Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tkanina antybakteryjna wykorzystująca nano-ziołową enkapsulację olejków eterycznych

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65187

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College

W tym artykule

Podsumowanie

Antybakteryjne fartuchy laboratoryjne zapobiegają zanieczyszczeniu krzyżowemu w wyniku nagromadzenia patogenów i przypadkowych wycieków biologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół opracowywania przyjaznej dla skóry tkaniny przeciwdrobnoustrojowej przy użyciu nanoziołowej enkapsulacji i zmodyfikowanych standardowych testów w celu precyzyjnej oceny skuteczności i przydatności do typowego zastosowania fartucha laboratoryjnego.

Streszczenie

Fartuchy laboratoryjne są powszechnie używane w laboratoriach zagrożeń biologicznych i placówkach opieki zdrowotnej jako odzież ochronna, aby zapobiec bezpośredniemu narażeniu na patogeny, rozlanie i oparzenia. Te powłoki ochronne na bazie bawełny zapewniają idealne warunki do rozwoju drobnoustrojów i miejsc przyczepiania się ze względu na ich porowaty charakter, zdolność zatrzymywania wilgoci i zatrzymywanie ciepła z ciała użytkownika. Kilka badań wykazało przeżywalność bakterii chorobotwórczych na odzieży szpitalnej i fartuchach laboratoryjnych, działających jako wektory transmisji mikrobiologicznej.

Powszechnym podejściem do rozwiązania tych problemów jest zastosowanie środków przeciwbakteryjnych w wykańczaniu tekstyliów, ale obawy zostały zgłoszone ze względu na toksyczność i wpływ na środowisko wielu syntetycznych chemikaliów. Trwająca pandemia otworzyła również okno do badań nad skutecznymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi oraz przyjaznymi dla środowiska i nietoksycznymi preparatami. W badaniu wykorzystano dwa naturalne związki bioaktywne, karwakrol i tymol, zamknięte w nanocząsteczkach chitozanu, które gwarantują skuteczną ochronę przed czterema ludzkimi patogenami z redukcją do 4 log (99,99%). Patogeny te są często wykrywane w fartuchach laboratoryjnych używanych w laboratoriach zagrożeń biologicznych.

Tkaniny poddane obróbce wytrzymały również do 10 cykli prania z 90% redukcją mikrobiologiczną, co jest wystarczające dla zamierzonego zastosowania. Dokonaliśmy modyfikacji w istniejących standardowych testach tkanin, aby lepiej odwzorować typowe scenariusze użycia fartuchów laboratoryjnych. Udoskonalenia te pozwalają na dokładniejszą ocenę skuteczności przeciwdrobnoustrojowych fartuchów laboratoryjnych oraz na symulację losu wszelkich przypadkowych wycieków drobnoustrojów, które muszą zostać zneutralizowane w krótkim czasie. Zaleca się dalsze badania w celu zbadania akumulacji patogenów w czasie na przeciwdrobnoustrojowych fartuchach laboratoryjnych w porównaniu ze zwykłymi powłokami ochronnymi.

Wprowadzenie

Biały fartuch ochronny jest obowiązkowym elementem wyposażenia ochrony osobistej (PPE) w laboratoriach mikrobiologicznych i placówkach służby zdrowia, i chroni przed bezpośrednim narażeniem na patogeny, wycieki i oparzenia. Te bawełniane płaszcze sprzyjają rozwojowi drobnoustrojów ze względu na wiele czynników - tkanina zapewnia miejsca mocowania i napowietrzania, bawełna i skrobia używane w procesie produkcyjnym wraz ze złuszczonymi komórkami nabłonka od użytkownika dostarczają składników odżywczych, a bliskość użytkownika zapewnia ciepło i wilgoć. Nagromadzenie drobnoustrojów na tekstyliach może również powodować problemy zdrowotne, takie jak alergie i infekcje szpitalne, nieprzyjemne zapachy i niszczenie tkanin1.

