Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65169

⸱

7 kwietnia 2023

 , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół zwiększania stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) myszy. Takie podejście może być przydatne do badania wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na neurodegenerację, funkcje poznawcze i obwodowy metabolizm glukozy u myszy.

Streszczenie

Cukrzyca zwiększa ryzyko pogorszenia funkcji poznawczych i upośledza funkcjonowanie mózgu. To, czy ten związek między wysokim poziomem glukozy a deficytami poznawczymi jest przyczynowy, pozostaje nieuchwytne. Co więcej, nie jest również jasne, czy deficyty te są spowodowane wzrostem poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i/lub krwi. Istnieje bardzo niewiele badań oceniających bezpośredni wpływ wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na funkcję ośrodkowego układu nerwowego (OUN), zwłaszcza na uczenie się i pamięć, ponieważ obecne modele cukrzycy nie są wystarczająco rozwinięte, aby odpowiedzieć na takie pytania badawcze. W tym artykule opisano metodę przewlekłego zwiększania poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym przez 4 tygodnie poprzez ciągłe wlewanie glukozy do komory bocznej za pomocą minipomp osmotycznych u myszy. Protokół został zweryfikowany poprzez pomiar poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym. Protokół ten zwiększył poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym do ~ 328 mg / dl po infuzji 50% roztworu glukozy przy szybkości przepływu 0,25 μl / h, w porównaniu ze stężeniem glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym wynoszącym ~ 56 mg / dl u myszy, które otrzymały sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF). Co więcej, protokół ten nie wpłynął na poziom glukozy we krwi. Dlatego metoda ta może być stosowana do określenia bezpośredniego wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym na funkcjonowanie mózgu lub określoną ścieżkę neuronalną niezależnie od zmian poziomu glukozy we krwi. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj podejście ułatwi opracowanie modeli zwierzęcych do testowania roli wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w pośredniczeniu w cechach choroby Alzheimera i/lub innych zaburzeń neurodegeneracyjnych związanych z cukrzycą.

Wprowadzenie

Zarówno cukrzyca typu 1, jak i typu 2 upośledzają funkcjonowanie mózgu1,2,3. Na przykład cukrzyca zwiększa ryzyko pogorszenia funkcji poznawczych i zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera3,4. Co więcej, osoby z cukrzycą mają wadliwe wykrywanie glukozy w mózgu5,6. Ta wada przyczynia się do patogenezy nieświadomości związanej z hipoglikemią i niewystarczającej odpowiedzi przeciwregulacyjnej na hipoglikemię7,8, która może być śmiertelna, jeśli nie zostanie natychmiast leczona.

Biorąc pod uwagę, że cukrzyca zwiększa poziom glukozy we krwi, jak również w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF)9, ważne jest ustalenie, czy jeden czy oba te czynniki przyczyniają się do upośledzenia funkcji mózgu. To, czy cukrzyca powoduje uszkodzenie mózgu przez wysoki poziom glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym, samodzielnie, czy w połączeniu z innymi czynnikami, takimi jak niedobór insuliny lub insulinooporność, jest również kwestią otwartą. Modele zwierzęce cukrzycy typu 1 i typu 2 wykazują pogorszenie funkcji poznawczych i neurodegenerację, a także zaburzony bilans energetyczny i obwodowy metabolizm glukozy10,11,12,13. Jednak na podstawie tych modeli nie jest możliwe oddzielenie selektywnego wpływu wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w porównaniu z poziomem glukozy we krwi w pośredniczeniu w powikłaniach cukrzycy na funkcjonowanie mózgu.

Ten protokół opisuje metody rozwoju mysiego modelu hiperglikory w celu przetestowania wpływu chronicznie wysokiego poziomu glukozy w płynie mózgowym na funkcjonowanie mózgu, bilans energetyczny i homeostazę glukozy. Model mysi opracowany za pomocą tej techniki stanowi narzędzie do badań badających etiologiczną rolę rozregulowanej homeostazy glukozy na funkcje neuronalne i behawioralne.

