Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Podsumowanie

Embriony piskląt są używane do badania ludzkich guzów mózgu z glejakiem (GBM) in ovo i w kokulturach ex vivo. Zachowanie komórek GBM można rejestrować za pomocą mikroskopii poklatkowej w kokulturach ex vivo, a oba preparaty można analizować w eksperymentalnym punkcie końcowym za pomocą szczegółowej analizy konfokalnej 3D.

Streszczenie

Embrion pisklęcia był idealnym modelowym systemem do badania rozwoju kręgowców, szczególnie do eksperymentalnych manipulacji. Zastosowanie zarodka kurcząt zostało rozszerzone do badania powstawania guzów mózgu ludzkiego glejaka (GBM) in vivo oraz inwazyjności komórek nowotworowych w otaczającej tkance mózgowej. Guzy GBM mogą powstawać przez wstrzyknięcie zawiesiny komórek znakowanych fluorescencyjnie do komory śródmózgowia E5 (optic tectum) in ovo.

W zależności od komórek GBM, w komorze i w ścianie mózgu losowo tworzą się zwarte guzy, a grupy komórek atakują tkankę ściany mózgowej. Grube skrawki tkanek (350 μm) utrwalonej tekty E15 z guzami mogą być barwione immunologicznie, aby ujawnić, że atakujące komórki często migrują wzdłuż naczyń krwionośnych podczas analizy za pomocą rekonstrukcji 3D konfokalnych obrazów stosu z. Żywe plastry śródmózgowia i przodomózgowia E15 (250-350 μm) można hodować na wkładkach błonowych, gdzie znakowane fluorescencyjnie komórki GBM można wprowadzić w nielosowe miejsca, aby zapewnić kokultury ex vivo w celu analizy inwazji komórek, która może również wystąpić wzdłuż naczyń krwionośnych, przez okres około 1 tygodnia. Te kokultury ex vivo mogą być monitorowane za pomocą mikroskopii poklatkowej fluorescencji szerokokątnej lub konfokalnej w celu obserwacji zachowania żywych komórek.

Współhodowane plastry mogą być następnie utrwalone, wybarwione immunologicznie i analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby określić, czy inwazja nastąpiła wzdłuż naczyń krwionośnych lub aksonów. Ponadto system kohodowli może być wykorzystywany do badania potencjalnych interakcji między komórkami poprzez umieszczanie agregatów o różnych typach i kolorach komórek w różnych precyzyjnych lokalizacjach i obserwowanie ruchów komórek. Leczenie farmakologiczne może być wykonywane na kulturach ex vivo, podczas gdy zabiegi te nie są kompatybilne z systemem in ovo. Te dwa uzupełniające się podejścia pozwalają na szczegółową i precyzyjną analizę zachowania ludzkich komórek GBM i powstawania nowotworów w środowisku mózgu kręgowców, którym można manipulować.

Wprowadzenie

Badania in vitro zachowań komórek nowotworowych są często wykorzystywane do analizy potencjalnych mechanizmów, które działają podczas bardziej złożonego zachowania, które obserwuje się podczas tworzenia guza i inwazji komórek w modelach ksenoprzeszczepów in vivo. Na przykład w przypadku glejaka wielopostaciowego (GBM) badania in vitro ujawniły mechanizmy potencjalnego działania L1CAM podczas tworzenia guza i inwazji mózgu w nowym modelu guza mózgu z ksenoprzeszczepem zarodka pisklęcia^1,2,3,4,5. Chociaż eksperymenty in vitro i in vivo uzupełniają się nawzajem w użyteczny sposób, pozostawiają istotną lukę w sposobie korelacji wyników. Na przykład, mechanistyczne analizy ruchliwości komórek GBM na szalce są wysoce sztuczną sytuacją, a modele ksenoprzeszczepów in vivo mogą ujawnić jedynie statyczne analizy punktów czasowych lub końcowych powstawania guza i zachowania komórek. Badania in vivo z wykorzystaniem gryzoni lub zarodków piskląt nie nadają się łatwo do monitorowania zachowania komórek, gdy komórki atakują tkankę mózgową w tych modelach ksenoprzeszczepów. Niemniej jednak model ksenoprzeszczepu zarodka pisklęcia wykazał, że białko adhezyjne L1CAM odgrywa rolę stymulującą w zdolności inwazyjnej ludzkich komórek T98G GBM^2,5.

Odpowiednie rozwiązanie tego problemu można osiągnąć poprzez połączenie metod zarówno in vivo, jak i in vitro przy użyciu organotypowego modelu hodowli wycinków mózgu, określanego jako model ex vivo. W tym modelu ex vivo żywa tkanka mózgowa może być utrzymywana na grubości kilkuset mikronów przez okres do kilku tygodni, co umożliwia wszczepienie komórek rakowych, obserwację ich zachowania w rzeczywistej tkance w czasie, a następnie przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy markerów w punkcie końcowym eksperymentu.

Popularna metoda hodowli organicznotypowych plastrów polegała na hodowli kilkusetmikronowego wycinka mózgu na wierzchu półprzezroczystej lub przezroczystej porowatej membrany, pozostawiając tkankę wystawioną na działanie powietrza, ale pozwalając pożywce na utrzymanie tkanki od spodu błony (patrz Stoppini et al.⁶). Różne warianty tej metody zostały wykorzystane do różnych badań, w tym przy użyciu różnych pożywek lub różnych wkładek membranowych. Różne wkładki membranowe obejmują porowatą (0,4 μm) wkładkę membranową o średnicy 30 mm w naczyniu hodowlanym 35 mm⁶ oraz wkładki do hodowli komórkowych (0,4 μm) dla płytek 6-dołkowych⁷. Różne podłoża obejmują 50% MEM / HEPES + 25% inaktywowaną termicznie surowicę końską + 25% zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) ⁸, 50% zredukowaną pożywkę surowicy + 25% surowicę końską + 25% HBSS⁹, a także inne. Jeśli półprzezroczysta lub przezroczysta membrana jest używana wraz z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami GBM, takie kultury można obrazować od dołu za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego szerokopolowego lub konfokalnego^{10,11,12,13,14,15}.

Podczas gdy wiele in vivo ortotopowych ksenoprzeszczepów guzów mózgu i organicznych modeli hodowli ex vivo na wycinkach mózgu zostało stworzonych przy użyciu gryzoni, jak wspomniano powyżej, zarodek pisklęcia (Gallus gallus) nie został w pełni wykorzystany do tych celów. Wykazano jednak, że zarodek pisklęcia może być wykorzystany jako ortotopowy model ksenoprzeszczepu in vivo do badania inwazji glejaka zarówno u ludzi, jak i szczurów^1,2,5. Ksenoprzeszczepowane komórki w mózgach zarodków kurcząt wykazywały wzorce inwazji podobne do tych obserwowanych w modelach gryzoni, co dodatkowo wspiera wykorzystanie zarodków piskląt jako modelu in vivo do analizy komórek nowotworowych GBM. Zarodki piskląt są również niedrogie, mogą być łatwiejsze w utrzymaniu niż zarodki gryzoni (np. w skorupkach jaj w inkubatorze laboratoryjnym) i są znacznie łatwiejsze w obróbce, co czyni je atrakcyjną opcją dla krótkoterminowych badań in vivo GBM. Niedawny artykuł opisywał użycie kultur wycinków mózgu zarodków piskląt do tworzenia i wzrostu aksonów podczas normalnego rozwoju mózgu, gdzie wycinki były żywotne przez co najmniej 7 dni¹⁶. Brakuje jednak wykorzystania takich kultur wycinków mózgu zarodków piskląt do analizy ex vivo zachowania komórek GBM w środowisku tkankowym. W artykule opisano zarówno przeszczepianie ludzkich komórek GBM i komórek macierzystych GBM (GSC) do mózgu wczesnego zarodka pisklęcia in vivo, jak i wprowadzanie komórek GBM do żywych kultur wycinków mózgu piskląt kurcząt ex vivo. Podano również kilka reprezentatywnych przykładów powstałych nowotworów i wzorców inwazji komórek uzyskanych z tych preparatów.

