pudełka jest wciśnięty u góry. Poczekaj, aż zacznie migać zielona dioda LED, która wskazuje, że komora jest gotowa.

3. Ustaw stacje czyszczące (Rysunek uzupełniający S1).

  1. Umieść 1 l wody w myjce ultradźwiękowej.
  2. Owiń dwa worki na śmieci na wierzchu myjki ultradźwiękowej.
  3. Wlej ~5 L 10% wybielacza (1% roztworu podchlorynu sodu) do myjki ultradźwiękowej.
  4. Napełnij wannę wystarczającą ilością wody, aby zanurzyć komorę.
  5. Włącz sprężarkę powietrza i otwórz zawór.
  6. Ustaw tło, aby złapać płyn podczas suszenia komory.

4. Przetwarzanie materiału do BTE do usuwania kory z pączków cytrusów

  1. Załaduj komorę do podstawy zausznej.
    1. Przygotuj komorę zauszną.
      1. Przymocuj pustą torbę na próbkę z tyłu komory. Użyj dwóch O-ringów, aby przymocować pustą torbę do tylnej dyszy komory zausznej.
      2. Sprawdź ostrze pod kątem oznak zużycia lub uszkodzeń, takich jak nacięcia tworzące się na ostrzu w miejscu, w którym przechodzi ono w plastik lub nacięcia tworzące się na końcówce. Upewnij się, że strzałka na ostrzu pokrywa się z symbolem pojedynczej kłódki.
      3. Upewnij się, że wylot powietrza na dnie komory jest skierowany w stronę symbolu O. Umieść przezroczystą pokrywę nad otworem komory i wsuń przezroczystą prowadnicę zauszną na komorę za pomocą prowadnicy po prawej stronie komory. Wsuń zamek na dnie komory tak daleko, jak to możliwe, do zamka. Upewnij się, że nasadka tłoka jest zamontowana w górnej części zamka.
    2. Umieść komorę na podstawie zausznej tak, aby dysza podstawy zausznej wystawała z tyłu komory. Poczekaj, aż niebieska dioda LED zacznie migać, wskazując, że umieszczenie się powiodło.
  2. Załaduj próbkę na podstawę zauszną aparatu zausznego, przesuwając białą naklejkę na klipsie NFC tag do litery Z po prawej stronie pudełka. Przesuwaj tag powolnymi ruchami okrężnymi na Z, aż żółte światło zacznie migać. Przymocuj próbkę do podstawy zausznej i upewnij się, że worek na próbkę nie ma w sobie otworów; Jeśli jest, załataj ją taśmą. Umieść pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym nad workiem na próbkę, aby przymocować go do przedniej części dyszy zausznej.
  3. Załadować nieużywany zestaw strzykawek.
    1. Wytaruj zestaw strzykawek. Umieścić nieużywany zestaw strzykawek na wieży wagi. Wyjąć zestaw strzykawek, gdy zacznie migać czerwona lampka lub na wadze pojawi się 0.
    2. Wyjąć tłok ze strzykawki z filtrem. Upewnij się, że płyn znajduje się w dolnej (bez filtra) strzykawce. Odłożyć tłok na bok na ręczniku papierowym lub na wieży, gdzie tłok nie dotyka żadnych powierzchni.
    3. Przymocować strzykawkę do wysuwanego portu wyjściowego, wciskając otwór wyjściowy do strzykawki i obracając o 90°.
  4. Przetwórz próbkę pączków.
    UWAGA: BTE ma ruchome części o dużej prędkości. Wszystkie operacje muszą odbywać się wewnątrz dygestorium. Wszyscy użytkownicy powinni używać okularów ochronnych, nauszników (zatyczek do uszu) i wszystkich innych środków ochrony osobistej (PPE), takich jak rękawice i fartuchy laboratoryjne.
    1. Naciśnij górny przycisk, aby uruchomić maszynę. Naciśnij drugi raz, aby zatrzymać silnik w dowolnym momencie podczas przetwarzania.
      UWAGA: Pudełko posiada czujnik prędkości i temperatury, aby zapewnić prawidłowe działanie.
    2. Chwyć jeden patyczek z pączka przez torbę i przełóż go przez górną część dyszy zausznej.