Dlatego proponowane podejście będzie przydatne w zrozumieniu bezpośrednich skutków podwyższonego poziomu glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym w różnych stanach patofizjologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na myszach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Rochester i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącymi humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Sześciotygodniowe samce myszy C57BL/6J wykorzystane w tym badaniu zostały uzyskane komercyjnie. Wszystkie zwierzęta umieszczono w grupie (5 myszy w klatce) w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem dnia i nocy, a także zapewniono im dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Po tym, jak myszom wszczepiono kaniulę do wlewania glukozy do komory bocznej, umieszczono je w pojedynczym pomieszczeniu, aby zapobiec uszkodzeniom implantów przez inne myszy.

1. Montaż minipomp osmotycznych

  1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) zgodnie z następującym protokołem. Rozpuścić NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g), CaCl2,2H 2O (0,206 g) i MgCl2,6H 2O (0,163 g) w 500 ml sterylnej wody, aby przygotować roztwór A. Rozpuść Na2HPO4,7H 2O (0,214 g) i NaH2PO4. H2O (0,027 g) w 500 ml sterylnej wody w celu przygotowania roztworu B. Następnie wymieszaj roztwór A i B w stosunku 1:1, aby przygotować aCSF.
    UWAGA: Ten preparat aCSF nie zawiera glukozy.
  2. Aby przygotować 50% roztwór glukozy, dodaj 50 g glukozy do 50 ml aCSF w zlewce. Umieścić zlewkę na płycie grzejnej i doprowadzić temperaturę zawiesiny do 60 °C. Wymieszać zawiesinę z mieszadłem magnetycznym aż do całkowitego rozpuszczenia glukozy.
  3. Dodaj płyn CSF do zlewki, aby ostateczna objętość wynosiła 100 ml. Przepuść roztwór przez filtr porowy 0,22 μm, aby go wysterylizować.
  4. Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej (NaCl) i przepuścić roztwór przez filtr 0,22 μm.
  5. Umieść wszystkie elementy minipompy i zestawu infuzyjnego na sterylnej tacy, a następnie przyciąć rurkę z zestawu do infuzji mózgu do 1 cala za pomocą sterylnych nożyczek. Przytrzymaj rurkę sterylnym hemostatem i wciśnij ją na wierzch jednego końca kaniuli. Podłącz drugi koniec rurki do górnej części modulatora przepływu. Przykryj oba końce rurki niewielką ilością kleju, aby uzyskać mocniejsze połączenie.
  6. Podłączyć igłę o sile 27 g do strzykawki o pojemności 1 ml i napełnić ją płynem mózgowo-rdzeniowym lub roztworem glukozy. Włożyć igłę 27 G do małego kawałka rurki. Następnie podłącz rurkę do otwartego końca modulatora przepływu i napełnij ją odpowiednim roztworem, aż krople roztworu zaczną wypływać z kaniuli. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w przewodach.
  7. Aby napełnić minipompkę, należy trzymać pompę pionowo i włożyć igłę strzykawki do pompy. Napełnij go odpowiednim roztworem, aż kropla roztworu zacznie tworzyć się przy otworze minipompy.
  8. Powoli włóż modulator przepływu do pompy, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do zespołu.
  9. Po zmontowaniu minipomp osmotycznych przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 50 ml. Napełnij probówkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej, tak aby pompy były całkowicie zanurzone, upewniając się, że kaniula nie znajduje się w roztworze soli fizjologicznej. Cztery tak zmontowane pompy można umieścić w jednej probówce o pojemności 50 ml.
  10. Luźno umieścić nakrętkę na każdej probówce i inkubować pompy w temperaturze 37 °C, aby zalać je przez co najmniej 48 godzin.

