Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Podsumowanie

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Streszczenie

Nieleczony ubytek słuchu powoduje znaczne koszty dla globalnego systemu opieki zdrowotnej i pogarsza jakość życia poszczególnych osób. Odbiorczy ubytek słuchu charakteryzuje się skumulowaną i nieodwracalną utratą czuciowych komórek rzęsatych i nerwów słuchowych w ślimaku. Całe i niezbędne eksplantaty ślimaka są jednym z podstawowych narzędzi w badaniach słuchu do wykrywania utraty komórek rzęsatych i charakteryzowania mechanizmów molekularnych komórek ucha wewnętrznego. Wiele lat temu opracowano protokół izolacji ślimaka noworodków i chociaż z czasem został zmodyfikowany, nadal ma potencjał do poprawy.

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół izolacji i hodowli całych eksplantatów ślimaka noworodków w wielodołkowych komorach hodowlanych, który umożliwia badanie komórek rzęsatych i komórek neuronów spiralnych na całej długości ślimaka. Protokół został przetestowany przy użyciu eksplantatów ślimakowych od myszy i szczurów. Zdrowe eksplantaty ślimaka uzyskano w celu zbadania interakcji między komórkami rzęsatymi, komórkami neuronów spiralnych zwojów i otaczającymi komórkami podporowymi.

Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że upraszcza ona etapy hodowli organów bez uszczerbku dla jakości eksplantatów. Wszystkie trzy zwoje narządu Cortiego są przymocowane do dna komory, co ułatwia eksperymenty in vitro i kompleksową analizę eksplantatów. Podajemy kilka przykładów obrazów ślimakowych z różnych eksperymentów z żywymi i utrwalonymi eksplantatami, pokazując, że eksplantaty zachowują swoją strukturę pomimo narażenia na leki ototoksyczne. Ten zoptymalizowany protokół może być szeroko stosowany do integracyjnej analizy ślimaka ssaków.

Wprowadzenie

Większość przypadków odbiorczego ubytku słuchu jest spowodowana degeneracją czuciowych komórek rzęsatych, słuchowych komórek nerwowych i/lub synaps słuchowych¹. Ten proces zwyrodnieniowy w komórkach czuciowych jest postępujący i zwykle nieodwracalny, co prowadzi do utraty słuchu². Dlatego informacje o żywotności komórek czuciowych i zmianach w szlakach sygnałowych w warunkach stresu mają kluczowe znaczenie dla ochrony komórek przed uszkodzeniem, a tym samym utratą. Badanie eksplantatów ślimaka w hodowli pozwala na rekapitulację kompleksu tkankowego i utrzymanie prawidłowej sieci komórka-komórka, co umożliwia lepszy opis procesów sygnalizacyjnych. Aby ustalić eksperymentalne modele ototoksyczności, często stosuje się antybiotyk gentamycynę i chemioterapeutyk cisplatynę, ponieważ wiadomo, że mają one ototoksyczne skutki uboczne³.

Systemy hodowli in vitro eksplantatów ślimakowych były rozwijane i modyfikowane z biegiem czasu; jednak opis protokołu krokowego dla hodowli całych eksplantatów ślimakowych często nie jest dostępny w kilku publikacjach. Jeden z pierwszych protokołów wideo dla pierwotnej hodowli mysiego narządu Cortiego został opublikowany przez Parkera i wsp., w którym autorzy opisali etapy izolacji nabłonka czuciowego, hodowli na szklanych szkiełkach nakrywkowych oraz elektroporacji eksplantatów do eksperymentów transfekcji⁴. Wcześniej opublikowano również inny protokół z wykorzystaniem szkiełek nakrywkowych, w którym rozważano organizację struktury komórkowej w uchu wewnętrznym⁵. Alternatywny protokół wykorzystujący błonę Millicell do hodowli eksplantatów myszy w narządzie Cortiego i narządzie przedsionkowym został zgłoszony⁶. Te raporty wideo przyczyniły się do ulepszenia metody, ale nadal istnieją wyzwania, które należy rozwiązać. Aby rozwiązać szereg problemów wynikających ze stosowania szklanych szkiełek nakrywkowych i wkładek, niniejszy protokół ma na celu usprawnienie etapów hodowli narządów i hodowli narządów wysokiej jakości w celu uzyskania wiarygodnych danych. Osiąga się to poprzez zminimalizowanie bezpośredniego obchodzenia się z narządem podczas procedur eksperymentalnych i unikanie transferu narządu przed uzyskaniem obrazów o wysokiej rozdzielczości żywych i nieruchomych komórek.

Obecny protokół aktualizuje wcześniej opublikowane systemy hodowli in vitro i wprowadza kilka optymalizacji w izolacji narządu Cortiego i transferze do komór hodowlanych, a także integrację nowej komory szkiełkowej w celu poprawy warunków hodowli i dalszej analizy. Ten zoptymalizowany protokół zmniejsza ryzyko uszkodzenia narządu, które może wystąpić w przypadku stosowania szklanych szkiełek nakrywkowych podczas zmiany podłoża lub podczas przenoszenia narządu z szkiełek nakrywkowych lub błon do dalszej analizy^4,5^,6. Szkiełka nakrywkowe mają lepszy współczynnik odbicia niż plastikowe; Są jednak delikatne i mogą łatwiej pękać. Zastosowane tutaj komory wielodołkowe są przymocowane do szkiełka mikroskopowego, które doskonale nadaje się do hodowli narządów i obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Przenoszenie wyizolowanych narządów odbywa się za pomocą szpatułki, która pozwala na doprowadzenie narządu we właściwej orientacji i wsunięcie go do komory, zamiast przykładania siły pipetą, jak wcześniej zalecano^4,5,6.

