Artykuł metodologiczny

Immunocytochemiczna wizualizacja białek z komórek cyjanobakteryjnych z wysoką autofluorescencją fikoerytryny i fikourobiliny

DOI:

10.3791/65168

⸱

15 września 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, The Czech Academy of Sciences, 2Japan Fisheries Research and Education Agency, 3National Marine Fisheries Research Institute, 4Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wizualizację i kwantyfikację określonego białka w komórkach na poziomie komórkowym dla cyjanobakterii zawierającej fikoerytrynę, Crocosphaera watsonii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany jest protokół wizualizacji i kwantyfikacji specyficznego białka w komórkach na poziomie komórkowym dla morskiego cyjanobakterii Crocosphaera watsonii, kluczowego pierwotnego producenta i utrwalacza azotu w oligotroficznych oceanach. Jednym z wyzwań stojących przed morskimi autotroficznymi utrwalaczamiN2 (diazotrofami) jest odróżnienie sygnałów fluorescencyjnych pochodzących z sondy od autofluorescencji. C. watsonii został wybrany tak, aby reprezentował cyjanobakterie zawierające chlorofil, fikoerytrynę i fikourobilinę. Protokół pozwala na prostą i półilościową wizualizację białek C. watsonii na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając badanie produkcji białek w różnych warunkach środowiskowych w celu oceny aktywności metabolicznej docelowych cyjanobakterii. Ponadto metody utrwalania i przenikania są zoptymalizowane w celu wzmocnienia sygnałów fluorescencyjnych z białek docelowych w celu odróżnienia ich od autofluorescencji, zwłaszcza od fikoerytryny i fikourobiliny. Wzmocniony sygnał można zobrazować za pomocą konfokalnej lub szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo intensywność fluorescencji została częściowo określona ilościowo za pomocą oprogramowania Fidżi. Ten proces analizy pojedynczej komórki umożliwia ocenę różnic między komórkami w zakresie określonej zawartości białka. Protokół może być wykonywany w dowolnym laboratorium nauk przyrodniczych, ponieważ wymaga tylko standardowego sprzętu i można go również łatwo dostosować do innych komórek cyjanobakterii zawierających fikoerytrynę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologiczna zmienność między komórkami (powszechnie określana jako "heterogeniczność") w aktywności metabolicznej w mikroorganizmach, w tym cyjanobakteriach, została udokumentowana przez badania nad kulturami klonów1,2,3,4. Ta niejednorodność obejmuje różnorodne działania metaboliczne, takie jak podział komórek5, asymilacja węgla6,7,8 i asymilacja azotu9,10. Na przykład ostatnie badania wykazały, że aktywność wiązania N2 u kolonialnych cyjanobakterii C. watsonii i C. subtropica (Cyanothece) wykazuje zmienność na poziomie pojedynczej komórki, będąc obecnym w subpopulacjach komórek, podczas gdy nieobecnym w innych w społeczności. Warto zauważyć, że działania związane z wychwytem azotu lub wiązaniem N2 wykazują również zmienność między komórkami in situ11,12,13. Wyniki te zostały potwierdzone analizami stabilnych izotopów 15N przeprowadzonymi za pomocą spektrometrów mas o stosunku izotopów (NanoSIMS)14,15. Jednak pomimo tego, że NanoSIMS oferuje nowatorską drogę analizy składu izotopowego na poziomie poszczególnych komórek, jego zastosowanie pozostaje ograniczone ze względu na złożoność techniczną i koszty.