    3. Drugą ręką chwyć kij z drewna pączkowego po drugiej stronie komory i powoli wbij się w ostrze. Posłuchaj delikatnego brzęczącego dźwięku wskazującego, że pączek jest odzierany z kory. Powoli przesuwaj pączek do przodu i do tyłu, obracając go.
      1. Jeśli usłyszysz głośny, agresywny dźwięk rąbania, szybko przesuń gałąź do góry i/lub naciśnij górny przycisk, aby zatrzymać silnik. Aby zatrzymać silnik, użyj przełącznika po prawej stronie, aby zakończyć przetwarzanie (patrz krok 4.4.3.2).
      2. Jeśli podczas cięcia żaden materiał nie wychodzi z wyjścia, oznacza to, że komora jest zatkana. Wyłącz silnik, zdejmij nasadkę tłoka przesuwnego i użyj plastikowej nasadki wacika, aby wypchnąć zatkanie z wyjścia urządzenia. Użyj przełącznika po prawej stronie, aby zakończyć obróbkę: W górę = Cięcie do przodu; Środkowy = silnik wyłączony; W dół = Odwrotne cięcie.
    4. Powtórz kroki 4.4.2 i 4.4.3 dla pozostałych gałęzi.
      UWAGA: Ogólnym wskaźnikiem, że wystarczająca ilość kory pączków została usunięta, jest to, że 25% strzykawki zostało wypełnione tkanką roślinną. Patogeny cytrusów przenoszone przez przeszczep mogą być nierównomiernie rozmieszczone na drzewie. Dlatego pobiera się od trzech do czterech próbek pączków z okolic baldachimu drzewa cytrusowego. Ważne jest, aby każda próbka pączków w torbie reklamowej zausznej przyczyniła się do powstania końcowej próbki zmielonej tkanki, aby zapewnić, że pełna próbka reprezentatywna dla drzewa zostanie przebadana pod kątem patogenów.
    5. Naciśnij górny przycisk, aby zatrzymać przetwarzanie. Poczekaj, aż lampka ponownie zacznie migać na żółto.
  5. Sprawdź masę próbki.
    1. Obrócić strzykawkę o 90° i pociągnąć ją w dół, aby ją odłączyć. Umieścić tłok z powrotem na strzykawce i umieścić strzykawkę na wieży.
    2. Poczekaj, aż waga automatycznie wykryje próbkę i określ, czy mieści się ona w odpowiednim zakresie wagowym (0,25 ± 0,05 g). Jeżeli masa próbki jest zbyt mała (<0,20 g), powtórzyć krok 4.4; czerwona dioda LED zacznie migać. Jeżeli masa próbki jest zbyt duża (>0,30 g), należy usunąć część materiału próbki; żółta dioda LED zacznie migać wolniej. Jeśli próbka znajduje się w zakresie, zielona dioda LED zacznie migać.
  6. Homogenizacja próbki pączków
    1. Wyjąć tłok ze strzykawki z próbką, wepchnąć płyn do strzykawki z próbką i ponownie dodać tłok. Tłok przepycha bufor i sok roślinny przez filtr siatkowy (zatrzymując wszelkie duże kawałki tkanki kory) i przez gumową rurkę do pustej strzykawki.
    2. Wymieszać próbkę, przepychając bufor i sok roślinny tam i z powrotem z jednej strzykawki do drugiej. Powtórz ~3x-4x i aż próbka stanie się jednorodną zieloną mieszaniną cieczy.
    3. Po dokładnej homogenizacji wepchnij próbkę soku roślinnego do strzykawki bez filtra siatkowego i odłącz gumową rurkę i strzykawkę z filtrem od strzykawki z próbką.
    4. Pobrać próbkę soku roślinnego ze strzykawki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Użyj markera permanentnego, aby oznaczyć próbkę numerem worka.
      UWAGA: Sok z próbki rośliny z kroku 4.6.5 może być teraz przetwarzany za pomocą dowolnej z dostępnych metod ekstrakcji kwasów nukleinowych, RNA lub DNA opartych na fenolu-chloroformie, kolumnie krzemionkowej lub kulkach magnetycznych9,25,26,27 w celu ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych (patrz krok 7) oraz dalszego wykrywania patogenów cytrusów przenoszonych przez szczepy (patrz krok 8).