Komory wielodołkowe pokryte poli-D-lizyną, które powinny zawierać wystarczającą ilość podłoża, ułatwiają przenoszenie organów i prawidłowe rozmieszczenie eksplantatów bez stosowania nacisku adhezyjnego i unikając nakładania się narządów, jak wspomniano wcześniej⁶. Ponadto przypadkowe nakładanie się narządów i nierówne struktury są rozwiązywane za pomocą konfokalnego stosu Z. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem różnych zastosowań, takich jak eksplantaty myszy i szczurów, eksplantaty narządu Cortiego i ślimaka, hodowla w pożywce zawierającej surowicę i bezsurowicy, oceny ototoksyczne i ogólne eksperymenty z odpowiedzią na leki. Eksplantaty ślimaka są montowane i inkubowane w komorach z dnem szkiełka nakrywkowego, co ułatwia przyleganie eksplantatów ślimaka do komór w celu optymalnego obchodzenia się z nimi podczas eksperymentów in vitro, obróbki końcowej eksplantatów oraz obrazowania żywych i utrwalonych eksplantatów ślimakowych. Wizualizacja całej długości narządu Cortiego i kwantyfikacja komórek rzęsatych są usprawnione. Ponadto oceny komórek podporowych, komórek neuronów spiralnych zwojów i neurytów są dokładne. Dlatego protokół ten może być wykorzystany do kompleksowej analizy komórek ślimakowych ssaków.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami w Kantonie Bazylea, Szwajcaria. Do eksperymentów wykorzystano postnatalne myszy C57BL/6JR, szczury Wistar i myszy z niedoborem STAT1 (mieszane C57BL/6-129/SvEv)⁷ w wieku 3-5 dni i dowolnej płci.

1. Powlekanie komór wielostudzienkowych

1. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną.
   1. W przypadku eksplantatów organów Cortiego przygotuj pożywkę zawierającą zmodyfikowaną pożywkę orła Dulbecco (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM HEPES i 30 U/ml penicyliny.
   2. W przypadku eksplantatów Cortiego i eksplantatów ślimaka przygotuj pożywkę zawierającą DMEM/F12, 1x suplement N2, 1x B27 minus przeciwutleniacze i 30 U/ml penicyliny.
2. Przygotować roztwór podstawowy poli-D-lizyny, dodając 10 ml wody z hodowli komórkowej do 5 mg poli-D-lizyny w okapie laminarnym. Końcowe stężenie poli-D-lizyny wynosi 0,5 mg/mL.
   UWAGA: Podwielokrotnić pozostałą zawartość roztworu podstawowego i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   1. Przygotować roztwory robocze poli-D-lizyny, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie.
3. Pokryj 8-dołkową komorę 150 μl/studzienkę roztworu roboczego poli-D-lizyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, pokryj 300 μl/studzienkę roztworu roboczego poli-D-lizyny.
4. Zassać roztwór za pomocą próżni lub pipetowania.
5. Przemyć 2x 200 μl sterylnej wody i raz 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej lub DMEM.
6. Do każdego dołka dodać 150 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, dodać 250 μl/studzienkę kompletnej pożywki hodowlanej.
7. Umieścić komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem eksplantatu.

2. Sekcja kości skroniowej

1. Zdezynfekuj stół operacyjny 70% etanolem i wysterylizuj wszystkie narzędzia w szklanym sterylizatorze mikrosferycznym.
2. Umieść sterylną szalkę Petriego o średnicy 60 mm na wiadrze z lodem.
3. Wlej kilka mililitrów 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i trzymaj na lodzie.
   UWAGA: Użyj 30 U/ml penicyliny w 1x PBS, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego.
4. Umieść sterylną podkładkę na sterylnej tacy i szybko odetnij głowę szczeniakowi nożyczkami operacyjnymi. Zanurz głowę w 70% etanolu na 5 sekund, jeśli zanieczyszczenie jest częstym zjawiskiem.
   UWAGA: Ten protokół został przetestowany na myszach i szczurach w wieku P3-P5. Tkanki ślimaka są trudniejsze do wypreparowania od starszych myszy i szczurów, a przeżywalność eksplantatów w hodowli jest ograniczona.
5. Umieść głowę zwierzęcia na sterylnej podkładce. Usuń żuchwę. Podnieś skórę i oderwij ją od czaszki.
6. Przytrzymaj czaszkę, umieszczając kleszcze w jamach oczodołu.
7. Ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie przeciąć w obszarze szwu koronalnego ostrym ostrzem skalpela, nie uszkadzając ślimaka.
   UWAGA: Unikaj wywierania zbyt dużego nacisku i unikaj ruchów skalpelem do przodu i do tyłu, ponieważ może to uszkodzić kość ślimakową, a tym samym przewód ślimakowy.
8. Ostrożnie wyjmij mózg z dwóch połówek czaszki.
9. Przenieść połówki czaszki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm za pomocą lodowatego PBS przygotowanego w kroku 2.3.