Alternatywnym podejściem do obserwacji wewnątrzkomórkowej heterogeniczności w aktywności metabolicznej jest immunodetekcja. Wcześniejsze doniesienia wykazały immunodetekcję nitrogenazy w poszczególnych komórkach, ale stanowi to wyzwanie ze względu na autofluorescencję emitowaną przez ich pigmenty fotosyntetyczne16,17,18. Sinice morskie, szczególnie te przystosowane do życia w wodach oceanicznych, takie jak główne diazotrofy oceaniczne C. watsonii i Trichodesmium, zawierają znaczne ilości fikobilin, które emitują autofluorescencję na krótszych falach: fikoerytryna i fikourobilin19. Aby obejść tę autofluorescencję, fluorochromy emitujące niebieski kolor ze wzbudzeniem UV są preferowane w badaniach nad cyjanobakteriami16,20,21. Jednak ta strategia nie zawsze przynosiła sukcesy, ponieważ komórki traktowane wyłącznie przeciwciałami pierwszorzędowymi emitowały silną autofluorescencję od niebieskiej do niebieskawo-żółtej pod wpływem wzbudzenia UV20,21. Podjęto wysiłki w celu złagodzenia tego problemu, poddając komórki ekspozycji na światło niebieskie lub UV przed obserwacją i stosując półprzewodnikowe nanokryształy22. W niniejszym badaniu zastosowano inną strategię, która wzmacnia sygnały fluorescencji białek przy użyciu systemu wzmacniania sygnału tyramidu (TSA) do wizualizacji białek o niskiej zawartości komórek.

TSA, znana również jako katalizowane osadzanie reporterowe (CARD), jest wysoce czułą metodą enzymatyczną, umożliwiającą wykrywanie celów o niskiej liczebności w immunocytochemii. Technika ta wykorzystuje aktywność katalityczną peroksydazy do kowalencyjnego osadzania znakowanego tyramidu w pobliżu docelowych białek in situ23,24. W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza katalizuje oksydacyjną kondensację tyramidu w reaktywne rodniki tyramidu, które następnie wiążą się z ugrupowaniami bogatymi w elektrony, takimi jak tyrozyna, fenyloalanina i tryptofan25. Wzmacnia to sygnały nawet od 10 do 200 razy w porównaniu ze standardowymi metodami, dzięki czemu sygnał jest wykrywalny za pomocą standardowych technik chromogenicznych lub fluorescencyjnych. W związku z tym technika ta ułatwia szybką i jednoczesną ocenę wielu białek wraz z markerami fenotypowymi w heterogenicznych populacjach i rzadkich podzbiorach komórek. Warto zauważyć, że jak dotąd połączenie systemów znakowania immunologicznego i TSA dla cyjanobakterii zostało ograniczone do jednego badania, które uwidoczniło saksytoksynę w Cylindrospermopsis raciborskii26.

Opisana tutaj metoda pozwala na badanie produkcji białek w różnych warunkach środowiskowych na poziomie pojedynczej komórki, umożliwiając ocenę aktywności metabolicznej u docelowych cyjanobakterii. Dostępność detekcji białek immunofluorescencyjnych całych komórek pozwala na szybką i półilościową wizualizację białek C. watsonii na poziomie pojedynczej komórki. Co więcej, metodę tę można łatwo dostosować do stosowania z innymi komórkami sinic zawierającymi fikurobilinę i fikoerytrynę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla sinic

  1. Hoduj komórki Crocosphaera watsonii PS0609 w kolbach Erlenmeyera lub fotobioreaktorach w YBCII medium27. Aby określić gęstość hodowli, należy zmierzyć gęstość komórek za pomocą wybranej metody (np. mikroskopii, cytometrii przepływowej, licznika komórek itp.).
  2. Utrzymuj gęstość komórek między ~1 × 104 do ~5 × 106 komórek mL-1.