2. Chirurgia wszczepienia pomp osmotycznych

  1. Postępowanie przedoperacyjne
    1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie i pozwól im ostygnąć przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Warunki panujące w autoklawie obejmują sterylizację parą wodną w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
    2. Zdezynfekuj obszar operacji 70% etanolem. Wytrzyj gałki, nauszniki i powierzchnię ramy stereotaktycznej.
      UWAGA: Zabieg chirurgiczny powinien być wykonywany w aseptycznym środowisku, pamiętając o unikaniu dotykania niesterylnych powierzchni podczas wykonywania zabiegu. Wymień rękawice, jeśli istnieje podejrzenie zanieczyszczenia.
    3. Umieść mysz w komorze anestezjologicznej, aby znieczulić ją 3% izofluranem zmieszanym z powietrzem przez 3-5 minut. Następnie wyjmij mysz z komory i połóż ją na sterylnej zasłonie. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy na poziomie 1,5%-2%.
    4. Uszczypnij tylną łapę myszy, aby zaobserwować wszelkie odruchy i sprawdzić głębokość znieczulenia.
    5. Wstrzyknąć 5 mg/kg karprofenu podskórnie w celu znieczulenia.
    6. Użyj czystych maszynek do strzyżenia, aby przypiąć obszar operacyjny na głowie myszy. Nacierać skórę głowy najpierw roztworem jodu powidonu, a następnie dokładnie wacikami nasączonymi alkoholem przez co najmniej 2 minuty. Powtórz ten proces co najmniej trzy razy.
    7. Zastosuj lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu.
  2. chirurgia
    1. Umieść mysz na ramie stereotaktycznej i dopasuj głowę do siekacza. Zakryj nos stożkiem nosowym. Zastosuj sterylne obłożenia, aby zabezpieczyć obszar operacyjny.
    2. Przesunąć przepływ izofluranu do stożka nosowego. Kontynuuj utrzymywanie znieczulenia na poziomie 1,5%-2% izofluranu.
    3. Umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby utrzymać temperaturę ciała.
    4. Załóż nowe sterylne rękawiczki i skalpelem wykonaj nacięcie w linii środkowej (o długości ~10-15 mm) na skórze głowy. Odsłoń powierzchnię czaszki szpatułką, używając bawełnianych końcówek, aby wytrzeć krwawienie.
      UWAGA: Użyj kauteryzatora, jeśli obfite krwawienie, co zdarza się rzadko.
    5. Przetrzyj bawełnianą końcówką zamoczoną w 3% nadtlenku wodoru, aby odsłonić szwy czaszkowe.
    6. Zanotuj bregmę i lambdę, aby poruszać się po współrzędnych czaszki. Ustaw wszystkie współrzędne na zero w bregma.
      UWAGA: Te współrzędne zostały uzyskane z atlasu mózgu myszy atlas14. Referencyjna odległość bregma-lambda w atlasie wynosi 4,21 mm. Aby skorygować różnice w wielkości czaszki w zależności od wieku i płci, zmierzono odległość bregma-lambda dla każdej myszy, a następnie podzielono ją przez 4,21 mm, aby uzyskać współczynnik mnożenia. Na przykład, jeśli odległość między bregmą a lambdą wynosiła 4,65 mm, dzielenie przez 4,21 mm dawało współczynnik mnożenia 1,10. Wszystkie współrzędne uzyskane z atlasu zostały następnie pomnożone przez ten współczynnik, aby zmierzyć rzeczywiste współrzędne, które zostały użyte do wywiercenia otworu. W powyższym przykładzie wynikowe współrzędne przednio-tylne (AP) i przyśrodkowo-boczne (ML) wynosiłyby odpowiednio 0,55 i 1,1 mm (tj. 1,1 x 0,5 lub 1 mm).
    7. Użyj wiertarki elektrycznej, aby zrobić otwór na tych współrzędnych: 0,5 mm za bregmą i 1 mm od linii bocznej do środkowej w prawo.
      UWAGA: Podczas wiercenia otworu w czaszce należy uważać, aby nie rozerwać opony twardej. Upewnij się, że wiertło jest sterylne. Można go umieścić wraz z innymi narzędziami w tej samej torbie autoklawu w celu sterylizacji.
    8. Wprowadzić hemostat pod naciętą skórę i wepchnąć go do miejsca, w którym zostanie wszczepiona minipompa osmotyczna. Delikatnie otwórz i zamknij hemostat, aby zrobić kieszeń na minipompkę.
    9. Użyj sterylnego hemostatu, aby wybrać zalaną minipompę osmotyczną z końcówki modulatora przepływu. Przepchnąć pompkę przez naciętą skórę do kieszeni.
      UWAGA: Uważaj, aby laktator i kaniula nie dotykały żadnej niesterylnej powierzchni.
    10. Nałóż trochę kleju na spód kaniuli i zamocuj go w uchwycie kaniuli. Powoli opuść kaniulę przez wywiercony otwór 2 mm brzusznie do powierzchni czaszki. Pozostaw go tam na co najmniej 5 minut, aby klej stwardniał.
    11. Przed włożeniem kaniuli do mózgu upewnij się, że kaniula nie jest zatkana i że roztwór przepływa prawidłowo.
      UWAGA: Czasami glukoza może osadzać się na końcówce kaniuli z powodu bardzo niskiego natężenia przepływu, blokując przepływ.
    12. Za pomocą nożyczek przypnij górną część kaniuli, upewniając się, że nie odrywa się od powierzchni czaszki.
    13. Przykryj kaniulę warstwą cementu dentystycznego, aby uzyskać dodatkowe wsparcie.
    14. Użyj nylonowych szwów (rozmiar 5-0 i 30 cali długości), aby zamknąć ranę i nałożyć miejscowy antybiotyk na ranę, aby zapobiec infekcji.
    15. Wyłącz izofluran i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu. Następnie przenieś zwierzę do nowej, czystej klatki.
  3. Opieka pooperacyjna
    1. Po zabiegu monitoruj mysz przez co najmniej 1 tydzień.
    2. Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie, raz na 24 godziny przez trzy dni po zabiegu.
    3. Pozwól ranie całkowicie się zagoić przed usunięciem szwów 7-10 dni po zabiegu.
      UWAGA: Zaobserwowano, że myszy z wysokim poziomem glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym goiły się dłużej. Przycinanie pazurów na tylnych łapach myszy minimalizuje ryzyko zranienia miejsca nacięcia z powodu drapania myszy.