W przeciwieństwie do zwykłego ubrania, płaszcze ochronne są rzadko prane lub dezynfekowane, co stwierdzono w wielu ankietach2,3. Wiele badań wskazuje na to, że fartuchy laboratoryjne działają jako wektor przenoszenia drobnoustrojów i ryzyka zakażeń szpitalnych w placówkach opieki zdrowotnej2,4, szczególnie oporne szczepy3, takie jak oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA); w ten sposób budzą obawy zdrowotne związane ze środkami ochrony indywidualnej, które mają chronić przed zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. Nie ma wystarczającej liczby badań przekrojowych dotyczących zakażeń związanych z fartuchem laboratoryjnym w kontekście obiektów o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub laboratoriów dydaktycznych mikrobiologii, ale wiele organów regulacyjnych ogranicza stosowanie fartuchów laboratoryjnych na poziomie hermetyzacji. Jednak wiele instytucji akademickich w Ameryce Północnej ma trudności ze spełnieniem wymagań ze względu na ograniczenia praktyczne, takie jak pranie i przechowywanie w obiekcie, powszechne są przypadki noszenia fartuchów laboratoryjnych w miejscach publicznych, takich jak stołówki i biblioteki. Jednym z praktycznych rozwiązań tych problemów jest zastosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych w wykańczaniu tekstyliów.

Tkaniny antybakteryjne zyskują coraz większą popularność w odzieży sportowej, sportowej i skarpetach, głównie w celu zmniejszenia zapachu ciała. Jednak użycie tych tkanin nie jest powszechne w opracowywaniu środków ochrony indywidualnej, z wyjątkiem niektórych pokrytych srebrem masek bawełnianych i odzieży medycznej5. Informujemy o opracowaniu tkaniny przeciwdrobnoustrojowej do fartuchów laboratoryjnych, która hamuje powszechne patogeny występujące w laboratoriach BSL-2 i zapewnia skuteczną ochronę przed zanieczyszczeniem krzyżowym powszechnych patogenów.

Obecnie na rynku dostępne są różne tkaniny i wykończenia przeciwdrobnoustrojowe, ale większość z nich wykorzystuje ciężkie cząsteczki koloidalne metali (np. srebro, miedź,), metaloorganiczne lub syntetyczne chemikalia, takie jak triklosan i czwartorzędowe związki amoniowe, które nie są przyjazne dla środowiska1 i mogą prowadzić do problemów zdrowotnych, takich jak podrażnienia skóry i alergie6. Niektóre preparaty syntetyczne stwarzają obawy ze względu na drobnoustroje niebędące przedmiotem zwalczania, takie jak normalna flora bakteryjna lub indukowanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) reguluje komercyjne tkaniny przeciwdrobnoustrojowe, które muszą być nietoksyczne dla użytkownika i wolne od ekotoksyczności. Dlatego preferowane są tkaniny przeciwdrobnoustrojowe na bazie naturalnych biocydów, które hamują szerokie spektrum drobnoustrojów. Olejki eteryczne (EO) są szeroko stosowane jako środki przeciwbakteryjne i terapeutyczne, ale ich zastosowanie w wykańczaniu przeciwdrobnoustrojowym jest ograniczone ze względu na ich trwałość6,7,8. Opierając się na naszej wiedzy i badaniach rynkowych dotyczących nano-ziołowych wykończeń8, żadna ziołowa tkanina przeciwbakteryjna nie jest dostępna na rynku. Dzieje się tak, ponieważ powłoki syntetyczne są łatwe w produkcji i mają długą żywotność. Kilka tkanin pokrytych nano-ziołami zgłoszonych tylko do celów badawczych to neem7, moringa9 i curry leaves9.

Niniejsze badanie wykorzystuje dwa bioaktywne składniki ekstrahowane z EOs oregano, karwakrol i tymol, które są skuteczne przeciwko szerokiej gamie patogenów bakteryjnych i wirusów, ale są ogólnie uznawane za bezpieczne dla ludzi10. Jednak te bioaktywne składniki są lotne, a zatem ich potencjał przeciwdrobnoustrojowy jest krótkotrwały, jeśli zostanie zastosowany bezpośrednio na tkaninę. Enkapsulacja nano-ziołowa to proces, w którym bioaktywne składniki lub leki są ładowane do polimerowej powłoki, która chroni rdzeń przed degradacją środowiska, a tym samym wydłuża okres przydatności do spożycia. Ponadto niewielki rozmiar cząstek polimerowych, które zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 10 nm do 100 nm, zwiększa skuteczność aplikacji i spowalnia uwalnianie związków bioaktywnych na tkaninę. Te bioaktywne związki są używane do różnych celów, takich jak konserwacja żywności10, ale nie do powlekania tekstyliów.