2. Przygotowanie odczynników

  1. Przechowywać 100% metanolu w temperaturze -20 °C.
  2. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Rozpuścić 1,36 g KH2PO4, 1,42 g Na2HPO4, 8,0 g NaCl i 0,224 g KCl w 0,8 l wody destylowanej, napełnić do 1 l, dostosować pH do 7,4 i autoklawować (patrz tabela materiałów).
  3. 1% paraformaldehydu (PFA) w PBS
    1. Dodać 50 ml PBS do szklanej zlewki na mieszadle w wentylowanym kapturze, podgrzać do 60 °C i wymieszać mieszadłem.
    2. Wprowadzić 0,5 g proszku paraformaldehydu do podgrzanego roztworu PBS. Stopniowo podnosić pH, podając kroplowo 1 N NaOH z pipety, aż roztwór stanie się przezroczysty. Po całkowitym rozpuszczeniu paraformaldehydu obniżyć temperaturę i przystąpić do filtrowania roztworu.
    3. Dostosować objętość roztworu do 40 ml za pomocą PBS. Dostosować pH za pomocą niewielkich ilości rozcieńczonego HCl do około 6,9. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  4. Roztwór blokujący PBG (0,2% żelatyny + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej; BSA, patrz tabela materiałów)
    1. Rozpuścić 0,2 g żelatyny i 0,5 g BSA w 100 ml PBS w szklanej zlewce o pojemności 200 ml. Podgrzej mieszaninę do 60 °C i wymieszaj. Następnie przelać go do probówki o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. 0,2% Triton X-100 w PBS: Dodaj 20 μl Triton X-100 do 10 ml PBS. Przygotować go w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. 0,5 M EDTA: Rozpuść 1,46 g EDTA w 10 ml wody destylowanej (DW) i dostosuj pH do 8,0 (EDTA nie rozpuści się w pH < 8,0). Przygotować go w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  7. 1 M Tris HCl: Rozpuść 1,58 g Tris HCl w 10 ml DW i dostosuj pH do 8,0. Przygotować go w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  8. 50 mM Tris HCl: Rozpuść 0,079 g Tris HCl w 10 ml DW i dostosuj pH do 7,0. Przygotować go w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Dodaj 10 mg/ml lizozymu: Dodaj 100 mg lizozymu, 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) i 1 ml 1 M Tris HCl (pH 8). Dodaj DW do 10 ml do probówki o pojemności 15 ml. Przygotuj go na świeżo w dniu użycia.
  10. 10 000 jednostek/ml achromopeptydazy: Rozpuścić 0,011 g z 900 jednostek/mg achromopeptydazy (patrz tabela materiałów) w 1 ml DW, dobrze wymieszać i zachować w temperaturze -20 °C.
  11. 60 jednostek/ml roztworu roboczego achromopeptydazy: Dodaj 3 μl 10 000 jednostek/ml achromopeptydazy do 0,5 ml 50 mM Tris HCl. Przygotuj go świeżo w dniu użycia.
  12. Przygotować 100x roztwór podstawowy tyramidu: Rozpuść odczynnik tyramidu w 150 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 6 miesięcy.
  13. 1x Bufor reakcyjny: Dodaj 1 kroplę 20x buforu reakcyjnego do 1 ml DW. Można go zastąpić buforem Tris o pH 7,4.
  14. Roztwory odczynników zatrzymujących reakcję
    1. Roztwór podstawowy odczynnika zatrzymującego reakcję: Dodać 1,45 ml 95% etanolu do jednej fiolki odczynnika zatrzymującego reakcję zawartego w zestawie do wzmacniania sygnału tyramidu (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy
    2. Roztwór roboczy odczynnika zatrzymującego reakcję: rozcieńczyć roztwór podstawowy odczynnika zatrzymującego reakcję (1:11) w PBS. Przygotować go na świeżo w dniu użycia.
  15. 100x roztwór H2O2: Dodać 1 kroplę (około 50 μL) H2O2 do 1 ml DW. Przygotować go na świeżo w dniu użycia.
  16. Roztwór roboczy tyrammidu (dla końcowej objętości 510 μl): Dodać 5 μl 100x roztworu podstawowego tyramidu, 5 μl 100x roztworu H2O2 i 500 μl 1x buforu reakcyjnego do probówki o pojemności 1,5 ml w podanej kolejności i delikatnie wymieszać przez pipetowanie. Przygotować go na świeżo w dniu użycia.

3. Zbieranie komórek

  1. Zebrać 10 ml kultury C. watsonii do probówki o pojemności 15 ml, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 500 × g w temperaturze 4 °C przez 8 minut i odrzucić supernatant. Próbki należy przechowywać na lodzie pomiędzy zabiegami.
  2. Zawiesić osad z pozostałym supernatantem, przenieść zawieszoną podpróbkę do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1 ml PBS do popłuczku. Zebrać komórki przez odwirowanie (5 500 × g, 4 °C, 5 min) i odrzucić supernatant.

4. Utrwalanie i konserwacja komórek

  1. Dodać 1 ml 1% roztworu PFA i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odwirować komórki w temperaturze 5 500 × g, w temperaturze 4 °C, 5 minut, usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić go do wyznaczonego pojemnika na odpady chemiczne, dodać 1 ml PBS i ponownie zawiesić.
  3. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant pipetą i wyrzucić go. Dodać 1 ml 100% metanolu (przechowywanego w temperaturze -20 °C) i ponownie zawiesić za pomocą mieszalnika wirowego. Przechowywać podpróbki w temperaturze -20 °C przez 15 minut lub przez noc.