3. Izolacja ślimaka

1. Zlokalizuj ślimak w kości skroniowej pod mikroskopem. Umieść kleszcze w górnym kanale półkolistym.
2. Poluzuj otaczającą tkankę między ślimakiem a kością skroniową za pomocą strzykawki insulinowej (myszy) lub kleszczy (szczury).
3. Ostrożnie odciągnij kość skroniową od ślimaka, trzymając ślimak przymocowany do przedsionka z kością skroniową. Upewnij się, że ślimak jest wolny od otaczających tkanek przed odsunięciem kości skroniowej na bok.
   UWAGA: Przyłożenie zbyt dużej siły spowoduje uszkodzenie przewodu ślimakowego.
4. Trzymaj ślimak w ustalonej pozycji, a drugą ręką ostrożnie wyjmij chrzęstną torebkę ślimakową. Ostrożnie włóż końcówki kleszczyków w okolicę wierzchołka lub między zwojami (widocznymi jako biała linia) i wyjmij kapsułkę kawałek po kawałku. Odsłoń przewód ślimakowy.
5. Ostrożnie umieść kleszcze pod ślimakiem i odłącz go od narządu przedsionkowego i kości skroniowej.
6. Przenieść ślimak do nowego naczynia o średnicy 60 mm zawierającego lodowaty PBS.
7. Dostosuj powiększenie mikroskopu, aby lepiej uwidocznić eksplantaty.
8. Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami dla narządu eksplantatów Cortiego:
   1. Przytrzymaj narząd u podstawy za pomocą kleszczy. Delikatnie usuń przewód ślimakowy, chwytając go kleszczami w okolicy haka podstawy.
   2. Odwiń przewód ślimakowy od modiolus, nie rozrywając go.
   3. Ostrożnie usuń więzadło spiralne z prążkiem naczyniowym, przytrzymując narząd u podstawy i odciągając je.
      UWAGA: Separację tkanek można również osiągnąć, przytrzymując obszar wierzchołkowy zamiast obszaru podstawowego. Może to być pomocne podczas preparowania narządów szczurów lub starszych szczeniąt myszy (>P5).
   4. Ostrożnie usuń membranę Reissnera, trzymając narząd u podstawy i ściągając go kawałek po kawałku.
      UWAGA: Jest to krok opcjonalny, ponieważ membrana Reissnera nie przeszkadza w pozyskiwaniu obrazu.
9. Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami dla eksplantatów ślimaka:
   1. Odłącz spiralny ganglion od kostnej blaszki spiralnej za pomocą strzykawki insulinowej (myszy) lub kleszczy (szczury).
   2. Delikatnie rozwiń modiolus podczas odłączania.
      UWAGA: Eksplantaty można podzielić na dwie części dla lepszej obsługi.
   3. Chwyć obszar haka kleszczami.
   4. Ostrożnie usuń więzadło spiralne z naczyniami rozstępu, ściągając je.
   5. Ostrożnie usuń membranę Reissnera, trzymając narząd u podstawy i ściągając go kawałek po kawałku.
      UWAGA: Ten krok jest zalecany, ponieważ błona Reissnera zwykle fałduje się i zakrywa włókna neuronów, a zatem może wpływać na eksperymenty.

4. Hodowla eksplantatów ślimaka

1. Przenieść eksplantaty z płytki Petriego do komór wielodołkowych. Podnieś eksplantaty komórkami rzęsatymi skierowanymi do góry za pomocą szpatułki laboratoryjnej. Dołącz kilka mikrolitrów 1x PBS, aby zapobiec przywieraniu próbek do szpatułki.
   UWAGA: Poważnie uszkodzone eksplantaty przykleją się do szpatułki.
2. Pozwól eksplantatom wsunąć się z szpatułki do komory, delikatnie machając szpatułką w podłożu. Umieść jeden eksplant w studzience szkiełka z 8-dołkową komorą.
   UWAGA: Jeśli eksplant przyklei się do szpatułki, przytrzymaj szpatułkę w podłożu i użyj kleszczy, aby odłączyć eksplantaty. Zawsze umieszczaj kleszcze na wewnętrznej granicy eksplantatu (z dala od komórek rzęsatych).
3. Sprawdź pod mikroskopem, czy eksplantaty zostały przeniesione we właściwej orientacji i umieszczone w środku studzienek.
   UWAGA: Nieprawidłowo zorientowane eksplantaty z komórkami rzęsatymi skierowanymi w dół mają tendencję do pokazywania kształtu litery U skierowanym w górę wzdłuż ich szerokości. Popraw ich orientację, przesuwając eksplantaty do rogów komór (dostępnych jest więcej podłoża) i skieruj je tak, aby się obracały.
4. Usunąć 80 μl pożywki za pomocą pipety o pojemności 100 μl i wyrzucić ją.
5. Sprawdź pod mikroskopem, czy widoczne są komórki rzęsate i komórki neuronów spiralnego zwoju. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby delikatnie rozsunąć niektóre zachodzące na siebie tkanki.
6. Usuń resztę podłoża i odczekaj ~10 s.
7. Odpipetować podłoże z powrotem. Dodaj jedną lub dwie krople pożywki obok eksplantatu i resztę pożywki w pewnej odległości od eksplanta, aby zapobiec oderwaniu się eksplantatu.
   UWAGA: Nawet jeśli eksplantaty są przymocowane do komór, pożywkę należy zawsze dodać jako pierwszą, pipetując jedną lub dwie krople obok eksplantatów. W ten sposób eksplantaty nie zostaną podniesione po dodaniu pozostałych kompletnych pożywek.
8. Umieść komorę z powrotem w inkubatorze i inkubuj przez 2 godziny, aby narządy mogły mocno przymocować się do dna komory.
9. Usuń pożywkę i ostrożnie dodaj 300 μl świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki za pomocą pipety o pojemności 100 μl lub 200 μl. Nie używać pipety o pojemności 1 ml.
   UWAGA: Jeśli pożądana jest obróbka wstępna, po 2 godzinach od utrwalenia należy dodać 300 μl kompletnego podłoża zawierającego substancję będącą przedmiotem zainteresowania. Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, należy użyć do 500 μl/studzienkę.
10. Umieść komory z powrotem w inkubatorze.

