Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, która prowadzi do przewlekłego zapalenia stawów. Makrofagi maziowe i fibroblasty maziowe odgrywają kluczową rolę w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów. Ważne jest, aby zrozumieć funkcje obu populacji komórek, aby ujawnić mechanizmy leżące u podstaw patologicznej progresji i remisji w zapalnym zapaleniu stawów. Ogólnie rzecz biorąc, warunki doświadczalne in vitro powinny w jak największym stopniu naśladować środowisko in vivo. Pierwotne komórki pochodzące z tkanek zostały wykorzystane w eksperymentach charakteryzujących fibroblasty maziowe w zapaleniu stawów. Natomiast w eksperymentach badających biologiczne funkcje makrofagów w zapalnym zapaleniu stawów wykorzystano linie komórkowe, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i makrofagi pochodzące z monocytów krwi. Nie jest jednak jasne, czy takie makrofagi rzeczywiście odzwierciedlają funkcje makrofagów rezydujących w tkankach. Aby uzyskać rezydujące makrofagi, poprzednie protokoły zostały zmodyfikowane w celu wyizolowania i namnażania zarówno pierwotnych makrofagów, jak i fibroblastów z tkanki maziowej w mysim modelu zapalenia stawów. Te pierwotne komórki maziowe mogą być przydatne do analizy in vitro zapalenia stawów.
Wprowadzenie
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się przerostem błony maziowej, prowadzącym do zniszczenia stawów1,2. Makrofagi i fibroblasty rezydujące w tkankach są obecne w zdrowej błonie maziowej w celu utrzymania homeostazy stawów. U pacjentów z RZS dochodzi do namnażania się fibroblastów maziowych (SF), a komórki odpornościowe, w tym monocyty, infiltrują do błony maziowej i płynu stawowego, co jest procesem związanym ze stanem zapalnym1,3,4. Makrofagi maziowe (SM), które obejmują makrofagi rezydentne i makrofagi pochodzące z monocytów krwi obwodowej, oraz SF są nieprawidłowo aktywowane i odgrywają ważną rolę w patogenezie RZS. Ostatnie badania sugerują, że interakcje komórka-komórka między SM i SF przyczyniają się zarówno do zaostrzenia, jak i remisji RA5,6.
Aby zrozumieć patogenezę RZS, użyto kilku modeli zapalenia stawów u gryzoni, w tym zapalenia stawów przenoszonego w surowicy K/BxN, zapalenia stawów wywołanego kolagenem i zapalenia stawów wywołanego przeciwciałami kolagenowymi. Testy komórkowe są na ogół wymagane do wyjaśnienia funkcji molekularnych w zapaleniu stawów. W związku z tym wyizolowano pierwotne komórki z modeli zwierzęcych zapalenia stawów. Metoda izolowania SF z mysiej tkanki zapalenia stawów jest dobrze znana, a komórki te przyczyniły się do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych w patogenezie zapalenia stawów7,8. Z drugiej strony, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, makrofagi pochodzące z monocytów krwi i linie komórkowe makrofagów były często wykorzystywane jako zasoby makrofagów do badań nad zapaleniem stawów9,10. Ponieważ makrofagi mogą nabywać funkcje związane ze swoim mikrośrodowiskiem, ogólne źródła makrofagów mogą nie mieć odpowiedzi specyficznych dla tkanki zapalenia stawów. Ponadto trudno jest uzyskać wystarczającą ilość komórek maziowych przez sortowanie, ponieważ mysia błona maziowa jest bardzo małą tkanką nawet w modelach zapalenia stawów. Brak wykorzystania makrofagów maziowych w badaniach in vitro był ograniczeniem w badaniach nad zapaleniem stawów. Ustanowienie protokołu izolacji i ekspansji makrofagów maziowych byłoby korzystne dla wyjaśnienia mechanizmów patologicznych w RZS.
W poprzedniej metodzie izolowania SF, SM były odrzucane7. Poza tym opisano metodę izolowania i namnażania rezydujących makrofagów z niektórych narządów11. W związku z tym istniejące protokoły zostały zmodyfikowane w połączeniu. Modyfikacja ma na celu osiągnięcie pierwotnej kultury zarówno SM, jak i SF o wysokiej czystości. Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie i namnażanie zarówno SM, jak i SF z mysiej tkanki zapalenia stawów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Doświadczenia z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Ehime i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Ehime dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach (37A1-1*16).
1. Przygotowanie instrumentów, odczynników i pożywki hodowlanej
- Przygotować pożywkę hodowlaną w następujący sposób: uzupełnić pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% roztwór antybiotyków i przeciwgrzybiczego (anti-anti).