5. Dezynfekcja wyjmowanej komory zausznej

UWAGA: Jeśli bufor z zestawu strzykawek dostanie się na komorę lub szkiełko, spłucz i przestrzegaj wszystkich zasad bezpieczeństwa laboratorium przed czyszczeniem. Zestaw strzykawek zawiera tiocyjanian guanidyny. Jeśli bufor z zestawu strzykawek wejdzie w kontakt z wybielaczem, wytworzy gazowy cyjanek.

  1. Wykonaj następujące czynności po przetworzeniu 10. próbki w komorze. Zwróć uwagę, że zielona dioda LED będzie nadal migać, zamiast przechodzić w na niebiesko.
  2. Zdemontuj komorę zausznego aparatu przedkolnego, aby usunąć wszystkie możliwe zanieczyszczenia; zdejmij przezroczystą plastikową osłonę, wyczyść suwak komory i wyczyść zatkany port na szkiełku komory.
  3. Przekręć zawór spustowy powietrza na dnie komory do pozycji otwartej (znak otwartej kłódki). Umieść elementy komory w ustawianej myjce ultradźwiękowej (patrz krok 3.1). Umieść pokrywę pod komorą, aby zapobiec jej unoszeniu się na wodzie. Uruchom myjkę ultradźwiękową na 15 minut
    UWAGA: Kąpiel do czyszczenia ultradźwiękowego (5 l) może pomieścić do dwóch komór.
  4. Płukać elementy komory w łaźni wodnej (krok 3.4) przez co najmniej 30 sekund. Przenieść elementy komory do stacji suszenia.
    UWAGA: Suszenie spowoduje szybkie przesuwanie się części w komorze, głośne dźwięki (~85 decybeli [dB]) i możliwe rozpryskiwanie. Wszyscy użytkownicy powinni używać okularów ochronnych, nauszników (zatyczek do uszu), fartuchów laboratoryjnych i wszystkich innych środków ochrony indywidualnej zgodnie z zasadami bezpieczeństwa laboratorium operacyjnego.
  5. Osuszyć komorę zauszną.
    1. Ustaw pistolet pneumatyczny w jednej linii z rowkiem górnego otworu komory (tam, gdzie zwykle znajduje się zamek). Naciśnij spust pistoletu, aby dozować powietrze przez ~30 s.
      UWAGA: Upewnij się, że otwór jest oddalony od użytkownika w kierunku tła. Powinno to obrócić zestaw ostrzy, aby usunąć uwięzioną pod nim ciecz.
    2. Ustaw pistolet pneumatyczny w kierunku górnych dysz komory. Naciśnij spust pistoletu pneumatycznego i powoli prześledź trzy pełne koła każdego wejścia dyszy.
    3. Umieść pistolet pneumatyczny na środku aparatu zausznego. Zaczynając od najbardziej wewnętrznego punktu, przytrzymaj spust w dół i poruszaj się, aż wiatrówka skieruje się w stronę miejsca, w którym znajdowałby się zamek.
    4. Szybko przepuść powietrze przez całą komorę, z przodu i z tyłu, aby usunąć wodę powierzchniową z zewnątrz.
  6. Wysuszyć szkiełko zauszne.
    1. Umieść pistolet pneumatyczny w szczelinie tłoka zamka i naciśnij spust, aby wyrzucić wodę z wyjścia zamka.
    2. Uruchom pistolet pneumatyczny wzdłuż wewnętrznej powierzchni szkiełka, aby go wysuszyć.
    3. Uruchom pistolet pneumatyczny wzdłuż rowka zamka, aby wypchnąć wodę.
    4. Szybko przepuść powietrze po całej powierzchni zewnętrznej, aby usunąć z niej wodę powierzchniową.
  7. Wysuszyć składniki.
    1. Chwyć nasadkę tłoka suwaka i pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym w dłoni, a następnie naciśnij spust.
    2. Przejedź pistoletem pneumatycznym po wewnętrznej powierzchni pokrywy.
    3. Umieść elementy w komorze i przesuń, aby kontynuować suszenie lub ponownie je złożyć.
      UWAGA: W przypadku środowiska o wysokim poziomie przetwarzania tkanek z wieloma funkcjonalnymi aparatami zausznymi można zapewnić system odkażania wsadowego, który jest w stanie odkazić 10 komór jednocześnie.