5. Test czynników ototoksycznych

1. Pozostaw eksplantaty na noc, aby przystosować się do warunków hodowli i zregenerować się.
2. Przygotuj różne stężenia środków ototoksycznych, aby znaleźć odpowiednie stężenie, aby ustalić model ototoksyczny z około 50% utratą komórek włosa. Stosować od 50 μM do 250 μM dla gentamycyny i od 40 μM do 320 μM dla cisplatyny. Roztwory cisplatyny należy przygotować na świeżo i chronić je przed światłem.
3. Usuń pożywkę i ostrożnie dodaj 300 μl pożywki zawierającej pożądany lek ototoksyczny.
4. Inkubować eksplantatyny z gentamycyną i cisplatyną w temperaturze 37 °C przez 24 godziny do 48 godzin w celu określenia przeżywalności komórek rzęsatych.
   UWAGA: Stężenia leku i czas ekspozycji dobierane są w zależności od celu badania. Konserwacja eksplantatów była tu testowana do 72 godzin. Nie należy stosować surowicy, jeśli planuje się przeprowadzenie długotrwałego posiewu.
5. Postępuj zgodnie z następną sekcją, aby wybarwić komórki ślimaka.

6. Utrwalenie i immunofluorescencja

1. Wyrzuć pożywkę pod koniec eksperymentu i natychmiast umyj eksplantaty 200 μl podgrzanego 1x PBS.
2. Utrwal eksplantaty za pomocą 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut pod wyciągiem chemicznym.
   UWAGA: PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną; zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed pierwszą pracą z PFA.
3. Umyj eksplantaty dwukrotnie 200 μl 1x PBS. Przechowywać eksplantaty w 1x PBS w temperaturze 4 °C na wypadek konieczności odroczenia procedur barwienia.
4. Przygotować roztwór przepuszczalny składający się z 1x PBS i 1%-5% Triton-X100.
5. Wyrzuć 1x PBS, dodaj 200 μl roztworu przepuszczalnego i inkubuj eksplantaty przez 15 minut.
6. Przygotuj roztwór blokujący.
   1. W przypadku eksplantatów narządów Cortiego przygotuj roztwór blokujący składający się z 1x PBS, 10% normalnej surowicy koziej (NGS, dla przeciwciał drugorzędowych kóz lub innej surowicy tego samego gatunku co przeciwciała drugorzędowe). Alternatywnie, użyj 1%-5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), jeśli komórki są barwione tylko falloidyną.
   2. W przypadku eksplantatów ślimakowych przygotuj roztwór blokujący składający się z 1x PBS, 10% NGS i fragmentu Fab (Fab fragment kozio-anty mysi IgG H + L, rozcieńczenie 1:200), jeśli używasz mysich przeciwciał pierwszorzędowych (np. mysiego anty-TuJ1) do barwienia komórek spiralnych zwojów.
7. Dodać 200 μl roztworu blokującego i inkubować eksplantaty przez 1 godzinę.
8. Wyrzuć roztwór blokujący. Do eksplantatów inkubowanych z fragmentem Fab dodaj 200 μl 4% PFA i inkubuj przez 5 minut.
9. Myj eksplantaty 1x PBS przez 5 min.
10. Przygotuj roztwór przeciwciała składający się z 1x PBS, 5% NGS i 0,1%-0,25% Triton-X100.
11. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze przeciwciała - MYO7A (ab3481 w rozcieńczeniu 1:500 lub MYO7A 138-1 w 1:100) - aby oznaczyć komórki rzęsate i TuJ1 (1:400) w celu oznaczenia neuronów spiralnego zwoju.
    UWAGA: Jeśli komórki rzęsate są znakowane tylko falloidyną, rozcieńczyć falloidynę w stosunku 1:150 w 1x PBS, inkubować przez 40 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej i przejść do kroku 6.22.
12. Należy uwzględnić kontrolę niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego poprzez pominięcie przeciwciała pierwszorzędowego.
13. Dodać 170 μl roztworu przeciwciała z przeciwciałem pierwszorzędowym do odpowiedniego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (40-60 obr./min).
14. Myj eksplantaty 4x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.
15. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze przeciwciała (np. kozie anty-królicze Alexa Fluor 488 lub kozie anty-mysie Alexa Fluor 568 IgG w rozcieńczeniu 1:500).
16. Dodać 170 μl roztworu przeciwciała z przeciwciałem drugorzędowym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Od tego kroku chroń eksplantaty przed długotrwałym nasłonecznieniem.
17. Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.
18. Przejdź do następnego kroku sekwencyjnego podwójnego etykietowania eksplantatów. Inkubować z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym będącym przedmiotem zainteresowania (np. MYO7A dla komórek rzęsatych) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (40–60 obr./min). Alternatywnie, inkubować z falloidyną (1:150) przez 40 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej i przejść do kroku 6.22.
    UWAGA: Wykonaj sekwencyjne znakowanie, jeśli przeciwciała pierwszorzędowe pochodzą od tego samego gatunku gospodarza. Wykonaj znakowanie falloidyny na końcu, aby uzyskać immunofluorescencję multipleksową.
19. Myj eksplantaty 4x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.
20. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze przeciwciała (np. kozie anty-królicze Alexa Fluor 488 lub kozie anty-mysie Alexa Fluor 568 IgG w rozcieńczeniu 1:500).
21. Dodać 170 μl przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
22. Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.
23. Przygotować roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy DAPI w stosunku 1:10 w celu przygotowania roztworów roboczych o stężeniu 0,1 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Pomiń krok 23 i przejdź do kroku 26, jeśli używany jest nośnik montażowy zawierający DAPI.
24. Rozcieńczyć roztwór roboczy DAPI w stosunku 1:100 w 1x PBS i inkubować eksplantaty z 200 μl roztworu DAPI przez 5 minut.
25. Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.
26. Wyjmij 1x PBS tak bardzo, jak to możliwe, aby dno komory wyschło. Nie pozwól, aby eksplant wyschł.
27. Odczekaj 2-5 s i dodaj jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na eksplant.
    UWAGA: Medium mocujące na eksplantacie pozostanie na swoim miejscu ze względu na napięcie powierzchniowe. Można użyć utwardzającego medium montażowego.
28. Przechowywać komory w temperaturze 4°C do czasu wykonania obrazowania.