- Przygotować pożywkę do trawienia w następujący sposób: uzupełnić pożywkę hodowlaną o 1 mg/mL kolagenazy typu IV. Stężenie kolagenazy należy dostosować bezpośrednio przed użyciem.
- Rozcieńczyć kolagen typu I-C do stężenia 0.15 mg/mL w 1 mM roztworze HCl. Zalać szalki hodowlane (o średnicy 40 lub 60 mm) rozcieńczonym roztworem kolagenu. Po 6-12 h w temperaturze pokojowej usunąć roztwór kolagenu z szalek i wysuszyć w temperaturze pokojowej. Szalki pokryte kolagenem można przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 tydzień. Przed użyciem wypłukać uprzednio pokryte szalki fosforanem buforem soli (PBS) lub pożywką.
- Przygotować sterylne narzędzia chirurgiczne, takie jak nożyczki, pęsety z ząbkowanymi końcówkami oraz pęsety precyzyjne. Przed użyciem namoczyć w 70% etanolu.
2. Przygotowanie tkanki zapalenia błony maziowej u myszy ( Rycina 1A)
- Przygotuj mysz z zapaleniem stawów w tylnych łapach.
UWAGA: W tym protokole wykorzystano samice myszy C57BL/6 (18-20 g) w wieku 7-8 tygodni po urodzeniu z zapaleniem stawów indukowanym przeciwciałami przeciwko kolagenowi (CAIA) lub zapaleniem stawów indukowanym transferem surowicy K/BxN (STA)8. Izolowanie SMs z tkanki nieobrzękniętej (tj. zdrowej) może być trudne ze względu na niewystarczającą liczbę komórek. - Zanurz myszy w znieczuleniu poprzez dostrychalny wtrysk 80 mg/kg ketaminy i 16 mg/kg ksylazyny. Oczyść myszy 70% etanolem.
- Rozetnij nożyczkami obszar klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Odetnij nożyczkami prawy przedsionek serca, a następnie wprowadź igłę motylkową 23 G do lewej komory via wierzchołek serca, po czym wykonaj refluks 15-20 mL sterylnego PBS za pomocą strzykawki, aby ręcznie usunąć krew obwodową (około 1 mL/2 s).
- Odsłoń tkanki tylnych łap, przecinając skórę nożyczkami i odciągając ją pęsetą z ząbkowanymi końcówkami.
UWAGA: Po tym kroku zaleca się używanie pęsety do manipulowania próbkami. Nie dotykaj odsłoniętej tkanki palcami, aby uniknąć przyklejenia się sierści mysiej. - Zwichnij stawy śródstopno-paliczkowe poprzez pociągnięcie, a następnie przetnij więzadła stawowe nożyczkami, aby usunąć palce.
- Przetnij nożyczkami ścięgna mięśni podudzia w pobliżu kostki. Chwyć ścięgno pęsetą i odwarstw mięśnie proksymalnie w podudziu, aby odsłonić piszczel. Usuń strzałkę.
- Zwichnij staw kolanowy poprzez pociągnięcie, a następnie przetnij więzadła stawowe nożyczkami, aby oddzielić piszczel wraz z obrzękniętą tylną łapą. Przechowuj próbki w lodowatej pożywce hodowlanej (0.3 mL/cm2) do czasu przejścia do kroku 3.1.
3. Trawienie tkanki zapalenia błony maziowej (Rysunek 1B)
- Odssać pożywkę hodowlaną, uważając, aby nie pobrać próbki, a następnie dodać świeżą pożywkę hodowlaną (0,3 mL/cm2). Powtórzyć proces płukania trzy lub cztery razy.
UWAGA: Od tego etapu manipulacje z próbkami powinny być wykonywane aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego. - Zwichnąć wszystkie stawy próbek, pociągając je za pomocą pęsety z cienkim końcem w pożywce hodowlanej pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 10x-20x). Pęsety z cienkim końcem są wygodne na tym etapie. Usunąć kość piszczelową oraz jak najwięcej naczyń, ścięgien i więzadeł. Należy uważać, aby nie złamać kości podczas zwichnąć.
- Przygotować dwie probówki 15 mL na próbkę. Przenieść zwichnięte kości z tkankami miękkimi do pierwszej probówki 15 mL za pomocą pęsety. Do probówki dodać 4 mL pożywki do trawienia na próbkę uzyskaną z obu tylnych łap.
- Aby zebrać pozostałe komórki i fragmenty tkanek, przenieść pożywkę, w której znajdowała się próbka, do drugiej probówki 15 mL. Wirować pożywkę z prędkością 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po usunięciu nadsączu resuspender osad w 1 mL pożywki do trawienia i przenieść roztwór komórek i fragmentów tkanek do pierwszej probówki 15 mL zawierającej prawie wszystkie tkanki (łącznie 5 mL pożywki do trawienia/tylne łapy).
