Urządzenie do bezpośredniej infuzji do dostarczania cząsteczek w roślinach

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje nowatorskie urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego do badania skuteczności cząsteczek przeciwko bakteriom (Candidatus Liberibacter asiaticus) lub ich owadziczemu wektorowi (Diaphorina citri, Kuwayama), które w połączeniu są związane z chorobą cytrusów Huanglongbing.

Streszczenie

Testowanie funkcji związków leczniczych w roślinach jest ważnym elementem badań rolniczych. Metody dolistne i zraszanie doglebowe są rutynowe, ale mają wady, takie jak zmienny pobór i rozkład środowiskowy badanych cząsteczek. Iniekcja pni drzew jest dobrze znana, ale większość metod wymaga drogiego, zastrzeżonego sprzętu. Aby przeprowadzić badania przesiewowe różnych metod leczenia Huanglongbing, potrzebna jest prosta, tania metoda dostarczania tych związków do tkanki naczyniowej małych drzew cytrusowych uprawianych w szklarniach, zakażonych wirusem Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) lub zarażonych wektorem owadów żywiących się łykiem CLas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).

Aby spełnić te wymagania dotyczące kontroli, zaprojektowano urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego (DPI), które łączy się z pniem rośliny. Urządzenie wykonane jest przy użyciu systemu druku 3D na bazie nylonu oraz łatwo dostępnych elementów pomocniczych. Skuteczność wychwytu związków tego urządzenia została przetestowana na roślinach cytrusowych przy użyciu markera fluorescencyjnego dioctanu 5,6-karboksyfluoresceiny. Rutynowo obserwowano równomierny rozkład markera w roślinach.

Ponadto, to urządzenie było używane do dostarczania cząsteczek przeciwbakteryjnych i owadobójczych, aby określić ich wpływ odpowiednio na CLas i D. citri. Antybiotyk aminoglikozydowy streptomycyna był dostarczany do roślin cytrusowych zakażonych CLas za pomocą urządzenia, co spowodowało zmniejszenie miana CLas z 2 tygodni do 4 tygodni po leczeniu. Dostarczenie insektycydu neonikotynoidowego imidachloprydu do roślin cytrusowych zaatakowanych przez D. citri spowodowało znaczny wzrost śmiertelności psyllidów po 7 dniach. Wyniki te sugerują, że to urządzenie DPI stanowi użyteczny system dostarczania cząsteczek do roślin w celu przetestowania i ułatwienia celów badawczych i przesiewowych.

Wprowadzenie

Zarządzanie roślinami w obiektach komercyjnych i krajobrazowych często wymaga użycia związków chemicznych w celu optymalizacji wzrostu i zdrowia roślin. Sposób, w jaki te cząsteczki są dostarczane, zależy od rodzaju cząsteczki, funkcji cząsteczki, rodzaju rośliny i zastosowanego systemu zarządzania. Stosowanie dolistne i doglebowe jest najłatwiejszą strategią podawania, ale ograniczenia w pobieraniu niektórych cząsteczek wymagają bezpośredniego podawania. Przykładem tych cząsteczek są cząsteczki terapeutyczne, które działają najlepiej, gdy poruszają się ogólnoustrojowo w roślinie, ale nie mogą być skutecznie dostarczane przez proste aplikacje miejscowe¹. Tak jest w przypadku Huanglongbing (HLB), zwanej również chorobą zielenienia cytrusów. HLB jest chorobą związaną z bakterią ograniczoną do łyka, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), która nie może być hodowana poza rośliną, lub jej owadem wektorem, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)².

Jeśli domniemane cząsteczki terapeutyczne są produktami genów, można je przetestować, tworząc transgeniczne rośliny wyrażające te związki. Jednak transgeniczna produkcja roślinna może być czasochłonna i zasobożerna, jest wysoce zależna od genotypu i może być hamowana przez wyciszanie genów³. Ponadto, nawet jeśli te transgeniczne wykazują obiecujące wyniki, ograniczenia regulacyjne i publiczne zmniejszają prawdopodobieństwo ich komercyjnej akceptacji^4,5. Egzogenne zastosowanie związków upraszcza jednak testowanie cząsteczek biologicznych i syntetycznych, ponieważ nie wymaga produkcji stabilnych lub przejściowo eksprymujących roślin transgenicznych, co skraca czas i zasoby do testowania efektów cząsteczki. Metoda skutecznego i wydajnego systemowego dostarczania do roślin związków egzogennych może być wykorzystana do wielu różnych celów badawczych i przesiewowych.

Jednym z tych zastosowań jest analiza ogólnoustrojowego ruchu molekuł w układzie naczyniowym rośliny, którą można przeprowadzić za pomocą możliwych do śledzenia markerów, niezależnie od tego, czy są to izotopy fluorescencyjne, widoczne czy unikalne izotopy chemiczne^6,7,8,9. Jednym z powszechnie stosowanych markerów fluorescencyjnych jest dioctan 5,6-karboksyfluoresceiny (CFDA), który jest barwnikiem przepuszczalnym dla błony, który jest degradowany przez wewnątrzkomórkowe esterazy do 5,6-karboksyfluoresceiny (CF), a następnie staje się fluorescencyjny i nieprzepuszczalny dla błony¹⁰. CFDA jest szeroko stosowany do monitorowania transportu łyka, relacji między ujściem a źródłem oraz wzorców naczyniowych w tkance roślinnej^11,12.

Oprócz tych markerów, pewne związki mogą bezpośrednio zmieniać fizjologię rośliny, aby zwiększyć produktywność lub zabić roślinę w przypadku herbicydów. Zarówno insektycydy, jak i związki przeciwdrobnoustrojowe są sposobem na zwiększenie produktywności roślin, zwłaszcza w obecności HLB. Przykładem cząsteczki przeciwdrobnoustrojowej, która jest stosowana do kontrolowania CLas, jest streptomycyna. Streptomycyna jest antybiotykiem aminoglikozydowym, który został pierwotnie wyizolowany ze Streptomyces griseus i wykazano, że hamuje wzrost bakterii poprzez hamowanie biosyntezy białek¹³. Jeśli chodzi o insektycydy, głównym celem badań HLB jest D. citri, który przenosi CLas z drzewa na drzewo¹⁴. W tym celu powszechnie stosuje się neonikotynoidy, takie jak imidachlopryd, ponieważ są one złotym standardem w zwalczaniu szkodników owadzich¹⁵. Wszystkie te różnorodne zastosowania są ważnymi aspektami obecnych strategii zarządzania zakładem, a rozwój nowych produktów zależy od skutecznych testów przesiewowych.