Wśród wielu polimerowych enkapsulantów, chitozan jest atrakcyjnym kandydatem ze względu na wiele jego cech, takich jak nietoksyczność, biodegradowalność, mukoadhezyjność i biokompatybilność11. Jest to naturalny polisacharyd, otrzymywany w procesie deacetylacji z chityny, która znajduje się w muszlach morskich i ścianach komórkowych grzybów. Jest używany w zastosowaniach biochemicznych i konserwujących żywność, takich jak dostarczanie leków lub białek11,12,13, kontrolowane uwalnianie14 i folie przeciwdrobnoustrojowe10. Chitozan nie jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, ale tworzy zawiesinę koloidalną w środowisku kwaśnym. Cząsteczki bioaktywne są ładowane do nanocząstek chitozanu (NPs) za pomocą prostej, dwuetapowej metody żelowania jonowego14,15,16. W tym procesie hydrofobowe związki bioaktywne, takie jak karwakrol i tymol, tworzą emulsję typu olej w wodzie, która jest wspomagana przez środek powierzchniowo czynny, Tween 80. Następnie stosuje się związek polianionowy, tripolifosforan pentasodu (TPP), do tworzenia wiązań krzyżowych między grupami aminowymi wzdłuż cząsteczki polimeru polikationowego a grupami fosforanowymi cząsteczek TPP w celu stabilizacji kompleksu. Ten proces kompleksowania zestala związki bioaktywne w matrycy chitozanu, który jest następnie oczyszczany i powlekany na próbkach bawełny w celu wytworzenia tkaniny przeciwdrobnoustrojowej.

Nano-preparaty muszą być najpierw przetestowane pod kątem skuteczności przeciwdrobnoustrojowej w formie emulsji, zanim zostaną nałożone na tkaninę. Można to wygodnie ocenić za pomocą metody jakościowej, takiej jak dyfuzja dysku Kirby'ego-Bauera, dyfuzja studni i test płytki cylindrycznej. Jednak test płytki cylindrycznej 17 zapewnia elastyczność w ładowaniu różnych objętości preparatu i porównywaniu strefy luzu. W tej metodzie preparaty przeciwdrobnoustrojowe są umieszczane w cylindrach ze stali nierdzewnej i umieszczane na miękkiej warstwie agaru, która jest zaszczepiana badanym mikroorganizmem lub patogenem. Średnica strefy klirensu wytwarzanego w stosunku do badanego organizmu jest proporcjonalna do potencjału hamującego preparatu przeciwdrobnoustrojowego i dlatego może być stosowana jako alternatywa dla metod rozcieńczania bulionu. Wielkość czystych stref jest jednak jedynie miarą porównawczą lub jakościową w obrębie określonej płytki, chyba że zostaną zachowane określone normy. Środki przeciwdrobnoustrojowe działają przeciwko patogenom poprzez hamowanie ich wzrostu (biostatyczne) lub zabijanie komórek (biobójcze), co można określić ilościowo odpowiednio za pomocą minimalnego stężenia hamującego (MIC) i minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC). Jednak skuteczność i zachowanie bioaktywnych substancji chemicznych różnią się w ich formułach (stan ciekły) i po pokryciu na podłożu, takim jak fabric18. Dzieje się tak, ponieważ wiele czynników odgrywa rolę w skuteczności, takich jak stabilność przylegania środków przeciwdrobnoustrojowych do tkaniny, wilgotność, rodzaj podłoża i przyleganie drobnoustrojów. Jeśli zamierzonym celem jest tylko aktywność bakteriostatyczna, test jakościowy, taki jak "Metoda smug równoległych"19, może zapewnić stosunkowo szybką i łatwą ocenę dyfuzyjnego preparatu przeciwdrobnoustrojowego. Jeśli jednak ma zostać określone działanie bakteriobójcze, można zastosować "Ocenę wykończeń antybakteryjnych na materiałach tekstylnych"20, która zapewnia logarytmiczną redukcję kolczastego patogenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie nanocząstek