6. Utylizacja i odkażanie

  1. Wyrzuć strzykawki i gumowe rurki do wyznaczonego pojemnika na odpady guanidyny.
  2. Wyrzuć wszelkie materiały roślinne do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.
  3. Wyjmij komorę zauszną z podstawy zausznej.
  4. Zdemontuj komorę zauszną i przystąp do ich odkażania, zgodnie z opisem w kroku 5.

7. Ocena przetwarzania tkanek i jakości RNA oczyszczonego z zausznych ekstraktów z pączków cytrusów

UWAGA: W tym protokole użyliśmy próbek budwood z 255 drzew cytrusowych, aby porównać czas potrzebny na przetworzenie tkanki pączków cytrusowych i jakość RNA oczyszczonego z ekstraktów z tkanki kory przygotowanych przez BTE (Rysunek 2, prawa strona, krok 1, krok 5 i krok 6) w porównaniu z próbkami przygotowanymi zgodnie z zatwierdzoną przez prawo metodą przetwarzania tkanek z pączków cytrusów z wykorzystaniem ręcznego obierania i siekania, liofilizacja, proszkowanie i odwirowanie tkanki kory, zgodnie z opisem Danga i wsp.23 (Rysunek 2, lewa strona, kroki 1-6).

  1. Aktualna procedura laboratoryjna: Przygotuj próbki pączków do przetwarzania tkanek zgodnie z zatwierdzoną prawem metodą23.
    1. Przeprowadzić ręczne obieranie i siekanie tkanki kory, liofilizację, proszkowanie, wirowanie i transfer soku roślinnego do probówki ekstrakcyjnej RNA, jak opisano przez Dang et al.23 (Rysunek 2, lewa strona, kroki 1-6).
    2. Po ręcznym obraniu trzech do czterech próbek pączków z każdego badanego drzewa, umieść całe pączki w plastikowym pojemniku na torby kompatybilnym z BTE i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu obróbki BTE (krok 7.2).
  2. Procedura zausznego aparatu cytrusowego: Rozpocząć przetwarzanie zausznej tkanki pączków cytrusów (sekcja 4, kroki 4.1-4.6; Rysunek 2, prawa strona, krok 1, krok 5 i krok 6).
    1. Należy użyć próbek pączków przechowywanych w torbach zausznych z kroku 7.1.2.
  3. Ekstrahuj i oczyść RNA z soku roślinnego uzyskanego w wyniku obecnej procedury laboratoryjnej (krok 7.1.1) i procedury zausznego (krok 7.2.2) przy użyciu zatwierdzonej przez przepisy półautomatycznej metody opartej na kulkach magnetycznych8,23,28.
  4. Oceń jakość RNA, mierząc jego stężenie, czystość i integralność8,23,24,29,33,31.
    1. Aby obliczyć stężenie, należy użyć spektrofotometrii i gęstości optycznej (OD) na długości fali 260 nm.
    2. Aby ocenić czystość, należy użyć spektrofotometrycznego stosunku OD 260/280.
    3. Aby sprawdzić integralność, użyj ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) z odwrotną transkrypcją (RT) ukierunkowanej na mRNA genu cytrusowego dehydrogenazy NADH24,32.

8. Ocena zanieczyszczenia krzyżowego i wykrywanie wirusów cytrusowych i wiroidów przy użyciu RNA oczyszczonego z ekstraktów z zausznych pąków cytrusowych

UWAGA: W tym protokole użyliśmy próbek budwood z 72 niezainfekowanych drzew cytrusowych i jednego drzewa zainfekowanego wirusami i wiroidami, aby ocenić potencjał zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami podczas przetwarzania przez BTE (Rysunek 2, prawa strona, krok 1, krok 5 i krok 6) oraz przydatność RNA oczyszczonego z ekstraktów z tkanek kory przygotowanych przez BTE do użycia jako matryca do wykrywania wirusów cytrusowych i wiroidów RT-qPCR.