Jedną z metod stosowanych do wprowadzania związków do roślin drzewiastych jest bezpośrednie wstrzykiwanie do pnia. Zaprojektowano różne systemy, które różnią się pod względem potrzeb w zakresie wstępnie nawierconych miejsc iniekcji, a systemy te wykorzystują wtrysk oparty na ciśnieniu lub pasywny przepływ¹⁶. Chociaż systemy oparte na ciśnieniu pozwalają na szybkie wprowadzenie danego związku, należy wziąć pod uwagę potencjalne uszkodzenia fizyczne spowodowane przetłaczaniem cieczy przez zablokowane lub zatorowe naczynia krwionośne¹⁷. Chociaż dolistne lub zraszanie związków jest mniej czasochłonne do wdrożenia, bezpośrednie wstrzykiwanie roślin zmniejsza marnotrawstwo interesującego związku z powodu strat powietrza lub gleby, a także może wydłużyć czas, w którym związki są w stanie aktywnym, zmniejszając narażenie na środowisko zewnętrzne¹⁸. Oba te aspekty są ważne dla zachowania drogich odczynników i zapewnienia spójności między powtórzeniami w warunkach badawczych.

To badanie opisuje projekt, konstrukcję i użycie innowacyjnego urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej (DPI), które może być użyte do oceny, jak interesujące związki wpływają na roślinę żywicielską. Do produkcji zarówno samego urządzenia, jak i kilku podzespołów związanych z jego budową wykorzystano standardową drukarkę 3D. Ta własna metoda konstrukcyjna pozwala naukowcom modyfikować urządzenie i jego komponenty w oparciu o ich specyficzne potrzeby eksperymentalne i zmniejsza zależność od dostępnych na rynku urządzeń do iniekcji roślin. Konfiguracja urządzenia jest prosta i wydajna, a wszystkie elementy pomocnicze są łatwo dostępne i niedrogie. Chociaż system został zaprojektowany do użytku z różnymi gatunkami roślin, przedstawione tutaj przykłady dotyczą doniczkowych roślin cytrusowych. Ponadto badanie to pokazuje, że urządzenie to jest w stanie skutecznie dostarczać wiele rodzajów związków ogólnoustrojowo do młodych roślin cytrusowych bez powodowania śmiertelności. Testowane związki obejmowały CFDA, który wykorzystano do oceny rozmieszczenia związków w roślinie, oraz streptomycynę i imidachlopryd, które wykorzystano do sprawdzenia, czy zaobserwowano przeciwdrobnoustrojowe i owadobójcze działanie tych związków po podaniu przez DPI.

Protokół

1. Produkcja roślin cytrusowych do eksperymentalnego wstrzykiwania związków

1. Rozmnażaj małe doniczkowe drzewa cytrusowe z ukorzenionych sadzonek wegetatywnych lub nasion. Uprawy doniczkowych linii cytrusowych w jasny/ciemny dzień 16 godzin/8 godzin w temperaturze 28 °C.
2. Wybierz rośliny cytrusowe o odpowiedniej wielkości do eksperymentu. Opisane zastosowania wymagały, aby rośliny miały od 12 cm do 100 cm wysokości i średnicę pnia 4-14 mm. Jeśli wymagany jest nowy wzrost spłukiwania, przytnij rośliny przed eksperymentem.

2. Trójwymiarowy wydruk urządzenia DPI i komponentów formy

1. Nałóż cienką warstwę kleju na bazie polioctanu winylu na stół roboczy.
2. Załaduj filament nylonowy do drukarki 3D i przygotuj drukarkę zgodnie z instrukcjami producenta. Zaimportuj żądany plik . Plik STL (Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4, Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6, Plik uzupełniający 7, Plik uzupełniający 8, Plik uzupełniający 9, Plik uzupełniający 10, Plik uzupełniający 11, Plik uzupełniający 12, Plik uzupełniający 13 i Plik uzupełniający 14), zainstaluj i rozpocznij drukowanie.
3. Wyjmij element ze stołu roboczego. Spłucz klej na bazie polioctanu winylu z podstawy drukowanego elementu wodą i usuń wszelkie struktury podporowe.
4. Spryskaj komponent DPI dwiema warstwami bezbarwnej farby w sprayu z połyskiem.

3. Wykonanie formy pierścieniowej z plastizolu

1. Zmontuj formę formy wystarczająco dużą, aby pomieścić elementy wzoru, budując prostokątną obudowę za pomocą zatrzaskowych plastikowych bloków na podstawie (rysunek uzupełniający S1A).
2. Wymieszaj monomer silikonowy RTV i katalizator w stosunku 10:1 i mieszaj bez wprowadzania bąbelków przez 1 minutę. Kolor, dodając barwnik spożywczy (3 krople/25 ml mieszanki silikonu) i mydło do rąk (1 ml mydła/25 ml mieszanki silikonu) (rysunek uzupełniający S1B).
3. Wlej cienką warstwę silikonu do formy formy, która wystarczy, aby całkowicie pokryć dno. Ubijaj, aby spłaszczyć powierzchnię i odczekaj 24 godziny, aż silikon stwardnieje (rysunek uzupełniający S1C).
4. Wlej drugą warstwę silikonu, jak opisano powyżej, która jest wystarczająco głęboka, aby pokryć odcisk rdzenia środkowego otworu na wzorze (widoczny w górnej części wzoru na rysunku uzupełniającym S1D). Włóż wzór do płynnego silikonu z nadrukiem rdzenia środkowego otworu skierowanym w dół. Upewnij się, że żadne pęcherzyki nie są uwięzione i że wzory są dobrze oddzielone i nie stykają się (rysunek uzupełniający S1E).
5. Zabezpiecz wzory ciężkim przedmiotem i/lub taśmą, aby zapobiec ich wypływaniu z silikonu podczas jego zastygania. Odczekać 24 godziny, aż nowo wylana warstwa stwardnieje (rysunek uzupełniający S1F).
6. Wlej dodatkowe warstwy silikonu, aż poziom zrówna się z górną częścią wzoru. Odczekać 24 godziny do utwardzenia (rysunek uzupełniający S1G).
7. Zdemontuj zatrzaskowe plastikowe bloki, aby zwolnić formę. Usuń wzory (rysunek uzupełniający S1H). Sprawdź formę pod kątem rozdarć lub deformacji (rysunek uzupełniający S1I).