  1. Nanoenkapsulacja ziołowa
    1. Przygotować 50 mL 1% (v/v) kwasu octowego.
      OSTROŻNIE: Bezwodny kwas octowy jest substancją drażniącą, która może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Należy nosić pełny fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe oraz gogle i pracować pod dygestorium.
    2. Przygotować roztwór chitosanu (1,2% w/v), rozpuszczając 0,6 g płatków chitosanu (średnia masa cząsteczkowa) w 50 mL 1% kwasu octowego (przygotowanego powyżej). Mieszać przez noc (O/N) w temperaturze pokojowej (R/T), aby uzyskać jednorodną emulsję.
    3. Dodać 0,5 g Tween 80 i mieszać (1 000 obr./min) w temperaturze 60 °C przez 2 h do uzyskania jednorodnego roztworu. Schłodzić roztwór do temperatury R/T przed dodaniem związków bioaktywnych (karwakrolu lub tymolu).
    4. Dodać 0,75 g karwakrolu (lub tymolu) kroplami lub stopniowo, mieszając zawiesinę (1 000 obr./min) przez 20 min w temperaturze R/T. Stosunek masowy chitosanu do związku bioaktywnego wynosi 1:1,25.
    5. Do mieszaniny dodawać kroplami 50 mL (0,5% w/v) TPP, mieszając w temperaturze R/T. Kontynuować mieszanie przez 30 min do uzyskania jednorodnej emulsji.
    6. Przygotować kontrolę negatywną, stosując tę samą procedurę, ale bez dodawania związków bioaktywnych.
  2. Oczyszczanie
    1. Odwirować emulsję przy 10 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C i zebrać utworzone NP (osad) po odlaniu supernatantu. Zachować supernatant do badania wydajności enkapsulacji.
    2. Przemyć cząstki (z etapu 1.2.1) wodnym roztworem Tween 80 (1% v/v) w objętości dwukrotnej w stosunku do objętości osadu, aby usunąć niezwiązane lub wolne związki bioaktywne. W każdym etapie płukania należy wymieszać osad za pomocą wortexera, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
    3. Przemyć cząstki (z etapu 1.2.2) dwa razy wodą dejonizowaną w celu usunięcia zanieczyszczeń.
    4. Zrekonstytuować NP, resuspendując osad (z etapu 1.2.3) w 30 mL wody dejonizowanej. Przechowywać NP w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
      UWAGA: Eksperyment można przerwać na tym etapie.
  3. Charakterystyka
    1. Rozcieńczyć NP w wodzie dejonizowanej, aż odczyty w zakresie ultrafiolet-widzialnym (UV-Vis) między 250 a 400 nm zmieszczą się w zakresie (absorbancja >1).
    2. Zarejestrować widma absorpcyjne UV-Vis NP w zakresie długości fal od 250 do 400 nm przy użyciu spektrofotometru UV-Vis.
    3. Przechowywać alikwot (1 mL) NP w temperaturze R/T przez różne okresy (np. od 1 do 6 miesięcy) i badać efekt przeciwdrobnoustrojowy metodą dyfuzyjną z cylindrami, porównując z próbką świeżą.
  4. Powlekanie tkaniny
    1. Nanieść NP na tkaninę bawełnianą o splotcie płóciennym, stosując metodę nasączania, suszenia i utrwalania (pad-dry-cure)7,21.
      1. Zanurzyć skrawki tkaniny w roztworze zawierającym NP zmieszane ze spoiwem do tkanin na 3 min, aż zostaną całkowicie nasączone. Następnie przepuścić skrawki przez laboratoryjną wyciskarkę dwuwalcową w celu usunięcia nadmiaru cieczy.
      2. Wysuszyć skrawki w piecu w temperaturze 100 °C przez 30 min i utrwalić w temperaturze 130 °C przez 10 min.
      3. Na koniec przemyć skrawki w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 min, aby usunąć niezwiązane NP.
        UWAGA: Alternatywnie można zastosować uproszczoną metodę opisaną poniżej.
    2. Wyciąć tkaninę bawełnianą (lub skrawki fartucha laboratoryjnego) w kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm.
    3. Zanurzyć wycięte fragmenty w 2 mL zsyntetyzowanych NP (10%) w plastikowym pojemniku (12 cm x 12 cm) na 2 min w temperaturze R/T. Usunąć nadmiar cieczy poprzez suszenie na powietrzu.
    4. Przeprasować w prasie termicznej w temperaturze 100 °C przez 3 min, aby związać NP.
    5. Usunąć niezwiązane NP, płucząc w wodnym roztworze Tween 80 (2% w/v), a następnie wysuszyć w piecu w temperaturze 100 °C przez 30 min.
      UWAGA: Tę tkaninę przeciwdrobnoustrojową można przechowywać przez 2 lata w temperaturze R/T.
  5. Trwałość po praniu
    1. Wyciąć tkaninę w kwadratowe skrawki o wymiarach 50 mm x 50 mm.
    2. Umieścić skrawki w 50 mL ciepłej wody z kranu (40 °C) w szklanym lub plastikowym pojemniku i dodać dwie krople zwykłego detergentu (bez właściwości przeciwdrobnoustrojowych).
    3. Płukać na wstrząsarce platformowej lub mieszadle magnetycznym przez 30 min.
    4. Wysuszyć na powietrzu lub inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 h, a następnie sprawdzić skuteczność przeciwdrobnoustrojową.