Protokół

Do przeprowadzenia tej pracy nie było potrzebne żadne zezwolenie ani zgoda na Uniwersytecie Delaware.

1. Wstrzyknięcie komórek GBM do osłony wzrokowej piskląt

1. Przygotowanie komórek GSC i GBM do wstrzykiwań
   1. Wzorce hodowli w pożywkach GSC (tabela 1). Hodowla ustaliła linie komórkowe GBM w pożywce GBM (Tabela 1).
   2. Opłucz komórki na płytkach sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i umieść 1 ml roztworu trypsyny w naczyniu o średnicy 10 cm. Pozostaw w inkubatorze do hodowli komórkowych na 2-3 minuty, aż komórki zaczną się odłączać.
   3. Dezaktywuj trypsynę, dodając 10 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej zawierającej surowicę do 10-centymetrowego naczynia i odłącz komórki, pipetując w górę i w dół. Umieścić zawiesinę komórek w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   4. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Odessać pożywkę z osadu komórkowego za pomocą jednorazowej pipety z drobnego szkła przymocowanej do kolby bocznej i pompy próżniowej. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej pożywce wzrostowej do stężenia 10 000 komórek na mikrolitr i umieścić w probówce do mikrofuge lub małej rurki z zakręcaną nakrętką na lodzie.
   6. Wymieszaj komórki z niewielką ilością sterylnego 1% barwnika Fast Green FCF (użyj proporcji 5 μl barwnika/100 μl zawiesiny komórek).
2. Wstrzyknięcie komórek GBM do tectum nerwu wzrokowego E5 in ovo. Patrz rysunek uzupełniający 1.
   1. Inkubować zapłodnione jaja kurze w nawilżanym inkubatorze do jaj, spiczastym końcem skierowanym w dół, w temperaturze 37,5 °C (pierwszy dzień inkubacji to dzień zarodkowy 0 [E0]). W 6 dniu inkubacji (E5) wysterylizuj skorupkę jaja, spryskując ją 70% etanolem.
   2. Za pomocą świecy do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu przestrzeni powietrznej nad zarodkiem i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą.
   3. Za pomocą zakrzywionych nożyczek delikatnie przetnij wokół śledzonego obszaru, uważając, aby nie przeciąć błon embrionalnych lub naczyń krwionośnych i wyrzuć górną część skorupki jajka.
   4. Umieść kilka kropli soli fizjologicznej lub pożywki do hodowli komórkowych na membranie przestrzeni powietrznej, aby ją zwilżyć, aby łatwo się oderwała. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie przebij błonę przestrzeni powietrznej nad górną częścią zarodka, usuń ją i zlokalizuj głowę zarodka pisklęcia.
   5. Użyj cienkich kleszczy, aby chwycić przezroczystą błonę owodniową, która bezpośrednio otacza zarodek, aby ustawić głowę tak, aby można było wstrzyknąć komórki do osłony wzrokowej. Jedną ręką należy przytrzymać owodnię za cienkie kleszcze, aby utrzymać głowę na miejscu podczas wstrzykiwania. Należy uważać, aby nie uszkodzić pozazarodkowych naczyń krwionośnych w błonie kosmówkowo-omoczniowej żółtka.
      UWAGA: Powyższa procedura wymaga pewnej praktyki, aby móc skutecznie chwycić przezroczystą błonę owodniową, która ściśle otacza zarodek, ponieważ jest niewidoczna, dopóki nie zostanie złapana i pociągnięta. Ćwicz używanie cienkich kleszczy, aby chwycić przezroczystą owodnię, która bezpośrednio otacza zarodek.
   6. Trzymaj głowę stabilnie, chwytając błonę owodniową cienkimi kleszkami. Za pomocą szklanej mikropipety i pneumatycznej pikopompy wstrzyknąć około 50 000 komórek w 5 μl odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych do osłony optycznej (5 μl to około 1/2 napełnionej mikropipety).
      UWAGA: Zobacz Cretu et al.¹, aby zobaczyć obraz zarodka E5, któremu wstrzyknięto komórki GBM zmieszane z barwnikiem.
   7. Umieść kilka kropli ampicyliny 50 mg/ml na wierzchu zarodka.
   8. Przykryj otwór w górnej części jaj przezroczystą taśmą i pozostaw w nawilżaczu do E15 w celu rozcięcia.

2. Sekcja obszarów mózgu z zarodków E15

UWAGA: Sekcja mózgów E15 w celu fiksacji jest podobna do tej opisanej w kroku 8.2 dla żywych wycinków mózgu, ale sekcja tutaj nie musi być przeprowadzana w warunkach aseptycznych.

1. Odetnij taśmę wokół górnej części skorupy, umożliwiając dostęp do zarodka.
2. Odetnij głowę zarodkowi na szyi i umieść głowę w 10 cm naczyniu ze sterylnym roztworem Tyrodów wolnych od wapnia i magnezu (CMF Tyrode's). Patrz rysunek uzupełniający 2.
3. Za pomocą cienkich kleszczy oderwij skórę pokrywającą mózg, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Usuń tworzące się kości czaszki po lewej i prawej stronie mózgu. Tworzące się kości czaszki nie pokrywają jeszcze większości mózgu.
4. Delikatnie użyj cienkich, spiczastych kleszczy, aby przebić się przez opony mózgowe leżące nad środkiem mózgu i oderwij je z każdej strony, aby odsłonić mózg.
5. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby zgarnąć mózg od dołu i delikatnie wyciągnąć go z jamy.
6. Rozłóż mózg na jego części: przodomózgowie, tecta, móżdżek.
7. Usuń leżącą pia mater z tecta za pomocą drobnych kleszczy. Zauważ, że pia łatwo oddziela się od tecta, ale nie od przodomózgowia czy móżdżku. Usuń pia z przodomózgowia, dotykając go lub zwijając na małym kawałku bibuły filtracyjnej.
8. Umieść wypreparowane obszary mózgu w małym naczyniu.
9. Umieść obszary mózgu do utrwalenia w 24-dołkowej studzience na płytkę i utrwal w 2% paraformaldehydzie (PFA) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Pozostawić na co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.
10. Po utrwaleniu wypłucz tkankę w 3x PBS przez co najmniej 1 godzinę przed zatopieniem w agarze .