5. Przepuszczalność i blokowanie

  1. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant (metanol) za pomocą pipety i wyrzucić go do wyznaczonego pojemnika na odpady chemiczne, dodać 1 ml PBS i ponownie zawiesić.
  2. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić go, dodać 1 ml 0,2% Triton X-100 i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant Triton X-100 za pomocą pipety i wyrzucić go, dodać 1 ml PBS i ponownie zawiesić.
  4. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant za pomocą pipety, dodać 0,5 ml lizozymu (patrz tabela materiałów) i 0,5 ml PBG (krok 2.4) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  5. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety i wyrzucić go do wyznaczonego pojemnika na odpady, dodać 0,5 ml 60 jednostek achromopeptydazy (krok 2.10) i 0,5 ml PBG i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Odwirować komórki (5 500 × g, 4 °C, 5 min), usunąć supernatant achromopeptydazy za pomocą pipety, wyrzucić go do wyznaczonego pojemnika na odpady i dodać niezbędną ilość PBS.
    UWAGA: O wymaganej ilości należy decydować na podstawie liczby podpróbek, które mają być obserwowane (jedna podpróbka to 90 μL dla okręgu o średnicy ~2 cm). Należy zapewnić przygotowanie kontroli ujemnej(-ych); bez 1lub 2przeciwciała i bez 1 przeciwciała
    7. .

6. Przygotowanie próbek do obrazowania

  1. Umieść próbki na szkiełku podstawowym i dodaj 1. przeciwciało28.
    1. Narysuj dwa kółka o średnicy około ~ 2 cm na szkle pokrytym polilizyną za pomocą odpychającego ciecze markera do slajdów (patrz tabela materiałów). Nanieść 90 μl podpróbek do kółek. Wysuszyć nałożoną podpróbkę w kapturze chemicznym. Zajmuje to około 30-60 min.
    2. Ponownie uwodnić podpróbkę i przemyć ją 90 μl PBS, inkubować przez 2 minuty i wyrzucić PBS. Powtórz kroki 2 razy.
    3. Rozcieńczyć 1st przeciwciało28 (1 mg mL-1) 200 razy w roztworze blokującym PBG. Dostosuj ilość roztworu w zależności od liczby próbek.
      1. Nałożyć 90 μl przeciwciała pierwszorzędowego (1st) class28 na każdą podpróbkę, z wyjątkiem kontroli ujemnej. Umieść destylowaną mokrą wodą bibułę do komory, zamknij ją pokrywą i owiń taśmą do szczepienia. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Zastosuj 2nd przeciwciało.
    1. Usuń nadmiar przeciwciała 1st pozwalając szkiełku postawić na dłuższym boku na bibułce, obróć go, aby podnieść komórki i dodaj 0,2% Triton X-100 do każdego okręgu za pomocą pipety i inkubować przez 2 minuty, aby przepłukać komórki. Powtórz 5 razy.
    2. Delikatnie nałożyć przeciwciało drugorzędowe (2nd) sprzężone z peroksydazą chrzanu (HRP) (koza, anty-królicze IgG) (patrz Tabela materiałów) i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie płucz komórki PBS przez 10 minut; Powtórz 3 razy.
  3. Wzmocnienie sygnału tyramidowego
    1. Dodać 90 μl roztworu roboczego tyramidu do próbek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór, pozwalając, aby szkiełko stało na dłuższym boku na bibułce. Dodać 90 μl odczynnika zatrzymującego reakcję i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć roztwór.
      UWAGA: Czas inkubacji powinien być badany dla każdego białka docelowego lub dla każdego mikroskopu. Czas inkubacji można skrócić lub pominąć etap obserwacji alokacji białka za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby uniknąć przesycenia sygnału.
  4. Przepłukać komórki PBS (5 razy) co 30 minut. Przepłukać komórki za pomocą DW. Energicznie usuń wodę. Dodaj jedną kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) i umieść szkiełko nakrywkowe.
  5. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar podłoża montażowego i pozostaw do wyschnięcia na około 30 minut. Uszczelnij je przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj w ciemności.