3. Wymiana minipomp

UWAGA: Ponieważ minipompy użyte w tym badaniu działają tylko przez 4 tygodnie, przetestowano również wymianę minipomp w celu przedłużenia czasu trwania infuzji glukozy, co może być wymagane w przypadku badań długoterminowych. Wiązało się to z następującymi krokami.

  1. Przygotuj myszy do operacji, jak opisano powyżej.
  2. Wykonaj małe pionowe nacięcie o długości 1 cm w skórze nieco powyżej pompy.
  3. Włożyć hemostat pod naciętą skórę i wyciągnąć pompę.
  4. Wyjmij pompę z przewodu i podłącz nową zalaną pompę do przewodu.
  5. Włóż pompkę z powrotem do środka i zszyj skórę.
  6. Postępuj zgodnie z tymi samymi instrukcjami pielęgnacji pooperacyjnej, jak opisano powyżej.

4. Procedura zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego

  1. preparat
    1. Pociągnij szklane kapilary o średnicy 1 mm za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać końcówki o średnicy 0,5 mm. Ustawienia to: ciepło = 800, ciąg = 15, prędkość = 5 i czas = 200 jednostek. Umieść wyciągnięte naczynia włosowate w sterylnym pudełku do czasu użycia.
    2. Podłączyć igłę 27 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Umieść naciągniętą kapilarnę na igle i użyj małej taśmy klejącej, aby zabezpieczyć połączenie.
    3. Mocno zamocować strzykawkę w uchwycie kapilarnym mikromanipulatora.
    4. Następnie przygotuj mysz do zabiegu, zgodnie z opisem w powyższej procedurze przedoperacyjnej.
  2. Zabiegu chirurgicznego
    1. Umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Po zamocowaniu głowy na ramie, jak opisano wcześniej, obróć pokrętła, aby przechylić głowę tak, aby nos był skierowany w dół. Zastosuj sterylne obłożenia, aby zabezpieczyć obszar operacyjny.
    2. Wykonaj małe nacięcie na powierzchni grzbietowej, zaczynając od płaszczyzny wewnątrzusznej do strony ogonowej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić rurki podczas wykonywania nacięcia.
    3. Zdejmij podpórkę z korpusu myszy i pozwól myszy spoczywać pionowo, tak aby szyja była całkowicie wyciągnięta grzbietowo.
    4. Za pomocą zakrzywionych kleszczy delikatnie przetnij tylne mięśnie szyi od linii środkowej, aby stworzyć małe okno. Następnie użyj aplikatora z mokrą bawełnianą końcówką, aby delikatnie przesunąć mięśnie szyi od linii środkowej do obwodu.
    5. Obserwuj, czy odsłonięta jest cisterna magna, która wygląda jak trójkątne okno z przezroczystą membraną opony twardej.
    6. Umieść zespół mikromanipulatora na ramie stereotaktycznej obok myszy, upewniając się, że końcówka kapilary nie dotyka żadnej powierzchni.
    7. Delikatnie rozbij końcówkę kapilarną, nie zakłócając konfiguracji.
    8. Patrząc w lupę (powiększenie 2,25x), obracaj odpowiednimi pokrętłami na mikromanipulatorze, aby powoli wyrównać i przesunąć końcówkę kapilary w kierunku cysterny wielkiej.
    9. Pewien opór jest odczuwalny, gdy końcówka kapilary dotknie membrany cisterna magna. Bardzo powoli dociśnij końcówkę do membrany za pomocą pokręteł.
      UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych naczyń krwionośnych w błonie. Ten krok jest bardzo ważny, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym.
    10. Bardzo delikatnie przebij membranę. Płyn mózgowo-rdzeniowy zacznie natychmiast wpływać do kapilary z powodu podciśnienia w kapilarze.
    11. Pozostaw ustawienie na kilka minut, aż w kapilarze zbierze się ~10 μl płynu mózgowo-rdzeniowego.
    12. Następnie powoli wyciągnij kapilarnę z cisterna magna i delikatnie dociśnij sterylny bawełniany aplikator końcówką do otworu cisterna magna, aby zatrzymać wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego.
    13. Ostrożnie wyjąć kapilarę ze strzykawki i przymocować ją do dozownika z mikronasadką. Naciśnij bańkę, aby przenieść płyn mózgowo-rdzeniowy do sterylnej probówki do mikrowirówki.
    14. Umieść podpórkę pod myszą i obróć pokrętła stereotaktyczne, aby wypoziomować głowę.
    15. Zamknij ranę nylonowymi szwami.
    16. Wstrzyknąć podskórnie 300 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej przed wyjęciem myszy z aparatu.
    17. Zapewnij zwierzętom opiekę pooperacyjną zgodnie z powyższym opisem, aż nadejdzie czas na usunięcie szwów - ~ 7-10 dni po zabiegu.

