Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65180

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.

Streszczenie

Neuroobrazy są cennym narzędziem do badania morfologii mózgu w eksperymentach z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) stało się standardową metodą badania tkanek miękkich, chociaż jego niska rozdzielczość przestrzenna stwarza pewne ograniczenia dla małych zwierząt. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania trójwymiarowych (3D) informacji o wysokiej rozdzielczości na mózgach i czaszkach noworodków myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT). Protokół obejmuje kroki potrzebne do wypreparowania próbek, wybarwienia i zeskanowania mózgu oraz uzyskania pomiarów morfometrycznych całego narządu i obszarów zainteresowania (ROI). Analiza obrazu obejmuje segmentację struktur oraz digitalizację współrzędnych punktów. Podsumowując, praca ta pokazuje, że połączenie mikrotomografii komputerowej i płynu Lugola jako środka kontrastowego jest odpowiednią alternatywą dla obrazowania okołoporodowych mózgów małych zwierząt. Ten przepływ obrazowania ma zastosowanie w biologii rozwojowej, biomedycynie i innych naukach zainteresowanych oceną wpływu różnych czynników genetycznych i środowiskowych na rozwój mózgu.

Wprowadzenie

Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) jest cennym narzędziem dla różnych dziedzin badań. W biologii nadaje się szczególnie do badań nad kośćmi ze względu na absorpcję promieniowania rentgenowskiego w zmineralizowanych tkankach. Dzięki tej funkcji, z pomocą mikro-CT podjęto różne pytania dotyczące rozwoju kości1, metabolism2 i evolution3,4, między innymi. W 2008 roku de Crespigny i wsp.5 wykazali, że obrazy mikro-tomografii komputerowej mózgów dorosłych myszy i królików można uzyskać przy użyciu jodu jako środka kontrastowego. Prace te otworzyły nowe zastosowanie dla tej techniki obrazowania, ponieważ jod umożliwił uzyskanie obrazów z tkanek miękkich, które w przeciwnym razie byłyby niewrażliwe na promieniowanie rentgenowskie. Tak więc ogólnym celem połączenia mikro-CT i środka kontrastowego na bazie jodu jest uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, w których można rozróżnić i zidentyfikować tkanki miękkie na poziomie mezo lub makroanatomicznym.

Ta technika ma znaczący potencjał do badań, które wymagają szczegółowej charakterystyki fenotypowej ex vivo małych próbek, takich jak embriony myszy, które są szeroko stosowane w projektach eksperymentalnych6. Kontrast jodowy w połączeniu z obrazowaniem mikro-CT został wykorzystany do uzyskania wolumetrycznych kwantyfikacji narządów7 i przełomowych struktur trójwymiarowych (3D)8,9. W ostatnich latach mikrotomografia komputerowa barwionych próbek została zastosowana do opisania cech fenotypowych mózgu gryzoni10 i zaproponowano różne ulepszenia tej techniki. Dla dorosłych mózgów stwierdzono, że protokół 48-godzinnego zanurzenia w jodzie, z wcześniejszym etapem perfuzji hydrożelem, daje obrazy wysokiej jakości11. Gignac et al.12 rozszerzyli granice tej techniki, pokazując, że mózgi szczurów barwione jodem mogą być przetwarzane w celu wykonania rutynowych technik histologicznych. Podobnie, procedury te wykazują obiecujące wyniki dla mózgów gryzoni embrionalnych i przed odsadzeniem8,13,14,15.

Chociaż neuronauka w dużej mierze stosuje techniki oparte na mikroskopie do oceny różnych strukturalnych i funkcjonalnych aspektów rozwoju mózgu, takie badania są bardziej odpowiednie do charakteryzowania konkretnych populacji komórek lub przestrzennie ograniczonych struktur. Z kolei obrazowanie mikro-CT pozwala na opis całych struktur i pozyskanie modeli 3D, które zachowują istotne informacje przestrzenne, co stanowi uzupełnienie technik mikroskopowych. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) jest również standardową techniką stosowaną do badania cech strukturalnych małych zwierząt16,17,18. Jednak mikrotomografia komputerowa, z użyciem środka kontrastowego, ma dwie główne zalety w przypadku próbek utrwalonych ex vivo: skanery mikro-CT są znacznie tańsze i łatwiejsze w obsłudze oraz pozwalają na wyższą rozdzielczość przestrzenną niż MRI12.