2. Test z płytką cylindryczną do przesiewania nanocząstek

  1. Przygotować agar sojowo-kazeinowy (TSA), pożywkę sojowo-kazeinową (TSB), agar bazowy do antybiotyków (ABA) oraz agar do zasiewu antybiotycznego (ASA) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wysterylizować pożywki w autoklawie przy 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 15 min.
  2. Przeprowadzić pasaż wybranych mikroorganizmów (z banku materiału), dla których wykonywane są testy skuteczności, na świeżo przygotowane płytki TSA (lub inne odpowiednie pożywki), stosując metodę posiewu smugowego w trzech kierunkach, a następnie inkubować w celu uzyskania płytek kontrolnych czystości. (Rekomendowane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa oraz C. albicans.)
  3. Zaszczepić kultury ze świeżych płytek kontrolnych do TSB (probówki 10 mL) i inkubować przy 35 °C przez noc (O/N) przy umiarkowanym wytrząsaniu (100-200 rpm).
  4. Odmierzyć 5,0 mL roztopionego ASA do każdej z probówek testowych. Liczba probówek powinna odpowiadać liczbie badanych mikroorganizmów.
  5. Aseptycznie wlać 20 mL wstępnie wysterylizowanego roztopionego ABA do każdej płytki Petriego (100 mm x 20 mm), aby utworzyć warstwę bazową. Liczba płytek agarowych powinna odpowiadać liczbie badanych mikroorganizmów. Odczekać do momentu zestalenia się pożywki.
  6. Po zestaleniu warstwy bazowej, zaszczepić każdy roztopiony ASA kulturą z etapu 2.3 (1,0 mL, uprzednio ogrzaną do 35 °C) i niezwłocznie przenieść zawartość (mieszaninę ASA i kultury) na powierzchnię płytki ABA. Obracać płytkę, aby równomiernie rozprowadzić warstwę roztopionego agaru. Upewnić się, że warstwa zasiewu jest gładka i pozbawiona grudek lub pęcherzyków powietrza.
  7. Umieścić do sześciu cylindrów ze stali nierdzewnej (6 mm x 6 mm x 10 mm; wstępnie autoklawowanych), rozmieszczonych równomiernie w układzie heksagonalnym, na każdej płytce agarowej za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1).
  8. Napełnić cylindry syntetyzowanymi NP o różnych objętościach (30 µL, 50 µL, 75 µL i 100 µL) w celu zbadania efektów przeciwdrobnoustrojowych. Kontrolą negatywną jest próbka bez żadnych związków bioaktywnych.
  9. Inkubować pospolite patogeny bakteryjne (np. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) przy 35 °C przez 24 h, a gatunki grzybów (np. C. albicans) w temperaturze pokojowej (R/T) przez 3 dni.
  10. Zmierzyć średnicę strefy zahamowania wzrostu i porównać skuteczność syntetyzowanych NP.
    UWAGA: Test ten może być wykorzystany do wstępnej selekcji najlepszych NP do powlekania tkaniny.