4. Odlewanie pierścieni plastizolowych

1. Pokryj wnętrze formy, wszystkie podstawowe elementy i O-ringi olejem spożywczym (rysunek uzupełniający S2A, B). Umieść O-ring wokół wycięcia pośrodku środkowego rdzenia słupka i umieść rdzeń w środkowym otworze formy pierścienia plastizolowego (rysunek uzupełniający S2C).
2. Włóż rdzeń kanału tłocznego do otworu z boku formy pierścieniowej z plastizolu. Ustaw końcówkę w kształcie litery V na końcu rdzenia kanału tłocznego, aby wyrównać ją z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym na środkowym rdzeniu słupka (rysunek uzupełniający S2D,E).
3. Podgrzej plastizol w kuchence mikrofalowej przez krótkie 10-sekundowe serie (rysunek uzupełniający S2F, G). Delikatnie wymieszaj plastisol, aby uniknąć pęcherzyków (rysunek uzupełniający S2H). Powtarzać ogrzewanie i mieszanie, aż roztwór osiągnie temperaturę między 160 °C a 170 °C (rysunek uzupełniający S2I).
   UWAGA: Przegrzanie plastizolu może prowadzić do uwolnienia toksycznych oparów. Zabieg należy wykonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub dygestorium. Nie podgrzewać plastizolu powyżej 170 °C.
4. Wlej stopiony plastizol do formy z pierścieniem plastizolowym w pobliżu zewnętrznej krawędzi formy bez wprowadzania pęcherzyków (rysunek uzupełniający S2J). Odczekać 1 godzinę, aż pierścienie plastizolowe ostygną (rysunek uzupełniający S2K). Wyjmij pierścienie z formy. Upewnij się, że urządzenie DPI jest prawidłowo dopasowane do urządzenia DPI przed użyciem w testach eksperymentalnych (rysunek uzupełniający S2L).

5. Dołączenie urządzenia DPI do instalacji

1. Znajdź gładkie, zdrowe miejsce na bagażniku do mocowania urządzenia. Unikaj wszelkich nierówności i węzłów, ponieważ mogą one przyczynić się do wycieku z urządzenia.
2. Za pomocą wiertła o średnicy 2 mm wywiercić otwór poziomo przez środek trzpienia pod kątem 90° z powierzchnią pnia (rysunek uzupełniający S3A). Przełóż wiertło przez otwór kilka razy, aby go oczyścić i wygładzić, aby utworzyć niezakłócony otwór (rysunek uzupełniający S3B).
3. Utwórz pionowy plaster w pierścieniu plastizolowym po przeciwnej stronie kanału dostarczania związku (rysunek uzupełniający S3C). Zamontuj pierścień wokół instalacji i wyrównaj kanał tłoczny z wcześniej wywierconym otworem (rysunek uzupełniający S3D).
   UWAGA: Pierścień musi ściśle przylegać do pnia, aby uniknąć wycieków; Zespoły rdzeni o różnych średnicach mogą być używane do wytwarzania pierścieni plastizolowych dla łodyg roślin o różnych rozmiarach.
4. Dodaj urządzenie DPI do pierścienia plastizolowego, upewniając się, że ściśle do siebie przylegają. Dopasuj wylewkę urządzenia DPI do kanału doprowadzającego pierścień plastizolowy i wywierconego otworu (rysunek uzupełniający S3E).
   UWAGA: Pomocne może być użycie wiertła do wyrównania otworu i wylewki urządzenia DPI.
5. Owinąć szczelnie taśmą silikonową, aby utrzymać urządzenie na miejscu (rysunek uzupełniający S3F). Sprawdź w pełni zmontowane i podłączone urządzenie, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie i orientację na roślinie.

6. Stosowanie procentu składanego za pomocą urządzenia DPI

1. Za pomocą strzykawki lub pipety napełnić urządzenie DPI roztworem, który Cię interesuje (Rysunek uzupełniający S3G). Za pomocą strzykawki przebić taśmę silikonową i pierścień plastizolowy po przeciwnej stronie urządzenia DPI, aby wyciągnąć powietrze z kanału wewnętrznego i uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do naczyń krwionośnych roślin (rysunek uzupełniający S3H). Włóż wyekstrahowany związek z powrotem do urządzenia DPI.
2. Dodaj dodatkowy mały plaster taśmy silikonowej na otwór utworzony przez strzykawkę, aby wzmocnić obszar i zapobiec rozdarciom. Sprawdź urządzenie pod kątem widocznych wycieków w punkcie mocowania i sprawdź zbiornik urządzenia pod kątem stabilnego poziomu cieczy.
   UWAGA: Woda może być początkowo używana do testowania szczelności, aby uniknąć marnowania roztworu testowego.
3. Przykryj otwarty koniec urządzenia DPI woskową folią uszczelniającą i pociągnij w dół, aby utworzyć uszczelkę i zmniejszyć parowanie eksperymentalnego związku. Za pomocą końcówki strzykawki przebić pojedynczy otwór w folii woskowej, aby zapobiec powstawaniu podciśnienia, a następnie ponownie napełnić urządzenie (rysunek uzupełniający S3I).
4. Codziennie sprawdzaj urządzenie, aby upewnić się, że elementy są prawidłowo ustawione (rysunek uzupełniający S3J) i uzupełniaj płyn za pomocą strzykawki, aby uniknąć wyschnięcia zbiornika. Powtarzaj ten proces, aż zostanie wprowadzona żądana ilość roztworu eksperymentalnego.
   UWAGA: Związki można z powodzeniem wprowadzać z danego urządzenia na okres do 1 miesiąca. Czas wchłaniania roztworu, który przekracza ten przedział czasowy, powinien zostać przetestowany empirycznie przed konfiguracją eksperymentalną.