  1. Pierwsze przetwarzanie próbki zausznej: Przeprowadź eksperyment podstawowy z 72 niezainfekowanymi próbkami.
    1. Przygotuj trzy (A-C) komory do zausznego aparatu oddechowego (krok 4.1.1).
    2. Przygotować wszystkie niezakażone próbki pączków cytrusów (1-72) w zausznych torbach na zakupy i przygotować taką samą liczbę (72) w dwustrzykawkowym systemie pobierania próbek zausznych aparatów cytrusowych, z jednym systemem strzykawkowym dla każdej próbki (etap 2.4).
    3. Torebki na próbki i strzykawki do pobierania próbek należy rozdzielić na sześć partii (I–VI) po 12 próbek każda.
    4. Rozpocząć przetwarzanie tkanki pączków cytrusów zausznych (krok 4) zgodnie z poniższą sekwencją (kroki 8.1.4.1-8.1.4.6) (patrz Tabela 1, Przetwarzanie pierwszej próbki zausznej części cytrusów).
      1. W przypadku partii I/próbek 1-12 należy przetworzyć 12 próbek w komorze A. Odkazić komorę A po próbce 12 (krok 5).
      2. W przypadku partii II/próbek 13-24 należy przetworzyć 12 próbek w komorze B. Odkazić komorę B po próbce 24 (krok 5).
      3. W przypadku partii III/próbek 25-36 należy przetworzyć 12 próbek w komorze C. Odkazić komorę C po próbce 36 (krok 5).
      4. W przypadku partii IV/próbek 37-48 należy przetworzyć 12 próbek w odkażonej komorze A (etap 8.1.4.1).
      5. W przypadku partii V/próbek 49--60 przetworzyć 12 próbek w odkażonej komorze B (krok 8.1.4.2).
      6. W przypadku partii VI/próbek 60-72 należy przetworzyć 12 próbek w odkażonej komorze C (etap 8.1.4.3).
    5. Torebki zauszne z wszystkimi próbkami należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia w kroku 8.2.
    6. Wyodrębnij i oczyść RNA z 72 próbek soków roślinnych wygenerowanych w krokach 8.1.4.1-8.1.4.6 przy użyciu zatwierdzonej przez organy regulacyjnej półautomatycznej metody opartej na kulkach magnetycznych8,23,28.
    7. Wykonaj RT-qPCR w celu wykrycia wirusów cytrusowych i wiroidów, zgodnie z wcześniejszym opisem8,33.
  2. W przypadku drugiego przetwarzania próbki zausznej należy przeprowadzić eksperyment zanieczyszczenia krzyżowego z 70 niezakażonymi próbkami i dwiema mieszanymi zakażonymi próbkami.
    1. Przygotuj trzy (A-C) komory do zausznego aparatu oddechowego (krok 4.1.1).
    2. Przygotować zakażoną mieszanką próbkę pączków cytrusów (73) w dwóch zausznych torbach na zakupy (etap 1.3) dla łącznej liczby dwóch zakażonych próbek.
    3. Zebrać zauszne torby na zakupy z niezakażonymi próbkami pączków cytrusów z kroku 8.1.5, z wyjątkiem próbki 3-Partia I i Próbka 51-Partia V (patrz wymiana próbki w kroku 8.2.4), aby uzyskać łączną liczbę 70 niezakażonych próbek.
    4. Dołączyć pierwszą torbę nośną zauszną z próbką 73 zakażoną mieszanką w miejsce próbki 3 w partii I, a drugą w miejsce próbki 51 w partii V, co daje łączną liczbę 72 próbek.
    5. Przygotować równą liczbę próbek (72) w dwustrzykawkowym systemie pobierania próbek zausznych, przy czym dla każdej próbki należy zastosować jedną podwójną strzykawkę (etap 2.4).
    6. Rozdzielić 72 torby na próbki i strzykawki do pobierania próbek na sześć partii (I–VI) po 12 próbek każda.
    7. Rozpocząć przetwarzanie zausznej tkanki pączków cytrusów (krok 4), postępując w tej samej kolejności, co w krokach 8.1.4.1-8.1.4.6.
      UWAGA: Jedyna różnica polega na zastąpieniu próbki 3 w partii I i próbki 51 w partii V zakażoną próbką 73 (krok 8.2.4) (tabela 1, przetwarzanie drugiej próbki zausznej).
