To badanie opisuje etapy uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy w wysokiej rozdzielczości poprzez połączenie mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) i środka kontrastowego w próbkach ex vivo. Opisujemy podstawowe analizy morfometryczne w celu ilościowego określenia wielkości i kształtu mózgu na tych obrazach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neuroobrazy są cennym narzędziem do badania morfologii mózgu w eksperymentach z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) stało się standardową metodą badania tkanek miękkich, chociaż jego niska rozdzielczość przestrzenna stwarza pewne ograniczenia dla małych zwierząt. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania trójwymiarowych (3D) informacji o wysokiej rozdzielczości na mózgach i czaszkach noworodków myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej (micro-CT). Protokół obejmuje kroki potrzebne do wypreparowania próbek, wybarwienia i zeskanowania mózgu oraz uzyskania pomiarów morfometrycznych całego narządu i obszarów zainteresowania (ROI). Analiza obrazu obejmuje segmentację struktur oraz digitalizację współrzędnych punktów. Podsumowując, praca ta pokazuje, że połączenie mikrotomografii komputerowej i płynu Lugola jako środka kontrastowego jest odpowiednią alternatywą dla obrazowania okołoporodowych mózgów małych zwierząt. Ten przepływ obrazowania ma zastosowanie w biologii rozwojowej, biomedycynie i innych naukach zainteresowanych oceną wpływu różnych czynników genetycznych i środowiskowych na rozwój mózgu.
Wprowadzenie
Obrazowanie metodą mikrotomografii komputerowej (micro-CT) jest cennym narzędziem dla różnych dziedzin badań. W biologii nadaje się szczególnie do badań nad kośćmi ze względu na absorpcję promieniowania rentgenowskiego w zmineralizowanych tkankach. Dzięki tej funkcji, z pomocą mikro-CT podjęto różne pytania dotyczące rozwoju kości1, metabolism2 i evolution3,4, między innymi. W 2008 roku de Crespigny i wsp.5 wykazali, że obrazy mikro-tomografii komputerowej mózgów dorosłych myszy i królików można uzyskać przy użyciu jo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
1. Pobieranie i przygotowanie próbek
- Przygotuj 500 ml 4% paraformaldehydu (PFA).
- Pod topnikiem ekstrakcyjnym w komorze dodać 20 g proszku PFA do 250 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w szklanej zlewce o pojemności 1 l. Umieść zlewkę z magnesem na magnetycznej płytce mieszającej.
- Mieszać podczas podgrzewania. Za pomocą termometru stale sprawdzaj temperaturę roztworu, aby utrzymać ją poniżej 60 °C.
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj krople 1 M N....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym materiale przedstawiono podstawowy protokół uzyskiwania obrazów mózgów noworodków myszy o wysokiej rozdzielczości. Głowy skanowano po zanurzeniu w roztworze Lugola. Pomimo niewielkiego rozmiaru, można rozróżnić główne struktury anatomiczne mózgu, takie jak opary węchowe, kora mózgową, śródmózowie, móżdżek i rąbie mózgu (Rysunek 1).
Wykorzystując te obrazy jako dane wejściowe, można przeprowadzić różne analizy. Zdigitalizowano zestaw punktów orientacyj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiono zwięzły protokół skanowania tkanek mózgowych noworodków myszy za pomocą mikro-CT ze środkiem kontrastowym. Ponadto zawiera proste procedury uzyskiwania wyników ilościowych i jakościowych. Opierając się na tych metodach, można przeprowadzić dalsze alternatywne lub uzupełniające analizy.
Jak pokazano w protokole, obrazy mikro-CT mogą być analizowane na różne sposoby. W poprzednich badaniach nasza grupa oszacowała zmienność wielkości i kształtu w okołoporodowych m.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Wei Liu za jego pomoc techniczną. Praca ta jest finansowana przez ANPCyT PICT 2017-2497 i PICT 2018-4113.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| &mikro; CT 35 | Scanco Medical AG | Należy pamiętać, że Scanco nie oferuje &mikro; CT 35 już. Ich najmniejszy skaner to teraz &mikro; CT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Myszy | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata Rurki | ||
| stożkowe | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Szafka na topnik | Esco | AC2-458 | |
| Szklana zlewka | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Szklana butelka | Simax | CFB017 | |
| Lejek szklany | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipuluj pod szafką z topnikiem i używaj środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | Podczas przygotowywania I2KI należy manipulować pod szafką z topnikiem i stosować środki ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | Podczas przygotowywania I2KI należy manipulować pod szafką z topnikiem i stosować środki ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice) |
| Mieszadło magnetyczne | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulować pod szafką z topnikiem i używać środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice) |
| Wytrząsarka orbitalna | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyd | Biopack | 2000959400 | Manipuluj pod szafką z topnikiem i używaj środków ochrony osobistej (maska, szkło i rękawice) |
| Szpatułka Paton | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastikowa pipeta Pasteura | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | Pakiet geomorficzny dla R został użyty w protokole (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Nożyczki | Belmed | ||
| Azydek sodu | Biopack | 2000163500 | |
| Termometr | Daigger | 7650 |
Bibliografia
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