3. Osadzanie i krojenie zebranych obszarów mózgu

1. Podgrzej roztwór 3,5% agaru i 8% sacharozy w PBS do stopienia i utrzymuj go w temperaturze topnienia.
2. Używając zakrzywionych kleszczy jako miarki, delikatnie podnieś tektum wzrokowe lub obszar przodomózgowia mózgu zarodka pisklęcia i lekko osusz bibułę filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu, aby zapewnić przyleganie agaru do zewnętrznej powierzchni mózgu.
3. Za pomocą sterylnej pipety transferowej napełnij formę roztworem agaru.
   UWAGA: Prostą formę można wykonać, formując folię aluminiową wokół przedmiotu o odpowiedniej wielkości, takiego jak małe prostokątne metalowe wibrujące bloki krajalnicy do tkanek.
4. Umieść obszar mózgu w agarze i pozwól agarowi całkowicie zastygnąć.
5. Usuń folię aluminiową z okolic osadzonego mózgu i przytnij nadmiar agaru po bokach za pomocą żyletki lub skalpela.
6. Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na kwadracie ze stali nierdzewnej tacki do krojenia, umieść blok agarozy z mózgiem na kleju i pozwól klejowi związać się przez 1 minutę. Umieść tackę w wibrującym uchwycie krajalnicy do tkanek, dokręć i napełnij tacę wystarczającą ilością PBS, aby pokryć górną część bloku agaru.
7. Pokrój plastry mózgu na wibrującej krajalnicy do tkanek o grubości 350 μm za pomocą stalowej żyletki.
8. Gdy plastry mózgu są krojone i swobodnie unoszą się na tacy do krojenia, użyj szpatułki, aby nabrać i wyjąć plastry z tacy. Delikatnie zsuń sekcję ze szpatułki na oznaczoną 10 cm szalkę Petriego z PBS, aby sekcje swobodnie unosiły się na wodzie.
   UWAGA: Agar otaczający wycinek mózgu może się oderwać, jeśli mózg nie zostanie wystarczająco osuszony bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu przed osadzeniem. Jeśli tak się stanie, tkanka mózgowa może zostać delikatnie usunięta ze zestalonego agaru i ponownie osadzona po odpowiednim osuszeniu nadmiaru płynu.

4. Immunologiczne barwienie wycinków mózgu za pomocą komórek nowotworowych

1. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w epifluorescencję należy przesiewać poszczególne plasterki w 10-centymetrowym naczyniu jeden po drugim pod kątem obecności lub braku komórek nowotworowych.
2. Przygotować odpowiednią ilość buforowanej fosforanami soli fizjologicznej z 0,1% Triton X-100 i 5% normalną surowicą kozią (PBSTG) (patrz Tabela 1) do barwienia immunologicznego i przepłukać plastry, które mają być wybarwione immunologicznie.
3. Studzienki wypełnione do połowy w 24-dołkowej płytce, która będzie używana do barwienia skrawków mózgu za pomocą PBS.
4. Odetnij rogi agaru wokół plasterków mózgu krawędzią szpatułki lub skalpela i delikatnie umieść je w studzienkach zawierających PBS.
5. Odessać PBS i zastąpić 350 μl pierwszorzędowego roztworu do barwienia przeciwciał w PBSTG (np. 2 μg/ml UJ127 w PBSTG).
6. Inkubować przez 24 godziny w chłodnym pomieszczeniu z delikatnym mieszaniem, tak aby można było zauważyć, że plaster swobodnie porusza się w studzience.
7. Po 24 godzinach usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przepłukać 3 x 1 h PBSTG w chłodnym pomieszczeniu z mieszaniem.
8. Po zakończeniu płukania inkubować w 350 μl/studzienkę wtórnego roztworu barwiącego przeciwciała w PBSTG (np. rozcieńczenie biotyny-GAM w PBSTG w stosunku 1:200). Inkubować przez 20 godzin w chłodni z mieszaniem.
   UWAGA: W przypadku rezygnacji z trzeciego etapu i inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym zawierającym fluorochrom na tym etapie, przykryj się, aby chronić przed światłem podczas inkubacji, a następnie przejdź do kroku 4.11.
9. Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać 3 x 1 h w PBSTG w chłodnym pomieszczeniu z mieszaniem.
10. Usunąć PBSTG i inkubować w roztworze trzeciorzędowym (np. streptawidyna Alexa Fluor 647 w PBSTG w rozcieńczeniu 1:250). W razie potrzeby zabarwić jądra na tym etapie, dodając do mieszaniny 0,1 μg/ml bisbenzimidu. Inkubować przez 20 godzin w chłodni z mieszaniem.
11. Usunąć roztwór trzeciorzędowy i spłukać 3 x 1 h w PBSTG w chłodnym pomieszczeniu z mieszaniem.
12. Pozostaw w PBS do momentu, gdy będzie gotowy do zamontowania na szkiełkach mikroskopowych.

5. Montaż warstw na szkiełkach mikroskopowych

1. Przygotuj tyle szkiełek mikroskopowych, ile jest sekcji do zamontowania.
2. Dla każdego slajdu umieść pasek winylowej taśmy izolacyjnej o grubości 10 mil (254 μm) o długości 50 mm na kawałku parafilmu.
3. Za pomocą kwadratowego dziurkacza o wymiarach 1 cm x 1 cm przebij otwór przez środek taśmy izolacyjnej i parafilmu.
4. Zdejmij taśmę z parafilmu i umieść ją na szkiełku mikroskopowym, pozostawiając miejsce na taśmę do etykietowania na szkiełku.
5. Za pomocą mikropipety umieść jedną lub dwie krople środka montażowego zapobiegającego blaknięciu w kwadratowym otworze pośrodku taśmy izolacyjnej.
6. Użyj zakrzywionej szpatułki, aby podnieść żądaną sekcję wibrującej krajalnicy do tkanek z PBSTG i dokładnie odprowadzić wilgoć czystą chusteczką laboratoryjną lub kawałkiem bibuły filtracyjnej.
7. Dotknij krawędzi plastra do kropli materiału montażowego i za pomocą innej szpatułki delikatnie wsuń sekcję w nośnik montażowy.
8. Przykryj sekcję kilkoma dodatkowymi kroplami materiału mocującego i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 30 mm (#1,5 grubości) na wierzchu sekcji i mocowania.
9. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby utrzymać je na miejscu.

6. Mikroskopia konfokalna nieruchomych wycinków mózgu

1. Użyj fluorescencji szerokokątnej, aby znaleźć fluorescencyjne guzy w zamontowanym wycinku mózgu za pomocą odpowiedniej soczewki obiektywu i zestawu filtrów.
   UWAGA: Niektóre guzy mogą być dość duże i są łatwo widoczne przy użyciu obiektywu 4x, podczas gdy pojedyncze komórki mogą wymagać obiektywu 10x.
2. Przełącz się na mikroskopię konfokalną przy użyciu odpowiedniej soczewki obiektywu, lasera (laserów), rozmiaru otworu i ustawień detektora. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć obiektywu 20x (apertura numeryczna [N.A.] = 0,75) do rutynowego obrazowania i obiektywu olejowego 60x (N.A. = 1.40) do obrazowania o wysokiej rozdzielczości.
3. Ustaw górną i dolną granicę osi z i rozmiar kroku (dla konkretnej sytuacji zgodnie z instrukcjami producenta mikroskopu konfokalnego) w celu uzyskania przekrojów optycznych. Zdobądź stos z sekcji optycznych.
4. Użyj oprogramowania mikroskopu konfokalnego, aby utworzyć render objętościowy 3D guza, zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Przygotowanie sferoidy

