Artykuł metodologiczny

Tkanina antybakteryjna wykorzystująca nano-ziołową enkapsulację olejków eterycznych

DOI:

10.3791/65187

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antybakteryjne fartuchy laboratoryjne zapobiegają zanieczyszczeniu krzyżowemu w wyniku nagromadzenia patogenów i przypadkowych wycieków biologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół opracowywania przyjaznej dla skóry tkaniny przeciwdrobnoustrojowej przy użyciu nanoziołowej enkapsulacji i zmodyfikowanych standardowych testów w celu precyzyjnej oceny skuteczności i przydatności do typowego zastosowania fartucha laboratoryjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fartuchy laboratoryjne są powszechnie używane w laboratoriach zagrożeń biologicznych i placówkach opieki zdrowotnej jako odzież ochronna, aby zapobiec bezpośredniemu narażeniu na patogeny, rozlanie i oparzenia. Te powłoki ochronne na bazie bawełny zapewniają idealne warunki do rozwoju drobnoustrojów i miejsc przyczepiania się ze względu na ich porowaty charakter, zdolność zatrzymywania wilgoci i zatrzymywanie ciepła z ciała użytkownika. Kilka badań wykazało przeżywalność bakterii chorobotwórczych na odzieży szpitalnej i fartuchach laboratoryjnych, działających jako wektory transmisji mikrobiologicznej.

Powszechnym podejściem do rozwiązania tych problemów jest zastosowanie środków przeciwbakteryjnych w wykańczaniu tekstyliów, ale obawy zostały zgłoszone ze względu na toksyczność i wpływ na środowisko wielu syntetycznych chemikaliów. Trwająca pandemia otworzyła również okno do badań nad skutecznymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi oraz przyjaznymi dla środowiska i nietoksycznymi preparatami. W badaniu wykorzystano dwa naturalne związki bioaktywne, karwakrol i tymol, zamknięte w nanocząsteczkach chitozanu, które gwarantują skuteczną ochronę przed czterema ludzkimi patogenami z redukcją do 4 log (99,99%). Patogeny te są często wykrywane w fartuchach laboratoryjnych używanych w laboratoriach zagrożeń biologicznych.

Tkaniny poddane obróbce wytrzymały również do 10 cykli prania z 90% redukcją mikrobiologiczną, co jest wystarczające dla zamierzonego zastosowania. Dokonaliśmy modyfikacji w istniejących standardowych testach tkanin, aby lepiej odwzorować typowe scenariusze użycia fartuchów laboratoryjnych. Udoskonalenia te pozwalają na dokładniejszą ocenę skuteczności przeciwdrobnoustrojowych fartuchów laboratoryjnych oraz na symulację losu wszelkich przypadkowych wycieków drobnoustrojów, które muszą zostać zneutralizowane w krótkim czasie. Zaleca się dalsze badania w celu zbadania akumulacji patogenów w czasie na przeciwdrobnoustrojowych fartuchach laboratoryjnych w porównaniu ze zwykłymi powłokami ochronnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biały fartuch ochronny jest obowiązkowym elementem wyposażenia ochrony osobistej (PPE) w laboratoriach mikrobiologicznych i placówkach służby zdrowia, i chroni przed bezpośrednim narażeniem na patogeny, wycieki i oparzenia. Te bawełniane płaszcze sprzyjają rozwojowi drobnoustrojów ze względu na wiele czynników - tkanina zapewnia miejsca mocowania i napowietrzania, bawełna i skrobia używane w procesie produkcyjnym wraz ze złuszczonymi komórkami nabłonka od użytkownika dostarczają składników odżywczych, a bliskość użytkownika zapewnia ciepło i wilgoć. Nagromadzenie drobnoustrojów na tekstyliach może również powodować problemy zdrowotne, takie jak alergie i infekcje szpitalne, nieprzyjemne zapachy i niszczenie tkanin1.

W przeciwieństwie do zwykłego ubrania, płaszcze ochronne są rzadko prane lub dezynfekowane, co stwierdzono w wielu ankietach2,3. Wiele badań wskazuje na to, że fartuchy laboratoryjne działają jako wektor przenoszenia drobnoustrojów i ryzyka zakażeń szpitalnych w placówkach opieki zdrowotnej2,4, szczególnie oporne szczepy3, takie jak oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA); w ten sposób budzą obawy zdrowotne związane ze środkami ochrony indywidualnej, które mają chronić przed zanieczyszczeniem mikrobiologicznym. Nie ma wystarczającej liczby badań przekrojowych dotyczących zakażeń związanych z fartuchem laboratoryjnym w kontekście obiektów o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub laboratoriów dydaktycznych mikrobiologii, ale wiele organów regulacyjnych ogranicza stosowanie fartuchów laboratoryjnych na poziomie hermetyzacji. Jednak wiele instytucji akademickich w Ameryce Północnej ma trudności ze spełnieniem wymagań ze względu na ograniczenia praktyczne, takie jak pranie i przechowywanie w obiekcie, powszechne są przypadki noszenia fartuchów laboratoryjnych w miejscach publicznych, takich jak stołówki i biblioteki. Jednym z praktycznych rozwiązań tych problemów jest zastosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych w wykańczaniu tekstyliów.