7. Wykrywanie sygnału fluorescencji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

  1. Włącz mikroskop fluorescencyjny, komputer i źródło światła UV. Otwórz oprogramowanie kamery podłączonej do mikroskopu (patrz Tabela materiałów). Ustaw monitorowanie obrazów na żywo. Wyłącz światło w pokoju.
    1. Umieścić szklane szkiełko zawierające komórki na stoliku z próbką. Użyj obiektywu o najmniejszym powiększeniu i wyreguluj obiektyw i soczewkę kondensatora, aby precyzyjnie dostroić ostrość. Zmieniaj obiektyw na większe powiększenia jeden po drugim.
    2. Nałóż olejek immersyjny na szkło nakrywkowe i zmień soczewkę na soczewkę zanurzeniową w oleju 100x. Zakryj źródło światła od źródła światła, wybierz zestaw filtrów DAPI do analizy Tyramidu-350 i otwórz migawkę wzbudzenia światła UV.
    3. Przetestuj 3-4 czasy naświetlania i zdecyduj o najlepszym czasie ekspozycji bez przesycenia. Wybierz zestaw filtrów FITC do obserwacji fikoerytryny, powtórz procedurę i zdecyduj o najlepszym czasie ekspozycji. Rozważ wykorzystanie zwiększonego wzmocnienia lub trybu binningu w aparacie, aby przyspieszyć procedurę i złagodzić degradację sygnału spowodowaną fototoksycznością. Ustaw z powrotem tryb wzmocnienia i binningu w celu uzyskania obrazu.
  2. Wybierz pole widzenia, zrób migawkę, aby uzyskać obraz w jasnym polu, obraz tyramidu i obraz fikoerytryny z wybranym czasem ekspozycji dla każdego obrazu.

8. Detekcja pod mikroskopem konfokalnym

  1. Włącz mikroskop konfokalny i komputer, a następnie uruchom oprogramowanie do mikroskopii. Rozgrzej laser przez 60 minut. Wyłącz światło w pokoju. Umieść szklane szkiełko zawierające komórki na stoliku z próbką, używając olejku immersyjnego na soczewce obiektywu.
  2. Wybierz laser 405 nm i ustaw rozdzielacze wiązki głównej (MBS) 405. Ustaw moc lasera na 0,5%. Ustaw parametry pomiaru tak, aby uzyskać rozmiar piksela 0,03 μm, powiększenie 10 (rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli). Ustaw czas zatrzymania piksela na 0,02 ms, co daje całkowity czas skanowania na 5,06 s.
  3. Ustaw zakres detektora od 410 nm do 695 nm na detektorze spektralnym GaAsP, umożliwiając rozdzielczość spektralną 9 nm. Ustaw optymalne wzmocnienie (800-900). Uruchom skanowanie lambda.
    UWAGA: Optymalne wzmocnienie powinno być zoptymalizowane dla każdego mikroskopu.