7. Korzystanie z CFDA do obserwacji ruchu naczyń krwionośnych za pomocą roślin cytrusowych

1. Przymocuj urządzenie DPI do roślin cytrynowych (Citrus medica L.) o wysokości 25 cm, nałóż pojedynczą dawkę 2,0 ml 20% DMSO w kontroli H_2Olub CFDA do urządzenia DPI i pozwól mu się wchłonąć przez 24 godziny. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, przygotuj roboczy roztwór CFDA, dodając 1,6 ml H₂O do 400 μl roztworu podstawowego CFDA (roztwór podstawowy zawiera 10 mM CFDA rozpuszczonego w 100% dimetylosulfotlenku [DMSO]) w celu wytworzenia końcowego stężenia CFDA 2 mM i 20% DMSO.
2. Wykonaj przekroje różnych tkanek rośliny i użyj stereoskopu lub mikroskopu złożonego z filtrem fluorescencyjnym, który obejmuje długość fali 498 nm, aby uwidocznić CFDA w tkankach roślinnych. Porównaj obrazy z 20% DMSO w kontrolach H₂O, aby uwzględnić autofluorescencję w tkance.

8. Pomiar zmian miana CLas w próbkach liści po leczeniu streptomycyną

1. Używając roślin Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") o wysokości 0,75 m pochodzących z uprawy szklarniowej, zbierz ogonek liściowy i nerwy z dwóch liści z objawami HLB z każdej rośliny, posiekaj je na małe kawałki, połącz każdy rodzaj tkanki i przechowuj je oddzielnie w odpornych na uderzenia probówkach o pojemności 2 ml zawierających stalową kulkę o średnicy 6,35 mm.
2. Zmielić próbkę za pomocą homogenizatora zaprogramowanego na dwa cykle 15 s z prędkością 3,4 m/s. Wyekstrahować całkowity kwas nukleinowy zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁹.
3. Przeprowadzić qPCR na próbkach liści zakażonych CLas, stosując mieszaninę qPCR określoną w tabeli 1 i warunki reakcji określone w tabeli 2. Do dalszej analizy należy użyć roślin wykazujących silne infekcje CLas (silne zakażenie jest ogólnie definiowane jako wartości Ct oparte na qPCR < 30 dla zestawu starterów CLas 16S LasLong (LL)).
   UWAGA: Miano bakterii jest szacowane przy użyciu CLas 16S Las Long (LL) i starterów DNA dehydryny cytrusowej w celu oszacowania względnych odpowiedników genomu, jak opisano wcześniej²⁰.
4. Wyposaż rośliny cytrusowe, które spełniają minimalne miano infekcji opisane powyżej, w urządzenia DPI i poddaj je jednorazowemu traktowaniu 2,0 ml roztworu_H2Olub roztworu streptomycyny o pożądanym stężeniu. Aby postępować zgodnie z tym badaniem, należy zastosować pojedynczą dawkę 2,0 ml streptomycyny o stężeniu 9,5 mg/ml (łącznie 19 mg) rozpuszczonej w_H2O.
5. Próbki liści należy pobrać po 7 dniach, 14 dniach i 28 dniach od zabiegu. Oznaczenie liści, z których pobrano próbki, pod kątem miana CLas, należy użyć tego samego protokołu, jak opisano powyżej.
6. Po 60 dniach od zabiegu należy uzyskać zdjęcia roślin traktowanych_H2Olub streptomycyną. Wykorzystaj obserwacje wizualne infekcji CLas, aby ocenić nasilenie infekcji. Zwróć uwagę na <50% liści wykazujących chlorozę międzynerwową i korkowanie nerwów wraz ze wzrostem powierzchni liści jako oznaki łagodnej infekcji, a ponad 50% liści z chlorozą międzynerwową i korkowaniem nerwów, a także odcięciem liści i zahamowaniem wzrostu rośliny jako oznakami poważniejszych infekcji.

9. Pomiar śmiertelności D. citri po leczeniu imidakloprydem

1. Przycinaj rośliny cytryny (Citrus medica L.) o wysokości 0,5 m do wysokości 12 cm, aby pobudzić wzrost nowego zaczerwienienia.
   UWAGA: Szybkość wzrostu spłukiwania może zależeć od zdrowia rośliny i pory roku; Weź to pod uwagę podczas projektowania eksperymentalnego.
2. Po rozwinięciu >6 spłukania o długości 1-2 cm należy wprowadzić rośliny do klatek zawierających dorosłe osobniki D. citri. Pozostaw rośliny w klatkach na 24 godziny, aby umożliwić złożenie jaj.
3. Przeprowadź reprezentatywne liczenie jaj na trzech pędach spłukujących 1-2 dni po złożeniu, a następnie zastosuj urządzenia DPI. Napełnij te urządzenia 2,0 ml kontrolki wody lub pożądanego stężenia imidakloprydu (21,8% składnika aktywnego). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj 528 μL/L, 52,8 μL/L i 5,28 μL/L imidachloprydu.
   UWAGA: Liczenie jaj jest miarą destrukcyjną, więc liczenie na tym etapie jest wykorzystywane do oszacowania liczby jaj w niepoliczonym rzucie tej samej rośliny i pomaga zapewnić punkt odniesienia dla kolejnych wschodzących nimf, które są przeprowadzane na końcu eksperymentu.
4. Zbierz wskaźnik wschodów D. citri na co najmniej trzech pozostałych pędach rumieniących. Uzyskaj reprezentatywne zdjęcia roślin 7 dni po wprowadzeniu związku.