Ta praca ma na celu opisanie procedury uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości z mózgów noworodków myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej po barwieniu roztworem Lugola, środkiem kontrastowym na bazie jodu. Przedstawiono kompleksowy protokół, który rozpoczyna się od wstępnych etapów, takich jak pobranie próbki i utrwalenie tkanek, a następnie przechodzi przez barwienie, akwizycję obrazu mikro-CT i standardowe przetwarzanie. Przetwarzanie obrazu obejmuje segmentację objętości 3D całej głowy, a także mózgu, oraz wybór określonych płaszczyzn anatomicznych w celu digitalizacji współrzędnych punktowych, które można następnie wykorzystać w analizach morfometrycznych. Chociaż skupiamy się tutaj na mózgu noworodka myszy, podobne strategie można zastosować do innych tkanek miękkich. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół jest na tyle elastyczny, że można go zastosować, z subtelnymi modyfikacjami, do innych typów próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Pobieranie i przygotowanie próbek

  1. Przygotuj 500 ml 4% paraformaldehydu (PFA).
    1. Pod topnikiem ekstrakcyjnym w komorze dodać 20 g proszku PFA do 250 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Umieść zlewkę z magnesem na magnetycznej płytce mieszającej.
    2. Mieszać podczas podgrzewania. Za pomocą termometru stale sprawdzaj temperaturę roztworu, aby utrzymać ją poniżej 60 °C.
    3. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj krople 1 M NaOH do roztworu, aby rozpuścić PFA. Gdy proszek PFA całkowicie się rozpuści, schłodzić roztwór w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Dostosuj objętość do 500 ml za pomocą 1x PBS. Dostosuj pH do 7,2-7,3, dodając krople 1 M HCl za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
    5. Za pomocą filtra papierowego i szklanego lejka przefiltruj roztwór w szklanej butelce o pojemności 1 l.
    6. Zamknij szklaną butelkę, wyjmij ją z szafki z topnikiem i przechowuj w lodówce w temperaturze -4 °C.
  2. Zbierz próbki mózgu.
    1. Aby uzyskać próbki, należy złożyć w ofierze mysie noworodki następnego dnia po urodzeniu, w wieku 0,5 dnia (P 0,5), używając nożyczek chirurgicznych do odcięcia im głów.
    2. Umieść nożyczki na szyi noworodka, trzymając ciało i wykonaj pojedyncze i czyste cięcie.
  3. Utrwal próbki w PFA.
    1. Napełnij stożkową probówkę o pojemności 50 ml 40 ml 4% PFA.
    2. Zanurz każdą głowę w probówce zawierającej PFA jako środek utrwalający. Do tej czynności użyj szpatułki Paton lub łyżki.
    3. Probówki stożkowe należy przechowywać w lodówce w temperaturze -4 °C przez 48 godzin, a następnie zmienić na 40 ml 1x PBS z 0,1% azydkiem sodu jako środkiem konserwującym. Przechowywać w lodówce w temperaturze -4 °C.

2. Barwienie próbki

  1. Przygotować płyn Lugola (3,75% w/v).
    1. Pod topnikiem ekstrakcyjnym w szafce, w szklanej zlewce o pojemności 1 l, rozpuścić 10 g Kl i 5 g I2 w 400 ml wody destylowanej, stale mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego.
  2. Zanurz każdą głowę w stożkowej rurce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml płynu Lugola.
    1. W przypadku noworodków o przybliżonej wielkości ciała 1,3 g należy pozostawić próbki zanurzone na 15-20 godzin z ciągłym mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
    2. Umieść próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 1% agarozy na 30 minut przed skanowaniem.