5. Test glukozy

  1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w zestawie do testów kolorymetrycznych glukozy.
  2. Rozcieńczyć podstawowy roztwór buforowy fosforanu sodu dostarczony w zestawie do stężenia 50 mM w ultraczystej wodzie.
  3. Przygotować wzorce glukozy w zakresach 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 i 50 mg/dl z roztworu podstawowego 1 000 mg/dl dostarczonego w zestawie w rozcieńczonym roztworze buforowym.
  4. Przygotować 7-krotne rozcieńczenie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego w buforze. Na przykład, jeśli całkowita zebrana objętość płynu mózgowo-rdzeniowego wynosi 10 μl, to siedmiokrotnie rozcieńczona objętość wyniesie 70 μl.
  5. Odpipetować 15 μl wzorców glukozy i rozcieńczyć płyn mózgowo-rdzeniowy w dwóch egzemplarzach na 96-dołkowej płytce.
  6. Odpipetować 85 μl rozcieńczonego buforu do każdej z studzienek z wzorcami i płynem mózgowo-rdzeniowym.
  7. Dodać 6 ml rozcieńczonego buforu do fiolki z mieszaniną enzymów kalorymetrycznych glukozy i wirować przez kilka sekund, aby dokładnie wymieszać.
  8. Dodać 100 μl preparatu mieszaniny enzymów do każdego dołka, aby rozpocząć reakcję.
  9. Uszczelnij płytkę arkuszem pokrywy i delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać odczynniki.
  10. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut. Fiolki z wysokim poziomem glukozy natychmiast zaczynają zmieniać kolor na fioletowy.
  11. Po 10 minutach zdjąć pokrywę i zmierzyć absorbancję przy 500-520 nm za pomocą czytnika płytek.
  12. Obliczyć stężenie glukozy w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, interpolując ich wartości z krzywej wzorcowej.