    8. Ekstrahować i oczyszczać RNA z 72 próbek soków roślinnych wygenerowanych w kroku 8.2.7, tak jak w kroku 8.1.6.
    9. Przeprowadzić test RT-qPCR w celu wykrycia wirusów cytrusowych i wiroidów, jak w kroku 8.1.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekstrakcja, oczyszczanie i jakość RNA przy użyciu zausznej tkanki cytrusowej z pączków i ocena czasu przetwarzania tkanek
Do tego testu wykorzystaliśmy próbki pączków z 255 reprezentatywnych drzew cytrusowych, aby porównać jakość RNA z BTE z procedurą standardową. Próbki zostały przetworzone przez ekstraktor tkanek pączków (BTE) (kroki protokołu 4.1-4.6 i Rysunek 2, prawa strona, krok 1, krok 5 i krok 6) lub przygotowane zgodnie z zatwierdzoną przez organy regulacyjnie metodą prze...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się choroby cytrusowej HLB, w celu zmniejszenia strat, przemysł cytrusowy, agencje regulacyjne i laboratoria diagnostyczne zostały wezwane do polegania na wysokoprzepustowych metodach ekstrakcji kwasów nukleinowych w połączeniu z niskoprzepustowym ręcznym przetwarzaniem próbek i testami wykrywania patogenów, takimi jak qPCR34 do testowania pojedynczych drzew, w połączeniu z praktykami zarządzania chorobami35. Wskaźnik pozytywności HLB w Kalifornii wzrósł ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy uznają lud Cahuilla za Tradycyjnych Opiekunów Ziemi, na której zakończono eksperymentalne prace. Jesteśmy wdzięczni profesorowi Normanowi Ellstrandowi z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Riverside za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej do prowadzenia działań badawczych w ramach tego projektu w ramach inicjatywy UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Badania te były wspierane przez CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (grant nr 18-0001-055-SC). Dodatkowego wsparcia udzielił również projekt CRB 6100; Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA, projekt Hatch 1020106; oraz National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) przyznane Georgiosowi Vidalakisowi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,08" Linia przycinarek sześciokątnychPowerCareFPRO07065Potrzebna do wymiany ostrzy.
Sprężarka powietrza o mocy 1 KM i pojemności 8 galonówCalifornia Air Tools8010Szybko schnące komory po wypłukaniu
Probówka do mikrowirówek o pojemności 1,5 mlGlobe Scientific111558BPrzechowuj próbkę po przetarciu strzykawkami
Zestaw strzykawek 10 mlRozwijająca się technologiaTE006-F1-10A-G1000-E1Materiał strzykawki jest cięty. Butelka 1 L z buforem tiocyjanianowym guanidyny. UWAGA - zawiera tiocyjanian guanidyny, wymagany serwis odpadów niebezpiecznych - nie mieszać z wybielaczem
12" LinijkaWestcott‎ 16012Do pomiaru żyłki trymera przed cięciem
12% Podchloryn soduHasa1041Dezynfekuje komory po przetworzeniu-20
C Insygniazamrażarki NS-CZ70WH0Przechowuj próbkę po przetworzeniu
Worki plastikowe 4" x 12"PlymorFP20-4x12-10Worki do przytrzymywania gałęzi podczas transportu. O-ringi mocują torbę do komory BTE, aby uszczelnić
6-calowy wacik bawełnianyPuritan806-PCLWacik do usuwania zatorów
7-galonowa torba do przechowywaniaHDX206152Zawiera roztwór podchlorynu sodu do dezynfekcji komór i wodę do płukania komór
Pistolet do przedmuchiwaniaJASTIND‎ JTABG103AKieruje powietrze do komór pod wysokim ciśnieniem