3. Skanowanie mikro-tomografem komputerowym

UWAGA: Skanowanie mikrotomografem komputerowym wymaga specjalnego sprzętu. Istnieją różne opcje tego rodzaju skanera, a szczegóły dotyczące zakupu zależą od charakterystyki używanego sprzętu. Laboratorium dr Hallgrímssona liczy na kilka alternatyw dla mikrotomografów komputerowych. W tym przypadku protokół opiera się na użyciu podstawowego skanera biurkowego, który jest jednym z bardziej dostępnych urządzeń do obrazowania małych zwierząt używanych przez laboratoria na całym świecie. Jeśli celem skanowania jest czaszka, pomiń kroki opisane w sekcji 2 protokołu i przejdź do sekcji 3. Po zeskanowaniu czaszki można przeprowadzić proces barwienia i skanowanie mózgu w celu uzyskania obrazów z tych samych próbek zarówno mózgu, jak i czaszki.

  1. Umieścić próbkę w uchwycie mikrotomografu komputerowego.
    1. Umieścić próbkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zamocuj próbkę, aby uniknąć ruchów podczas sesji skanera. W tym celu można użyć pewnego materiału poliuretanowego do wypełnienia pustych części tuby.
    2. Otwórz urządzenie i umieść probówkę z próbką w uchwycie mikro-CT.
    3. Zaloguj się do panelu sterowania mikrotomografu komputerowego i zarejestruj próbkę do skanowania. Spowoduje to automatyczne wygenerowanie liczby próby. Oprócz numeru wypełnij pole "Nazwa". Zarówno nazwa, jak i numer próbki powinny być zapisane w innym miejscu (np. w arkuszu kalkulacyjnym) na wypadek, gdyby konieczne było ponowne pobranie surowych danych.
    4. Uruchom program do skanowania. Wprowadź nazwę lub numer próbki i wybierz plik kontrolny, który powinien zawierać parametry skanowania.
  2. Zeskanuj próbkę.
    1. Na ekranie oprogramowania mikro-CT ustaw następujące parametry: izotropowa wielkość woksela 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, czas integracji 800 000 ms i 500 projekcji na 180°.
    2. Ustaw region skanowania, wybierając opcję Scout View (Widok skauta). Gdy pojawi się obraz referencyjny, naciśnij Linia odniesienia, aby ustawić region. Przesuń ciągłą zieloną linię do krawędzi próbki, a następnie przytrzymaj Shift podczas przeciągania kursora, aby rozszerzyć obszar skanowania na drugą krawędź próbki.
    3. Wybierz przycisk OK, aby rozpocząć skanowanie.
  3. Oceń i wyeksportuj skan.
    1. Otwórz program oceny skanera mikro-CT i kliknij Wybierz próbkę i pomiar. W polu Filtr wpisz nazwę próbki, wybierz próbkę i wybierz plik pomiaru.
    2. Plik zostanie załadowany jako plasterki, których liczba zależy od początkowego okna skanowania. Kliknij przycisk Załaduj wszystko, który załaduje każdy plasterek i ułatwi późniejsze przemieszczanie się między plasterkami.
    3. Wybierz opcję Zadania > Ocena 3D, aby zainicjować pole przycinania wokół plasterków. Pojawi się monit Ocena 3D z wieloma polami, w tym Zadanie/Ocena, VOI (Wolumen zainteresowania), Rozpocznij X, Y, Z i Wymiar X, Y, Z.
    4. Ustaw pole Zadanie > Ocena 3D na odpowiedni skrypt, ponieważ można wykonywać różne zadania oceny, takie jak rekonstrukcja, segmentacja, morfometria (np. gęstość mineralna kości) oraz konwersje lub transfery plików. Skrypt oceny domyślnej może służyć jako przewodnik.
    5. Po wybraniu skryptu dostosuj pole VOI na głównym obrazie. Zacznij od pierwszego plasterka. Upewnij się, że pudełko zawiera anatomię, która ma być oceniona. Przesuń VOI, klikając prawym przyciskiem myszy jeden z małych białych kwadratów w kierunku krawędzi pola i zmieniając rozmiar VOI za pomocą środkowego przycisku myszy. Alternatywnie dostosuj numerycznie pola wymiaru.
    6. Przejdź przez próbkę za pomocą paska przewijania pod obrazem, aby upewnić się, że wszystkie anatomie zostały uchwycone w polu VOI. Kliknij XY, XZ lub YZ w lewym górnym rogu oprogramowania, aby zmienić orientację.
    7. Wybierz pozycję Rozpocznij ocenę. W zależności od skryptu oceny zadania spowoduje to wygenerowanie pliku obrazu 3D .aim z odpowiadającym mu plikiem nagłówkowym .txt. Dodatkowo w skrypcie można określić ścieżkę do protokołu FTP (File Transfer Protocol) obrazu do określonej lokalizacji.

4. Przetwarzanie obrazu

  1. Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów.
    UWAGA: Przetwarzanie obrazu może odbywać się za pomocą różnych programów. Protokół ten zawiera podstawowe kroki w komercyjnym oprogramowaniu, które jest powszechnie akceptowane w tej dziedzinie i zawiera wszechstronne narzędzia do podstawowego i zaawansowanego przetwarzania. Ponadto istnieją różne dopuszczalne formaty zrekonstruowanych obrazów mikrotomografii komputerowej. Ten aspekt zwykle zależy od sprzętu używanego do akwizycji i jego oprogramowania. Tutaj przetwarzanie obrazu odbywa się za pomocą .bmp obrazów. Tę samą procedurę można zastosować do obrazów .tiff i innych typów. Ponieważ akwizycja odbywa się w skanerze z .aim jako domyślnym formatem, najpierw prezentowana jest konwersja z .aim na .bmp.
    1. Aby otworzyć pliki .im, wybierz pozycję Plik > Otwórz dane i wybierz plik. Następnie otworzy się okno z tytułem Wybór formatu pliku. Wybierz opcję Raw Data (Nieprzetworzone dane).
    2. Otworzy się okno z tytułem Parametry danych surowych. W tym oknie wypełnij parametry zgodnie z informacjami w pliku nagłówka .txt, który jest generowany dla każdego pliku .aim. W polu Data Type (Typ danych) wybierz opcję 16-bit (16-bitowy) dla nagłówka wraz z liczbą po polu Dane obrazu rozpoczynają się od przesunięcia bajtu. Ustaw również wymiary i rozmiar woksela, korzystając z informacji zawartych w pliku nagłówka .txt. Po wprowadzeniu parametrów naciśnij przycisk OK.
    3. Jeśli potrzebna jest konwersja z .aim na .bmp, w Panelu głównym > widoku projektu kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt .aim i wybierz opcję Konwertuj > Konwertuj typ obrazu. W obszarze Właściwości wybierz opcję 8-bit (Typ danych wyjściowych). Wybierz pozycję Zastosuj.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowy 8-bitowy obiekt. Wybierz pozycję Zapisz jako. Wybierz .bmp i zapisz.
    5. Aby otworzyć plik .bmp, wybierz opcję Plik > Otwórz dane i wybierz plik. Następnie otworzy się okno z parametrami obrazu. Potwierdź parametry i zaakceptuj, jeśli są poprawne.
    6. W Panelu głównym > widoku projektu tworzony jest nowy obiekt o nazwie plików .bmp. Kliknij ten obiekt prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Przekrój orto. W obszarze Właściwości wybierz numer plasterka i płaszczyznę orientacji, które chcesz wyświetlić.
  2. Uzyskaj objętości 3D kompletnej głowicy.
    1. W panelu głównym > widoku projektu kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt obrazu. Wybierz opcję Interaktywne progowanie > Utwórz. W oknie Właściwości zmieniaj wartości w polach Minimalne RGB i Maksymalne RGB, aż zostanie zaznaczona część obrazu odpowiadająca głowie zwierzęcia. Wybierz pozycję Zastosuj.
    2. W Panelu głównym > widoku projektu tworzony jest obiekt z progiem. Kliknij prawym przyciskiem myszy ten obiekt i w obszarze Właściwości wybierz opcję Isosurface. W obszarze Właściwości wybierz próg, aby zwizualizować powierzchnię, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Próg ten należy wybrać empirycznie, a następnie może być konieczne zbadanie różnych wartości.
  3. Digitalizacja współrzędnych punktów
    1. Współrzędne punktów 3D mogą być digitalizowane zarówno na podstawie przekrojów, jak i wyodrębnionych powierzchni. W przypadku pierwszej opcji kliknij prawym przyciskiem myszy opcję obrazu i wybierz opcję Pokrój. W polu Tłumacz wybierz żądany plasterek w płaszczyźnie osiowej. Jeśli płaszczyzna nie jest prawidłowo umieszczona, kliknij przycisk Opcje > Obróć we właściwościach, aby określić właściwą orientację.
    2. Aby zdigitalizować punkty orientacyjne, kliknij prawym przyciskiem myszy w Panelu głównym > widoku projektu i wybierz opcję Utwórz obiekt > punktów i linii > punktów orientacyjnych. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowe punkty orientacyjne obiektu i wybierz opcję Widok punktu orientacyjnego. W widoku punktu orientacyjnego zmodyfikuj rozmiar punktu w polu Rozmiar. Aby dodać punkty orientacyjne w oknie Właściwości, należy użyć opcji Dodaj w trybie edycji.
      UWAGA: Dla noworodków zestaw punktów orientacyjnych i półpunktów orientacyjnych wokół osiowych i strzałkowych krzywizn mózgu został wcześniej opublikowany14.
    3. Najpierw wybierz płaszczyznę osiową, która przecina najbardziej rostralny punkt opuszki węchowej i najbardziej ogonowy punkt kory.
    4. Wybierz obiekty Punkty orientacyjne, a następnie w obszarze Właściwości wybierz opcję Edytor punktów orientacyjnych. Za pomocą strzałki kliknij w miejsce, w którym punkt ma zostać zdigitalizowany.
    5. W proponowanym zestawie punktów orientacyjnych digitalizowane są 24 punkty w wybranej płaszczyźnie osiowej. Zdigitalizuj pierwszy w najbardziej ogonowym punkcie mózgu w linii środkowej.
    6. Zdigitalizuj pięć punktów równomiernie rozmieszczonych na krzywej (półpunkty orientacyjne) aż do następnego punktu orientacyjnego na przecięciu śródmózgowia i kory mózgowia.
    7. Następnie zdigitalizuj osiem punktów (półpunktów orientacyjnych) wokół kory mózgowej.
    8. Zdigitalizuj nowy punkt orientacyjny na skrzyżowaniu kory mózgowej i opuszki węchowej. Następnie zdigitalizuj cztery punkty (półpunkty orientacyjne) wokół opuszki węchowej.
    9. Zdigitalizuj nowy punkt orientacyjny w najbardziej rostralnym punkcie opuszki węchowej na linii środkowej. Następnie zdigitalizuj dwa punkty (półpunkty orientacyjne) pomiędzy obiema opuszkami węchowymi.
    10. Digitalizacja nowego punktu orientacyjnego w najbardziej ogonowym punkcie opuszki węchowej na linii środkowej.
    11. W przypadku punktów strzałkowych ustal wycinek po prawej stronie mózgu w płaszczyźnie przystrzałkowej, w której mózg jest najbardziej wydatny doogonowo.
    12. W proponowanym układzie punktów orientacyjnych digitalizowane są 33 punkty w wybranej płaszczyźnie parastrzałkowej. Zdigitalizuj pierwszy na przecięciu międzymózgowia i tyłomózgowia. Następnie zdigitalizuj dziewięć punktów (półpunktów orientacyjnych) w brzusznej granicy mózgu.
    13. Zdigitalizuj nowy punkt orientacyjny w najbardziej rostralnym punkcie opuszki węchowej. Następnie zdigitalizuj trzy punkty (półpunkty orientacyjne) wokół opuszki węchowej.
    14. Zdigitalizuj nowy punkt orientacyjny na skrzyżowaniu opuszki węchowej i kory mózgowej. Następnie zdigitalizuj trzy punkty (półpunkty orientacyjne) wokół opuszki węchowej.
    15. Zdigitalizuj nowy punkt orientacyjny na skrzyżowaniu opuszki węchowej i kory mózgowej. Następnie zdigitalizuj siedem punktów (półpunktów orientacyjnych) wokół kory mózgowej.
    16. Digitalizacja nowego punktu orientacyjnego na skrzyżowaniu kory mózgowia i śródmózgowia. Następnie zdigitalizuj siedem punktów (półpunktów orientacyjnych) wokół kory mózgowej.
    17. Digitalizacja nowego punktu orientacyjnego na skrzyżowaniu kory mózgowia i śródmózgowia. Następnie zdigitalizuj sześć punktów (półpunktów orientacyjnych) wokół śródmózgowia.
    18. Digitalizacja nowego punktu orientacyjnego na skrzyżowaniu śródmózgowia i móżdżku. Następnie zdigitalizuj dwa punkty (półpunkty orientacyjne) wokół móżdżku.
    19. Digitalizacja nowego punktu orientacyjnego na skrzyżowaniu móżdżku i tyłomózgowia.
    20. Zapisz zdigitalizowane punkty. Kliknij prawym przyciskiem myszy obiekty Punkty orientacyjne i wybierz opcję Zapisz dane.
  4. Przeanalizuj współrzędne punktu.
    UWAGA: Po zdigitalizowaniu współrzędnych punktów dla zestawu próbek, można przeprowadzić podstawowe analizy za pomocą narzędzi morfometrii geometrycznej w celu uzyskania zmiennych rozmiaru (rozmiaru środka ciężkości) i kształtu (kształt lub współrzędne Prokrustesa). Analizy są przeprowadzane w darmowym, otwartym środowisku oprogramowania, które jest szczególnie przydatne do analiz statystycznych.
    1. Za pomocą notatnika zbuduj plik zawierający współrzędne wszystkich zdigitalizowanych okazów. W tym celu należy postępować zgodnie z formatem TPS, zgodnie z opisem w https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
    2. Otwórz oprogramowanie statystyczne. Wybierz opcję Plik > Zmień katalog, aby wybrać katalog, w którym zapisany jest plik .tps.
    3. Wybierz pozycję Pakiety > Zainstaluj pakiety. Wybierz jedno lustro kraty. Poszukaj geomorfu i zainstaluj go.
    4. Załaduj pakiety, wpisując w konsoli: library(geomorph) i library(Morpho).
    5. Załaduj zestaw danych, wpisując w konsoli: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
    6. Wykonaj uogólnioną analizę Prokrustesa, wpisując w konsoli: GPA<- gpagen(dataset).
    7. Uzyskaj rozmiar środka ciężkości, wpisując w konsoli: CS<-GPA$Csize.
    8. Uzyskaj współrzędne Procrustesa, wpisując w konsoli: ProcCoord<- GPA$coords.
    9. Wykreśl współrzędne Procrustes i średni kształt, wpisując w konsoli: plotAllSpecimens(ProcCoord).
  5. Segmentacja ROIs
    UWAGA: Aby podzielić mózg na segmenty i uzyskać rekonstrukcję 3D, ręcznie zidentyfikuj tkanki mózgowe w każdym wycinku. Tę samą procedurę można zastosować do określonych ROI, takich jak opuszki węchowe, kora mózgowa itp.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy Panel główny > widoku projektu i wybierz Utwórz obiekt > pole etykiety.
    2. Wybierając obiekt Pole etykiety, naciśnij opcję Edytor segmentacji w oknie Właściwości.
    3. W sekcji Materiały dodaj nowy materiał i, jeśli to konieczne, zmień jego nazwę na Mózg.
    4. W obszarze Zaznaczenie wybierz opcję Bieżący wycinek, aby podzielić tkankę odpowiadającą mózgowi w każdym wycinku.
    5. Korzystając z opcji dostępnych w Narzędziach, wybierz tkankę mózgową w każdym wycinku. W tym przypadku najbardziej odpowiednia jest magiczna różdżka i pędzel.
    6. Po dokonaniu zaznaczenia w każdym plasterku naciśnij przycisk Dodaj w zaznaczeniu.
    7. Po zakończeniu zaznaczania we wszystkich plasterkach wróć do widoku projektu w panelu głównym i kliknij prawym przyciskiem myszy pole etykiety, aby wybrać opcję Generuj powierzchnię, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
    8. Po uzyskaniu powierzchni wyeksportuj ją, stosując polecenie Wyodrębnij powierzchnię.
    9. Aby uzyskać objętość struktur podzielonych na segmenty, w Panelu głównym > Widoku projektu wybierz obiekt zawierający etykietę, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Zmierz i przeanalizuj > ułamek objętości. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiono podstawowy protokół uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy o wysokiej rozdzielczości. Głowy skanowano po zanurzeniu w roztworze Lugola. Pomimo niewielkiego rozmiaru, można rozróżnić główne struktury anatomiczne mózgu, takie jak opary węchowe, kora mózgową, śródmózowie, móżdżek i rąbie mózgu (Rysunek 1).

Wykorzystując te obrazy jako dane wejściowe, można przeprowadzić różne analizy. Zdigitalizowano zestaw punktów orientacyj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono zwięzły protokół skanowania tkanek mózgowych noworodków myszy za pomocą mikro-CT ze środkiem kontrastowym. Ponadto zawiera proste procedury uzyskiwania wyników ilościowych i jakościowych. Opierając się na tych metodach, można przeprowadzić dalsze alternatywne lub uzupełniające analizy.

Jak pokazano w protokole, obrazy mikro-CT mogą być analizowane na różne sposoby. W poprzednich badaniach nasza grupa oszacowała zmienność wielkości i kształtu w okołoporodowych m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Wei Liu za jego pomoc techniczną. Praca ta jest finansowana przez ANPCyT PICT 2017-2497 i PICT 2018-4113.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  &mikro; CT 35Scanco Medical AGNależy pamiętać, że Scanco nie oferuje  &mikro; CT 35 już. Ich najmniejszy skaner to teraz  &mikro; CT 45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MyszyBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata Rurki
stożkoweDaiggerCH-CI4610-1856
Szafka na topnikEscoAC2-458 
Szklana zlewka GlasscoGL-229.202.10
Szklana butelkaSimaxCFB017
Lejek szklanyHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Manipuluj pod szafką z topnikiem i używaj środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice)
I2Cicarelli804211Podczas przygotowywania I2KI należy manipulować pod szafką z topnikiem i stosować środki ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice)
KICicarelliPA131542.1210Podczas przygotowywania I2KI należy manipulować pod szafką z topnikiem i stosować środki ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice)
Mieszadło magnetyczneArcano4925
NaOHCicarelli1580110Manipulować pod szafką z topnikiem i używać środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice)
Wytrząsarka orbitalnaBiomintBM021
Paraformaldehyd Biopack2000959400Manipuluj pod szafką z topnikiem i używaj środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice)
Szpatułka PatonGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Plastikowa pipeta PasteuraDaigger9153
RR ProjectPakiet geomorficzny dla R został użyty w protokole (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Nożyczki Belmed
Azydek soduBiopack2000163500
TermometrDaigger7650

Bibliografia

  1. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  2. Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660(2021).
  3. Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
  4. Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
  5. de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  6. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  7. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  8. Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227(2016).
  9. Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
  10. Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
  11. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  12. Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
  13. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  14. Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
  15. Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184(2022).
  16. Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
  17. Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615(2018).
  18. Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
  19. Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  21. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  22. Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

M zg noworodka myszysegmentacja m zguroztw r Lugola3D rekonstrukcja m zguobrazowanie z u yciem rodka kontrastowegomorfologia m zguprzetwarzanie obraz wrozwojowe obrazowanie neuronowe
Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.