9. Określ ilościowo intensywność sygnału za pomocą Fidżi

  1. Otwórz obraz przechwycony za pomocą filtra DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zaznacz komórki na obrazie w jasnym polu i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI). Po zdefiniowaniu ROI dla wszystkich komórek zapisz ROI.
  2. Zamknij obraz jasnego pola i otwórz obraz fluorescencyjny. Podziel obraz RGB na czerwony, niebieski i zielony, aby wyodrębnić sygnał Tyramide-350.
  3. Zastosuj ROI przygotowany przez obraz jasnego pola do niebieskiego obrazu i zmierz intensywność sygnału29. Zapisz wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaobserwowano sygnał fluorescencji z substancji zewnątrzkomórkowych w kontroli negatywnej, gdzie nie zastosowano przeciwciała 1st (Rysunek 1A-C). Sygnał fluorescencyjny odczynnika wzmocnionego tyramidem, sprzężonego z dużą podjednostką białka Rubisco (RbcL), został pomyślnie wykryty u C. watsonii pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu filtra DAPI ze wzbudzeniem UV (Rysunek 1D-F). Dodatkowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku cyjanobakterii system TSA znalazł szerokie zastosowanie w fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ TSA (TSA-FISH, CARD-FISH), ukierunkowanej na specyficzne rRNA. Jednak jego zastosowanie w odniesieniu do białek pozostaje ograniczone26. W tym badaniu zastosowano procedurę TSA, aby umożliwić immunodetekcję całych komórek cyjanobakterii C. watsonii wiążącej N-2, z uwzględnieniem modyfikacji opartych na poprzednim piśmiennictwie20. Godne uw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potwierdzamy, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Radkowi Kanie i Barmorze Šedivá za pomoc w konfokalnej analizie mikroskopowej oraz dr Romanowi Sobotce i dr Kateřinie Bišovej za porady w zakresie immunodetekcji i analizy mikroskopii fluorescencyjnej. Badania były wspierane finansowo przez Czeską Fundację Badawczą GAČR (projekt 20-17627S dla OP i TM), projekt Mobility plus realizowany przez JSPS i Czeską Akademię Nauk (JPJSBP 120222502) oraz JSPS KAKENHI (projekt 23H02301).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AchromopeptydazaFUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952Tyramid-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254Tyramid-405
Alexa Fluor488 Tyramid SuperBoost KitThermo ScientificB40922Kozia anty-królicza IgG
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
WirówkaEppendorf5804 R
Probówki wirówkowe (15 ml)VWR525-1085Do pobierania komórek
Mikroskop konfokalnyZeissLSM880 Wyposażony w Airyscan
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusBX51Filtr DAPI: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm
ŻelatynaMerk4070
Wysoce precyzyjne okulary nakrywkowe do mikroskopu konfokalnegoDeckglä sernr 1.5H
Liquid Blocker Regular/MiniDaido Sangyo Co., Ltd.Część 6505Do utrzymywania komórek na szkle szkiełkowym
LizozymITW OdczynnikiA4972
MetanolCarl Roth67-56-1
Fosforan monopotasowyPenta12290
Pożywka monuntingowaSigma-Aldrich345789-20MLOdczynnik FluorSave
Podłoże montażoweVectashildH-1300
Soczewka obiektywowa stosowana w mikroskopie konfokalnymZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Szkło szkiełkowe powlekane polilizynąSigma-AldrichP0425-72EA
Chlorek potasu Lach-Ner
Bezpieczna rurka blokująca (1,5 ml)Eppendorf0030 120.086Do obróbki komórek i przechowywania chemikaliów
Chlorek sodu Penta16610
Wodorofosforan sodu Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Biotechnology. 62, 202-211 (2020).
  3. Takhaveev, V., Heinemann, M. Metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Microbiology. 45, 30-38 (2018).
  4. van Heerden, J. H., et al. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. Science. 343 (6174), 1245114(2014).
  5. Lindemann, D., Westerwalbesloh, C., Kohlheyer, D., Grunberger, A., von Lieres, E. Microbial single-cell growth response at defined carbon limiting conditions. RSC advances. 9 (25), 14040-14050 (2019).
  6. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J. L., Heinemann, M. Phenotypic bistability in Escherichia coli's central carbon metabolism. Molecular Systems Biology. 10 (7), 736(2014).
  7. Nikolic, N., et al. Cell-to-cell variation and specialization in sugar metabolism in clonal bacterial populations. PLoS Genetics. 13 (12), 1007122(2017).
  8. Solopova, A., et al. Bet-hedging during bacterial diauxic shift. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7427-7432 (2014).
  9. Schreiber, F., et al. Phenotypic heterogeneity driven by nutrient limitation promotes growth in fluctuating environments. Nature Microbiology. 1, 16055(2016).
  10. Zimmermann, M., et al. Substrate and electron donor limitation induce phenotypic heterogeneity in different metabolic activities in a green sulphur bacterium. Environmental Microbiology Reports. 10 (2), 179-183 (2018).
