Artykuł metodologiczny

Urządzenie do bezpośredniej infuzji do dostarczania cząsteczek w roślinach

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65194

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory, 2Agrosource Incorporated

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje nowatorskie urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego do badania skuteczności cząsteczek przeciwko bakteriom (Candidatus Liberibacter asiaticus) lub ich owadziczemu wektorowi (Diaphorina citri, Kuwayama), które w połączeniu są związane z chorobą cytrusów Huanglongbing.

Streszczenie

Testowanie funkcji związków leczniczych w roślinach jest ważnym elementem badań rolniczych. Metody dolistne i zraszanie doglebowe są rutynowe, ale mają wady, takie jak zmienny pobór i rozkład środowiskowy badanych cząsteczek. Iniekcja pni drzew jest dobrze znana, ale większość metod wymaga drogiego, zastrzeżonego sprzętu. Aby przeprowadzić badania przesiewowe różnych metod leczenia Huanglongbing, potrzebna jest prosta, tania metoda dostarczania tych związków do tkanki naczyniowej małych drzew cytrusowych uprawianych w szklarniach, zakażonych wirusem Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) lub zarażonych wektorem owadów żywiących się łykiem CLas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).

Aby spełnić te wymagania dotyczące kontroli, zaprojektowano urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego (DPI), które łączy się z pniem rośliny. Urządzenie wykonane jest przy użyciu systemu druku 3D na bazie nylonu oraz łatwo dostępnych elementów pomocniczych. Skuteczność wychwytu związków tego urządzenia została przetestowana na roślinach cytrusowych przy użyciu markera fluorescencyjnego dioctanu 5,6-karboksyfluoresceiny. Rutynowo obserwowano równomierny rozkład markera w roślinach.

Ponadto, to urządzenie było używane do dostarczania cząsteczek przeciwbakteryjnych i owadobójczych, aby określić ich wpływ odpowiednio na CLas i D. citri. Antybiotyk aminoglikozydowy streptomycyna był dostarczany do roślin cytrusowych zakażonych CLas za pomocą urządzenia, co spowodowało zmniejszenie miana CLas z 2 tygodni do 4 tygodni po leczeniu. Dostarczenie insektycydu neonikotynoidowego imidachloprydu do roślin cytrusowych zaatakowanych przez D. citri spowodowało znaczny wzrost śmiertelności psyllidów po 7 dniach. Wyniki te sugerują, że to urządzenie DPI stanowi użyteczny system dostarczania cząsteczek do roślin w celu przetestowania i ułatwienia celów badawczych i przesiewowych.

Wprowadzenie

Zarządzanie roślinami w obiektach komercyjnych i krajobrazowych często wymaga użycia związków chemicznych w celu optymalizacji wzrostu i zdrowia roślin. Sposób, w jaki te cząsteczki są dostarczane, zależy od rodzaju cząsteczki, funkcji cząsteczki, rodzaju rośliny i zastosowanego systemu zarządzania. Stosowanie dolistne i doglebowe jest najłatwiejszą strategią podawania, ale ograniczenia w pobieraniu niektórych cząsteczek wymagają bezpośredniego podawania. Przykładem tych cząsteczek są cząsteczki terapeutyczne, które działają najlepiej, gdy poruszają się ogólnoustrojowo w roślinie, ale nie mogą być skutecznie dostarczane przez proste aplikacje miejscowe1. Tak jest w przypadku Huanglongbing (HLB), zwanej również chorobą zielenienia cytrusów. HLB jest chorobą związaną z bakterią ograniczoną do łyka, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), która nie może być hodowana poza rośliną, lub jej owadem wektorem, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.

Jeśli domniemane cząsteczki terapeutyczne są produktami genów, można je przetestować, tworząc transgeniczne rośliny wyrażające te związki. Jednak transgeniczna produkcja roślinna może być czasochłonna i zasobożerna, jest wysoce zależna od genotypu i może być hamowana przez wyciszanie genów3. Ponadto, nawet jeśli te transgeniczne wykazują obiecujące wyniki, ograniczenia regulacyjne i publiczne zmniejszają prawdopodobieństwo ich komercyjnej akceptacji4,5. Egzogenne zastosowanie związków upraszcza jednak testowanie cząsteczek biologicznych i syntetycznych, ponieważ nie wymaga produkcji stabilnych lub przejściowo eksprymujących roślin transgenicznych, co skraca czas i zasoby do testowania efektów cząsteczki. Metoda skutecznego i wydajnego systemowego dostarczania do roślin związków egzogennych może być wykorzystana do wielu różnych celów badawczych i przesiewowych.

Jednym z tych zastosowań jest analiza ogólnoustrojowego ruchu molekuł w układzie naczyniowym rośliny, którą można przeprowadzić za pomocą możliwych do śledzenia markerów, niezależnie od tego, czy są to izotopy fluorescencyjne, widoczne czy unikalne izotopy chemiczne6,7,8,9. Jednym z powszechnie stosowanych markerów fluorescencyjnych jest dioctan 5,6-karboksyfluoresceiny (CFDA), który jest barwnikiem przepuszczalnym dla błony, który jest degradowany przez wewnątrzkomórkowe esterazy do 5,6-karboksyfluoresceiny (CF), a następnie staje się fluorescencyjny i nieprzepuszczalny dla błony10. CFDA jest szeroko stosowany do monitorowania transportu łyka, relacji między ujściem a źródłem oraz wzorców naczyniowych w tkance roślinnej11,12.

Oprócz tych markerów, pewne związki mogą bezpośrednio zmieniać fizjologię rośliny, aby zwiększyć produktywność lub zabić roślinę w przypadku herbicydów. Zarówno insektycydy, jak i związki przeciwdrobnoustrojowe są sposobem na zwiększenie produktywności roślin, zwłaszcza w obecności HLB. Przykładem cząsteczki przeciwdrobnoustrojowej, która jest stosowana do kontrolowania CLas, jest streptomycyna. Streptomycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który został pierwotnie wyizolowany ze Streptomyces griseus i wykazano, że hamuje wzrost bakterii poprzez hamowanie biosyntezy białek13. Jeśli chodzi o insektycydy, głównym celem badań HLB jest D. citri, który przenosi CLas z drzewa na drzewo14. W tym celu powszechnie stosuje się neonikotynoidy, takie jak imidachlopryd, ponieważ są one złotym standardem w zwalczaniu szkodników owadzich15. Wszystkie te różnorodne zastosowania są ważnymi aspektami obecnych strategii zarządzania zakładem, a rozwój nowych produktów zależy od skutecznych testów przesiewowych.