1. Tworzenie płyt z poli(metakrylanu 2-hydroksyetylu) (poli-HEMA)
   1. Stworzyć roztwór 10 μg/ml poli-HEMA w 95% etanolu i pokryć 35-milimetrowe szalki Petriego (lub szalki do hodowli komórkowych) 1 ml tego roztworu.
   2. Pozostaw naczynia na noc na odkrytym bujaku w temperaturze pokojowej, aby uzyskać powłokę na powierzchni naczynia.
      UWAGA: Rozpuszczalnik odparuje i pozostawi półprzezroczystą powłokę na naczyniu, która może wydawać się nierówna, ale nie wpłynie to na zdolność do tworzenia sferoid komórkowych.
   3. Po wysuszeniu wysterylizuj otwarte naczynia w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego przez 1 godzinę. Po sterylizacji załóż pokrywki. Naczynia pokryte powłoką są teraz gotowe do użycia.
2. Barwienie fluorescencyjne DiD do mikroskopii poklatkowej
   UWAGA: Ta sekcja dotyczy barwienia pojedynczych komórek barwnikiem fluorescencyjnym DiD, który ma być używany do tworzenia sferoid, co optymalizuje wizualizację ruchliwości komórek dla obrazowania poklatkowego na żywo.
   1. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej bez surowicy.
   2. Dodać 5 μl wywaru DiD/ml zawiesiny komórek i delikatnie wymieszać pipetując. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Odwirować oznakowaną zawiesinę komórkową o sile 800 × g w temperaturze 5 °C przez 5 minut.
   4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym podłożu w celu wypłukania.
   5. Powtórz ten etap wirowania i płukania jeszcze dwa razy.
      UWAGA: W razie potrzeby przejdź do kroku 7.3.6, aby utworzyć sferoidy natychmiast po tym procesie.
3. Tworzenie sferoid komórkowych
   1. Rozgrzej 0,25% roztwór trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do temperatury 37 °C.
   2. Hodowla GSC w pożywce GSC¹⁷ (Tabela 1) i komórki złośliwej kłuży śluzowej (MG) U-118 w pożywce hodowlanej U-118 (patrz Tabela 1). Użyj zlewającego się naczynia o średnicy 10 cm do przygotowania jednej płytki sferoid o średnicy 35 mm. Początkowo dodać czynniki wzrostu bFGF (stężenie końcowe 10 ng/ml) i TGF-α (stężenie końcowe 20 ng/ml) do GSC, a następnie co 3 dni.
      UWAGA: Ogniwa użyte w obecnym badaniu to zielony GSC15-2/K72, zielony GSC16-4/K72, czerwony U-118/L1LE/mCherry2x i czerwony U-118/1879/mCherry2x. Jedna płytka sferoidów powinna wystarczyć na dwie 6-dołkowe płytki z wycinkami mózgu na wkładkach błonowych.
   3. Opłucz komórki na płytkach sterylnym PBS i umieść 1 ml roztworu trypsyny na 10 cm naczyniu. Umieść w inkubatorze do hodowli komórkowych na 2-3 minuty, aż komórki zaczną się odłączać.
   4. Dezaktywuj trypsynę, dodając 10 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej zawierającej surowicę do 10-centymetrowego naczynia i odłącz komórki, pipetując w górę i w dół. Umieścić zawiesinę komórek w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   5. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Odessać pożywkę z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki.
   7. Umieść 2 ml zawiesiny komórek na każdym 35-milimetrowym naczyniu pokrytym poliehema i dodaj 2 ml więcej odpowiedniej pożywki, aby uzyskać 4 ml całkowitej pożywki na szalkę. W przypadku stosowania GSC należy dodać czynniki wzrostu.
   8. Inkubuj komórki w inkubatorze komórkowym, aż agregaty osiągną rozmiar 100-200 μm, co może trwać 1-2 dni, w zależności od gęstości komórek, które zostały platerowane.

8. Sekcja mózgu żywego zarodka pisklęcia i krojenie wibrującego krajalnika do tkanek

1. Przygotowanie do sekcji
   1. Przygotować 6-dołkową płytkę z membraną poliestrową z 1 ml pożywki do hodowli plastrów mózgu (patrz Tabela 1) pod wkładką membranową.
   2. Wysterylizuj obszar roboczy i narzędzia 70% etanolem.
   3. Umieść 6-dołkową płytkę wkładaną na lodzie podczas sekcji.
   4. Przygotuj 100 ml wibracyjnego materiału do krojenia tkarek do tkanek (Tabela 1) i umieść na lodzie.
   5. Umieścić fiolkę z 4% niskotopliwą agarozą w PBS w łaźni wodnej, aż rozpuści się w ciecz (około 50 °C).
   6. Napełnij wibrującą wannę krajalnicy do chusteczek lodem.
2. Aseptyczne wycięcie mózgu zarodka pisklęcia E14/15
   1. Za pomocą świecznika do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu kieszeni powietrznej nad zarodkiem E14 lub E15 i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą.
   2. Używając zakrzywionych lub cienkich nożyczek, delikatnie przeciąć wokół śledzonego obszaru, uważając, aby nie przeciąć błony zarodka lub naczyń krwionośnych i wyrzucić górny kawałek skorupy.
   3. Za pomocą zakrzywionych kleszczy usuń błonę powietrzną nad górną częścią zarodka i zlokalizuj głowę zarodka pisklęcia.
   4. Odetnij głowę zarodkowi i umieść głowę w 10 cm naczyniu z zimnym, sterylnym roztworem CMF. Patrz rysunek uzupełniający 2.
   5. Za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków oderwij skórę pokrywającą mózg, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Usuń tworzące się kości czaszki po lewej i prawej stronie mózgu. Tworzące się kości czaszki nie pokrywają jeszcze większości mózgu.
   6. Delikatnie użyj cienkich, spiczastych kleszczy (#5 lub #55), aby przebić się przez opony mózgowe leżące nad środkiem mózgu i oderwij je na każdą stronę, aby odsłonić mózg.
   7. Za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy zgarnij mózg od dołu z przodu i delikatnie wyciągnij go z jamy.
   8. Rozłóż mózg na trzy główne części: przodomózgowie, śródmózgowie (tekta wzrokowa), móżdżek. W razie potrzeby skonsultuj się z atlasem rozwoju piskląt.
   9. Usuń leżącą pia mater z tecta za pomocą drobnych kleszczy.
      UWAGA: Pia łatwo oddziela się od tecta, ale nie od przodomózgowia lub móżdżku. Pia można usunąć z przodomózgowia, dotykając go lub zwijając na sterylnej gazie.
   10. Umieść wypreparowane obszary mózgu w małym sterylnym naczyniu na lodzie.
3. Osadzanie i krojenie mózgu
   1. Używając zakrzywionych kleszczy jako miarki, delikatnie podnieś osłonę nerwu wzrokowego lub obszar przodomózgowia i lekko osusz sterylną gazę, aby usunąć nadmiar płynu, aby zapewnić przyleganie agarozy do zewnętrznej powierzchni mózgu.
   2. Za pomocą sterylnej pipety transferowej napełnij formę niskotopliwą agarozą. Przygotuj prostą formę, formując folię aluminiową wokół przedmiotu o odpowiedniej wielkości. Mały prostokątny metalowy wibrujący blok krajalnicy do tkanek jest rutynowo używany jako obiekt. Patrz rysunek uzupełniający 3.
   3. Szybko umieść obszar mózgu w agarozie i pozwól mu zastygnąć (około 4-5 minut) na lodzie.
      UWAGA: Mózg może opaść na dno formy, zanim agaroza stwardnieje. Jeśli tak się stanie, odczekaj 1 minutę, aby agar zaczął twardnieć, a następnie umieść obszar mózgu w agarozie. Spróbuj zawiesić obszar mózgu bezpośrednio w środku agarozy.
   4. Usuń folię aluminiową z okolic mózgu osadzonego w zestalonej agarozie i przytnij nadmiar agarozy po bokach za pomocą sterylnej żyletki lub skalpela.
   5. Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na kwadracie ze stali nierdzewnej naczynia/tacki do krojenia, umieść blok agarozy z mózgiem i pozwól klejowi związać się przez 1 minutę. Umieść naczynie/tacę w wibrującym uchwycie krajalnicy do chusteczek, dokręć i napełnij tacę środkiem do krojenia, aby przykryć górną część bloku agarozy.
   6. Wytnij skrawki na wibrującej krajalnicy do tkanek na poziomie 250-350 μm za pomocą szafirowego noża, który według doniesień powoduje mniej uszkodzeń żywych tkanek niż stalowa żyletka.
   7. Gdy plastry mózgu są krojone i swobodnie unoszą się na tacce do krojenia, użyj sterylnej szpatułki, aby zgarnąć i wyjąć plasterek z tacy. Delikatnie zsuń fragment ze szpatułki na wkładkę membranową za pomocą innej sterylnej szpatułki.
      UWAGA: Zwykle w razie potrzeby na każdej wkładce membranowej można umieścić dwa lub trzy plastry mózgu. Agaroza otaczająca wycinek mózgu może się oderwać, jeśli mózg nie zostanie wystarczająco osuszony sterylną gazą, aby usunąć nadmiar płynu. Jeśli po wystarczającym osuszeniu przed osadzeniem nadal występuje, delikatnie podnieś plasterek bez otaczającej go agarozy i wsuń go na wkładkę membranową.
   8. Umieścić 6-dołkową płytkę z wycinkami mózgu na wkładkach membranowych w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   9. Następnego dnia po posiewie należy użyć sterylnej pipety Pasteura, aby zassać pożywkę spod wkładki (po bokach wkładek znajdują się przerwy, aby pipeta mogła uzyskać dostęp do podłoża znajdującego się poniżej). Dodaj 1 ml świeżego podłoża w plastrach do każdego dołka pod wkładem membranowym. Następnie kontynuuj wymianę nośnika co drugi dzień.
   10. Poczekaj kilka dni, aż plastry mózgu mocno przylgną do wkładek błonowych i wydają się nieco spłaszczać. Jest to znak, że plastry są żywotne i gotowe do wprowadzenia komórek GBM.