7. Immunofluorescencja żywych komórek z eksplantatów

1. Użyć wyizolowanych eksplantatów po całonocnej inkubacji.
2. Usunąć pożywkę i ostrożnie dodać 300 μl pożywki zawierającej 125 μM cisplatyny.
3. Inkubuj eksplantaty przez 18 godzin, aby zmierzyć ponadtlenek mitochondriów w żywych eksplantatach.
4. Wyrzucić pożywkę pod koniec ekspozycji na lek.
5. Dodać 300 μl przepuszczalnej sondy w celu wykrycia komórkowego ROS (np. 250 nM mitohydroetydyny) i/lub kaspazy-3 (np. 2 μM peptydu DEVD sprzężonego z barwnikiem wiążącym kwas nukleinowy).
6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
7. Delikatnie umyj eksplantaty dwukrotnie 200 μl ciepłego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub odpowiedniego buforu.
8. Zobrazuj komórki w ciągu 2 godzin ze wzbudzeniem fluorescencyjnym przy 400 nm i detekcją emisji przy 590 nm.
9. Wyrzuć pożywkę pod koniec eksperymentu i natychmiast umyj eksplantaty 200 μl podgrzanego 1x PBS.
10. Napraw eksplantaty i wybarwij komórki ślimaka zgodnie z powyższym opisem.

8. Wizualizacja za pomocą obrazowania konfokalnego

1. Zobrazuj eksplantaty za pomocą mikroskopu wyposażonego w jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem lub mikroskopu konfokalnego wyposażonego w jednostkę konfokalną ze skaningiem punktowym.
2. Uzyskuj obrazy za pomocą obracającego się dysku z obiektywem powietrznym o powiększeniu 20x (apertura numeryczna: 0,75) do zliczania komórek. Alternatywnie, uzyskaj obrazy za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem powietrznym 40x (apertura numeryczna: 0,95) lub obiektywem olejowym 100x (apertura numeryczna: 1,45), aby uwidocznić i policzyć synapsy lub zobrazować stereocilia.
   UWAGA: Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego kanału, aby uniknąć nadmiernego i niepełnego nasycenia obrazów. Zastosuj te same ustawienia do wszystkich eksplantatów w tym samym eksperymencie.
3. Skonfiguruj mikroskop, aby uchwycić obraz 3D całego eksplantatu ślimakowego za pomocą obiektywu pneumatycznego 20x, stosu z i narzędzi do automatycznego szycia. Użyj 3 x 3 sąsiednich pól z 15% zachodzeniem na siebie dla eksplantatów myszy i 4 x 4 sąsiednie pola do zszycia eksplantatów szczurów.
4. Dostosuj obrazy za pomocą oprogramowania mikroskopu lub bezpłatnego oprogramowania FIJI o otwartym kodzie źródłowym⁸.
   UWAGA: Dekonwolucja, technika przetwarzania obrazu, może być stosowana do obrazów konfokalnych w celu wyostrzenia ich kontrastu i rozdzielczości^9-11.

Wyniki

Obecny protokół został przetestowany na ślimaku nowonarodzonych myszy i szczurów. W artykule przedstawiono zdjęcia eksplantatów z różnych eksperymentów. Eksplantaty narządu Cortiego były wystawione na działanie gentamycyny lub cisplatyny i widoczna była utrata komórek włosa. Eksplantaty narządu Cortiego zachowały swoją strukturę i całkowitą długość zarówno w warunkach normalnych, jak i stresowych (Ryc. 1 i Ryc. 2). Komórki rzęsate, które przeżyły na całej długości eksplantatów szczurów wcześniej wystawionych na działanie cisplatyny, były indywidualnie wykrywalne (Ryc. 1). Oprócz wykrywania komórek rzęsatych, które przeżyły, wykryto również komórki rzęsate ulegające apoptozie (Ryc. 2). Takie podejście ułatwia wizualizację i zliczanie ocalałych komórek, co można wykonać przy użyciu podejścia głębokiego uczenia, jak opisano wcześniej¹². Możliwe było również wykrycie procesów biologicznych w żywych komórkach ślimaka za pomocą odpowiednich sond przepuszczalnych dla komórek (Rysunek 3).