Tkaniny antybakteryjne zyskują coraz większą popularność w odzieży sportowej, sportowej i skarpetach, głównie w celu zmniejszenia zapachu ciała. Jednak użycie tych tkanin nie jest powszechne w opracowywaniu środków ochrony indywidualnej, z wyjątkiem niektórych pokrytych srebrem masek bawełnianych i odzieży medycznej5. Informujemy o opracowaniu tkaniny przeciwdrobnoustrojowej do fartuchów laboratoryjnych, która hamuje powszechne patogeny występujące w laboratoriach BSL-2 i zapewnia skuteczną ochronę przed zanieczyszczeniem krzyżowym powszechnych patogenów.

Obecnie na rynku dostępne są różne tkaniny i wykończenia przeciwdrobnoustrojowe, ale większość z nich wykorzystuje ciężkie cząsteczki koloidalne metali (np. srebro, miedź,), metaloorganiczne lub syntetyczne chemikalia, takie jak triklosan i czwartorzędowe związki amoniowe, które nie są przyjazne dla środowiska1 i mogą prowadzić do problemów zdrowotnych, takich jak podrażnienia skóry i alergie6. Niektóre preparaty syntetyczne stwarzają obawy ze względu na drobnoustroje niebędące przedmiotem zwalczania, takie jak normalna flora bakteryjna lub indukowanie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) reguluje komercyjne tkaniny przeciwdrobnoustrojowe, które muszą być nietoksyczne dla użytkownika i wolne od ekotoksyczności. Dlatego preferowane są tkaniny przeciwdrobnoustrojowe na bazie naturalnych biocydów, które hamują szerokie spektrum drobnoustrojów. Olejki eteryczne (EO) są szeroko stosowane jako środki przeciwbakteryjne i terapeutyczne, ale ich zastosowanie w wykańczaniu przeciwdrobnoustrojowym jest ograniczone ze względu na ich trwałość6,7,8. Opierając się na naszej wiedzy i badaniach rynkowych dotyczących nano-ziołowych wykończeń8, żadna ziołowa tkanina przeciwbakteryjna nie jest dostępna na rynku. Dzieje się tak, ponieważ powłoki syntetyczne są łatwe w produkcji i mają długą żywotność. Kilka tkanin pokrytych nano-ziołami zgłoszonych tylko do celów badawczych to neem7, moringa9 i curry leaves9.

Niniejsze badanie wykorzystuje dwa bioaktywne składniki ekstrahowane z EOs oregano, karwakrol i tymol, które są skuteczne przeciwko szerokiej gamie patogenów bakteryjnych i wirusów, ale są ogólnie uznawane za bezpieczne dla ludzi10. Jednak te bioaktywne składniki są lotne, a zatem ich potencjał przeciwdrobnoustrojowy jest krótkotrwały, jeśli zostanie zastosowany bezpośrednio na tkaninę. Enkapsulacja nano-ziołowa to proces, w którym bioaktywne składniki lub leki są ładowane do polimerowej powłoki, która chroni rdzeń przed degradacją środowiska, a tym samym wydłuża okres przydatności do spożycia. Ponadto niewielki rozmiar cząstek polimerowych, które zazwyczaj mieszczą się w zakresie od 10 nm do 100 nm, zwiększa skuteczność aplikacji i spowalnia uwalnianie związków bioaktywnych na tkaninę. Te bioaktywne związki są używane do różnych celów, takich jak konserwacja żywności10, ale nie do powlekania tekstyliów.

Wśród wielu polimerowych enkapsulantów, chitozan jest atrakcyjnym kandydatem ze względu na wiele jego cech, takich jak nietoksyczność, biodegradowalność, mukoadhezyjność i biokompatybilność11. Jest to naturalny polisacharyd, otrzymywany w procesie deacetylacji z chityny, która znajduje się w muszlach morskich i ścianach komórkowych grzybów. Jest używany w zastosowaniach biochemicznych i konserwujących żywność, takich jak dostarczanie leków lub białek11,12,13, kontrolowane uwalnianie14 i folie przeciwdrobnoustrojowe10. Chitozan nie jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, ale tworzy zawiesinę koloidalną w środowisku kwaśnym. Cząsteczki bioaktywne są ładowane do nanocząstek chitozanu (NPs) za pomocą prostej, dwuetapowej metody żelowania jonowego14,15,16. W tym procesie hydrofobowe związki bioaktywne, takie jak karwakrol i tymol, tworzą emulsję typu olej w wodzie, która jest wspomagana przez środek powierzchniowo czynny, Tween 80. Następnie stosuje się związek polianionowy, tripolifosforan pentasodu (TPP), do tworzenia wiązań krzyżowych między grupami aminowymi wzdłuż cząsteczki polimeru polikationowego a grupami fosforanowymi cząsteczek TPP w celu stabilizacji kompleksu. Ten proces kompleksowania zestala związki bioaktywne w matrycy chitozanu, który jest następnie oczyszczany i powlekany na próbkach bawełny w celu wytworzenia tkaniny przeciwdrobnoustrojowej.

Nano-preparaty muszą być najpierw przetestowane pod kątem skuteczności przeciwdrobnoustrojowej w formie emulsji, zanim zostaną nałożone na tkaninę. Można to wygodnie ocenić za pomocą metody jakościowej, takiej jak dyfuzja dysku Kirby'ego-Bauera, dyfuzja studni i test płytki cylindrycznej. Jednak test płytki cylindrycznej 17 zapewnia elastyczność w ładowaniu różnych objętości preparatu i porównywaniu strefy luzu. W tej metodzie preparaty przeciwdrobnoustrojowe są umieszczane w cylindrach ze stali nierdzewnej i umieszczane na miękkiej warstwie agaru, która jest zaszczepiana badanym mikroorganizmem lub patogenem. Średnica strefy klirensu wytwarzanego w stosunku do badanego organizmu jest proporcjonalna do potencjału hamującego preparatu przeciwdrobnoustrojowego i dlatego może być stosowana jako alternatywa dla metod rozcieńczania bulionu. Wielkość czystych stref jest jednak jedynie miarą porównawczą lub jakościową w obrębie określonej płytki, chyba że zostaną zachowane określone normy. Środki przeciwdrobnoustrojowe działają przeciwko patogenom poprzez hamowanie ich wzrostu (biostatyczne) lub zabijanie komórek (biobójcze), co można określić ilościowo odpowiednio za pomocą minimalnego stężenia hamującego (MIC) i minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC). Jednak skuteczność i zachowanie bioaktywnych substancji chemicznych różnią się w ich formułach (stan ciekły) i po pokryciu na podłożu, takim jak fabric18. Dzieje się tak, ponieważ wiele czynników odgrywa rolę w skuteczności, takich jak stabilność przylegania środków przeciwdrobnoustrojowych do tkaniny, wilgotność, rodzaj podłoża i przyleganie drobnoustrojów. Jeśli zamierzonym celem jest tylko aktywność bakteriostatyczna, test jakościowy, taki jak "Metoda smug równoległych"19, może zapewnić stosunkowo szybką i łatwą ocenę dyfuzyjnego preparatu przeciwdrobnoustrojowego. Jeśli jednak ma zostać określone działanie bakteriobójcze, można zastosować "Ocenę wykończeń antybakteryjnych na materiałach tekstylnych"20, która zapewnia logarytmiczną redukcję kolczastego patogenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie nanocząstek

  1. Nano-ziołowa kapsułka
    1. Przygotować 50 ml 1% (v/v) kwasu octowego.
      UWAGA: Lodowaty kwas octowy jest substancją drażniącą, która może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Załóż pełnowymiarowy fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary oraz pracuj pod wyciągiem.
    2. Przygotować roztwór chitozanu (1,2% w/v) rozpuszczając 0,6 g płatków chitozanu (średnia masa cząsteczkowa) w 50 ml 1% kwasu octowego (przygotowanego powyżej). Mieszać przez noc (O/N) w temperaturze pokojowej (R/T), aby uzyskać jednorodną emulsję.
    3. Dodać 0,5 g Tween 80 i mieszać (1 000 obr./min) w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, aby uzyskać jednorodny roztwór. Przynieś roztwór do R/T przed dodaniem związków bioaktywnych (karwakrolu lub tymolu).
    4. Dodawać 0,75 g karwakrolu (lub tymolu) kroplami lub stopniowo, mieszając (1,000 obr./min) mieszaninę przez 20 minut w temperaturze R/T. Stosunek wagowy chitozanu do związku bioaktywnego wynosi 1:1,25.
    5. Dodaj kroplami 50 ml (0,5% w/v) TPP do mieszaniny, mieszając w temperaturze R/T. Kontynuuj mieszanie przez 30 minut, aby uzyskać jednorodną emulsję.
    6. Przygotować kontrolę ujemną, postępując zgodnie z tą samą procedurą, ale bez dodawania związków bioaktywnych.
  2. oczyszczanie
    1. Odwirować emulsję o stężeniu 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i zebrać powstałe nanocząsteczki (osady) po dekantacji supernatantu. Zachowaj supernatant w celu zbadania skuteczności kapsułkowania.
    2. Przepłukać cząstki (z kroku 1.2.1) za pomocą wodnego roztworu Tween 80 (1% v/v) z podwójną objętością utworzonych granulek w celu usunięcia niezwiązanych lub wolnych związków bioaktywnych. Upewnij się, że naruszyłeś granulkę poprzez wirowanie, aż na każdym etapie prania utworzy się jednorodny roztwór.
    3. Umyj cząstki (z kroku 1.2.2) dwukrotnie wodą dejonizowaną, aby pozbyć się zanieczyszczeń.
    4. Rozpuścić nanocząsteczki przez ponowne zawieszenie osadu (z etapu 1.2.3) w 30 ml wody dejonizowanej. Nanocząsteczki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Na tym etapie eksperyment można wstrzymać.
  3. Charakterystyka
    1. Rozcieńczyć NPs w wodzie dejonizowanej, aż odczyty światła widzialnego w ultrafiolecie (UV-Vis) między 250 a 400 nm mieszczą się w zakresie (absorbancja >1).
    2. Rejestrować widma absorpcyjne UV-VIS nanocząsteczek na długościach fal w zakresie od 250 do 400 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
    3. Przechowywać podwielokrotność (1 ml) nanocząsteczek w temperaturze R/T przez pewien czas (np. od 1 do 6 miesięcy) i przetestować działanie przeciwdrobnoustrojowe metodą płytki cylindrycznej wraz ze świeżą próbką.
  4. Powłoka na tkaninie
    1. Nałóż NP na tkaninę bawełnianą metodą utwardzania na sucho7,21.
      1. Zanurz próbki tkanin w roztworze zawierającym NP zmieszane ze spoiwem do tkanin na 3 minuty, aż do namoczenia. Następnie przepuść próbki przez dwurolkową podkładkę laboratoryjną, aby usunąć nadmiar płynu.
      2. Suszyć próbki w piekarniku w temperaturze 100 °C przez 30 minut i utwardzać w temperaturze 130 °C przez 10 minut.
      3. Na koniec umyj próbki w kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut, aby usunąć niezwiązane NPs.
        UWAGA: Alternatywnie postępuj zgodnie z uproszczoną metodą opisaną poniżej.
    2. Pokrój bawełnianą tkaninę (lub próbki fartuchów laboratoryjnych) na kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm.
    3. Zanurz pokrojone kawałki w 2 ml zsyntetyzowanego NP (10%) w plastikowym pojemniku (12 cm x 12 cm) na 2 minuty w temperaturze R/T. Usuń nadmiar płynu przez suszenie na powietrzu.
    4. Prasować na gorąco w temperaturze 100 °C przez 3 minuty, aby związać NPs.
    5. Usunąć niezwiązane NP przez przepłukanie w roztworze wodnym Tween 80 (2% w/v) i suszyć w suszarce w temperaturze 100 °C przez 30 min.
      UWAGA: Ta tkanina antybakteryjna może być przechowywana przez 2 lata w R/T.
  5. Trwałość prania
    1. Pokrój tkaninę na próbki kwadratów o wymiarach 50 mm x 50 mm.
    2. Umieść próbki w 50 ml ciepłej wody z kranu (40 °C) w szklanym/plastikowym pojemniku i dodaj dwie krople zwykłego detergentu (nieantybakteryjnego).
    3. Płukać na wytrząsarce na platformie bujanej lub mieszadle magnetycznym przez 30 minut.
    4. Suszyć na powietrzu lub inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny i sprawdzić skuteczność przeciwdrobnoustrojową.

2. Test płytki cylindrycznej do badania przesiewowego nanocząstek

  1. Przygotować agar sojowy z tryptykazą (TSA), bulion sojowy z tryptykazą (TSB), agar na bazie antybiotyku (ABA) i agar z nasion antybiotyku (ASA) zgodnie z instrukcjami producenta i sterylizować pożywkę przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przy 15 psi przez 15 min.
  2. Hoduje się subkultura drobnoustrojów (z odchodu) będących przedmiotem zainteresowania, na których przeprowadza się testy skuteczności, na świeżo przygotowanych płytkach TSA (lub innych odpowiednich pożywkach) metodą płytek z trójdrożnymi smugami i inkubować w celu wytworzenia płytek o czystości. (Zalecane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa i C. albicans.)
  3. Zaszczepić kultury ze świeżych płytek czystości w TSB (probówki 10 ml) w temperaturze 35 °C O/N z umiarkowanym wstrząsaniem (100-200 obr./min).
  4. Podwielokrotność 5,0 ml stopionego ASA w każdej z probówek. Liczba probówek odpowiada liczbie badanych mikroorganizmów.
  5. Wlać 20 ml wstępnie wysterylizowanego stopionego ABA do każdej płytki Petriego (100 mm x 20 mm) w sposób aseptyczny, aby utworzyć warstwę podstawową. Liczba płytek agarowych odpowiada liczbie mikroorganizmów, które mają być badane. Poczekaj, aż podłoże stwardnieje.
  6. Po zestaleniu warstwy podstawowej, zaszczepić każdy stopiony ASA nocną kulturą z etapu 2,3 (1,0 ml, wstępnie podgrzany do 35 °C) i natychmiast przenieść zawartość (mieszaninę ASA i kultury) na powierzchnię płytki ABA. Zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić stopioną warstwę agaru. Upewnij się, że warstwa nasion jest gładka i wolna od nierówności lub pęcherzyków.
  7. Umieść do sześciu cylindrów ze stali nierdzewnej (6 mm x 6 mm x 10 mm; wstępnie autoklawowanych), równomiernie rozmieszczonych na sześciokątnym wzorze, na płytce agarowej za pomocą pary sterylnych pęset (Rysunek 1).
  8. Załaduj butle zsyntetyzowanymi nanocząsteczkami o różnych objętościach (30 μl, 50 μl, 75 μl i 100 μl), które mają być przebadane pod kątem działania przeciwdrobnoustrojowego. Kontrola ujemna to taka, w której nie ma żadnych związków bioaktywnych.
  9. Inkubować powszechne patogeny bakteryjne (np. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) w temperaturze 35 °C przez 24 godziny, a gatunki grzybów (np. C. albicans) w temperaturze R/T przez 3 dni.
  10. Zmierzyć średnicę strefy czystej i porównać skuteczność zsyntetyzowanych NPs.
    UWAGA: Ten test może być wykorzystany do wstępnego przesiewu najlepszych NP, które mają być pokryte na tkaninie.

3. Metoda równoległego pasma (zmodyfikowana z AATCC 147)

  1. Przygotowanie materiału
    1. Pokrój tkaninę nasączoną NP na próbki o wymiarach 50 mm x 25 mm.
    2. Przygotuj agar Muellera-Hintona (MHA), TSA i TSB, zgodnie z instrukcjami producenta, i sterylizuj pożywkę przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przy 15 psi przez 15 min.
    3. Subhodowla drobnoustrojów (z odchu) będących przedmiotem zainteresowania, w stosunku do których przeprowadza się testy skuteczności, na świeżo przygotowanych płytkach TSA (lub innych odpowiednich pożywkach) metodą płytek z trzema prążkami i inkubować w temperaturze 35 °C przez 2 dni w przypadku plam bakteryjnych i w temperaturze R/T przez 5 dni w przypadku szczepów grzybów w celu uzyskania płytek czystości. (Zalecane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa i C. albicans.)
  2. Wzbogacanie kultur drobnoustrojów
    1. Zaszczepić kultury ze świeżych płytek czystości w TSB (probówki 10 ml) w temperaturze 35 °C O/N z umiarkowanym wstrząsaniem (100-200 obr./min).
    2. Rozcieńczyć kultury O/N do 1,5 × 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml lub odpowiadających zmętnieniu 0,5 wzorca McFarlanda (zwykle rozcieńczenie 1/10 do 1/20 dla większości zdrowych kultur).
    3. Zaszczepić rozcieńczoną kulturę powyżej za pomocą sterylnej pętli o średnicy 4 mm w następujący sposób. Załaduj pętlę kultury bulionowej i przenieś ją na powierzchnię płytki agarowej MHA, wykonując pięć równoległych smug, każda o długości 6 cm i odległości 1 cm od siebie, zgodnie z Rysunek 2. Nie napełniaj ponownie pętli.
    4. Delikatnie dociśnij próbkę tkaniny sterylną szpatułką w poprzek pięciu smug, tak aby tkanina znalazła się w środku i dotykała wszystkich pięciu linii smug. Inkubować w temperaturze 35 °C przez 24 godziny.
  3. Jakościowa ocena skuteczności przeciwdrobnoustrojowej
    1. Zbadaj inkubowaną płytkę pod kątem przerwania wzrostu wzdłuż smug poza krawędziami tkaniny (przezroczysta strefa wskazuje na zahamowanie wzrostu).
    2. Obliczyć średnią szerokość strefy inhibicji wzdłuż linii smugi (W) po obu stronach próbki tkaniny, korzystając z równania (1).
      W = (T - D)/2 (1)
      W = szerokość wolnej strefy; T = całkowita długość wolnej strefy, łącznie z szerokością próbki; D = szerokość próbki tkaniny (25 mm).

4. Ilościowa metoda redukcji logarytmu (zmodyfikowana z AATCC 100)

  1. Przygotowanie eksperymentalne
    1. Pokrój tkaninę na próbki kwadratów o wymiarach 50 mm x 50 mm.
    2. Przygotuj bulion TSA, TSB, Letheen i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie.
    3. Przygotować kultury O/N drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania, na których przeprowadza się testy skuteczności, zaszczepiając izolowane kolonie z płytek czystości w sterylnym TSB i inkubując w temperaturze 35 °C przez 18-24 godziny. (Zalecane gatunki: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa i C. albicans.)
  2. Wzbogacanie kultur drobnoustrojów
    1. Rozcieńczyć kultury O/N do 1,5 × 108 CFU/ml lub odpowiadającej zmętnieniu 0,5 wzorca McFarlanda (zwykle rozcieńczenie 1/10 do 1/20 dla większości zdrowych kultur).
    2. Określ odpowiednią objętość kultur do dociskania, mierząc zdolność tkaniny do zatrzymywania cieczy w następujący sposób.
      1. Dodać serię objętości rozcieńczonej kultury bulionowej (np. 100-500 μl) na próbki tkanin (na oddzielnych płytkach Petriego) i wybrać objętość tak, aby próbka tkaniny całkowicie wchłonęła wodę i nie pozostawiała pozostałości/wolnego płynu. Zdolność zatrzymywania cieczy różni się w zależności od rodzaju i grubości tkaniny. W przypadku zwykłych bawełnianych fartuchów laboratoryjnych jest to około 200 μL.
      2. Zwiększyć objętość (zdolność zatrzymywania cieczy określoną powyżej [np. 200 μl]) każdej kultury na próbki umieszczone na sterylnych płytkach Petriego. Liczba próbek odpowiada liczbie testów (np. tkanina testowana natychmiast i po praniu [oraz testowane cykle prania]) oraz badanemu działaniu przeciwdrobnoustrojowemu w czasie kontaktu (po określonym czasie/dniu [np. 30 minut, 2 godziny, dzień 1-3]).
        UWAGA: Użyj mikropipety z końcówkami filtra aerozolowego (aby zapobiec zanieczyszczeniu pipety przy kolejnych użyciach), aby zaszczepić kultury na próbkach z równomiernym rozprowadzeniem.
      3. Do kontroli ujemnej należy użyć tego samego rodzaju próbek tkanin niepoddanych obróbce. Przeprowadzić kontrolę ujemną dla każdego odpowiedniego badanego gatunku drobnoustrojów, okresu kontaktu, różnych tkanin i cykli prania.
  3. Odzyskiwanie drobnoustrojów poprzez zliczanie żywotnych płytek
    1. Pozostawić zaszczepione próbki (zarówno poddane działaniu substancji, jak i niepoddane obróbce) do wyschnięcia na powietrzu wewnątrz płytek Petriego (uchylone pokrywki) przy R/T przez wymagany okres/okresy kontaktu, które mają być badane (np. 0 min, 30 min, 60 minut itd., a nawet dni w przypadku efektów długoterminowych). Zawsze dołączaj "0 min", aby reprezentować natychmiastowy efekt i skuteczność neutralizującą.
    2. Przenieś próbki w sposób aseptyczny do oddzielnych sterylnych probówek wirówkowych (50 ml) i mocno zakręć nakrętki.
    3. Dodać bulion Letheen (wszelkie odpowiednie neutralizujące) do rozcieńczenia 1/100 (np. 19,8 ml na inokulum 200 μl).
    4. Zamknij szczelnie probówki wirówkowe nakrętkami i wiruj przez 1 minutę ze średnią prędkością.
    5. Zawiesinę należy seryjnie rozcieńczyć sterylnym PBS w kolejnych rozcieńczeniach 1/10, tak aby liczba kolonii w grupie "niepoddanej działaniu substancji" stała się zbyt niska, aby można ją było policzyć (TLTC).
    6. Rozcieńczenia (0,1 ml) należy umieścić na odpowiednich podłożach, które wspomagają wzrost mikroorganizmu (np. TSA w przypadku bakterii lub agar z dekstrozą Sabouraud [SDA] w przypadku grzybów) lub na innych podłożach, które optymalizują wzrost i zapewniają dobry kontrast, aby dokładne liczenie kolonii było dokładne.
    7. Inkubować płytki bakteryjne w temperaturze 35 °C przez 2 dni, a płytki grzybów w temperaturze R/T przez 5 dni.
    8. Policz żywotne CFU bezpośrednio za pomocą licznika kolonii lub oprogramowania do obrazowania (np. CFU AI).
    9. Oblicz redukcję logarytmu mikrobiologicznego (R) spowodowaną przez tkaninę przeciwdrobnoustrojową, korzystając z równania (2):
      R = figure-protocol-1 × 100 (2)
      A = wartość logarytmiczna liczby jtk odzyskanych z tkaniny niepoddanej obróbce; B = wartość logarytmiczna liczby jtk odzyskanych z tkaniny poddanej obróbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstępne badanie przesiewowe zsyntetyzowanych NPs
Zgodnie z dwuetapową techniką emulsji typu olej w wodzie16, związki bioaktywne (karwakrol i tymol) zostały z powodzeniem zamknięte w chitozanie. Zostało to potwierdzone za pomocą spektrofotometrii UV-Vis dla maksymalnej absorpcji odpowiednich związków bioaktywnych w porównaniu z kontrolami, które były nanocząsteczkami chitozanu bez żadnych związków bioaktywnych. Utworzone nanocząsteczki były jednorodne i stabilne przez 12 miesię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność przeciwdrobnoustrojowa biocydów jest tradycyjnie testowana za pomocą testów ilościowych, takich jak minimalne stężenie hamujące (MIC) i minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC), w których bakterie zanurza się w płynie przeciwdrobnoustrojowym na 24 godziny. Jednak testy te nie są odpowiednie dla tkanin powlekanych, w których brakuje granicy faz cieczy, a biocydy są powoli dyfundowane wzdłuż włókien tkaniny. W związku z tym ustanowiono wiele standardowych testów tkanin, takich jak AATCC 147, ISO 20645, AATCC 100...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Kanada.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyMillipore Sigma64-19-7
Agar na bazie antybiotykuBD DifcoDF0270-17-4Znany również jako antybiotyk Medium 2
Antybiotyk agar z nasionamiBD DifcoDF0263-17-3Znany również jako antybiotyk Podłoże 1
Agar z krwią (agar odżywczy z 5% krwią owczą)Podarowany przez CFIA
Bromcresol Purple Laktose AgarDarowizna od CFIA
em>Candida albicansATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 10231
CarvacrolMillipore Sigma282197 (CAS# 499-75-2)
Wirówka  Wirówka Allergra X-22RBeckman CoulterModel # X-22RChłodzony. Odczekaj co najmniej 20 minut lub do momentu, gdy temperatura osiągnie ustawioną niską wartość (np. 4 ° C) ponieważ chłodzenie wymaga czasu.
Chitozan o średniej masie cząsteczkowej (CS)Millipore Sigma448877 (CAS # 9012-76-4)
Prasa termiczna z klapkąIntivaIM1200
Escherichia coli (E. coli)ATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychInkubator ATTC 23725
Thermo Scientific1205M34
Letheen BulionBD DifcoDF0681-17-7Służy do neutralizacji działania przeciwbakteryjnego. Produkt różnych producentów może wymagać dodania Polysorbate 80, który jest już dodany w produkcie Difco.
Milli Q wodaMillipore SigmaZR0Q16WWWoda dejonizowana
Mueller-Hinton AgarBD DifcoDF0252-17-6
Tripolifosforan pentasodowy (TPP)Millipore Sigma238503 (CAS # 7758-29-4)
Sól fizjologiczna buforowana fosforem (PBS)Thermo ScientificAM9624
Pseudomonas aeruginosaATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 9027
Agar z dekstrozy SabouraudBD DifcoDF0109-17-1
Inkubator z wytrząsarką / Wytrząsarka termicznaVWRModel# SHKA2000
Staphylococcus aureusATCC Globalne Centrum Zasobów BiologicznychATTC 6538
MilliporeThymol SigmaT0501 (CAS# 89-83-8)
Tryptikaza Agar sojowyBD Difco236950
Tryptyka Bulion sojowyBD Difco215235
Tween 80Millipore SigmaSTS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-VIS SpectrophometerThermo ScientificGENESYS 30 (840-277000)
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmidt-Emrich, S., et al. Rapid assay to assess bacterial adhesion on textiles. Materials. 9 (4), 249(2016).
  2. Qaday, J., et al. Bacterial contamination of medical doctors and students white coats at Kilimanjaro Christian Medical Centre, Moshi, Tanzania. International Journal of Bacteriology. 2015, 507890(2015).
  3. Treakle, A. M., et al. Bacterial contamination of health care workers' white coats. American Journal of Infection Control. 37 (2), 101-105 (2009).
  4. Wong, D., Nye, K., Hollis, P. Microbial flora on doctors' white coats. BMJ. 303 (6817), 1602-1604 (1991).
  5. Gouveia, I. C. Nanobiotechnology: A new strategy to develop non-toxic antimicrobial textiles for healthcare applications. Journal of Biotechnology. (150), 349(2010).
  6. Joshi, M., Ali, S. W., Purwar, R., Rajendran, S. Ecofriendly antimicrobial finishing of textiles using bioactive agents based on natural products. Indian Journal of Fibre and Textile Research. 34, 295-304 (2009).
  7. Ahmed, H. A., Rajendran, R., Balakumar, C. Nanoherbal coating of cotton fabric to enhance antimicrobial durability. Elixir Applied Chemistry. 45, 7840-7843 (2012).
  8. Morais, D. S., Guedes, R. M., Lopes, M. A. Antimicrobial approaches for textiles: From research to market. Materials. 9 (6), 498(2016).
  9. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Development of advanced textile finishes using nano-emulsions from herbal extracts for organic cotton fabrics. Coatings. 11 (8), 939(2021).
  10. Martínez-Hernández, G. B., Amodio, M. L., Colelli, G. Carvacrol-loaded chitosan nanoparticles maintain quality of fresh-cut carrots. Innovative Food Science & Emerging Technologies. 41, 56-63 (2017).
  11. Zhang, H. L., Wu, S. H., Tao, Y., Zang, L. Q., Su, Z. Q. Preparation and characterization of water-soluble chitosan nanoparticles as protein delivery system. Journal of Nanomaterials. 2010, 1-5 (2010).
  12. Patel, R., Gajra, B., Parikh, R. H., Patel, G. Ganciclovir loaded chitosan nanoparticles: preparation and characterization. Journal of Nanomedicine & Nanotechnology. 7 (6), 1-8 (2016).
  13. Merodio, M., Arnedo, A., Renedo, M. J., Irache, J. M. Ganciclovir-loaded albumin nanoparticles: characterization and in vitro release properties. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 251-259 (2001).
  14. Hsieh, W. C., Chang, C. P., Gao, Y. L. Controlled release properties of Chitosan encapsulated volatile Citronella Oil microcapsules by thermal treatments. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 53 (2), 209-214 (2006).
  15. Yoksan, R., Jirawutthiwongchai, J., Arpo, K. Encapsulation of ascorbyl palmitate in chitosan nanoparticles by oil-in-water emulsion and ionic gelation processes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 76 (1), 292-297 (2010).
  16. Keawchaoon, L., Yoksan, R. Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 84 (1), 163-171 (2011).
  17. Cazedey, E. C. L., Salgado, H. R. N. Development and validation of a microbiological agar assay for determination of orbifloxacin in pharmaceutical preparations. Pharmaceutics. 3 (3), 572-581 (2011).
  18. Jayapriya, S., Bagyalakshmi, G. Textile antimicrobial testing and standards. International Journal of Textile and Fashion Technology. 4 (1), 2250-2378 (2013).
  19. AATCC 100. Antibacterial Finishes on Textile Materials: Assessment of Developed from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 100. , (2004).
  20. AATCC 147. Antimicrobial Activity Assessment of Textile Materials: Parallel Streak Method from American Association of Textile Chemists and Colorists. AATCC 147. , (2004).
  21. Ortelli, S., Costa, A. L., Dondi, M. TiO2 nanosols applied directly on textiles using different purification treatments. Materials. 8 (11), 7988-7996 (2015).
  22. Poole, K. Pseudomonas aeruginosa: resistance to the max. Frontiers in Microbiology. 2, 65(2011).
  23. Pinho, E., Magalhães, L., Henriques, M., Oliveira, R. Antimicrobial activity assessment of textiles: standard methods comparison. Annals of Microbiology. 61 (3), 493-498 (2010).
  24. Venkatraman, P. D., Sayed, U., Parte, S., Korgaonkar, S. Novel antimicrobial finishing of organic cotton fabrics using nano-emulsions derived from Karanja and Gokhru plants. Textile Research Journal. 92 (23-24), 5015-5032 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz steczki chitosanuochrona fartuch w laboratoryjnychredukcja patogen wzwi zki bioaktywnemetoda smug r wnoleg ychlogarytmiczna redukcja drobnoustroj wwyka czanie tekstyli w

Powiązane artykuły