3. Metoda posiewu równoległego (zmodyfikowana zgodnie z AATCC 147)

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Potnij tkaninę potraktowaną nanocząsteczkami (NP) na próbki o wymiarach 50 mm x 25 mm.
    2. Przygotuj agar Muellera-Hintona (MHA), TSA oraz TSB zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wysterylizuj podłoża w autoklawie przy 121 °C i ciśnieniu 15 psi przez 15 min.
    3. Przeszczep interesujące mikroorganizmy (z kolekcji), dla których przeprowadzane są testy skuteczności, na świeżo przygotowane płytki TSA (lub inne odpowiednie podłoże), stosując metodę posiewu smugowego w trzech kierunkach; inkubuj w 35 °C przez 2 dni w przypadku szczepów bakteryjnych oraz w temperaturze pokojowej (R/T) przez 5 dni w przypadku szczepów grzybowych w celu otrzymania płytek kontrolnych czystości. (Zalecane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa oraz C. albicans.)
  2. Zaszczepianie kultur mikrobowych
    1. Zaszczep kultury ze świeżych płytek kontrolnych do TSB (probówki 10 mL) i inkubuj w 35 °C przez noc (O/N) przy umiarkowanym wytrząsaniu (100-200 rpm).
    2. Rozcieńcz kultury inkubowane przez noc do poziomu 1,5 × 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/mL lub do mętności odpowiadającej standardowi 0,5 McFarland (zazwyczaj rozcieńczenie od 1/10 do 1/20 dla większości zdrowych kultur).
    3. Zaszczep powyższą rozcieńczoną kulturę za pomocą sterylnej pętli 4 mm w następujący sposób: pobierz pętlą ilość kultury w bulionie i przenieś ją na powierzchnię płytki z agarem MHA, wykonując pięć równoległych smug, z których każda ma długość 6 cm i są one oddalone od siebie o 1 cm, zgodnie z Rysunkiem 2. Nie dopełniaj pętli.
    4. Używając sterylnej szpachelki, delikatnie dociśnij próbkę tkaniny w poprzek pięciu smug w taki sposób, aby tkanina znajdowała się w centrum i dotykała wszystkich pięciu linii posiewu. Inkubuj w 35 °C przez 24 h.
  3. Jakościowa ocena skuteczności przeciwdrobnoustrojowej
    1. Zbadaj inkubowaną płytkę pod kątem zahamowania wzrostu wzdłuż smug poza krawędziami tkaniny (strefa przejaśnienia wskazuje na inhibicję wzrostu).
    2. Oblicz średnią szerokość strefy inhibicji wzdłuż linii smugowej (W) po obu stronach próbki tkaniny, korzystając z równania (1).
      W = (T - D)/2    (1)
      W = szerokość strefy przejaśnienia; T = całkowita długość strefy przejaśnienia, wliczając szerokość próbki; D = szerokość próbki tkaniny (25 mm).