W przypadku eksplantatów ślimakowych zawierających neurony spiralnego zwoju, eksplantaty mogą być pocięte na dwie części, lub obszar wierzchołkowy może zostać odcięty, aby zapewnić lepsze warunki hodowli. W tym przypadku zdecydowaliśmy się oddzielić obszar wierzchołka, ponieważ jest on mniej podatny na stres. Rysunek 4 pokazuje podstawowe i przyśrodkowe obszary eksplantatów ślimaka. Wykryto komórki rzęsate znakowane markerem komórek rzęsatych MYO7A. Podobnie zidentyfikowano zdrowe i uszkodzone spiralne ciała komórek zwojowych i neuryty znakowane markerem neuronalnym TuJ1. Analizę obszarów zwojów spiralnych można przeprowadzić ręcznie lub za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak FIJI z wtyczką NeuronJ do śledzenia neurytów¹³ lub rozszerzeniami, takimi jak TrackMate i Cellpose do segmentacji morfologicznej^14,15. Dokładniejsze badanie eksplantatów myszy ujawniło wysoką rozdzielczość komórek ślimakowych i stereocilia komórek rzęsiastych (Ryc. 5).

Rysunek 1: Eksplantaty narządu Cortiego od szczurów narażonych na działanie gentamycyny. Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) eksplantatów (A) kontrolnych i (B) naświetlonych gentamycyną (200 μM przez 24 godziny). Komórki rzęsate są znakowane falloidyną i można je uwidocznić na całej długości ślimaka. Dla lepszej ilustracji obraz jest w odcieniach szarości. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem z obiektywem 20x (apertura numeryczna: 0,75). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Eksplantaty narządu Cortiego u myszy wystawionych na działanie cisplatyny. Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) eksplantatów (A) kontrolnych i (B) naświetlonych cisplatyną (160 μM przez 48 godzin). Komórki rzęsate są znakowane falloidyną (kolor czerwony), a apoptotyczne komórki rzęsate są znakowane fluorescyną. Obrazy uzyskano za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i obiektywu 20x (apertura numeryczna: 0,75). Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Eksplantaty organu Cortiego z eksperymentów obrazowania na żywo. Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) eksplantatów od myszy typu dzikiego pokazujące (A) eksplantaty kontrolne i (B) eksplantaty z ekspozycją na cisplatynę 125 μM przez 18 godzin. Komórki rzęsate są znakowane mitohydroetydyną i kaspazą-3. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i obiektywu 20x (apertura numeryczna: 0,75). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Eksplantaty ślimakowe myszy z nokautem STAT1 wystawione na działanie cisplatyny. Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) (A) eksplantatów kontrolnych i (D) eksplantatów wystawionych na działanie cisplatyny 40 μM przez 48 godzin. Ciała komórek rzęsatych są znakowane przeciwciałem MYO7A (kolor zielony), a spiralne komórki zwojowe przeciwciałem TuJ1 (kolor czerwony) i znakowanie jądrowe DAPI (kolor niebieski). Obrazy uzyskano za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i obiektywu 20x (apertura numeryczna: 0,75) z dodatkowym zoomem 2,15 (B,C,E,F). Podziałka liniowa = (B,C,E,F) 50 μm i (A,D) 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mysi organ eksplantatów Cortiego. (A-D) Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) pełnometrażowych eksplantatów od myszy typu dzikiego. Panie przewodniczący, panie i panowie! Eksplantaty znakowano przeciwciałem MYO7A, falloidyną i znakowaniem jądrowym DAPI. (B) W powiększonym przeglądzie ciała komórkowe komórek rzęsatych oznaczone przeciwciałem MYO7A (kolor zielony) są wyraźnie widoczne. (C,D) Falloidyna znakuje stereorzęski i naskórek komórek rzęsatych. Eksplantaty były oznaczone falloidyną. (D) W powiększonym przeglądzie, zdekonfanowane obrazy pojedynczych stereocilii wewnętrznych komórek rzęsatych są dobrze zidentyfikowane (dolny rząd), podczas gdy pojedyncze zewnętrzne stereorzęski komórek rzęsatych są trudniejsze do nakreślenia (górny rząd). Obrazy w panelach A i C uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem z obiektywem 20x (apertura numeryczna: 0,75). Obraz w panelu B został uzyskany tym samym mikroskopem, ale za pomocą obiektywu pneumatycznego o powiększeniu 40x (apertura numeryczna: 0,95). Obraz w panelu D został uzyskany za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i 100-krotnego obiektywu olejowego (apertura numeryczna: 1,45) z dodatkowym zoomem 3,46. Skany zostały uśrednione cztery razy na sekcję XY, a rozmiar piksela wynosił 0,02 μm. Podziałka = (D) 3 μm, (B) 100 μm i (A,C) 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Celem aktualizacji tego protokołu było usprawnienie etapów od izolacji eksplantatów do obrazowania żywych i utrwalonych komórek ślimaka. Ulepszyliśmy niektóre kroki podczas izolacji i wprowadziliśmy kilka innowacyjnych narzędzi w celu ustanowienia wydajnego i płynnie działającego protokołu uzyskiwania wysokiej jakości eksplantatów. Opisana metoda jest zoptymalizowanym protokołem z poprzednich raportów ^4,5. Ponadto w niektórych obecnych badaniach brakuje stopniowej aktualizacji protokołu. Dzięki uproszczonym etapom hodowli eksplantatów, protokół ten zapewnia łatwą obsługę dobrze zachowanych eksplantatów, co jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych danych. Wprowadzenie komór wielodołkowych z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym do eksplantatów ucha wewnętrznego poprawia przyczepianie narządów i zachowanie nienaruszonych eksplantatów. W tym miejscu przedstawiamy kilka przykładów eksperymentów w warunkach stresowych, aby wykazać, że narządy w hodowli utrzymują swoją organizację komórkową pomimo utraty komórek rzęsatych i uszkodzenia neurytów.