9. Wprowadzenie komórek GBM do wycinków mózgu

1. Metoda sferoidalna
   1. Gdy sferoidy komórek osiągną rozmiar 150-200 μm, użyj mikropipety o pojemności 20 μl ustawionej na 5 μl, aby usunąć od jednej do kilku sferoid z naczyń hodowlanych. Patrz rysunek uzupełniający 3.
   2. Delikatnie wyrzuć pożywkę ze sferoidami na żądany wycinek mózgu.
      UWAGA: Sferoidy komórek powinny być widoczne na końcówce pipety. Użycie przezroczystej końcówki do pipet sprawi, że będą one lepiej widoczne w końcówce. Jeśli sferoida spadnie z wycinka mózgu, gdy płyn zostanie uwolniony, należy użyć wysterylizowanej etanolem rzęsy przyklejonej do cienkiego drewnianego aplikatora, aby delikatnie popchnąć sferoidę z powrotem na plasterek mózgu.
   3. Pozwól sferoidom rozmnażać się na wycinkach mózgu przez 2-5 dni.
      UWAGA: Ograniczeniem wydaje się być ostateczna degradacja naczyń krwionośnych i komórek mózgowych w wycinku. Zdegradowane naczynia krwionośne pojawią się jako nieciągłe kulki w plasterku, gdy zostaną zabarwione na lamininę.
2. Metoda stempla biopsyjnego
   1. Pozwól, aby plasterki mózgu przyczepiły się, wydając się, że spłaszczają się na wkładce membranowej (może to zająć 2-5 dni w hodowli).
   2. Rozmrozić matrycę komórkową na lodzie.
   3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego hodowli komórkowej podłącz sterylny stempel do biopsji o średnicy 1 mm do probówki aspiratora próżniowego.
   4. Delikatnie dotknij wycinka mózgu stemplem do biopsji, aby utworzyć 1-milimetrowy otwór w środku wycinka mózgu.
      UWAGA: Tkanka w stemplu biopsyjnym zostanie zassana do stempla przez próżnię.
   5. Przygotować zawiesinę matrycy komórkowej przez trypsynizację 60%-70% zlewającej się 10-centymetrowej płytki komórek i ponowne zawieszenie w 10 ml pożywki; następnie wymieszać 1 ml tej zawiesiny ze 100 μl matrycy.
   6. Za pomocą mikropipety o pojemności 20 μl umieść 1 μl mieszaniny macierzy komórkowej w każdym otworze w wycinkach mózgu.
   7. Po zakończeniu umieszczania mieszaniny komórek umieść naczynie z plasterkami mózgu z osadzonymi komórkami z powrotem w inkubatorze i pozwól matrycy zestalić się, a komórki potencjalnie zaatakować otaczający wycinek mózgu.

10. Szerokokątna fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa

1. Umieść usuwalną taśmę wokół krawędzi płytki 6-dołkowej, aby zapobiec parowaniu pożywki, pozostawiając niewielką szczelinę po jednej stronie na wymianę gazową.
2. Umieść płytki w dostosowanej do potrzeb komorze hodowlanej na regulowanym zautomatyzowanym stoliku pod mikroskopem odwróconej epifluorescencji.
   UWAGA: Komora była utrzymywana w warunkach atmosferycznych 5% CO₂ i 95% powietrza za pomocą regulatora wtrysku gazu, a temperatura była utrzymywana na poziomie 37 °C za pomocą regulatora temperatury ciepłego powietrza i wkładu stopniowego o kontrolowanej temperaturze. Zobacz Fotos et al.¹⁸, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat użytego tutaj systemu.
3. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania sterującego mikroskopem, utwórz harmonogram akwizycji poklatkowej, który zbiera obrazy fluorescencyjne obszarów zainteresowania raz na 10 minut przez 20 godzin
   UWAGA: Jeśli w komórkach stosuje się zieloną etykietę fluorescencyjną (np. zielone białko fluorescencyjne [GFP]), należy użyć minimalnej ilości niebieskiego światła wzbudzającego wymaganej do wizualizacji komórek, aby zapobiec fototoksyczności. Czerwone (np. mCherry) i dalekie czerwone (np. DiD) etykiety nie wydają się mieć tego potencjalnego problemu ze względu na wzbudzenie o większej długości fali.

11. Immunologiczne barwienie wycinków mózgu po mikroskopii poklatkowej

UWAGA: Ten protokół barwienia immunologicznego jest zoptymalizowany do barwienia naczyń krwionośnych lamininą, a jąder bisbenzimidem. Użyj odpowiednich przeciwciał dla pożądanej cząsteczki (cząsteczek) będącej przedmiotem zainteresowania.

1. Odessać pożywkę spod wkładki membranowej za pomocą pipety Pasteura i umieścić 1 ml 2% PFA w 0,1 M buforze kakodylanu sodu pod wkładką i 1 ml na górze wkładki, aby przykryć wycinek mózgu. Pozostaw plastry na noc w temperaturze 4 °C.
2. Usuń utrwalacz spod wkładki membranowej i wszelki utrwalacz pozostały na wycinku mózgu (utrwalacz ma tendencję do przeciekania przez wkładkę membranową do studzienki poniżej).
3. Wyjmij wkładkę z plastrami z dołka 35 mm i umieść je w większym plastikowym naczyniu.
4. Przygotuj 24-dołkową płytkę, dodając 350 μl PBS do tylu dołków, ile jest wycinków mózgu (jeden plasterek / studzienka w przypadku barwienia immunologicznego).
   1. Za pomocą cienkiej szpatułki delikatnie usuń agarozę z okolic wycinka mózgu, nie odłączając wycinka mózgu od wkładki membranowej. Upewnij się, że agaroza łatwo odrywa się od zewnętrznej krawędzi wycinka mózgu. Jeśli nie, pozostaw agarozę przyczepioną do wycinka mózgu.
   2. Za pomocą ostrego skalpela przetnij błonę wokół wycinka mózgu, aż plasterek z leżącą pod nim błoną będzie wolny od reszty wkładki. Podnieś błonę za pomocą dołączonego wycinka mózgu, używając cienkich kleszczy, aby chwycić membranę i umieść ją w dołku 24-dołkowej płytki w PBS.
5. Plastry opłukać 3x PBS przez 1 godzinę w chłodni ze stałym delikatnym mieszaniem lub kołysaniem, tak aby plasterek poruszał się w dołku.
6. Podczas płukania przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.
   1. Rozcieńczyć antylamininę do 2 μg/ml w PBSTG (patrz Tabela 1).
7. Wyjąć PBS z dołków i inkubować przez noc w roztworze przeciwciała pierwotnego w chłodnym pomieszczeniu z delikatnym mieszaniem.
8. Po co najmniej 20 godzinach inkubacji odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przepłukać skrawki 3x przez 1 godzinę w PBSTG.
9. Podczas płukania należy przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciał.
   1. Rozcieńczyć fluorescencyjny GAM specyficznym fluorochromem do rozcieńczenia 1:200 w PBSTG wraz ze stężeniem 0,1 μg/ml bisbenzimidu.
   2. Usunąć PBSTG i inkubować przez noc w chłodnym pomieszczeniu z mieszaniem w roztworze przeciwciał fluorescencyjnych drugorzędowych.
   3. Usunąć przeciwciało drugorzędowe i przepłukać 2x przez 1 godzinę w PBSTG i 1x przez 1 godzinę w PBS.
   4. Pozostawić w PBS do momentu, gdy będzie gotowy do zamontowania na szkiełkach mikroskopowych (sekcja 5) i view.

Wyniki

Przedstawione tutaj są liczne rysunki pokazujące niektóre reprezentatywne wyniki, które uzyskano z wykonywania in vivo iniekcji do układu wzrokowego (Rysunek 1 i Rysunek 2), hodowla żywych wycinków mózgu i ocena ich żywotności (Rysunek 3), tworzenie ex vivo kultur wycinków mózgu i wszczepianie fluorescencyjnie znakowanych komórek metodą stempla biopsyjnego ( Rysunek 4), generowanie sferoid komórkowych poprzez hodowlę komórek na poli-HEMA (Rysunek 5), tworzenie ex vivo kokultur wycinków mózgu ze sferoidami komórek i rejestrowanie inwazyjnego zachowania komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej 4D (Rysunek 6), oraz analiza inwazyjnego zachowania komórek od sferoidów względem naczyń krwionośnych w preparatach z ustalonymi warstwami mózgu (Rysunek 7 i Rysunek 8). Wyniki te w żadnym wypadku nie są wyczerpujące, ale raczej dostarczają dobrych przykładów tego, co można uzyskać przy użyciu mózgu zarodka pisklęcia jako modelu ksenoprzeszczepu do badań nad ludzkim GBM.

Rysunek 1 pokazuje niektóre reprezentatywne wyniki guzów, które powstały w tekucie nerwu wzrokowego in vivo po wstrzyknięciu GSC wykazujących ekspresję GFP. GSC przyczepiają się do powierzchni komory i tworzą inwazyjne guzy w ścianie mózgu. Łańcuchy dostaw wyraźnie znajdują się w pobliżu naczyń krwionośnych i wydają się migrować wzdłuż nich. Filmy z obracającymi się renderami objętościowymi 3D utrwalonych i wybarwionych immunologicznie wycinków guzów GSC in vivo są podane w Dodatkowym Filmie S1, Dodatkowym Filmie S2, Dodatkowym Filmie S3 i Dodatkowym Filmie S4. W tym eksperymencie użyto czterech kolorów do identyfikacji pięciu cech (zielone GSC, białe jądra, białe naczynia krwionośne, niebieska integryna alfa-6 i czerwona Sox2 lub czerwona gniazdina).

Rysunek 2 pokazuje niektóre reprezentatywne wyniki guzów, które powstały w tektum wzrokowym in vivo po wstrzyknięciu GSC wyrażających GFP zmieszanych z komórkami U-118/L1LE² wyrażających mCherry w wyniku transdukcji wektora retrowirusowego. Eksperymenty te ujawniły, że gdy te guzy powstały z zawiesiny komórek mieszanych, sortowanie nastąpiło w taki sposób, że GSC znajdowały się albo na obrzeżach, albo w centrum, podczas gdy komórki U-118 składały się albo z wewnętrznego rdzenia, albo z zewnętrznej kory, w zależności od konkretnej linii GSC.

Rysunek 3 pokazuje wyniki żywotności kultur ex vivo wycinków mózgu. Po 1 tygodniu w hodowli, fiksacja i barwienie immunologiczne lamininy ujawniły wiele nienaruszonych naczyń krwionośnych i ekspresję Sox2, z których oba zostały tutaj użyte, aby wykazać żywotność wycinka mózgu. Wykazało to, że wycinki mózgu zarodka pisklęcia mogą być hodowane na wkładkach błonowych przez około 2 tygodnie i pozostają żywotne z normalnie wyglądającymi naczyniami krwionośnymi i ekspresją czynnika transkrypcyjnego.

Rysunek 4 pokazuje wyniki wprowadzania "zatyczek" czerwonych komórek U-118/L1LE/mCherry (zmieszanych z matrycą) do wycinków mózgu ex vivo po utworzeniu ubytków w tych wycinkach za pomocą metody stempla biopsyjnego. Komórki U-118 wyraźnie zaatakowały tkankę mózgową, czasami obszernie, a często wzdłuż naczyń krwionośnych. Jednak inwazja komórek nie była jednolita na całym obwodzie wprowadzonych komórek. Naczynia krwionośne czasami wydawały się uszkodzone lub nieobecne w niektórych wycinkach, prawdopodobnie z powodu dodatkowej traumy związanej z metodą stempla lub długością czasu w hodowli. Okazało się, że metoda stempla biopsyjnego/czopa komórkowego może być wykorzystana do wprowadzenia komórek GBM do określonych miejsc w hodowanym ex vivo wycinku mózgu, po czym komórki atakują wycinek mózgu.

Rysunek 5 pokazuje żywe sferoidy w hodowli oraz kilka przykładów fluorescencji szerokopolowej żywych sferoid komórek GBM wprowadzonych na wycinki mózgu ex vivo do eksperymentów poklatkowych. Filmy przedstawiające inwazję komórek ze sferoid do wycinka mózgu znajdują się w Filmie Uzupełniającym S5 i Filmie Uzupełniającym S6. To pokazało, że sferoidy komórkowe są kolejną skuteczną metodą wprowadzania komórek GBM lub GSC do określonych miejsc wycinka mózgu ex vivo, a inwazyjne zachowanie komórek można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnego, chociaż rozdzielczość pojedynczych komórek może być słaba.

Rysunek 6 pokazuje statyczne obrazy konfokalnych eksperymentów poklatkowych na żywo inwazji komórek GSC16-4/GFP i U-118/L1LE/mCherry na wycinki mózgu. Konfokalne obrazy stosu z użyciem osi Z były rejestrowane co 10 minut przez okres 20 godzin w wielopunktowym eksperymencie poklatkowym. Filmy przedstawiające inwazję komórek ze sferoid na wycinki mózgu wykonane jako konfokalne stosy Z w czasie są prezentowane w Filmie Uzupełniającym S7, Filmie Uzupełniającym S8, Filmie Uzupełniającym S9, Filmie Uzupełniającym S10 i Filmie Uzupełniającym S11. Eksperyment ten ujawnił, że konfokalne obrazowanie poklatkowe było lepsze niż fluorescencja szerokokątna w śledzeniu inwazyjnych zachowań poszczególnych komórek. Komórki U-118/L1LE były zauważalnie bardziej inwazyjne niż GSC w tych warunkach. Jest to nawet widoczne na statycznych obrazach, gdzie GSC są zlokalizowane bardziej centralnie, a komórki U-118 są bardziej rozproszone.