6. Oznaczanie stężenia glukozy we krwi

  1. Wykonaj małe boczne nacięcie na ogonie myszy za pomocą żyletki i użyj kropli krwi, aby zmierzyć poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru, zgodnie z instrukcjami instrukcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Samcom myszom wszczepiono kaniulę połączoną z minipompą osmotyczną (Rysunek 1) w celu przewlekłego infuzyjnego podawania aCSF lub 50% roztworu glukozy do komór bocznych mózgu (Rysunek 2). Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrano 10 dni po zabiegu (Rysunek 3) w celu potwierdzenia skuteczności tej procedury. Wyniki wykazały wzrost poziomu glukozy w CSF (średnia: 327,7 mg/dL) u myszy, którym podawano 50% glukozę, w porównaniu do poziomu (średnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół zwiększania stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym u myszy za pomocą minipomp osmotycznych połączonych z kaniulą wszczepioną w komorę boczną. Przewlekły wlew glukozy w mózg myszy za pomocą tej procedury będzie przydatny w określeniu wpływu długotrwałej hiperglikoryzji na funkcje poznawcze, ogólnoustrojowy metabolizm glukozy i równowagę energetyczną oraz w lepszym zrozumieniu patogenezy powikłań cukrzycy.

Przewlekła cukrzyca powoduje uszkodzen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Narodowe Instytuty Zdrowia przyznają DK124619 KHC.

Fundusze na rozpoczęcie działalności i nagroda za badania pilotażowe, Wydział Medyczny, University of Rochester, NY, dla KHC.

Nagroda Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, dla KHC.

University Research Award, Biuro Wiceprezesa ds. Badań, University of Rochester, NY, dla KHC.

MUR zaprojektował i wykonał metodę, przeanalizował wyniki, przygotował wykresy i rysunki oraz napisał i zredagował manuskrypt. KHC wymyślił i nadzorował badanie, przeanalizował wyniki oraz napisał i zredagował manuskrypt. Gwarantem tej pracy jest KHC. Ostateczna wersja manuskryptu została zaakceptowana przez wszystkich autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m filtr strzykawkowyRoztwory membranoweSFPES030022S
1 ml sterylna strzykawka (końcówka Luer-lok)BD309628
1 ml strzykawka TBBD309659
100 ml Szklana zlewkaFisher Nie dotyczy
100% etanolu (Koptec)DLIUN170Użyj 70% rozcieńczenia do oczyszczenia obszaru operacyjnego
Rurka stożkowa 50 mlFisher Nie dotyczy
Wskaźnik zapłonuKOPF1905
Zestaw do infuzji mózgu AlzetDURECTZestaw # 3; 0008851Przyciąć rurki w zestawie do 1 cala długości
Pompa osmotyczna AlzetDURECT2004Natężenie przepływu 0,25 &mikro; L/h
System anestezjologicznyKent ScientificSomnoSuite
Betadine solutionAvrio HealthN/A
CaCl2 . 2H2OFisher C79-500
Uchwyt kaniuliKOPF1966
Zakres centrowaniaKOPF1915
Płyn do cementudentystycznego Lang DentalREF1404
Cement dentystyczny w proszkuLang DentalREF1220-C
D-glukoza   SigmaG8270
Wiertarka elektrycznaKOPF1911Podczas wiercenia otworu unikaj pęknięcia opony twardej
Smar do oczu (Optixcare)CLC MedicaN/A
Sterylizator z kulkami szklanymi (Germinator 500)VWR101326-488Umieść narzędzia w sterylnej wodzie, aby ostygły przed operacją
Zestaw do oznaczania glukozyCayman chemiczny 10009582
H2O2SigmaH1009-500mlNałóż 3% H2O2 na powierzchnię czaszki, aby szwy czaszkowe były widoczne.
Maszynka do strzyżenia włosówWAHLN/A
poduszka grzewczaHeatpax19520483
HemostatN/AN/A
Isoflurane (Fluriso)ZoetisNDC1385-046-60
KClVWR0395-500g
Stojak magnetycznyWPIM1
Powiększająca lampa biurkowaBrightechLightView Pro Flex 2
Metalowa szpatułkaN/AN/A
MgCl2 . 6H2OFisher BP214-500
Mikromanipulator (praworęczny)WPIM3301R
Mikromanipulator z wyświetlaczem cyfrowymKOPF1940
Na2HPO4 . 7H2OFisher S373-500
NaClSigmaS7653-5Kg
NaH2PO4 . H2OFisher S369-500
NeosporinJohnson & JohnsonN/AStosować miejscowo maść zapobiegającą infekcji
ParafilmBemisDM-999
Rimadyl (karprofen) 50 mg/mlZoetisN/A5 mg/kg, podskórnie, do analgezji
SkalpelN/AN/A
Stereotaktyczny system allignacyjnyKOPF1900
Sterylna igła BD o rozmiarze 27 305109
Sterylne aplikatory z końcówką bawełnianą (Solon)AMD Medicom56200
Sterylne nici nylonowe (5.0)OasisMV-661Do zamykania rany należy stosować niechłonny szew
Sterylne ostre nożyczki N/AN/D
Sterylne ostrza chirurgiczneVWR55411-050
Rękawice chirurgiczne (nitryl)AmmexN/AZmień rękawice w przypadku podejrzenia zanieczyszczenia
PodajnikNIEDOTYCZY
DOTYCZY