Jednym z wyzwań związanych z hodowlą narządów ucha wewnętrznego jest unikanie odrywania się i unoszenia narządów, ponieważ wpływa to na integralność eksplantatów, odpowiedź na leczenie i późniejsze badania. Wcześniej eksplantaty hodowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych ^4,5. Chociaż hodowla na powierzchniach szklanych wydaje się być dobrą alternatywą, powlekanie szkła jest czasochłonne, a same szkiełka nakrywkowe są kruche i delikatne. Alternatywny protokół wykorzystujący hodowlę komórek Millicell próbuje rozwiązać ten problem⁶. Jednak przecięcie i przeniesienie membrany z eksplantatami wydaje się być delikatnym krokiem w tym protokole. Ponadto eksplantaty mogą ulec uszkodzeniu podczas montażu i uszczelniania szkiełka nakrywkowego. W proponowanym przez nas podejściu, po przeniesieniu eksplantatów do komór pokrytych poli-D-lizyną i umieszczeniu we właściwej pozycji, nie jest wymagane dalsze przenoszenie ani pokrywanie szkiełkami nakrywkowymi. Kolejną zaletą tego protokołu jest zastosowanie komór z cienkim, przepuszczalnym dla gazów polimerowym szkiełkiem nakrywkowym, które zapewnia optymalne warunki hodowli eksplantatów narządowych. Polimer ten ma właściwości optyczne podobne do szkła, dzięki czemu nadaje się do obrazowania komórek w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.

Dodanie surowicy do pożywki jest stosowane w większości protokołów hodowli komórek i tkanek, w tym w hodowli eksplantatów ucha wewnętrznego z 1%-10% FBS 4,5,6,16. Obecność surowicy wpływa na warunki hodowli w eksperymentach; Dlatego w niektórych sytuacjach preferowana jest hodowla bez surowicy. Brak surowicy w hodowli eksplantatów ślimaka zastąpiono albo przez dodanie N2 do DMEM, albo przez dodanie N2 do pożywki Neurobaseal-A ^5,6. W związku z tym przetestowaliśmy warunki hodowli eksplantatów z surowicą i bez. W obu przypadkach komórki ucha wewnętrznego były niezbędne i reagowały na warunki ototoksyczne. Testowaliśmy te warunki przez 72 godziny, ale eksplantaty mogą być utrzymywane w kulturze jeszcze dłużej, zwłaszcza gdy są inkubowane z pożywką bez surowicy wraz z N2, B27 i czynnikami wzrostu, jak sugerowano w innych badaniach ^5,16.

Oprócz ogólnych krytycznych etapów izolacji eksplantatów ucha wewnętrznego, takich jak czas trwania izolacji narządu i zastosowany antybiotyk, w tym protokole znajdują się również pewne krytyczne kroki, które są jednak możliwe do opanowania. Jednym z krytycznych etapów tej metody jest objętość pożywki, która pozostaje w komorze po wprowadzeniu narządu. Zostało to zoptymalizowane, aby utrzymać eksplantaty przy życiu i przytwierdzone do dolnej powierzchni. Kolejny krytyczny krok jest związany z czasem inkubacji wymaganym do przymocowania eksplantatów do dna komory. Czas inkubacji dłuższy niż 2 godziny z kilkoma mikrolitrami pożywki może wpłynąć na zdrowie eksplantatów. Można również stosować krótsze czasy inkubacji, takie jak 1 godzina, o ile zachowa się ostrożność, aby nie odłączyć eksplantatów. Kolejnym ważnym aspektem są pozostałości poli-D-lizyny. Należy ściśle przestrzegać etapów płukania poli-D-lizyny, ponieważ pozostałości soli bromkowej poli-D-lizyny mogą być toksyczne dla komórek. Po dokładnym wykonaniu etapów mycia, powłoka poli-D-lizyną ułatwia płynne przyleganie eksplantatów do komór, dzięki czemu można skorygować położenie, zanim zostaną one mocno przymocowane do dna komory.