- Trawić próbkę przez 60-120 min w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem w inkubatorze do hybrydyzacji.
UWAGA: Należy określić optymalny czas trawienia próbek. Czas ten zależy od stopnia obrzęku stawów skokowych oraz użytych kolagenaz. W większości przypadków 60-120 min jest wystarczające. Po 60 min inkubacji pobrać pipetą część trawionej próbki i obejrzeć pod mikroskopem. Jeśli trawienie jest niewystarczające, należy kontynuować inkubację i sprawdzać stopień trawienia co 30 min. - Dokładnie wymieszać roztwór za pomocą pipety. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (rozmiar porów 40 µm) do probówki 50 mL.
- Dodać 10 mL pożywki hodowlanej do probówki 50 mL przez sitko komórkowe. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Po usunięciu nadsączu resuspender w 10 mL pożywki hodowlanej. Powtórzyć wirowanie. Po usunięciu nadsączu resuspender w 2 mL pożywki hodowlanej.
Rycina 1: Procedura pobierania tkanek z zapaleniem stawów u myszy i trawienia kolagenazą. (A) (i) Tylna łapa myszy z zapalnym zapaleniem stawów. (ii) Usunięcie skóry z tylnej łapy. (iii) Zwichnięcie stawów śródstopno-paliczkowych i usunięcie palców. (iv) Przecięcie ścięgien w kostce. (v) Usunięcie mięśni w dolnych częściach kończyn. (vi) Zwichnięcie stawu kolanowego. (B) Po lewej; wycięte kończyny w medium hodowlanym. Po prawej; zwichnięty staw skokowy i śródstopie w medium hodowlanym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
4. Izolacja fibroblastów błony maziowej ( Rysunek 2A)
- Wysiać wszystkie zawiesiny komórek uzyskane z obu kostek na pokrytą kolagenem szalkę.
UWAGA: W przypadku pozyskiwania komórek z kostek z niewielkim lub umiarkowanym obrzękiem stosuje się szalkę o średnicy 40 mm. Rozmiar pokrytej kolagenem szalki można zmienić na szalkę o średnicy 60 mm, jeśli w obu kostkach występuje silny obrzęk. - Dodać pożywkę hodowlaną (około 222 µL/cm2). Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2.
- Zebrać komórki nieprzywierające za pomocą pipety (użyć w kroku 5.1). Przemyć pokrytą kolagenem szalkę pożywką hodowlaną i zebrać pożywkę. Hodować komórki przywierające w świeżej pożywce (Rysunek 2B,i). Większość komórek, które szybko przywierają do pokrytej kolagenem szalki, wykazuje morfologię fibroblastoidalną (wrzecionowatą).
- Przesiać komórki przed osiągnięciem pełnej konfluencji poprzez traktowanie 0,05% trypsyną w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS). Dzięki tej metodzie zanieczyszczenie innymi komórkami jest ograniczone, nawet podczas wstępnej ekspansji. Jeśli wymagane są bardziej oczyszczone komórki fibroblastopodobne, należy przeprowadzić wielokrotne pasażowanie w celu zwiększenia czystości; obserwuje się wówczas również rozrost cytoplazmy komórek w adhezji (Rysunek 2B,ii). Ponieważ nadmierna liczba pasaży wpływa na utratę naiwnych cech komórek, należy używać komórek z liczbą pasaży mniejszą niż 5.
5. Izolacja makrofagów maziówkowych ( Rycina 2A)
- Wysiać wszystkie nieprzylegające komórki z kroku 4.4 na szalki (o średnicy 40 lub 60 mm), które nie zostały pokryte kolagenem.
UWAGA: Komórki nieprzylegające obejmują makrofagi, inne limfocyty oraz pozostałe fibroblasty z tkanki zapalenia błony maziowej. - Kulturować komórki zbiorcze przez 1 dzień w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.
- Aby usunąć nieprzylegające limfocyty, odessać medium hodowlane, a następnie dodać świeże medium hodowlane. Powtórzyć ten proces dwa lub trzy razy (Rycina 2B,iii).
- Kulturować przylegające komórki zbiorcze przez 1-2 tygodnie w medium hodowlanym, wymieniając medium co 2 dni w celu utrzymania konfluencji (Rycina 2B,iv).
UWAGA: Liczba SM powoli zwiększa się w warunkach kokultury z SF. W związku z tym okres kokultury należy dostosować w zależności od potrzeb. - Przemyć dwa razy PBS lub HBSS. Traktować 0,05% trypsyną w HBSS (około 55 µL/cm2) przez 3 min w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności. Fibroblasty łatwo odrywają się od szalki hodowlanej po traktowaniu trypsyną, natomiast makrofagi wykazują oporność na działanie trypsyny. Właściwość tę wykorzystać do selekcji makrofagów maziówkowych.
- Ostrożnie dodać medium hodowlane (około 222 µL/cm2) do 0,05% trypsyny w HBSS. Po tym kroku nie wlewać medium bezpośrednio na komórki.
- Aby usunąć oddzielone komórki, odessać medium hodowlane, a następnie ostrożnie dodać świeże medium hodowlane. Powtórzyć ten proces dwa lub trzy razy. Pozostałe na szalce komórki utrzymywać w świeżym medium hodowlanym do momentu użycia (Rycina 2B,v).
UWAGA: Po traktowaniu trypsyną komórki przylegające wykazują cechy morfologiczne typowe dla makrofagów.
Rycina 2: Separacja frakcji bogatej w makrofagi i frakcji bogatej w fibroblasty z tkanki zapalnego zapalenia stawów. (A) Schemat procedury separacji komórek bogatych w makrofagi i bogatych w fibroblasty z tkanki stawowej. (B) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym etapów procedury od (i) do (v) przedstawionych na Rycini 2A. Pasek skali oznacza 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
U samic myszy C57BL/6 w wieku 7–8 tygodni wywołano zapalenie stawów indukowane przeciwciałami przeciwko kolagenowi. Komórki makrofagopodobne oraz komórki fibroblastopodobne wyizolowano niezależnie z tkanki zapalnej stawów zgodnie z opisaną powyżej procedurą (Rycina 2A,B). Komórki makrofagopodobne wykorzystano bezpośrednio po kroku 5.7. Komórki fibroblastopodobne hodowano początkowo do osiągnięcia stanu subkonfluencji po kroku 4.4, a następnie przeniesiono do nowej szalki hod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowana tutaj metoda ulepsza wcześniejsze techniki izolowania zarówno SF od mysiego zapalenia stawów, jak i rezydujących makrofagów z wielu narządów 7,11. Zmodyfikowana metoda może izolować zarówno makrofagi, jak i fibroblasty z zapalnej błony maziowej o wysokiej czystości, a przy tym jest prosta i powtarzalna. Ponieważ metoda nie wymaga skomplikowanych instrumentów, takich jak sorter komórek, każdy może ją przeprowadzić. Ponadto obecna technika pozwala unikną...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują pracownikom Wydziału Wsparcia Badań Medycznych, Centrum Wsparcia Zaawansowanych Badań (ADRES) oraz członkom Wydziału Patofizjologii Integracyjnej, Centrum Proteo-Naukowego (PROS), Uniwersytetu Ehime, za ich pomoc techniczną i pomocne wsparcie. Badanie to było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) granty KAKENHI JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (dla NS) i JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (dla YI); granty Fundacji Badań Medycznych w Osace na rzecz Chorób Nieuleczalnych, Fundacji Nakatomi, Grantu Wschodzących Gwiazd Japońskiego Towarzystwa Badań nad Kośćmi i Minerałami (JSBMR), Fundacji Sumitomo, Fundacji Badań Medycznych SENSHIN, Fundacji Pamięci Mochidy (dla NS); oraz grant Fundacji Nauki Takeda na badania medyczne, grant na projekt UCB Japan (UCBJ) oraz grant JSBMR Frontier Scientist 2019 (dla YI).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5,0 g/L Trypsyna/5,3 mmol/L roztwór EDTA | nacalai tesque | 35556-44 | Rozcieńczony antybiotykiem HBSS |
| – przeciwgrzybicze (anty/anty) | Gibco | 15240-062 | |
| Igła motylkowa | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Sitko do komórek | Falcon | 352340 | 40 µ m porów, Nylon |
| Cellmatrix Typ I-C | Nitta żelatyna | 637-00773 | Kolagen typu I-C |
| Probówka wirówkowa 15 | TPP | 91014 | Probówka 15 ml |
| Rurka wirówkowa 50 | TPP | 91050 | 50 ml |
| Kolagenaza z C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Kolagenaza typu IV |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | SIGAM | 173012 | Przeprowadzono inaktywację termiczną |
| Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Nożyczki | Bio Centrum Badawcze | PRI28-1525A | |
| tkankowych 40 | TPP | 93040 | Do hodowli komórkowych |
| Naczynie do hodowli tkankowych 60 | TPP | 92006 | Do hodowli komórkowych |
| Pęseta | KFI | 1-9749-31 | Pęseta drobnopunktowa |
| Badań Biologicznych | PRI28-1522 | Końcówka ząbkowana | |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Mikroskop stereoskopowy |
Bibliografia
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083(2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