4. Ilościowa metoda redukcji logarytmicznej (zmodyfikowana zgodnie z AATCC 100)

  1. Przygotowanie eksperymentalne
    1. Wyciąć z tkaniny kwadratowe próbki o wymiarach 50 mm x 50 mm.
    2. Przygotować agar tryptykosoitonowy (TSA), bulion tryptykosoitonowy (TSB), bulion Letheen oraz sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wysterylizować podłoża w autoklawie.
    3. Przygotować nocne kultury mikroorganizmów, dla których przeprowadzane będą testy skuteczności, poprzez zaszczepienie izolowanych kolonii z płytek czystościowych do sterylnego TSB i inkubację w temperaturze 35 °C przez 18-24 h. (Zalecane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa oraz C. albicans.)
  2. Zaszczepianie kultur mikrobowych
    1. Rozcieńczyć nocne kultury do stężenia 1,5 × 108 CFU/mL lub do mętności odpowiadającej standardowi 0,5 McFarland (zazwyczaj rozcieńczenie od 1/10 do 1/20 dla większości zdrowych kultur).
    2. Wyznaczyć odpowiednią objętość kultur do zaszczepienia, mierząc pojemność sorpcyjną tkaniny w następujący sposób:
      1. Nanieść serie objętości rozcieńczonej kultury w bulionie (np. 100-500 µL) na próbki tkaniny (w oddzielnych szalkach Petriego) i wybrać taką objętość, aby próbka tkaniny całkowicie wchłonęła ciecz i nie pozostawiła wolnego płynu. Pojemność sorpcyjna różni się w zależności od rodzaju i grubości tkaniny. Dla standardowych bawełnianych fartuchów laboratoryjnych wynosi ona około 200 µL.
      2. Nanieść określoną objętość (wyznaczoną powyżej pojemność sorpcyjną [np. 200 µL]) każdej kultury na próbki umieszczone w sterylnych szalkach Petriego. Liczba próbek powinna odpowiadać liczbie testów (np. tkanina badana natychmiast oraz po praniu [w zależności od testowanych cykli prania]) oraz efektom przeciwdrobnoustrojowym badanym w określonych czasach kontaktu (po wyznaczonym czasie/dniu [np. 30 min, 2 h, Dzień 1-3]).
        UWAGA: Do szczepienia kultur na próbkach z równomiernym rozkładem należy używać mikropipety z końcówkami z filtrem przeciważowym (aby zapobiec kontaminacji pipety przy kolejnych użyciach).
      3. W przypadku kontroli negatywnej należy użyć próbek tego samego rodzaju tkaniny, ale niepoddanych działaniu środka. Kontrolę negatywną wykonuje się dla każdego odpowiadającego testu – gatunku mikroorganizmu, okresu kontaktu, rodzaju tkaniny oraz cyklu prania.
  3. Odzyskiwanie mikroorganizmów metodą przeliczeniową na płytkach
    1. Pozostawić zaszczepione próbki (zarówno traktowane, jak i nietraktowane) do wyschnięcia w szalkach Petriego (z uchylonymi pokrywkami) w temperaturze pokojowej (R/T) przez wymagany czas kontaktu poddawany badaniu (np. 0 min, 30 min, 60 min itp., lub nawet przez kilka dni w przypadku efektów długoterminowych). Zawsze należy uwzględnić próbkę „0 min” w celu wykazania efektu natychmiastowego oraz skuteczności neutralizacji.
    2. Przenieść próbki aseptycznie do oddzielnych sterylnych probówek wirówkowych (50 mL) i mocno zakręcić nakrętki.
    3. Dodać bulion Letheen (lub odpowiednie bufory neutralizujące), aby uzyskać rozcieńczenie 1/100 (np. 19,8 mL dla inokulum 200 µL).
    4. Mocno zakręcić probówki wirówkowe i mieszać w wstrząsarzu typu vortex przez 1 min w średniej prędkości.
    5. Wykonać rozcieńczenia seryjne zawiesiny w sterylnym PBS w kolejnych rozcieńczeniach 1/10, tak aby liczba kolonii w grupie „nietraktowanej” stała się zbyt niska do przeliczenia (TLTC).
    6. Wylać rozcieńczenia (0,1 mL) na odpowiednie płytki z pożywką wspierającą wzrost danego mikroorganizmu (np. TSA dla bakterii lub agar Sabourauda [SDA] dla grzybów) lub na dowolną pożywkę optymalizującą wzrost i zapewniającą dobry kontrast dla dokładnego przeliczenia kolonii.
    7. Inkubować płytki z bakteriami w temperaturze 35 °C przez 2 dni, a płytki z grzybami w temperaturze pokojowej (R/T) przez 5 dni.
    8. Przeliczyć żywe CFU bezpośrednio za pomocą licznika kolonii lub oprogramowania do analizy obrazu (np. CFU AI).
    9. Obliczyć logarytmiczną redukcję drobnoustrojów (R) wywołaną przez tkaninę przeciwdrobnoustrojową, korzystając z równania (2):
      R = Wzór ułamkowy (A-B)/A do obliczeń proporcji w analizie matematycznej. × 100     (2)
      A = wartość logarytmiczna liczby CFU odzyskanych z tkaniny nietraktowanej; B = wartość logarytmiczna liczby CFU odzyskanych z tkaniny traktowanej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wstępny screening zsyntetyzowanych NP