Jednym z ograniczeń tej metody jest obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii pionowej. Może to być ważna kwestia dla laboratoriów z odwróconymi mikroskopami. Szkiełka podstawowe z wyjmowanymi komorami silikonowymi mogą być używane do mikroskopii pionowej i odwróconej; jednak najpierw należy przetestować nasze warunki powlekania poli-D-lizyną. Kolejnym ograniczeniem jest przechowywanie komór, ponieważ wkładki nie są wyjmowane, a łączna wysokość jednej komory z pokrywą wynosi blisko 11 mm w porównaniu do 1 mm wysokości standardowego szkiełka mikroskopowego. Jednak komora 8-dołkowa zajmuje mniej miejsca niż płytki 4-dołkowe sugerowane przed¹⁶.

Prezentujemy tutaj obrazy uzyskane za pomocą dwóch mikroskopów. Podczas gdy punktowy skaningowy mikroskop konfokalny zapewnia obrazy tkanek o wysokiej rozdzielczości dzięki cienkiemu przekrojowi optycznemu, mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem zapewnia szybszy czas obrazowania z dobrą rozdzielczością. Stereocilia wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC) i zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC) są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponieważ stereorzęski IHC są większe niż u OHC, zostały one wielokrotnie i dobrze uwidocznione w tej pracy. W przypadku stereocilii OHC inne alternatywne mikroskopy mogą poprawić wizualizację, takie jak mikroskopia superrozdzielcza (SRM). Obrazy eksplantatów uzyskane za pomocą mikroskopu z wirującym dyskiem są wystarczające do łatwej integracji automatycznego zliczania komórek rzęsatych przy użyciu podejścia opartego na głębokim uczeniu¹². Co więcej, krótki czas akwizycji jest ważny dla eksperymentów z żywymi komórkami i tkankami. Ponadto protokół ten nie ogranicza się do eksplantatów ślimaka u noworodków. Dzięki pewnym optymalizacjom można również hodować inne eksplantaty, takie jak narządy przedsionkowe lub tkanki embrionalne.

Kwantyfikacja komórek ślimaka, takich jak komórki rzęsate i neurony, in vitro jest ważna dla oceny żywotności komórek, a tym samym odsetka uszkodzonych lub utraconych komórek. Badania szlaków sygnałowych i funkcji komórek pomagają odkryć mechanizmy śmierci i przeżycia. Badania embrionalnych i noworodkowych tkanek ślimaka są przydatne do badania etapów rozwojowych ślimaka. W związku z tym protokół ten pomoże zoptymalizować badania in vitro eksplantatów ucha wewnętrznego, na przykład w celu ustanowienia modeli ototoksycznych, zbadania etapów rozwojowych, oceny szlaków sygnałowych i przeprowadzenia badań przesiewowych leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 ml polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej czystości 17 x 120 mm styl	FALCON	352096
45° Kleszcze kątowe	Fine Science Tools	11251-35
50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa 30 x 115 mm	styl FALCON	352070
Medium montażowe zapobiegające blaknięciu	VECTASHIELD	H-1000
Alexa Fluor 568 falloidyna	Thermofisher	2151755
Anti-beta III Przeciwciało tubulinowe [TUJ-1]	Abcam	ab14545
Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI	VECTASHIELD	H-1200
Anty-miozyna VII królik poliklonalny	Abcam	ab3481
B-27 Suplement (50x), bez przeciwutleniaczy	Thermofisher	10889038
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej 23	Swann Moiton	210
CellEvent™ Kaspaza-3/7 Zielony odczynnik detekcyjne	Thermofisher	C10723
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX	Thermofisher	31331028
Podwójne szpatułki, jedna zakrzywiona końcówka	VWR	RSGA038.150
Alkohol etylowy 70% V/V 1,000 ml	bichsel	160 0 106 00
Surowica bydlęca, certyfikowana	Thermofisher	16000036
Roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu przygotowany w PBS	Thermofisher	201255309/201255305
Źródło zimnego halogenowego światła o wysokiej intensywności	Intralux®	5100
Huygens Professional wersja 21.10	Scientific Volume Imaging
ibidi µ-Slide 8 well	ibidi	80826
	LEICA	M80
	LEICA	MS5
MitoSOX™ Czerwony mitochondrialny wskaźnik ponadtlenkowy do obrazowania żywych komórek	Suplement Thermofisher	M36008
N2 (100x)	Termofisher	17502048
mikroskop Nikon Eclipse Ti z jednostką konfokalną Yokogawa CSU-W1 z wirującym dyskiem i kamerą Photometrics Prime 95B.	Mikroskop NIKON
Nikon Eclipse Ti z punktową jednostką konfokalną A1	NIKON
	Narzędzia do nauki o nauce	14005-16
Nożyczki operacyjne	Fine Science Tools	14088-10
Pęseta operacyjna	Fine Science Tools	11008-15
PBS pH 7,2 (1x), 500mL	Thermofisher	20012-019
Penicylina	Sigma-Aldrich	P3032
BROMOWODOREK POLI-D-LIZYNY MOL WT GT 30	Sigma-Aldrich	P7405
Rękojeść skalpela #4	Fine Science Tools	10004-13
Steri 250 Drugi sterylizator	Simon Keller AG&	nbsp; 031100
Sterylizator, granulki środka osuszającego	Simon Keller AG	31120
Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm	FALCON	353802
Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm	FALCON	353004
Trito  X-100	Sigma	T9284
Niekonwencjonalne badania rozwojowe miozyny-VIIa	Bank hybrydoma	138-1s
WFI do hodowli komórkowych [-] Przeciwbakteryjny, 500 ml	Thermofisher	A12873-01