Bibliografia

  1. Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. Impact of diabetes on cognitive function and brain structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).
  2. Takeda, S., et al. Diabetes-accelerated memory dysfunction via cerebrovascular inflammation and Abeta deposition in an Alzheimer mouse model with diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (15), 7036-7041 (2010).
  3. Arvanitakis, Z., Wilson, R. S., Bienias, J. L., Evans, D. A., Bennett, D. A. Diabetes mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Archives of Neurology. 61 (5), 661-666 (2004).
  4. Zilliox, L. A., Chadrasekaran, K., Kwan, J. Y., Russell, J. W. Diabetes and cognitive impairment. Current Diabetes Reports. 16 (9), 87(2016).
  5. Reno, C. M., Litvin, M., Clark, A. L., Fisher, S. J. Defective counterregulation and hypoglycemia unawareness in diabetes: mechanisms and emerging treatments. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 42 (1), 15-38 (2013).
  6. Cryer, P. E., Davis, S. N., Shamoon, H. Hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 26 (6), 1902-1912 (2003).
  7. Hwang, J. J., et al. Hypoglycemia unawareness in type 1 diabetes suppresses brain responses to hypoglycemia. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1485-1495 (2018).
  8. Cryer, P. E., Gerich, J. E. Glucose counterregulation, hypoglycemia, and intensive insulin therapy in diabetes mellitus. The New England Journal of Medicine. 313 (4), 232-241 (1985).
  9. Tigchelaar, C., et al. Elevated cerebrospinal fluid glucose levels and diabetes mellitus are associated with activation of the neurotoxic polyol pathway. Diabetologia. 65 (7), 1098-1107 (2022).
  10. Zheng, H., et al. Cognitive decline in type 2 diabetic db/db mice may be associated with brain region-specific metabolic disorders. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (1), 266-273 (2017).
  11. Ernst, A., et al. Diabetic db/db mice exhibit central nervous system and peripheral molecular alterations as seen in neurological disorders. Translational Psychiatry. 3 (5), 263(2013).
  12. Wang, Y., Yang, Y., Liu, Y., Guo, A., Zhang, Y. Cognitive impairments in type 1 diabetes mellitus model mice are associated with synaptic protein disorders. Neuroscience Letters. 777, 136587(2022).
  13. Jolivalt, C. G., et al. Type 1 diabetes exaggerates features of Alzheimer's disease in APP transgenic mice. Experimental Neurology. 223 (2), 422-431 (2010).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2019).
  15. Vinik, A. I., Maser, R. E., Mitchell, B. D., Freeman, R. Diabetic autonomic neuropathy. Diabetes Care. 26 (5), 1553-1579 (2003).
  16. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), 78(2021).
  17. Grieb, P. Intracerebroventricular streptozotocin injections as a model of Alzheimer's disease: in search of a relevant mechanism. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1741-1752 (2016).
  18. Kealy, J., et al. Acute inflammation alters brain energy metabolism in mice and humans: role in suppressed spontaneous activity, impaired cognition, and delirium. The Journal of Neuroscience. 40 (29), 5681-5696 (2020).
  19. Dougherty, J. M., Roth, R. M. Cerebral spinal fluid. Emergency Medicine Clinics of North America. 4 (2), 281-297 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Glukoza w p ynie m zgowo rdzeniowymfunkcje m zgu myszychirurgia stereotaktycznaimplantacja kaniulipobieranie p ynu m zgowo rdzeniowegomodel zaburze poznawczychbariera krew m zgschorzenia neurodegeneracyjneinfuzja glukozy
Implantacja minipompy osmotycznej w celu zwiększenia stężenia glukozy w płynie mózgowo-rdzeniowym myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.