Rysunek 7 pokazuje kilka przykładów preparatów ex vivo brain slice/sferoid, gdzie dwie różne, oddzielnie znakowane sferoidy (sferoidy U-118/L1LE/mCherry i sferoidy GSC16-4/GFP) umieszczono na wycinkach mózgu, hodowano przez kilka dni, a następnie utrwalano, wybarwiono immunologicznie na lamininę i zobrazowano za pomocą sekcji optycznej pod mikroskopem konfokalnym. Okazało się, że oba typy komórek zaatakowały wycinek mózgu i przemieszczały się wzdłuż naczyń krwionośnych. Kiedy różne typy sferoid znajdowały się wystarczająco blisko, aby się ze sobą stykać, wydawało się, że inwazja jednego typu komórek w sferoidę drugiego typu komórek jest niewielka, jeśli w ogóle, a sferoidy pozostawały posegregowane.

Rysunek 8 pokazuje kilka przykładów preparatów ex vivo brain slice/sferoid, gdzie sferoidy typu "mieszanego typu komórkowego" wygenerowane w hodowli przy użyciu dwóch różnie oznakowanych typów komórek (U-118/L1LE/mCherry zmieszane z GSC16-4/GFP) zostały umieszczone na wycinkach mózgu, hodowane przez kilka dni, a następnie utrwalone, wybarwione immunologicznie na lamininę i zobrazowane przez sekcję optyczną pod mikroskopem konfokalnym. Okazało się, że czerwone komórki U-118 / L1LE / mCherry migrowały ze sferoid i rozpraszały się znacznie bardziej wyraźnie niż zielone komórki GSC16-4 / GFP, które miały tendencję do pozostawania w kępkach w pobliżu środka sferoid. Dodatkowo, komórki U-118/L1LE/mCherry zostały również wybarwione DiD, tak aby można było bezpośrednio porównać dwie oddzielne znaczniki (mCherry i DiD) w utrwalonych preparatach ex vivo. Znacznik DiD można było wykryć, nawet w pojedynczych komórkach, które zaatakowały wycinek mózgu; Było to jednak jako puncta wewnątrzkomórkowe.