  11. Masuda, T., et al. Heterogeneous N2 fixation rates confer energetic advantage and expanded ecological niche of unicellular diazotroph populations. Communications Biology. 3, 172(2020).
  12. Mohr, W., Vagner, T., Kuypers, M. M., Ackermann, M., Laroche, J. Resolution of conflicting signals at the single-cell level in the regulation of cyanobacterial photosynthesis and nitrogen fixation. PLoS One. 8 (6), 66060(2013).
  13. Polerecky, L., et al. Temporal patterns and intra- and inter-cellular variability in carbon and nitrogen assimilation by the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Frontiers in Microbiology. 12, 620915(2021).
  14. Berthelot, H., et al. NanoSIMS single cell analyses reveal the contrasting nitrogen sources for small phytoplankton. ISME Journal. 13, 651-662 (2019).
  15. Foster, R. A., Sztejrenszus, S., Kuypers, M. M. Measuring carbon and N2 fixation in field populations of colonial and free-living unicellular cyanobacteria using nanometer-scale secondary ion mass spectrometry. Journal of Phycology. 49 (3), 502-516 (2013).
  16. Lin, S., Henze, S., Lundgren, P., Bergman, B., Carpenter, E. J. Whole-cell immunolocalization of nitrogenase in marine diazotrophic cyanobacteria, Trichodesmium spp. Applied and Environmental Microbiology. 64, 3052-3058 (1998).
  17. Berman-Frank, I., et al. Segregation of nitrogen fixation and oxygenic photosynthesis in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Science. 294, 1534-1537 (2001).
  18. El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A., Bergman, B. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology. 149, 1139-1146 (2003).
  19. Webb, E. A., Ehrenreich, I. M., Brown, S. L., Valois, F. W., Waterbury, J. B. Phenotypic and genotypic characterization of multiple strains of the diazotrophic cyanobacterium, Crocosphaera watsonii, isolated from the open ocean. Environmental Microbiology. 11 (2), 338-348 (2009).
  20. Taniuchi, Y., Murakami, A., Ohki, K. Whole-cell immunocytochemical detection of nitrogenase in cyanobacteria: improved protocol for highly fluorescent cells. Aquatic Microbial Ecology. 51, 237-247 (2008).
  21. Ohki, K., Taniuchi, Y. Detection of nitrogenase in individual cells of a natural population of Trichodesmium using immunocytochemical methods for fluorescent cells. Journal of Oceanography. 65, 427-432 (2009).
  22. Orcutt, K. M., Ren, S., Gundersen, K. Detecting proteins in highly autofluorescent cells using quantum dot antibody conjugates. Sensors. 9 (9), 7540-7549 (2009).
  23. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. 125, 279-285 (1989).
  24. Bobrow, M. N., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. Journal of Immunological Methods. 137, 103-112 (1991).
  25. Bobrow, M. N., Litt, G. J., Shaughnessy, K. J., Mayer, P. C., Conlon, J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. Journal of Immunological Methods. 150, 145-149 (1992).
  26. Piccini, C., Fabre, A., Lacerot, G., Bonilla, S. Combining immunolabeling and catalyzed reporter deposition to detect intracellular saxitoxin in a cyanobacterium. Journal of Microbiol Methods. 117, 18-21 (2015).
  27. Chen, Y. B., Zehr, J. P., Mellon, M. Growth and nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. Journal of Phycology. 32, 916-923 (1996).
  28. Ohki, K. Intercellular localization of nitrogenase in a non-heterocystous cyanobacterium (Cyanophyte), Trichodesmium sp. NIBB1067. Journal of Oceanography. 64, 211-216 (2008).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. McKnight, P. E., Najab, J. Mann-Whitney U Test. The Corsini Encyclopedia of Psychology. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2010).
  31. Steel, R. G. D. Some rank sum multiple comparison tests. Biometrics. 17, 539-552 (1961).
  32. M, S. H. K. Standard Deviation. International Encyclopedia of Statistical Science. Lovric, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  33. Gross, A. J., Sizer, I. W. The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by peroxidase. Journal of Biological Chemistry. 234 (6), 1611-1614 (1959).
  34. Eling, T. E., Thompson, D. C., Foureman, G. L., Curtis, J. F., Hughes, M. F. Prostaglandin H synthase and xenobiotic oxidation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 30, 1-45 (1990).
  35. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry Part A. 77 (11), 1020-1031 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka cyjanobakteriioznaczanie ilo ci bia kaCrocosphaera watsoniiautofluorescencja fikoerytrynyautofluorescencja fikourobilinymikroskopia konfokalnamikroskopia fluorescencyjnaanaliza pojedynczych kom rekoprogramowanie Fiji
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły