Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, która prowadzi do przewlekłego zapalenia stawów. Makrofagi maziowe i fibroblasty maziowe odgrywają kluczową rolę w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów. Ważne jest, aby zrozumieć funkcje obu populacji komórek, aby ujawnić mechanizmy leżące u podstaw patologicznej progresji i remisji w zapalnym zapaleniu stawów. Ogólnie rzecz biorąc, warunki doświadczalne in vitro powinny w jak największym stopniu naśladować środowisko in vivo. Pierwotne komórki pochodzące z tkanek zostały wykorzystane w eksperymentach charakteryzujących fibroblasty maziowe w zapaleniu stawów. Natomiast w eksperymentach badających biologiczne funkcje makrofagów w zapalnym zapaleniu stawów wykorzystano linie komórkowe, makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i makrofagi pochodzące z monocytów krwi. Nie jest jednak jasne, czy takie makrofagi rzeczywiście odzwierciedlają funkcje makrofagów rezydujących w tkankach. Aby uzyskać rezydujące makrofagi, poprzednie protokoły zostały zmodyfikowane w celu wyizolowania i namnażania zarówno pierwotnych makrofagów, jak i fibroblastów z tkanki maziowej w mysim modelu zapalenia stawów. Te pierwotne komórki maziowe mogą być przydatne do analizy in vitro zapalenia stawów.
Wprowadzenie
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą autoimmunologiczną charakteryzującą się przerostem błony maziowej, prowadzącym do zniszczenia stawów1,2. Makrofagi i fibroblasty rezydujące w tkankach są obecne w zdrowej błonie maziowej w celu utrzymania homeostazy stawów. U pacjentów z RZS dochodzi do namnażania się fibroblastów maziowych (SF), a komórki odpornościowe, w tym monocyty, infiltrują do błony maziowej i płynu stawowego, co jest procesem związanym ze stanem zapalnym1,3,4. Makrofagi maziowe (SM), które obej....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Doświadczenia z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Ehime i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Ehime dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach (37A1-1*16).
1. Przygotowanie instrumentów, odczynników i pożywki hodowlanej
- Przygotować pożywkę hodowlaną w następujący sposób: uzupełnić pożywkę Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% roztwór antybiotyków i przeciwgrzybiczego (anti-anti).
- Przygotować pożywkę do trawienia w następujący sposób: uzupełnić pożywkę hodowlaną o 1 mg/mL kolag....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
U samic myszy C57BL/6 w wieku 7–8 tygodni wywołano zapalenie stawów indukowane przeciwciałami przeciwko kolagenowi. Komórki makrofagopodobne oraz komórki fibroblastopodobne wyizolowano niezależnie z tkanki zapalnej stawów zgodnie z opisaną powyżej procedurą (Rycina 2A,B). Komórki makrofagopodobne wykorzystano bezpośrednio po kroku 5.7. Komórki fibroblastopodobne hodowano początkowo do osiągnięcia stanu subkonfluencji po kroku 4.4, a następnie przeniesiono do nowej szalki hod.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowana tutaj metoda ulepsza wcześniejsze techniki izolowania zarówno SF od mysiego zapalenia stawów, jak i rezydujących makrofagów z wielu narządów 7,11. Zmodyfikowana metoda może izolować zarówno makrofagi, jak i fibroblasty z zapalnej błony maziowej o wysokiej czystości, a przy tym jest prosta i powtarzalna. Ponieważ metoda nie wymaga skomplikowanych instrumentów, takich jak sorter komórek, każdy może ją przeprowadzić. Ponadto obecna technika pozwala unikną.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują pracownikom Wydziału Wsparcia Badań Medycznych, Centrum Wsparcia Zaawansowanych Badań (ADRES) oraz członkom Wydziału Patofizjologii Integracyjnej, Centrum Proteo-Naukowego (PROS), Uniwersytetu Ehime, za ich pomoc techniczną i pomocne wsparcie. Badanie to było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) granty KAKENHI JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (dla NS) i JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (dla YI); granty Fundacji Badań Medycznych w Osace na rzecz Chorób Nieuleczalnych, Fundacji Nakatomi, Grantu Wschodzących Gwiazd Japońskiego Towarzystwa Badań nad Kośćmi i Minerałami (JSBMR), Fundacji Sumitomo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5,0 g/L Trypsyna/5,3 mmol/L roztwór EDTA | nacalai tesque | 35556-44 | Rozcieńczony antybiotykiem HBSS |
| – przeciwgrzybicze (anty/anty) | Gibco | 15240-062 | |
| Igła motylkowa | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Sitko do komórek | Falcon | 352340 | 40 µ m porów, Nylon |
| Cellmatrix Typ I-C | Nitta żelatyna | 637-00773 | Kolagen typu I-C |
| Probówka wirówkowa 15 | TPP | 91014 | Probówka 15 ml |
| Rurka wirówkowa 50 | TPP | 91050 | 50 ml |
| Kolagenaza z C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Kolagenaza typu IV |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | SIGAM | 173012 | Przeprowadzono inaktywację termiczną |
| Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Nożyczki | Bio Centrum Badawcze | PRI28-1525A | |
| tkankowych 40 | TPP | 93040 | Do hodowli komórkowych |
| Naczynie do hodowli tkankowych 60 | TPP | 92006 | Do hodowli komórkowych |
| Pęseta | KFI | 1-9749-31 | Pęseta drobnopunktowa |
| Badań Biologicznych | PRI28-1522 | Końcówka ząbkowana | |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Mikroskop stereoskopowy |
Bibliografia
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