Wyniki

Elementy urządzenia do infuzji bezpośredniej
Podstawowa wersja urządzenia do infuzji bezpośredniej ma 8 cm wysokości i 3,3 cm szerokości z przodu i z boku (Rysunek 1A). Zawiera pojedynczy centralny zbiornik, który przylega do wylewki, a całkowita objętość, która może być zawarta w tych składnikach, wynosi 2,0 ml (Rysunek 1D). Pierścień plastizolowy ma 1,8 cm wysokości i średnicę 2,7 cm (Rysunek 1C). Pierścień ten zawiera również dwa kanały: jeden do umieszczenia wylewki urządzenia DPI, a drugi o zmiennej średnicy, który pasuje do pnia leczonego drzewa. Dodatkowo wokół pionowego kanału znajduje się rowek, który kieruje nadmiar zabiegu do otoczenia drzewa, co pozwala na dodatkowe pobieranie związku przez korę (Rysunek 1F). Po prawidłowym zamontowaniu pierścień plastizolowy powinien przylegać do urządzenia DPI, a wylewka powinna pokrywać się z otworem wywierconym w drzewie (Rysunek 1B i Rysunek 1E).

CFDA
Aby zbadać skuteczność urządzenia DPI we wprowadzaniu egzogennych substancji chemicznych do roślin cytrusowych, za pomocą urządzenia infiltrowano 2,0 ml 2 mM CFDA. Sygnał fluorescencyjny wykryto w układzie naczyniowym rośliny poddanej działaniu środka (Rysunek 2A), ale nie był on obecny w roślinach kontrolnych traktowanych 20% DMSO w H₂O (Rysunek 2B). Sygnał ten zaobserwowano we wszystkich wypreparowanych typach tkanek roślinnych, w tym w mezofilu liści, unaczynieniu ogonków liściowych, unaczynieniu łodygi i unaczynieniu korzeni (Rysunek 2C). Sygnał ten zaobserwowano w roślinie w ciągu 24 godzin od zabiegu i był on stosunkowo równomiernie rozprowadzany w tkankach.

Streptomycyna
Aby sprawdzić, czy wprowadzone związki mają wpływ terapeutyczny na chorobę HLB, 2,0 ml związku bakteriobójczego, streptomycyny, wprowadzono do roślin słodkiej pomarańczy Valencia (Citrus sinensis) w stężeniu 9,5 mg/ml (łącznie 19 mg). Rośliny te utrzymywano w doniczkach szklarniowych, a miano CLas (mierzone za pomocą równoważników genomu CLas na równoważniki genomu cytrusowego) monitorowano w czasie za pomocą qPCR (Rysunek 3A). Początkowe średnie miana DNA CLas dla roślin traktowanych streptomycyną i_H2Owynosiły odpowiednio 0,562 CLas genomu / genomu cytrusów i 0,49 CLas genomu / genomu cytrusowego. Zmniejszenie średniego miana bakterii wykryto metodą qPCR 7-28 dni po leczeniu streptomycyną w porównaniu z kontrolami_H2Ow tym samym punkcie czasowym. Ponadto różnica między średnimi mianami bakterii w czasie 0 i 28 wynosiła odpowiednio 0,314 i 0,117 dla roślin traktowanych streptomycyną i roślin traktowanych_H2O.

Ten eksperyment został zaprojektowany w celu zmierzenia reakcji rośliny na różne zabiegi w różnych okresach czasu. Zastosowano dwuczynnikowy kwadratowy projekt powierzchni odpowiedzi, przy czym czas traktowano jako ilościowy czynnik dyskretny z czterema poziomami (0 dni, 7 dni, 14 dni i 28 dni), a traktowano jako czynnik kategoryczny z dwoma poziomami (_H2Oi streptomycyna). Dla każdej z ośmiu kombinacji leczenia zastosowano pięć powtórzeń, a miano CLas mierzono jako zmienną odpowiedzi. Dane zostały przekształcone przy użyciu logarytmu₁₀ w oparciu o analizę wykresu Boxa-Coxa. Redukcja modelu została przeprowadzona przez selekcję do przodu przy użyciu kryterium informacyjnego Akaike (AICc)²¹, co spowodowało usunięcie zarówno efektów czasu, jak i interakcji. Drugi czynnik, traktowanie, był istotny (p = 0,0252), przy czym rośliny traktowane streptomycyną wykazywały niższe średnie miano CLas (0,349) niż rośliny traktowane H₂O (0,496) we wszystkich punktach czasowych łącznie (Figura 3B). To zmniejszenie miana CLas odpowiadało sporadycznemu wzrostowi nowego zdrowego wzrostu po 60 dniach u roślin traktowanych streptomycyną, o czym świadczą zdjęcia reprezentatywnych drzew traktowanych_H2O(Rysunek 3C) w porównaniu z 19 mg streptomycyny (Rysunek 3D).

Imidaklopryd
Imidaklopryd wprowadzono do młodocianych azjatyckich roślin cytrynowych zaatakowanych przez psyllid cytrusowy (ACP) przy użyciu urządzenia DPI w celu przetestowania jego potencjału jako insektycydowego testu przesiewowego na obecność D. citri. Pojedynczy zabieg o pojemności 2,0 ml komercyjnego roztworu insektycydu imidakloprydu przetestowano w trzech różnych stężeniach (5,28 μL/L, 52,8 μL/L i 528 μL/L) wraz z kontrolą wody. Średnia całkowita liczba jaj na trzy pędy rzutowe przed zabiegiem wahała się od 280,5 do 321 i nie było znaczących różnic między roślinami, które miały być użyte dla każdej grupy poddanej działaniu środka (Ryc. 4A). Średnia całkowita liczba nimf, które przeżyły na trzech pędach rzutowych 7 dni po zabiegu, wynosiła odpowiednio 293,75, 268, 97,5 i 2 dla kontroli wodnej i 5,28 μL/L, 52,8 μL/L i 528 μL/L roztworów imidakloprydu (Ryc. 4B). Stanowiło to znaczne zmniejszenie pojawienia się nimfy psyllida przy poziomach roztworu imidakloprydu 52,8 μL/L (p = 0,029) i 528 μL/L (p = 0,002) w porównaniu z kontrolą wody zgodnie z jednoczynnikową ANOVA, po której nastąpiła analiza post-hoc Tukeya. Dodatkowo, ten wzrost śmiertelności nimf psyllid przy najwyższym poziomie roztworu imidakloprydu był wizualnie widoczny przez zmniejszenie produkcji spadzi nimf na liniach traktowanych imidakloprydem (Rysunek 4D) w porównaniu z kontrolą wody ( Rysunek 4C).

Rysunek 1: Urządzenie do bezpośredniego infuzji roślin i pierścień plastizolowy. (A) Nienaruszone urządzenie do bezpośredniej infuzji roślin i (C) pierścień plastizolowy wraz z ich wymiarami. (B) Urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego i pierścień plastizolowy połączone i przymocowane do drzewa cytrusowego. Pionowe przekroje poprzeczne (D) urządzenia do bezpośredniego naparu roślinnego, (F) pierścienia plastizolowego oraz (E) tych dwóch elementów połączonych i przymocowanych do drzewa cytrusowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przekrój środkowego nerwu liścia rośliny cytrusowej o średnicy 25 cm. Obrazy przedstawiające 24 godziny po leczeniu (A) 2 mM CFDA lub (B) 20% DMSO w H₂O przy użyciu urządzenia do bezpośredniego wlewu roślinnego. (C) Przekroje różnych tkanek roślinnych 24 godziny po podaniu 2 mM zabiegu CFDA, w tym pień 5 cm powyżej urządzenia do bezpośredniego infuzji roślin (u góry po lewej), pień 5 cm poniżej urządzenia do bezpośredniego infuzji roślin (w środku po lewej), korzeń (u dołu po lewej), nerwy liściowe (u góry po prawej), ogonek liściowy (w środku po prawej) i mezofil liściowy (u dołu po prawej). Podziałka = 1 mm. Skróty: CFDA = dioctan 5,6-karboksyfluoresceiny; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Monitorowanie miana CLas (mierzonego za pomocą równoważników genomu CLas na odpowiedniki genomu cytrusowego) w czasie za pomocą qPCR. (A) Przebieg czasowy pokazujący zmiany w mianie DNA CLas porównujące pięć roślin, którym podano 19 mg streptomycyny, z pięcioma roślinami, którym podano H₂O kontrola. Punkty reprezentują średnią dla danego zabiegu w danym punkcie czasowym. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej. (B) Wykres słupkowy przedstawiający średnie miano CLas roślin traktowanych_H2O- i streptomycyną we wszystkich punktach czasowych. Słupki błędu reprezentują 95% przedział ufności, a gwiazdki oznaczają znaczące różnice (* = p < 0,05) między średnimi mianami CLas dla roślin traktowanych streptomycyną i_H2Ozgodnie z jednokierunkową ANOVA. (C) Reprezentatywne obrazy roślin cytrusowych 0 miesięcy i 2 miesiące po bezpośrednim leczeniu infuzją roślin (C)_H2Olub (D) streptomycyną. Rośliny potraktowane streptomycyną po 2 miesiącach wykazują nowy jasnozielony wzrost liści, co sugeruje zmniejszenie miana CLas. Skrót: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Monitorowanie śmiertelności nimf psyllidów u młodocianych roślin cytrynowych zaatakowanych przez ACP. Wykresy słupkowe przedstawiające (A) szacowaną początkową liczbę jaj i (B) ocalałe nimfy D. citri na trzech płukanych cytrusach 7 dni po traktowaniu kontrolą wody i różnymi rozcieńczeniami imidachloprydu. Słupki błędu reprezentują błąd standardowy średniej, a gwiazdki oznaczają znaczące różnice (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) między danym poziomem uzdatniania a kontrolą wody zgodnie z jednoczynnikową ANOVA, po której następuje analiza post-hoc Tukeya. Obrazy cytrusów zaatakowanych przez nimfę D. citri 7 dni po podaniu działaniu (C) kontroli wodnej lub (D) 528 μL/L imidachloprydu przy użyciu urządzenia do bezpośredniego nawlewu roślinnego. Skróty: ACP = azjatycki psyllid cytrusowy; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Objętość na próbkę (μl)	Komponent
Rozdział 12,5	2x GoTaq qPCR z BRYT Green Dye Master Mix
5	Szablon DNA (20 ng/μL)
0,5	10 μM Podkład F i R dla CLas		Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Naprzód); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Odwrotny)
0,5	10 μM Podkład F i R do sprzątania cytrusów		Dehydryna cytrusowa: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Naprzód); AAAACTTCACCGATCCACCAG (odwrócony)
6,5	H2O

Tabela 1: Mieszanka qPCR używana do ilościowego określenia miana CLas w liniach cytrusowych traktowanych streptomycyną. Pokazano sekwencję starterów 16S Las Long i starterów dehydryny cytrusowej do kwantyfikacji DNA CLas i kwantyfikacji DNA cytrusowego.

Rozdział

krok		Temperatura (°C)	Godzina
1	Początkowa denaturacja	95 Rozdział 95	Czas trwania: 2 min
cyfra arabska	Deturat	95 Rozdział 95	15 sekund
3	Wyżarzanie	60	20 sekund
4	rozszerzenie	72 Rozdział 72	20 sekund
5	Przejdź do kroku 2, powtórz 39x
6	Krzywa topnienia	60 z rampą do 95 przy 0,2 °C/s	Czas trwania: 3 min

Tabela 2: Warunki reakcji dla qPCR użytego do ilościowego określenia miana CLas w liniach cytrusowych traktowanych streptomycyną.

Rysunek uzupełniający S1: Obrazy pokazujące proces montażu formy do wytworzenia pierścienia plastizolowego. (A) Do wytworzenia pierwszej warstwy formy pierścienia plastizolowego użyto połączonych ze sobą bloków z tworzywa sztucznego. (B) Równomiernie wymieszany roztwór zawierający silikonową gumę RTV, katalizator, barwnik spożywczy i mydło. (C) Równomiernie wylana pierwsza warstwa formy z pierścieniem plastizolowym. (D) Zdjęcie wzorów pierścieni plastizolowych ze środkiem trzymającym odcisk rdzenia u góry. (E) Wzory pierścieni plastizolowych włożone w nieutwardzoną drugą warstwę formy. (F) Taśma maskująca i gumowy młotek używane do zabezpieczania wzorów podczas utwardzania drugiej warstwy. (G) Trzecią warstwę formy dodajemy, aż zrówna się z wierzchem wzorów. (H) Usuwanie wzorów z formy. (I) W pełni skonstruowana forma pierścieniowa z plastizolu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Obrazy przedstawiające proces montażu pierścienia plastizolowego związanego z urządzeniem do bezpośredniego infuzji roślinnej. (A) Elementy zespołu pierścienia plastizolowego, w tym forma, centralny rdzeń z O-ringiem i rdzeń kanału doprowadzającego. (B) Powlekanie rdzeni nieprzywierającym olejem spożywczym w sprayu w celu ułatwienia usunięcia pierścienia plastizolowego po stwardnieniu. (C) Włożenie środkowego rdzenia i pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym do formy. (D) Wstawienie rdzenia kanału tłocznego prostopadle do rdzenia środkowego. (E) Prawidłowy montaż elementów rdzenia pierścienia plastizolowego w gnieździe formy. (F) Plastizol stosowany do wytwarzania pierścienia plastizolowego. (G) Podgrzewanie plastizolu w kuchence mikrofalowej. (H) Wymieszanie plastizolu po podgrzaniu. (I) Sprawdzenie temperatury plastizolu. (J) Wlanie podgrzanego plastizolu do zmontowanego rdzenia. (K) Umożliwienie chłodzenia plastizolu wokół zmontowanego rdzenia. (L) W pełni zmontowane pierścienie plastizolowe przymocowane do urządzenia do bezpośredniego infuzji roślin. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Obrazy przedstawiające proces montażu urządzenia do bezpośredniego infuzji roślin. (A) Wiercenie otworu w środku rośliny cytrusowej, aby stworzyć kanał do dostarczania związku. (B) Widok z przodu wywierconego otworu. (C) Przecięcie pierścienia plastizolowego żyletką naprzeciwko kanału dostarczania związku. (D) Ciasne dopasowanie pierścienia plastizolowego wokół trzpienia w miejscu wcześniej wywierconego otworu. (E) Montaż urządzenia do bezpośredniego infuzji roślinnej do pierścienia plastizolowego, z króćcem doprowadzającym związek na urządzeniu włożonym do kanału pierścienia plastizolowego. (F) Za pomocą taśmy silikonowej przymocować urządzenie do bezpośredniej infuzji roślinnej do pierścienia plastizolowego i przytrzymać całe urządzenie na miejscu. (G) Napełnianie komory urządzenia do bezpośredniej infuzji roślinnej związkiem będącym przedmiotem zainteresowania. (H) Za pomocą strzykawki wyciągnąć powietrze z wywierconego otworu w instalacji i uruchomić przepływ związku. (I) Nałożenie woskowej folii uszczelniającej na otwór w komorze urządzenia do bezpośredniej infuzji roślin i zrobienie otworu, aby zapobiec podciśnieniu. (J) W pełni zmontowane urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego na roślinie cytrusowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa 4 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa 6 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa o średnicy 8 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa 10 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa 12 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Rdzeń słupka z plastizolowym pierścieniem . Pilnik STL do drzewa 14 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa 4 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa 6 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 9: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa o średnicy 8 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 10: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa 10 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 11: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa 12 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 12: Rdzeń kanału dostarczania pierścienia plastizolowego. Pilnik STL do drzewa 14 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 13: Urządzenie do bezpośredniego nawożenia roślin. Plik STL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 14: Wzór użyty do stworzenia formy dla pierścienia plastizolowego. Plik STL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Aby urządzenie DPI można było uznać za realną metodę dostarczania związków egzogennych do roślin, musi ono przyczyniać się do solidnego i spójnego wchłaniania związków do różnych typów tkanek. Eksperyment z wykorzystaniem CFDA wyraźnie wykazał zarówno ruch związków akropetalnych, jak i podstawnych, a także zarówno w układzie naczyniowym, jak i komórkach mezofilu liścia. Dodatkowo, przypuszczalnie dlatego, że wywiercony otwór używany w tym urządzeniu DPI zapewnia dużą powierzchnię do wchłaniania związku, CFDA był obecny w stosunkowo równych ilościach we wszystkich sekcjach łodygi, a nie tylko w niewielkim podzbiorze układu naczyniowego przylegającego do urządzenia, jak zaobserwowano w poprzednich badaniach wchłaniania barwnika u roślin stosujących iniekcję do pnia⁶. Dodatkowo badano dostarczanie białka zielonej fluorescencji i barwnika kwiatowego za pomocą urządzenia DPI i zaobserwowano rozkład tych związków podobny do CFDA (dane nie pokazane). Dane te sugerują, że urządzenie może być wykorzystywane do ogólnoustrojowego dostarczania różnych związków, które różnią się wielkością i strukturą molekularną. Warto jednak zauważyć, że istniały różnice w pobieraniu związku w zależności od fazy rozwoju liści, przy czym młodsze rozwijające się liście pochłaniały więcej związku niż starsze liście założone. Może to wynikać ze zmian we właściwościach naczyniowych obecnych w tkance zlewu w porównaniu z tkanką źródłową i powinno być zoptymalizowane pod kątem danego eksperymentu.

Urządzenie DPI wykazało wystarczający absorpcję związków do wizualizacji CFDA, GFP i barwnika kwiatowego, a także zajęło wystarczająco dużo, aby pokazać przeciwbakteryjne i owadobójcze działanie odpowiednio streptomycyny i imidachloprydu. Oba te związki spowodowały zmiany w żywotności organizmu docelowego 1 tydzień po pojedynczym zabiegu 2,0 ml. Dane te sugerują, że urządzenie DPI może być stosowane w testach na całej roślinie w celu przetestowania żywotności szerokiej gamy związków do zwalczania szkodników mikrobiologicznych i owadzich. Co więcej, ze względu na bezpośredni kontakt z układem naczyniowym, urządzenie to może nawet dawać możliwość badania związków, które nie są efektywnie pobierane przez korzenie lub komórki naskórka. Szczególnie interesująca byłaby interferencja RNA (RNAi), ponieważ można ją wykorzystać do modulowania ekspresji genów w roślinie żywicielskiej, patogenie lub wektorze patogenu. Wcześniejsze badania, które wprowadziły RNA spinki do włosów przez wywiercony otwór w pniu jabłoni i winogron, wykazały, że cząsteczki RNA były ograniczone do tkanki ksylemu, co sugeruje, że cząsteczki te mogą być skuteczne tylko przeciwko organizmom żującym i żywiącym się sokami ksylemu²². Biorąc pod uwagę, że urządzenie DPI wykorzystuje podobny system dostarczania z wywierconymi otworami, ma się rozumieć, że RNA spinki do włosów dostarczane za pomocą tego urządzenia może być również ograniczone do tkanki ksylemu. Jednak zaobserwowany spadek miana CLas ograniczonego łykiem po leczeniu streptomycyną z urządzenia DPI silnie sugeruje, że antybiotyk ten był obecny w łyku. W związku z tym prawdopodobne jest, że rozmieszczenie naczyniowe związków dostarczanych za pomocą urządzenia DPI zależy od ich wielkości i składu chemicznego, a każda cząsteczka powinna być oceniana indywidualnie.

Chociaż na rynku dostępnych jest wiele komercyjnie dostępnych urządzeń DPI, opisywane tutaj urządzenie może być produkowane we własnym zakresie i można je modyfikować. W ten sposób można dokonywać ulepszeń i zmian wielkości w oparciu o zastosowane gatunki roślin i projekt doświadczalny, a nie jest to zależne od produktów komercyjnych. Ponadto urządzenie jest częściowo trwale przymocowane do rośliny, co oznacza, że wiele zabiegów danego związku może być wykonywanych jednocześnie bez konieczności ponownego uszkadzania rośliny za pomocą wielu wstrzyknięć związku. Ostrzegamy, że urządzenie może przeciekać, jeśli nie zostanie prawidłowo zainstalowane. W rezultacie związek ten jest tracony do środowiska, zamiast być dostarczany do zakładu. Dlatego należy zadbać o to, aby sprawdzić urządzenie pod kątem oznak wycieku podczas konfiguracji i pierwszych kilku dni po niej. Chociaż wiercenie w drzewie jest potencjalnie szkodliwe, ta metoda została wybrana, aby zapewnić solidne i stałe pobieranie związku. Ponadto w tych eksperymentach nie zaobserwowano żadnego negatywnego wpływu na zdrowie roślin po dołączeniu urządzenia DPI. Jednak w projekcie doświadczenia należy uwzględnić dodatkowe rośliny, aby zastąpić te, które mogą tracić wigor w trakcie danego doświadczenia. Wreszcie, ponieważ urządzenie to wykorzystuje przepływ pasywny do wprowadzania związków, może być trudno przewidzieć tempo wchłaniania przez różne gatunki roślin lub etapy rozwoju tego samego gatunku. Może to skomplikować eksperymenty, jeśli szybkość wchłaniania związku jest czynnikiem ograniczającym. Aby uzyskać najlepsze wyniki, eksperymenty należy zaplanować tak, aby zapewnić roślinie wystarczająco dużo czasu, aby w pełni wchłonąć 2,5 ml związku, co może zająć do 1 tygodnia. Podsumowując, to urządzenie DPI jest skutecznym narzędziem do szybkiej oceny aktywności in planta związków przeciwdrobnoustrojowych lub owadobójczych przeciwko CLas i jego wektorowi, D. citri, dostarczając w ten sposób więcej informacji na temat skuteczności ogólnoustrojowej i wpływu na wydajność roślin niż poprzednio prezentowany test z oderwanymi liśćmi²³. Niewątpliwie różnorodność zastosowań tego systemu wykracza daleko poza konkretne zastosowania opisane w niniejszym opracowaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kulki stalowe o średnicy 0,5 cm Produkty	balistyczne Inc.
10 ml strzykawka Luer-Lok	Becton Dickinson	382903029952
20 G 1 igła strzykawkowa	Becton Dickinson	305175
2 ml	Scientific	1420-9710
3/32 cala Wiertło z czarnego tlenku
	Markforged	F-PR-2027
Oprogramowanie do druku 3D	Markforged	F-SW-FDVX Oprogramowanie
do druku 3D	Markforged	S-FW-OEVX
5(6)-CFDA (5-(i-6)-dioctan karboksyfluoresceiny)	Invitrogen	C195
5/64-calowe wiertło z czarnego tlenku	Uszczelniacze	964502
96-dołkowa maszyna qPCR	Wirówka Roche	5815916001
	Eppendorf	22621408
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	SP-BX43-BI
Filtr do mikroskopu fluorescencyjnego	Chroma	69401-ET
Błyszcząca bezbarwna farba w sprayu	Rustoleum	249117
szara Płytka bazowa Lego		11024
Ręczna wiertarko-wkrętarka akumulatorowa	Makita	6349D
Homogenizator	Fisher Scientific	15-340-163
Imidaklopryd 2F	Quali-Pro	83080133
Płynny plastizol Średnia twardość	Fusion X Przynęty wędkarskie	XSOL-505
Czerwony silikon 70 Shore A O-ring	Grainger	różni się rozmiarem
Nieprzywierający spray do gotowania	PAM	64144030217
NucleoSpin Plant II	Macherey-Nagel	740770.5
Parafilm	Bemis	HS234526A
Klej na bazie octanu poli viyl	Elmers	E301
qPCR Master Mix	Promega	A6001
qPCR Startery	Zintegrowane technologie DNA Różni	się w zależności od sekwencji
Odwrotna transkryptaza	Promega	A5003
Żyletka z pojedynczą krawędzią	Garvey	40475
Półprzezroczysta silikonowa guma RTV	Aero Marine Products	AM 115T
Przezroczysta taśma silikonowa	Maxwell	KE30S
Ścięta onkocyna 112	Genscript	Różni się w zależności od sekwencji
Biały 1 x 6 Lego Piece	300901
Biały	Nylon Markkuty	F-MF-0003