Zastosowanie dwuetapowej techniki emulsji olej w wodzie16 pozwoliło na pomyślną enkapsulację związków bioaktywnych (karwakrolu i tymolu) w chitosanie. Potwierdzono to za pomocą spektrofotometrii UV-Vis, analizując piki absorbancji odpowiednich związków bioaktywnych w porównaniu z kontrolami, którymi były NP chitozanowe bez związków bioaktywnych. Otrzymane NP były jednorodne i stabilne przez 12 miesięcy w temperaturze 4 °C. Wstępny screenin...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Skuteczność przeciwdrobnoustrojowa biocydów jest tradycyjnie testowana za pomocą testów ilościowych, takich jak minimalne stężenie hamujące (MIC) i minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC), w których bakterie zanurza się w płynie przeciwdrobnoustrojowym na 24 godziny. Jednak testy te nie są odpowiednie dla tkanin powlekanych, w których brakuje granicy faz cieczy, a biocydy są powoli dyfundowane wzdłuż włókien tkaniny. W związku z tym ustanowiono wiele standardowych testów tkanin, takich jak AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Kanada.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyMillipore Sigma64-19-7
Agar na bazie antybiotykuBD DifcoDF0270-17-4Znany również jako antybiotyk Medium 2
Antybiotyk agar z nasionamiBD DifcoDF0263-17-3Znany również jako antybiotyk Podłoże 1
Agar z krwią (agar odżywczy z 5% krwią owczą)Podarowany przez CFIA
Bromcresol Purple Laktose AgarDarowizna od CFIA
em>Candida albicansATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 10231
CarvacrolMillipore Sigma282197 (CAS# 499-75-2)
Wirówka  Wirówka Allergra X-22RBeckman CoulterModel # X-22RChłodzony. Odczekaj co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy temperatura osiągnie ustawioną niską wartość (np. 4 ° C) ponieważ chłodzenie wymaga czasu.
Chitozan o średniej masie cząsteczkowej (CS)Millipore Sigma448877 (CAS # 9012-76-4)
Prasa termiczna z klapkąIntivaIM1200
Escherichia coli (E. coli)ATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychInkubator ATTC 23725
Thermo Scientific1205M34
Letheen BulionBD DifcoDF0681-17-7Służy do neutralizacji działania przeciwbakteryjnego. Produkt różnych producentów może wymagać dodania Polysorbate 80, który jest już dodany w produkcie Difco.
Milli Q wodaMillipore SigmaZR0Q16WWWoda dejonizowana
Mueller-Hinton AgarBD DifcoDF0252-17-6
Tripolifosforan pentasodowy (TPP)Millipore Sigma238503 (CAS # 7758-29-4)
Sól fizjologiczna buforowana fosforem (PBS)Thermo ScientificAM9624
Pseudomonas aeruginosaATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 9027
Agar z dekstrozy SabouraudBD DifcoDF0109-17-1
Inkubator z wytrząsarką / Wytrząsarka termicznaVWRModel# SHKA2000
Staphylococcus aureusATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 6538
MilliporeThymol SigmaT0501 (CAS# 89-83-8)
Tryptikaza Agar sojowyBD Difco236950
Tryptyka Bulion sojowyBD Difco215235
Tween 80Millipore SigmaSTS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-VIS SpectrophometerThermo ScientificGENESYS 30 (840-277000)
<

Bibliografia

  1. Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249(2016).
  2. Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890(2015).
  3. Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
  4. Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
  5. Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349(2010).
  6. Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
  7. Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
  8. Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498(2016).
  9. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939(2021).
  10. Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
  11. Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
  12. Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
  13. Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
  14. Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
  15. Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
  16. Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
  17. Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
  18. Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
  19. AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
  20. AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
  21. Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
  22. Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65(2011).
  23. Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
  24. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanocząsteczki chitosanuochrona fartuchów laboratoryjnychredukcja patogenówzwiązki bioaktywnemetoda smug równoległychlogarytmiczna redukcja drobnoustrojówwykańczanie tekstyliów
Tkanina antybakteryjna wykorzystująca nano-ziołową enkapsulację olejków eterycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.