Black SharpieSharpie  S-19421Oznacz probówki o pojemności 1,5 ml, aby można było później zidentyfikować próbkę
Dozownik do butelekmarkiZ627569Regulowany dozownik do butelki do dozowania guandyny do strzykawki
Technologia komory BTEEevolving SolutionsTE002BB-A05-E1Służy do przetwarzania drewna pączkowego. Zawiera O-ringi, zauszny suwak, tłok suwakowy, zawór spustowy, pokrywę, zestaw ostrzy i narzędzie do usuwania zestawu ostrzy
Mydło do naczyń Dawn57445CTŚrodek powierzchniowy poprawiający przenikanie podchlorynu sodu do komory
Wyciąg z filtrem hepaScienceP5-36XT-A Wyciągz filtrem hepa (ASTS-030)  w celu ograniczenia ewentualnych zanieczyszczeń i ochrony przed wyciekami chemikaliów
Izolowany pojemniktransportowy z piankiPolarTech261/J50CIzolowany kontener transportowy do wysyłania próbek na lodzie po ich pobraniu
Fartuch laboratoryjnyRed KapKP14WH LN 46Fartuch laboratoryjny ograniczający możliwe zanieczyszczenia i chroniący przed wyciekami chemicznymi
LaptopMicrosoftSurfacez obsługą Wi-Fi do uruchamiania TES GUI. Potrzebny do wstępnej konfiguracji i zapewnia bardziej szczegółowe informacje na temat bazy przetwarzania tkanek
Telefon z obsługą NFC TelefonSamsungGalaxy S9do pobrania i używania aplikacji na telefon TES
Znacznik klipsa NFCTechnologia Evolving SolutionsTE005-Clip-E1Przykładowy tag, który można połączyć z drzewami. Stworzony do działania z aplikacją na telefon TES
Technologia NFC Collar TagEevolving SolutionsTE005-Collar-E1Tag przymocowany do drzewa. Stworzony do działania z aplikacją na telefon TES
Rękawice nitryloweUsa Scientific3915-4400Rękawice ograniczające ewentualne zanieczyszczenia i chroniące przed wyciekami chemikaliów
Nauszniki redukujące hałas3M90565-4DC-PSChroń uszy podczas pracy sprężarki powietrza i bazy do przetwarzania tkanek
Poliuretanowy wąż powietrzny odrzutowyFYPower‎ 510019Mocuje pistolet pneumatyczny do kompresora
Okulary bezpieczeństwaSolidworkSW8329-USOchrona oczu przed zagrożeniami chemicznymi i fizycznymi
Butelka z rozpylaczemJohnBeeB08QM81BJVWybielacz w sprayu do denatynacji powierzchni
Ekstraktor tkanek Technologia bazowaEwoluujące rozwiązaniaTE001-A-E1System do przetwarzania tkanek roślinnych. Do działania potrzebuje komór BTE lub LTE. W zestawie zasilający, adapter ostrza i klucz imbusowy 8/32"
wagi do przetwarzania tkanekEwoluujące rozwiązaniaTE003-A05-200g-01-E1Waga o masie 200 g o rozdzielczości 0,01, która łączy się z bazą do przetwarzania tkanek w celu wymuszenia zakresów masy i/lub powiązania wzorców masy z próbką. Zawiera wagę, zasilający, połączeniowy, uchwyt na strzykawkę 5 ml, osłonę powietrzną wieży 
WermikulitEasyGoProductsB07WQDZGRPPotrzebne do transportu odpadów niebezpiecznych (tiocyjanian guanidyny) za pomocą usługi utylizacji odpadów niebezpiecznych
Przecinak do drutuBoenfu‎ BOWC-06002-USNożyce do drutu do cięcia żyłki trymera
Air Technologia bazowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366(2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170(2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281(2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367(2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088(2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Tags

Citrus Budwood ProcessingPathogen DetectionBudwood Tissue ExtractorNucleic Acid ExtractionCitrus Virus DetectionHigh Throughput ScreeningPlant Tissue HomogenizationPCR AssaysPhloem Rich TissueMolecular Diagnostics

Related Articles