Jedną z metod stosowanych do wprowadzania związków do roślin drzewiastych jest bezpośrednie wstrzykiwanie do pnia. Zaprojektowano różne systemy, które różnią się pod względem potrzeb w zakresie wstępnie nawierconych miejsc iniekcji, a systemy te wykorzystują wtrysk oparty na ciśnieniu lub pasywny przepływ16. Chociaż systemy oparte na ciśnieniu pozwalają na szybkie wprowadzenie danego związku, należy wziąć pod uwagę potencjalne uszkodzenia fizyczne spowodowane przetłaczaniem cieczy przez zablokowane lub zatorowe naczynia krwionośne17. Chociaż dolistne lub zraszanie związków jest mniej czasochłonne do wdrożenia, bezpośrednie wstrzykiwanie roślin zmniejsza marnotrawstwo interesującego związku z powodu strat powietrza lub gleby, a także może wydłużyć czas, w którym związki są w stanie aktywnym, zmniejszając narażenie na środowisko zewnętrzne18. Oba te aspekty są ważne dla zachowania drogich odczynników i zapewnienia spójności między powtórzeniami w warunkach badawczych.

To badanie opisuje projekt, konstrukcję i użycie innowacyjnego urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej (DPI), które może być użyte do oceny, jak interesujące związki wpływają na roślinę żywicielską. Do produkcji zarówno samego urządzenia, jak i kilku podzespołów związanych z jego budową wykorzystano standardową drukarkę 3D. Ta własna metoda konstrukcyjna pozwala naukowcom modyfikować urządzenie i jego komponenty w oparciu o ich specyficzne potrzeby eksperymentalne i zmniejsza zależność od dostępnych na rynku urządzeń do iniekcji roślin. Konfiguracja urządzenia jest prosta i wydajna, a wszystkie elementy pomocnicze są łatwo dostępne i niedrogie. Chociaż system został zaprojektowany do użytku z różnymi gatunkami roślin, przedstawione tutaj przykłady dotyczą doniczkowych roślin cytrusowych. Ponadto badanie to pokazuje, że urządzenie to jest w stanie skutecznie dostarczać wiele rodzajów związków ogólnoustrojowo do młodych roślin cytrusowych bez powodowania śmiertelności. Testowane związki obejmowały CFDA, który wykorzystano do oceny rozmieszczenia związków w roślinie, oraz streptomycynę i imidachlopryd, które wykorzystano do sprawdzenia, czy zaobserwowano przeciwdrobnoustrojowe i owadobójcze działanie tych związków po podaniu przez DPI.

Protokół

1. Produkcja roślin cytrusowych do eksperymentalnego wstrzykiwania związków

  1. Rozmnażaj małe doniczkowe drzewa cytrusowe z ukorzenionych sadzonek wegetatywnych lub nasion. Uprawy doniczkowych linii cytrusowych w jasny/ciemny dzień 16 godzin/8 godzin w temperaturze 28 °C.
  2. Wybierz rośliny cytrusowe o odpowiedniej wielkości do eksperymentu. Opisane zastosowania wymagały, aby rośliny miały od 12 cm do 100 cm wysokości i średnicę pnia 4-14 mm. Jeśli wymagany jest nowy wzrost spłukiwania, przytnij rośliny przed eksperymentem.

2. Trójwymiarowy wydruk urządzenia DPI i komponentów formy

  1. Nałóż cienką warstwę kleju na bazie polioctanu winylu na stół roboczy.
  2. Załaduj filament nylonowy do drukarki 3D i przygotuj drukarkę zgodnie z instrukcjami producenta. Zaimportuj żądany plik . Plik STL (Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4, Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6, Plik uzupełniający 7, Plik uzupełniający 8, Plik uzupełniający 9, Plik uzupełniający 10, Plik uzupełniający 11, Plik uzupełniający 12, Plik uzupełniający 13 i Plik uzupełniający 14), zainstaluj i rozpocznij drukowanie.
  3. Wyjmij element ze stołu roboczego. Spłucz klej na bazie polioctanu winylu z podstawy drukowanego elementu wodą i usuń wszelkie struktury podporowe.
  4. Spryskaj komponent DPI dwiema warstwami bezbarwnej farby w sprayu z połyskiem.

3. Wykonanie formy pierścieniowej z plastizolu

  1. Zmontuj formę formy wystarczająco dużą, aby pomieścić elementy wzoru, budując prostokątną obudowę za pomocą zatrzaskowych plastikowych bloków na podstawie (rysunek uzupełniający S1A).
  2. Wymieszaj monomer silikonowy RTV i katalizator w stosunku 10:1 i mieszaj bez wprowadzania bąbelków przez 1 minutę. Kolor, dodając barwnik spożywczy (3 krople/25 ml mieszanki silikonu) i mydło do rąk (1 ml mydła/25 ml mieszanki silikonu) (rysunek uzupełniający S1B).
  3. Wlej cienką warstwę silikonu do formy formy, która wystarczy, aby całkowicie pokryć dno. Ubijaj, aby spłaszczyć powierzchnię i odczekaj 24 godziny, aż silikon stwardnieje (rysunek uzupełniający S1C).
  4. Wlej drugą warstwę silikonu, jak opisano powyżej, która jest wystarczająco głęboka, aby pokryć odcisk rdzenia środkowego otworu na wzorze (widoczny w górnej części wzoru na rysunku uzupełniającym S1D). Włóż wzór do płynnego silikonu z nadrukiem rdzenia środkowego otworu skierowanym w dół. Upewnij się, że żadne pęcherzyki nie są uwięzione i że wzory są dobrze oddzielone i nie stykają się (rysunek uzupełniający S1E).
  5. Zabezpiecz wzory ciężkim przedmiotem i/lub taśmą, aby zapobiec ich wypływaniu z silikonu podczas jego zastygania. Odczekać 24 godziny, aż nowo wylana warstwa stwardnieje (rysunek uzupełniający S1F).
  6. Wlej dodatkowe warstwy silikonu, aż poziom zrówna się z górną częścią wzoru. Odczekać 24 godziny do utwardzenia (rysunek uzupełniający S1G).
  7. Zdemontuj zatrzaskowe plastikowe bloki, aby zwolnić formę. Usuń wzory (rysunek uzupełniający S1H). Sprawdź formę pod kątem rozdarć lub deformacji (rysunek uzupełniający S1I).

4. Odlewanie pierścieni plastizolowych

  1. Pokryj wnętrze formy, wszystkie podstawowe elementy i O-ringi olejem spożywczym (rysunek uzupełniający S2A, B). Umieść O-ring wokół wycięcia pośrodku środkowego rdzenia słupka i umieść rdzeń w środkowym otworze formy pierścienia plastizolowego (rysunek uzupełniający S2C).
  2. Włóż rdzeń kanału tłocznego do otworu z boku formy pierścieniowej z plastizolu. Ustaw końcówkę w kształcie litery V na końcu rdzenia kanału tłocznego, aby wyrównać ją z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym na środkowym rdzeniu słupka (rysunek uzupełniający S2D,E).
  3. Podgrzej plastizol w kuchence mikrofalowej przez krótkie 10-sekundowe serie (rysunek uzupełniający S2F, G). Delikatnie wymieszaj plastisol, aby uniknąć pęcherzyków (rysunek uzupełniający S2H). Powtarzać ogrzewanie i mieszanie, aż roztwór osiągnie temperaturę między 160 °C a 170 °C (rysunek uzupełniający S2I).
    UWAGA: Przegrzanie plastizolu może prowadzić do uwolnienia toksycznych oparów. Zabieg należy wykonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub dygestorium. Nie podgrzewać plastizolu powyżej 170 °C.
  4. Wlej stopiony plastizol do formy z pierścieniem plastizolowym w pobliżu zewnętrznej krawędzi formy bez wprowadzania pęcherzyków (rysunek uzupełniający S2J). Odczekać 1 godzinę, aż pierścienie plastizolowe ostygną (rysunek uzupełniający S2K). Wyjmij pierścienie z formy. Upewnij się, że urządzenie DPI jest prawidłowo dopasowane do urządzenia DPI przed użyciem w testach eksperymentalnych (rysunek uzupełniający S2L).

5. Dołączenie urządzenia DPI do instalacji

  1. Znajdź gładkie, zdrowe miejsce na bagażniku do mocowania urządzenia. Unikaj wszelkich nierówności i węzłów, ponieważ mogą one przyczynić się do wycieku z urządzenia.
  2. Za pomocą wiertła o średnicy 2 mm wywiercić otwór poziomo przez środek trzpienia pod kątem 90° z powierzchnią pnia (rysunek uzupełniający S3A). Przełóż wiertło przez otwór kilka razy, aby go oczyścić i wygładzić, aby utworzyć niezakłócony otwór (rysunek uzupełniający S3B).
  3. Utwórz pionowy plaster w pierścieniu plastizolowym po przeciwnej stronie kanału dostarczania związku (rysunek uzupełniający S3C). Zamontuj pierścień wokół instalacji i wyrównaj kanał tłoczny z wcześniej wywierconym otworem (rysunek uzupełniający S3D).
    UWAGA: Pierścień musi ściśle przylegać do pnia, aby uniknąć wycieków; Zespoły rdzeni o różnych średnicach mogą być używane do wytwarzania pierścieni plastizolowych dla łodyg roślin o różnych rozmiarach.
  4. Dodaj urządzenie DPI do pierścienia plastizolowego, upewniając się, że ściśle do siebie przylegają. Dopasuj wylewkę urządzenia DPI do kanału doprowadzającego pierścień plastizolowy i wywierconego otworu (rysunek uzupełniający S3E).
    UWAGA: Pomocne może być użycie wiertła do wyrównania otworu i wylewki urządzenia DPI.
  5. Owinąć szczelnie taśmą silikonową, aby utrzymać urządzenie na miejscu (rysunek uzupełniający S3F). Sprawdź w pełni zmontowane i podłączone urządzenie, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie i orientację na roślinie.

6. Stosowanie procentu składanego za pomocą urządzenia DPI

  1. Za pomocą strzykawki lub pipety napełnić urządzenie DPI roztworem, który Cię interesuje (Rysunek uzupełniający S3G). Za pomocą strzykawki przebić taśmę silikonową i pierścień plastizolowy po przeciwnej stronie urządzenia DPI, aby wyciągnąć powietrze z kanału wewnętrznego i uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do naczyń krwionośnych roślin (rysunek uzupełniający S3H). Włóż wyekstrahowany związek z powrotem do urządzenia DPI.
  2. Dodaj dodatkowy mały plaster taśmy silikonowej na otwór utworzony przez strzykawkę, aby wzmocnić obszar i zapobiec rozdarciom. Sprawdź urządzenie pod kątem widocznych wycieków w punkcie mocowania i sprawdź zbiornik urządzenia pod kątem stabilnego poziomu cieczy.
    UWAGA: Woda może być początkowo używana do testowania szczelności, aby uniknąć marnowania roztworu testowego.
  3. Przykryj otwarty koniec urządzenia DPI woskową folią uszczelniającą i pociągnij w dół, aby utworzyć uszczelkę i zmniejszyć parowanie eksperymentalnego związku. Za pomocą końcówki strzykawki przebić pojedynczy otwór w folii woskowej, aby zapobiec powstawaniu podciśnienia, a następnie ponownie napełnić urządzenie (rysunek uzupełniający S3I).
  4. Codziennie sprawdzaj urządzenie, aby upewnić się, że elementy są prawidłowo ustawione (rysunek uzupełniający S3J) i uzupełniaj płyn za pomocą strzykawki, aby uniknąć wyschnięcia zbiornika. Powtarzaj ten proces, aż zostanie wprowadzona żądana ilość roztworu eksperymentalnego.
    UWAGA: Związki można z powodzeniem wprowadzać z danego urządzenia na okres do 1 miesiąca. Czas wchłaniania roztworu, który przekracza ten przedział czasowy, powinien zostać przetestowany empirycznie przed konfiguracją eksperymentalną.

7. Korzystanie z CFDA do obserwacji ruchu naczyń krwionośnych za pomocą roślin cytrusowych

  1. Przymocuj urządzenie DPI do roślin cytrynowych (Citrus medica L.) o wysokości 25 cm, nałóż pojedynczą dawkę 2,0 ml 20% DMSO w kontroli H2Olub CFDA do urządzenia DPI i pozwól mu się wchłonąć przez 24 godziny. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, przygotuj roboczy roztwór CFDA, dodając 1,6 ml H2O do 400 μl roztworu podstawowego CFDA (roztwór podstawowy zawiera 10 mM CFDA rozpuszczonego w 100% dimetylosulfotlenku [DMSO]) w celu wytworzenia końcowego stężenia CFDA 2 mM i 20% DMSO.
  2. Wykonaj przekroje różnych tkanek rośliny i użyj stereoskopu lub mikroskopu złożonego z filtrem fluorescencyjnym, który obejmuje długość fali 498 nm, aby uwidocznić CFDA w tkankach roślinnych. Porównaj obrazy z 20% DMSO w kontrolach H2O, aby uwzględnić autofluorescencję w tkance.

8. Pomiar zmian miana CLas w próbkach liści po leczeniu streptomycyną

  1. Używając roślin Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") o wysokości 0,75 m pochodzących z uprawy szklarniowej, zbierz ogonek liściowy i nerwy z dwóch liści z objawami HLB z każdej rośliny, posiekaj je na małe kawałki, połącz każdy rodzaj tkanki i przechowuj je oddzielnie w odpornych na uderzenia probówkach o pojemności 2 ml zawierających stalową kulkę o średnicy 6,35 mm.
  2. Zmielić próbkę za pomocą homogenizatora zaprogramowanego na dwa cykle 15 s z prędkością 3,4 m/s. Wyekstrahować całkowity kwas nukleinowy zgodnie z wcześniejszym opisem19.
  3. Przeprowadzić qPCR na próbkach liści zakażonych CLas, stosując mieszaninę qPCR określoną w tabeli 1 i warunki reakcji określone w tabeli 2. Do dalszej analizy należy użyć roślin wykazujących silne infekcje CLas (silne zakażenie jest ogólnie definiowane jako wartości Ct oparte na qPCR < 30 dla zestawu starterów CLas 16S LasLong (LL)).
    UWAGA: Miano bakterii jest szacowane przy użyciu CLas 16S Las Long (LL) i starterów DNA dehydryny cytrusowej w celu oszacowania względnych odpowiedników genomu, jak opisano wcześniej20.
  4. Wyposaż rośliny cytrusowe, które spełniają minimalne miano infekcji opisane powyżej, w urządzenia DPI i poddaj je jednorazowemu traktowaniu 2,0 ml roztworuH2Olub roztworu streptomycyny o pożądanym stężeniu. Aby postępować zgodnie z tym badaniem, należy zastosować pojedynczą dawkę 2,0 ml streptomycyny o stężeniu 9,5 mg/ml (łącznie 19 mg) rozpuszczonej wH2O.
  5. Próbki liści należy pobrać po 7 dniach, 14 dniach i 28 dniach od zabiegu. Oznaczenie liści, z których pobrano próbki, pod kątem miana CLas, należy użyć tego samego protokołu, jak opisano powyżej.
  6. Po 60 dniach od zabiegu należy uzyskać zdjęcia roślin traktowanychH2Olub streptomycyną. Wykorzystaj obserwacje wizualne infekcji CLas, aby ocenić nasilenie infekcji. Zwróć uwagę na <50% liści wykazujących chlorozę międzynerwową i korkowanie nerwów wraz ze wzrostem powierzchni liści jako oznaki łagodnej infekcji, a ponad 50% liści z chlorozą międzynerwową i korkowaniem nerwów, a także odcięciem liści i zahamowaniem wzrostu rośliny jako oznakami poważniejszych infekcji.

9. Pomiar śmiertelności D. citri po leczeniu imidakloprydem

  1. Przycinaj rośliny cytryny (Citrus medica L.) o wysokości 0,5 m do wysokości 12 cm, aby pobudzić wzrost nowego zaczerwienienia.
    UWAGA: Szybkość wzrostu spłukiwania może zależeć od zdrowia rośliny i pory roku; Weź to pod uwagę podczas projektowania eksperymentalnego.
  2. Po rozwinięciu >6 spłukania o długości 1-2 cm należy wprowadzić rośliny do klatek zawierających dorosłe osobniki D. citri. Pozostaw rośliny w klatkach na 24 godziny, aby umożliwić złożenie jaj.
  3. Przeprowadź reprezentatywne liczenie jaj na trzech pędach spłukujących 1-2 dni po złożeniu, a następnie zastosuj urządzenia DPI. Napełnij te urządzenia 2,0 ml kontrolki wody lub pożądanego stężenia imidakloprydu (21,8% składnika aktywnego). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj 528 μL/L, 52,8 μL/L i 5,28 μL/L imidachloprydu.
    UWAGA: Liczenie jaj jest miarą destrukcyjną, więc liczenie na tym etapie jest wykorzystywane do oszacowania liczby jaj w niepoliczonym rzucie tej samej rośliny i pomaga zapewnić punkt odniesienia dla kolejnych wschodzących nimf, które są przeprowadzane na końcu eksperymentu.
  4. Zbierz wskaźnik wschodów D. citri na co najmniej trzech pozostałych pędach rumieniących. Uzyskaj reprezentatywne zdjęcia roślin 7 dni po wprowadzeniu związku.

Wyniki

Komponenty urządzenia do bezpośredniej infuzji
Podstawowa wersja urządzenia do bezpośredniej infuzji ma wysokość 8 cm oraz szerokość 3,3 cm z przodu i z boku (Rysunek 1A). Zawiera ono pojedynczy centralny zbiornik połączony z wylewką, a całkowita objętość, jaką mogą pomieścić te elementy, wynosi 2,0 mL (Rysunek 1D). Pierścień z plastizolu ma wysokość 1,8 cm i średnicę 2,7 cm (Rysunek 1C). Pierścień ten posiada również dwa kanały: jeden przeznaczony na wylewkę urządzenia DPI oraz drugi o zmiennej średnicy, który dopasowuje się do pnia leczonego drzewa. Dodatkowo wokół kanału pionowego znajduje się rowek, który kieruje nadmiar preparatu wokół drzewa, co umożliwia dodatkowe wchłanianie związku przez korę (Rysunek 1F). Po prawidłowym montażu pierścień z plastizolu powinien przylegać ściśle do urządzenia DPI, a wylewka powinna być wyrównana z otworem wywierconym w drzewie (Rysunek 1B oraz Rysunek 1E).

CFDA
Aby zbadać skuteczność urządzenia DPI w wprowadzaniu egzogennych substancji chemicznych do roślin cytrusowych, przy użyciu urządzenia infiltrowano 2,0 mL 2 mM CFDA. Sygnał fluorescencyjny wykryto w układzie przewodzącym potraktowanej rośliny (Rysunek 2A), natomiast był on nieobecny u roślin kontrolnych potraktowanych 20% DMSO w H2O (Rysunek 2B). Sygnał ten zaobserwowano we wszystkich rozsektowanych typach tkanek roślinnych, w tym w mezofilu liścia, wiązkach przewodzących ogonka liściowego, wiązkach przewodzących łodygi oraz wiązkach przewodzących korzenia (Rysunek 2C). Sygnał ten zaobserwowano w roślinie w ciągu 24 h od zabiegu i był on rozłożony stosunkowo równomiernie w tkankach.

Streptomycyna
Aby sprawdzić, czy wprowadzone związki wykazują działanie terapeutyczne w chorobie HLB, do zakażonych CLas roślin słodkiej pomarańczy odmiany Valencia (Citrus sinensis) wprowadzono 2,0 mL związku bakteriobójczego, streptomycyny, w stężeniu 9,5 mg/mL (łącznie 19 mg). Rośliny te utrzymywano w doniczkach w szklarni, a miano CLas (mierzone jako ekwiwalenty genomu CLas na ekwiwalenty genomu cytrusów) monitorowano w czasie za pomocą qPCR (Rycina 3A). Początkowe średnie miana DNA CLas dla roślin traktowanych streptomycyną oraz H2O wynosiły odpowiednio 0,562 CLas genome/citrus genome oraz 0,49 CLas genome/citrus genome. Spadek średniego miana bakterii wykryto za pomocą qPCR od 7 do 28 dni po podaniu streptomycyny w porównaniu z kontrolami H2O w tych samych punktach czasowych. Ponadto różnica między średnimi mianami bakterii w dniu 0 a dniu 28 wynosiła odpowiednio 0,314 dla roślin traktowanych streptomycyną oraz 0,117 dla roślin traktowanych H2O.

Niniejszy eksperyment został zaprojektowany w celu pomiaru odpowiedzi rośliny na różne zabiegi w różnych odstępach czasu. Zastosowano dwuczynnikowy kwadratowy model powierzchni odpowiedzi, w którym czas traktowano jako ilościowy czynnik dyskretny z czterema poziomami (0 dni, 7 dni, 14 dni i 28 dni), a zabieg jako czynnik kategoryczny z dwoma poziomami (H2O i streptomycyna). Dla każdej z ośmiu kombinacji zabiegów wykonano pięć powtórzeń, a mianem zmiennej odpowiedzi był miano CLas. Dane przekształcono za pomocą log10 na podstawie analizy wykresu Boxa-Coxa. Redukcję modelu przeprowadzono metodą selekcji w przód przy użyciu kryterium informacyjnego Akaike (AICc)21, co doprowadziło do usunięcia efektów czasu oraz interakcji. Pozostały czynnik, zabieg, był istotny (p = 0,0252), przy czym rośliny traktowane streptomycyną wykazały niższe średnie miano CLas (0,349) niż rośliny traktowane H2O (0,496) we wszystkich punktach czasowych łącznie (Rycina 3B). Redukcja miana CLas odpowiadała sporadycznym wzrostom nowych, zdrowych pędów po 60 dniach u roślin traktowanych streptomycyną, co potwierdzają fotografie reprezentatywnych drzew traktowanych H2O (Rycina 3C) w porównaniu do drzew traktowanych 19 mg streptomycyny (Rycina 3D).

Imidaklopryd
Imidaklopryd wprowadzono do zainfekowanych młodymi osobnikami azjatyckiego psyllida cytrusowego (ACP) roślin cytrynowca za pomocą urządzenia DPI, aby przetestować jego potencjał jako testu przesiewowego insektycydów przeciwko D. citri. Przetestowano pojedynczą dawkę 2,0 mL komercyjnego roztworu insektycydu imidakloprydu w trzech różnych stężeniach (5,28 µL/L, 52,8 µL/L i 528 µL/L) wraz z kontrolą wodną. Średnia całkowita liczba jaj na trzy młode pędy przed zabiegiem wynosiła od 280,5 do 321, a między roślinami przeznaczonymi do poszczególnych grup badawczych nie stwierdzono istotnych różnic (Rysunek 4A). Średnia całkowita liczba przeżyłych nimf na trzech młodych pędach 7 dni po zabiegu wynosiła odpowiednio 293,75, 268, 97,5 i 2 dla kontroli wodnej oraz roztworów imidakloprydu o stężeniach 5,28 µL/L, 52,8 µL/L i 528 µL/L (Rysunek 4B). Według jednoczynnikowej analizy ANOVA z następującym testem post-hoc Tukeya, reprezentowało to istotną redukcję pojawiania się nimf psyllida przy stężeniach roztworu imidakloprydu 52,8 µL/L (p = 0,029) i 528 µL/L (p = 0,002) w porównaniu z kontrolą wodną. Dodatkowo wzrost śmiertelności nimf psyllida przy najwyższym stężeniu roztworu imidakloprydu był widoczny wizualnie poprzez zmniejszenie produkcji spadzi przez nimfy na liniach traktowanych imidakloprydem (Rysunek 4D) w porównaniu z kontrolą wodną (Rysunek 4C).

Urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej do badań nad roślinami; przekrój, szczegóły zestawu w pomiarze eksperymentalnym.
Rysunek 1: Urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej i pierścień z plastizolu. (A) Kompletne urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej oraz (C) pierścień z plastizolu wraz z ich wymiarami. (B) Urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej i pierścień z plastizolu połączone i przymocowane do cytrusa. Przekroje pionowe (D) urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej, (F) pierścienia z plastizolu oraz (E) tych dwóch komponentów połączonych i przymocowanych do cytrusa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna przekroju rośliny; schematy przedstawiają strukturę komórkową i obecność chlorofilu.
Rysunek 2: Przekrój poprzeczny nerwu głównego liścia rośliny cytrusowej o wysokości 25 cm. Obrazy wykonane 24 h po traktowaniu (A) 2 mM CFDA lub (B) 20% DMSO w H2O przy użyciu urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej. (C) Przekroje poprzeczne różnych tkanek roślinnych 24 h po traktowaniu 2 mM CFDA, w tym: pnia 5 cm powyżej urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej (lewa góra), pnia 5 cm poniżej urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej (lewa środek), korzenia (lewa dół), nerwu głównego liścia (prawa góra), ogonka liściowego (prawa środek) oraz mezofilu liścia (prawa dół). Paski skali = 1 mm. Skróty: CFDA = 5,6-karboksyfluoresceina-diacetat; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Efekty traktowania cytrusów; wykresy porównują dane genomiczne; zdjęcia roślin pokazują wyniki dla H2O i streptomycyny.
Rycina 3: Monitorowanie miana CLas (mierzonego jako ekwiwalenty genomu CLas na ekwiwalenty genomu cytrusów) w czasie przy użyciu qPCR. (A) Przebieg czasowy pokazujący zmiany w mianie DNA CLas w porównaniu pięciu roślin traktowanych 19 mg streptomycyny z pięcioma roślinami traktowanymi kontrolą H2O. Punkty reprezentują średnią dla danej grupy traktowania w danym punkcie czasowym. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej. (B) Wykres słupkowy przedstawiający średnie miano CLas w roślinach traktowanych H2O i streptomycyną we wszystkich punktach czasowych. Słupki błędu reprezentują 95% przedział ufności, a gwiazdki oznaczają istotne różnice (* = p < 0.05) między średnimi mianami CLas dla roślin traktowanych streptomycyną i H2O zgodnie z jednoczynnikową analizą ANOVA. (C) Reprezentatywne zdjęcia roślin cytrusów 0 miesięcy i 2 miesięcy po bezpośrednim zabiegu infuzji roślinnej z zastosowaniem (C) H2O lub (D) streptomycyny. Rośliny traktowane streptomycyną wykazują nowy wzrost jasnozielonych liści po 2 miesiącach, co sugeruje redukcję miana CLas. Skrót: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Efekty imidakloprydu: wykresy słupkowe liczby jaj i nimf; liście zainfekowane i niezafekowane.
Rysunek 4: Monitorowanie śmiertelności nimf psyllid w młodych roślinach cytrynowca zainfekowanych ACP. Wykresy słupkowe przedstawiające (A) szacunkową początkową liczbę jaj oraz (B) przeżyłe nimfy D. citri na trzech młodych pędach cytrusów 7 dni po potraktowaniu kontrolą wodną i różnymi rozcieńczeniami imidakloprydu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej, a gwiazdki oznaczają istotne różnice (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) między danym poziomem traktowania a kontrolą wodną zgodnie z jednoczynnikową analizą ANOVA, a następnie analizą post-hoc Tukeya. Zdjęcia młodych pędów cytrusów zainfekowanych nimfami D. citri 7 dni po traktowaniu (C) kontrolą wodną lub (D) 528 µL/L imidakloprydu przy użyciu urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej. Skróty: ACP = azjatycka psyllida cytrusowa; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Objętość na próbkę (µL)Komponent
12.52x GoTaq qPCR z barwnikiem BRYT Green Dye Master Mix
5Matryca DNA (20 ng/µL)
0.510 µM Startery F i R dla CLasClas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Forward);
TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (odwrócona)
0.510 µM Startery F i R dla genów pomocniczych CitrusDehydryna cytrusowa: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Forward);
AAAACTTCACCGATCCACCAG (odwrotny)
6.5H2O

Tabela 1: Mieszanina do qPCR użyta do ilościowego oznaczenia miana CLas w liniach cytrusów traktowanych streptomycyną. Przedstawiono sekwencje starterów 16S Las Long oraz starterów dehydryny cytrusów do ilościowego oznaczenia DNA CLas oraz DNA cytrusów.

KrokTemperatura (°C)Czas
1Denaturacja wstępna952 min
2Denaturacja9515 s
3Przyłączanie (annealing)6020 s
4Elongacja7220 s
5Powrót do kroku 2, powtórzyć 39x
6Krzywa topnienia60 z gradientem do 95 w temp. 0.2 °C/s3 min

Tabela 2: Warunki reakcji dla qPCR zastosowanego do ilościowego oznaczenia miana CLas w liniach cytrusów traktowanych streptomycyną.

Rycina uzupełniająca S1: Zdjęcia przedstawiające proces składania formy do wytwarzania pierścienia z plastizolu. (A) Do wytworzenia pierwszej warstwy formy pierścienia z plastizolu użyto plastikowych bloków zatrzaskowych. (B) Jednorodnie wymieszany roztwór zawierający gumę silikonową RTV, katalizator, barwnik spożywczy i mydło. (C) Równomiernie wylana pierwsza warstwa formy pierścienia z plastizolu. (D) Zdjęcie wzorów pierścienia z plastizolu z odlewem rdzenia otworu centralnego u góry. (E) Wzory pierścienia z plastizolu włożone do nieutwardzonej drugiej warstwy formy. (F) Taśma maskująca i gumowy młotek użyte do zabezpieczenia wzorów podczas utwardzania drugiej warstwy. (G) Dodanie trzeciej warstwy formy, aż do wyrównania z górną krawędzią wzorów. (H) Wyjmowanie wzorów z formy. (I) W pełni ukończona forma pierścienia z plastizolu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Zdjęcia przedstawiające proces montażu pierścienia z plastizolu powiązanego z urządzeniem do bezpośredniej infuzji roślinnej. (A) Elementy montażowe pierścienia z plastizolu, w tym forma, rdzeń centralny z o-ringiem oraz rdzeń kanału doprowadzającego. (B) Pokrywanie rdzeni nieprzywierającym sprayem do smażenia w celu ułatwienia usunięcia pierścienia z plastizolu po utwardzeniu. (C) Wkładanie rdzenia centralnego i o-ringu do formy. (D) Wkładanie rdzenia kanału doprowadzającego prostopadle do rdzenia centralnego. (E) Prawidłowy montaż elementów rdzenia pierścienia z plastizolu w zagłębieniu formy. (F) Plastizol użyty do wytworzenia pierścienia z plastizolu. (G) Podgrzewanie plastizolu w kuchence mikrofalowej. (H) Mieszanie plastizolu po podgrzaniu. (I) Sprawdzanie temperatury plastizolu. (J) Wlewanie podgrzanego plastizolu do zmontowanego rdzenia. (K) Odstawienie plastizolu do ostygnięcia wokół zmontowanego rdzenia. (L) W pełni zmontowane pierścienie z plastizolu przymocowane do urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Zdjęcia przedstawiające proces montażu urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej. (A) Wywiercanie otworu przez środek rośliny cytrusowej w celu utworzenia kanału do dostarczania związku. (B) Widok z przodu wywierconego otworu. (C) Przecięcie pierścienia z plastizolu żyletką po przeciwnej stronie kanału dostarczania związku. (D) Ścisłe dopasowanie pierścienia z plastizolu wokół łodygi w miejscu wcześniej wywierconego otworu. (E) Montaż urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej do pierścienia z plastizolu, poprzez włożenie króćca dostarczającego związek do kanału w pierścieniu z plastizolu. (F) Użycie taśmy silikonowej do przymocowania urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej do pierścienia z plastizolu i ustabilizowania całego aparatu. (G) Napełnianie komory urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej badanym związkiem. (H) Użycie strzykawki do odessania powietrza z wywierconego otworu w roślinie i zainicjowanie przepływu związku. (I) Nałożenie woskowej folii uszczelniającej na otwór w komorze urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej i wykonanie małej dziurki w celu zapobieżenia powstaniu próżni. (J) W pełni zmontowane urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej na roślinie cytrusowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik .STL rdzenia środkowego pierścienia z plastizolu dla drzewka 4 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik .STL rdzenia centralnego pierścienia z plastizolu dla drzewka 6 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik .STL rdzenia środkowego pierścienia z plastizolu dla drzewka 8 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plik .STL rdzenia środkowego pierścienia z plastizolu dla drzewka 10 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik .STL rdzenia centralnego pierścienia z plastizolu dla drzewa 12 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik .STL rdzenia środkowego pierścienia z plastizolu dla drzewa 14 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Plik .STL rdzenia kanału doprowadzającego pierścień z plastizolu dla drzewa 4 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Plik .STL rdzenia kanału dostarczającego pierścień z plastizolu dla drzewka 6 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Plik .STL rdzenia kanału doprowadzającego pierścień z plastizolu dla drzewa 8 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 10: Plik .STL rdzenia kanału dostarczającego pierścień z plastizolu dla drzewa 10 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 11: Plik .STL rdzenia kanału dostarczającego pierścień z plastisolu dla drzewa 12 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 12: Plik .STL rdzenia kanału dostarczającego pierścień z plastizolu dla drzewa 14 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 13: Plik .STL urządzenia do bezpośredniego naparu roślinnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 14: Plik .STL z wzorem użytym do wykonania formy pierścienia z plastizolu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Aby urządzenie DPI można było uznać za realną metodę dostarczania związków egzogennych do roślin, musi ono przyczyniać się do solidnego i spójnego wchłaniania związków do różnych typów tkanek. Eksperyment z wykorzystaniem CFDA wyraźnie wykazał zarówno ruch związków akropetalnych, jak i podstawnych, a także zarówno w układzie naczyniowym, jak i komórkach mezofilu liścia. Dodatkowo, przypuszczalnie dlatego, że wywiercony otwór używany w tym urządzeniu DPI zapewnia dużą powierzchnię do wchłaniania związku, CFDA był obecny w stosunkowo równych ilościach we wszystkich sekcjach łodygi, a nie tylko w niewielkim podzbiorze układu naczyniowego przylegającego do urządzenia, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach wchłaniania barwnika u roślin stosujących iniekcję do pnia6. Dodatkowo badano dostarczanie białka zielonej fluorescencji i barwnika kwiatowego za pomocą urządzenia DPI i zaobserwowano rozkład tych związków podobny do CFDA (dane nie pokazane). Dane te sugerują, że urządzenie może być wykorzystywane do ogólnoustrojowego dostarczania różnych związków, które różnią się wielkością i strukturą molekularną. Warto jednak zauważyć, że istniały różnice w pobieraniu związku w zależności od fazy rozwoju liści, przy czym młodsze rozwijające się liście pochłaniały więcej związku niż starsze liście założone. Może to wynikać ze zmian we właściwościach naczyniowych obecnych w tkance zlewu w porównaniu z tkanką źródłową i powinno być zoptymalizowane pod kątem danego eksperymentu.

Urządzenie DPI wykazało wystarczający absorpcję związków do wizualizacji CFDA, GFP i barwnika kwiatowego, a także zajęło wystarczająco dużo, aby pokazać przeciwbakteryjne i owadobójcze działanie odpowiednio streptomycyny i imidachloprydu. Oba te związki spowodowały zmiany w żywotności organizmu docelowego 1 tydzień po pojedynczym zabiegu 2,0 ml. Dane te sugerują, że urządzenie DPI może być stosowane w testach na całej roślinie w celu przetestowania żywotności szerokiej gamy związków do zwalczania szkodników mikrobiologicznych i owadzich. Co więcej, ze względu na bezpośredni kontakt z układem naczyniowym, urządzenie to może nawet dawać możliwość badania związków, które nie są efektywnie pobierane przez korzenie lub komórki naskórka. Szczególnie interesująca byłaby interferencja RNA (RNAi), ponieważ można ją wykorzystać do modulowania ekspresji genów w roślinie żywicielskiej, patogenie lub wektorze patogenu. Wcześniejsze badania, które wprowadziły RNA spinki do włosów przez wywiercony otwór w pniu jabłoni i winogron, wykazały, że cząsteczki RNA były ograniczone do tkanki ksylemu, co sugeruje, że cząsteczki te mogą być skuteczne tylko przeciwko organizmom żującym i żywiącym się sokami ksylemu22. Biorąc pod uwagę, że urządzenie DPI wykorzystuje podobny system dostarczania z wywierconymi otworami, ma się rozumieć, że RNA spinki do włosów dostarczane za pomocą tego urządzenia może być również ograniczone do tkanki ksylemu. Jednak zaobserwowany spadek miana CLas ograniczonego łykiem po leczeniu streptomycyną z urządzenia DPI silnie sugeruje, że antybiotyk ten był obecny w łyku. W związku z tym prawdopodobne jest, że rozmieszczenie naczyniowe związków dostarczanych za pomocą urządzenia DPI zależy od ich wielkości i składu chemicznego, a każda cząsteczka powinna być oceniana indywidualnie.

Chociaż na rynku dostępnych jest wiele komercyjnie dostępnych urządzeń DPI, opisywane tutaj urządzenie może być produkowane we własnym zakresie i można je modyfikować. W ten sposób można dokonywać ulepszeń i zmian wielkości w oparciu o zastosowane gatunki roślin i projekt doświadczalny, a nie jest to zależne od produktów komercyjnych. Ponadto urządzenie jest częściowo trwale przymocowane do rośliny, co oznacza, że wiele zabiegów danego związku może być wykonywanych jednocześnie bez konieczności ponownego uszkadzania rośliny za pomocą wielu wstrzyknięć związku. Ostrzegamy, że urządzenie może przeciekać, jeśli nie zostanie prawidłowo zainstalowane. W rezultacie związek ten jest tracony do środowiska, zamiast być dostarczany do zakładu. Dlatego należy zadbać o to, aby sprawdzić urządzenie pod kątem oznak wycieku podczas konfiguracji i pierwszych kilku dni po niej. Chociaż wiercenie w drzewie jest potencjalnie szkodliwe, ta metoda została wybrana, aby zapewnić solidne i stałe pobieranie związku. Ponadto w tych eksperymentach nie zaobserwowano żadnego negatywnego wpływu na zdrowie roślin po dołączeniu urządzenia DPI. Jednak w projekcie doświadczenia należy uwzględnić dodatkowe rośliny, aby zastąpić te, które mogą tracić wigor w trakcie danego doświadczenia. Wreszcie, ponieważ urządzenie to wykorzystuje przepływ pasywny do wprowadzania związków, może być trudno przewidzieć tempo wchłaniania przez różne gatunki roślin lub etapy rozwoju tego samego gatunku. Może to skomplikować eksperymenty, jeśli szybkość wchłaniania związku jest czynnikiem ograniczającym. Aby uzyskać najlepsze wyniki, eksperymenty należy zaplanować tak, aby zapewnić roślinie wystarczająco dużo czasu, aby w pełni wchłonąć 2,5 ml związku, co może zająć do 1 tygodnia. Podsumowując, to urządzenie DPI jest skutecznym narzędziem do szybkiej oceny aktywności in planta związków przeciwdrobnoustrojowych lub owadobójczych przeciwko CLas i jego wektorowi, D. citri, dostarczając w ten sposób więcej informacji na temat skuteczności ogólnoustrojowej i wpływu na wydajność roślin niż poprzednio prezentowany test z oderwanymi liśćmi23. Niewątpliwie różnorodność zastosowań tego systemu wykracza daleko poza konkretne zastosowania opisane w niniejszym opracowaniu.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Użycie nazw handlowych, firm lub korporacji w tej publikacji ma na celu informację i wygodę czytelnika. Takie użycie nie stanowi oficjalnego poparcia ani aprobaty Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych lub Służby Badań Rolniczych dla jakiegokolwiek produktu lub usługi, z wyłączeniem innych, które mogą być odpowiednie. Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) zabrania dyskryminacji we wszystkich swoich programach i działaniach ze względu na rasę, kolor skóry, pochodzenie narodowe, wiek, niepełnosprawność oraz, w stosownych przypadkach, płeć, stan cywilny, stan rodzinny, status rodzicielski, religię, orientację seksualną, informacje genetyczne, przekonania polityczne, odwet lub dlatego, że całość lub część dochodu danej osoby pochodzi z jakiegokolwiek programu pomocy publicznej. Nie wszystkie zabronione bazy mają zastosowanie do wszystkich programów. Osoby niepełnosprawne, które wymagają alternatywnych środków przekazywania informacji o programie (alfabet Braille'a, duży druk, taśma audio itp.), powinny skontaktować się z Centrum TARGET USDA pod numerem (202) 720-2600 (głos i TDD). Aby złożyć skargę na dyskryminację, napisz do USDA, Dyrektora, Biura Praw Obywatelskich, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410 lub zadzwoń pod numer (800) 795-3272 (głos) lub (202) 720-6382 (TDD). USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Mant Acon za rośliny użyte w tym badaniu. Finansowanie zostało zapewnione przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) projekt CRIS 8062-22410-007-000-D oraz grant USDA NIFA 2020-70029-33176.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kulki stalowe o średnicy 0,5 cm Produktybalistyczne Inc.
10 ml strzykawka Luer-LokBecton Dickinson382903029952
20 G 1 igła strzykawkowaBecton Dickinson305175
2 mlScientific1420-9710
3/32 cala Wiertło z czarnego tlenku
MarkforgedF-PR-2027
Oprogramowanie do druku 3DMarkforgedF-SW-FDVX Oprogramowanie
do druku 3DMarkforgedS-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(i-6)-dioctan karboksyfluoresceiny)InvitrogenC195
5/64-calowe wiertło z czarnego tlenkuUszczelniacze964502
96-dołkowa maszyna qPCRWirówka Roche5815916001
Eppendorf22621408
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusSP-BX43-BI
Filtr do mikroskopu fluorescencyjnegoChroma69401-ET
Błyszcząca bezbarwna farba w sprayuRustoleum249117
szara Płytka bazowa Lego11024
Ręczna wiertarko-wkrętarka akumulatorowaMakita6349D
HomogenizatorFisher Scientific15-340-163
Imidaklopryd 2FQuali-Pro83080133
Płynny plastizol Średnia twardośćFusion X Przynęty wędkarskieXSOL-505
Czerwony silikon 70 Shore A O-ringGraingerróżni się rozmiarem
Nieprzywierający spray do gotowaniaPAM64144030217
NucleoSpin Plant IIMacherey-Nagel740770.5
ParafilmBemisHS234526A
Klej na bazie octanu poli viylElmersE301
qPCR Master MixPromegaA6001
qPCR StarteryZintegrowane technologie DNA Różnisię w zależności od sekwencji
Odwrotna transkryptazaPromegaA5003
Żyletka z pojedynczą krawędziąGarvey40475
Półprzezroczysta silikonowa guma RTVAero Marine ProductsAM 115T
Przezroczysta taśma silikonowaMaxwellKE30S
Ścięta onkocyna 112GenscriptRóżni się w zależności od sekwencji
Biały 1 x 6 Lego Piece300901
BiałyNylon MarkkutyF-MF-0003
#SHT #T Rurki z nakrętką USA Drukarka 3D 964077 DNApeptydów

Bibliografia

  1. Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
  2. Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
  3. Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
  4. Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
  5. Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
  6. Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
  7. Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
  8. Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
  9. Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
  10. Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
  11. Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606(2019).
  12. Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
  13. Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
  14. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  15. Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097(2020).
  16. Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831(2019).
  17. Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552(2022).
  18. Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
  19. Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244(2020).
  20. Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
  21. Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
  22. Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253(2018).
  23. Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bezpośrednia infuzja roślinnarośliny do dostarczania cząsteczekiniekcja pniowaurządzenie do druku 3Dtraktowanie drzew cytrusowychbakterie ograniczone do floemudostarczanie streptomycynyaplikacja imidaclopryduskuteczność pobierania związkówtranspiracja roślin
Urządzenie do bezpośredniej infuzji do dostarczania cząsteczek w roślinach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.