Rysunek 1: Guzy w E15 wynikające z wstrzyknięcia GSC do tektum wzrokowego E5 in vivo. Certyfikaty GSC są zielone ze względu na wyrażenie GFP. Komórki GSC15-2 są pokazane w panelach A, C i E, a komórki GSC16-4 są pokazane w panelach B, D i F. (A) Widok w małym powiększeniu tektum nerwu wzrokowego z guzem w pobliżu komory (V). Barwienie Sox2 jest pokazane na czerwono, co powoduje zabarwienie większości jąder komórek OT. (B) Podobny obraz do A, ale z komórkami GSC16-4, które również są barwione na czerwono pod kątem gniazda, które mogą wydawać się żółte lub białe na obrazie z powodu mieszania kolorów i ekspozycji obrazu. Jądra OT wydają się białe z powodu barwienia przeciwstawnego bisbenzimidem. (C-F) Różne perspektywy renderowania objętości generowane z z-stacków przy użyciu obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60x. Jądra komórkowe wydają się białe z powodu barwienia bisbenzimidem, a niektóre wydają się czerwone w panelach C i E z powodu barwienia immunologicznego dla Sox2. Czerwone zabarwienie w panelach D i F pochodzi z barwienia gniazda. Należy pamiętać, że ze względu na "Alpha Blending" dla renderingów objętościowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kolory nie mieszają się tak, jak przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności, a najbardziej rozpowszechniony kolor dominuje i zasłania mniej intensywny kolor. Naczynia krwionośne są zabarwione na biało z powodu barwienia immunologicznego lamininy. Barwienie markerem GSC integryną alfa-6 jest pokazane na niebiesko i pojawia się punktowo na powierzchniach GSC. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderów objętościowych. Filmy przedstawiające obroty renderów objętościowych w panelach C-F są prezentowane w Filmie Uzupełniającym S1, Filmie Uzupełniającym S2, Filmie Uzupełniającym S3 i Filmie Uzupełniającym S4. Podziałka = 500 μm (A,B). Skróty: GSCs = glejak wielopostaciowy komórki macierzyste; OT = tectum optyczne; GFP = białko zielonej fluorescencji; BV = naczynie krwionośne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Guzy w E15 wynikające z mieszaniny komórek GSC i U-118 GBM wstrzykniętych do tektum wzrokowego E5. GSC są zielone ze względu na ekspresję GFP, a komórki U-118 / L1LE są czerwone ze względu na ekspresję mCherry. GSC15-2 są pokazane na panelach A-D, a GSC16-4 są pokazane na panelach E i F. (A) Konfokalna pojedyncza płaszczyzna Z o małym powiększeniu guza mieszanokomórkowego (strzałka) w pobliżu komory. Jądra są barwione na biało bibenzimidem. (B) Większe powiększenie (obiektyw 10x) guza pokazanego w A z inwazją czerwonych komórek U-118 do OT w pobliżu powierzchni komory. (C) Nieco odmienna płaszczyzna przekroju optycznego od tej w A pokazująca guz (strzałka) wbity głębiej w ścianę OT. (D) Maksymalna projekcja (obiektyw 20x) wielu płaszczyzn Z guza w C, pokazująca szczegóły posortowanych komórek w guzie. (E) Pojedynczy obraz w płaszczyźnie Z (obiektyw 20x) mieszanego guza z komórkami GSC16-4, pokazujący, że sortowanie w guzie nastąpiło w odwrotny sposób niż komórki GSC15-2, z zielonymi GSC tworzącymi cienką i równą korę otaczającą czerwone komórki U-118. Obszar przyczepienia guza do ściany OT nie jest pokazany w tej płaszczyźnie z. Zwróć uwagę na obszar guza, w którym występuje nieciągłość kory GSC z wybrzuszonymi komórkami U-118 / L1LE (strzałka). Barwienie immunologiczne dla L1CAM jest pokazane na niebiesko. (F) Ten sam obraz co na E, ale pokazujący tylko zielone GSC i niebieskie barwienie L1CAM. Podziałka = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Skróty: GSCs = glejak wielopostaciowy komórki macierzyste; OT = tectum optyczne; GFP = białko zielonej fluorescencji; V = komora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Żywotność wycinków tectum optycznej ex vivo po 1 tygodniu w hodowli. Plastry tektum optycznego E14 hodowano na wkładkach membranowych przez 1 tydzień, a następnie utrwalono i wybarwiono immunologicznie. W A i B pokazano obrazy konfokalne (obiektyw 10x) wycinka mózgu wybarwionego na jądra bisbenzimidem (A) i wybarwionym immunologicznie na lamininę (B), który wyraźnie pokazuje normalne, nienaruszone naczynia krwionośne optycznie pocięte w różnych konfiguracjach na skutek barwienia lamininą. (C) Obraz konfokalny podobny do pokazanego na panelach A i B, gdzie widoczne są zarówno jądra, jak i barwienie lamininą. (D) Obraz konfokalny o większym powiększeniu (60-krotny obiektyw olejowy) ukazujący szczegóły barwienia jądrowego i lamininy. (E) Maksymalny obraz projekcyjny konfokalnego stosu z (obiektyw 20x) wycinka mózgu wybarwionego na czynnik transkrypcyjny Sox2 w kolorze czerwonym i całkowitych jąder z bisbenzimidem w kolorze białym. Zauważ, że większość jąder wykazuje barwienie Sox2, jak pokazano in vivo (patrz Rysunek 1). Podziałka = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Skrót: P = powierzchnia pionowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Komórki U-118/mCherry umieszczone w wycinku mózgu ex vivo metodą stempla biopsyjnego. Potwory utworzono w wycinkach mózgu za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 1 mm, a następnie wszczepiono czerwone komórki U-118/L1LE/mCherry zmieszane z matrycą jako "zatyczkę". Po kilku dniach wycinki mózgu utrwalono, wybarwiono immunologicznie pod kątem lamininy i zamontowano na szkiełkach do analizy pod mikroskopem konfokalnym. Panele A i C pokazują konfokalne, pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z (obiektyw 4x) o małym powiększeniu, przedstawiające powstały "guz" i otaczające go komórki, które zaatakowały wycinek mózgu. (B) Render objętościowy stosu z preparacji w panelu A przy większym powiększeniu (obiektyw 20x), pokazujący rozległą inwazję komórek U-118 (strzałka). (D) Obraz pokazuje podobny render objętościowy dolnej części intensywnie atakujących komórek pokazanych na panelu C. Barwienie laminy jest pokazane na zielono, ale nie widać wyraźnych naczyń krwionośnych. (E) Obraz pokazuje część czopa komórkowego i grupę komórek, które zaatakowały wycinek mózgu, wraz z zabarwieniem lamininy dla naczyń krwionośnych na niebiesko. (F) Większe powiększenie atakujących komórek pokazanych na panelu E, a komórki można wyraźnie zobaczyć ustawione wzdłuż naczyń krwionośnych (strzałki). Wszystkie panele wykazują białe przeciwbarwienie jądrowe bibenzimidem. Podziałka = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). Skala dla paneli B i D przebiega wzdłuż osi renderowania objętościowego. Skrót: OT = optic tectum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Sferoidy żywych komórek w hodowli i obrazy fluorescencyjne o szerokim polu żywych komórek GBM w wycinkach mózgu ex vivo. Na panelach A i B pokazano obrazy z kontrastem fazowym (przy użyciu obiektywu 10x na mikroskopie odwróconym) komórek U-118/L1LE GBM (A) i GSC (B) rosnących jako sferoidy (strzałki). W tle panelu A pokazane są nieostre nierówności powłoki poli-HEMA, które mogą wystąpić na naczyniu do hodowli komórkowej. Na panelach C-F pokazano szerokopolowe obrazy fluorescencyjne sferoid komórek U-118/L1LE i komórek atakujących (strzałki) podczas eksperymentu poklatkowego w celu monitorowania na żywo zachowania inwazji w warstwach ex vivo (przy użyciu obiektywu 20x na niestandardowym systemie mikroskopu poklatkowego¹⁸). W panelach C i E komórki są barwione dalekoczerwonym fluorescencyjnym barwnikiem błonowym DiD, a w panelach D i F komórki są obrazowane za pomocą ich czerwonej ekspresji mCherry. Podziałka = 100 μm. Filmy z eksperymentów poklatkowych z fluorescencją szerokokątną pokazane na panelach C i D znajdują się odpowiednio w Filmie Uzupełniającym S5 i Filmie Uzupełniającym S6. Skróty: GBM = glejak; GSC = komórki macierzyste GBM; S = sferoida. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Obrazy poklatkowe 4D na żywo GSC i komórek GBM renderowane objętościowo. We wszystkich panelach pokazane są obrazy końcowe pięciu różnych wszczepień sferoidalnych z mieszanych komórek na oddzielnych wycinkach mózgu. W przypadku paneli A-E konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. Preparaty obejmowały wycinki mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118/L1LE/mCherry i zielonych komórek GSC16-4/GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinki mózgu hodowano na wkładkach membranowych w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej o bardzo dużej odległości roboczej (ELWD) 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Rendery objętościowe zostały wygenerowane za pomocą oprogramowania do mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Filmy poklatkowe przedstawiające te konfokalne rendery objętościowe w czasie są prezentowane w Filmie Uzupełniającym S7, Filmie Uzupełniającym S8, Filmie Uzupełniającym S9, Filmie Uzupełniającym S10 i Filmie Uzupełniającym S11. Skróty: GBM = glejak; GSC = komórki macierzyste GBM; GFP = białko zielonej fluorescencji; NA = apertura numeryczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Konfokalne obrazy nieruchomych wycinków mózgu z inwazyjnymi komórkami GBM ze sferoid różnych typów komórek. Zielone sferoidy składały się z komórek GSC16-4 / GFP, a czerwone sferoidy składały się z komórek U-118 / L1LE / mCherry. Na panelach A-F pokazano różne widoki wycinków mózgu, na których hodowano wiele czerwonych i zielonych sferoid przez kilka dni przed utrwaleniem i barwieniem immunologicznym dla lamininy (niebieski). Panele A-C są z tego samego wycinka OT, w którym A został zrobiony obiektywem 4x, a panele B i C to rendery objętościowe o większym powiększeniu (obiektyw 20x) komórek, które zaatakowały wycinek mózgu z dwóch sferoid pokazanych na panelu A. Oba typy komórek wyraźnie zaatakowały tkankę wzdłuż naczyń krwionośnych. Panel D pokazuje render objętościowy (obiektyw 20x) innego wycinka mózgu, w którym dwie różne sferoidy znajdowały się blisko siebie, a komórki z obu są widoczne migrujące wzdłuż tego samego naczynia krwionośnego, które znajduje się między nimi (strzałka). Panel E to render objętościowy o dużym powiększeniu (60-krotny obiektyw olejowy), który pokazuje, że zielone komórki migrują wzdłuż zewnętrznej powierzchni naczynia krwionośnego, podczas gdy czerwone krwinki migrują wewnątrz naczynia krwionośnego (strzałka). Wstawka pokazuje pojedynczy przekrój optyczny w płaszczyźnie z, w której czerwona krwinka jest wyraźnie otoczona niebieskim zabarwieniem naczynia krwionośnego (strzałka), a zielona komórka znajduje się wyraźnie poza naczyniem krwionośnym. Podziałka we wstawce = 50 μm. Panel F pokazuje render objętościowy (obiektyw 10x) wycinka przodomózgowia z dwoma blisko siebie przylegającymi do siebie sferoidami o różnym kolorze. Bardzo niewiele, jeśli w ogóle, inwazji komórek nastąpiło z jednej sferoidy na drugą, a między nimi istniała ostra granica. Panele A, B, C i E również pokazują białe przeciwbarwienie jądrowe bibenzimidem. Podziałka = 500 μm (A). Skale dla paneli B-F znajdują się wzdłuż osi renderowania objętościowego. Skróty: GBM = glejak; GSC = komórki macierzyste GBM; GFP = białko zielonej fluorescencji; OT = tectum optyczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Konfokalne obrazy nieruchomych wycinków mózgu z inwazyjnymi komórkami GBM z mieszanych sferoid i sferoidów oznaczonych DiD. Panele A-D pokazują rendery objętościowe wycinków mózgu, które zawierały sferoidy komórek mieszanych złożone z zielonych komórek GSC16-4 / GFP i czerwonych komórek U-118 / L1LE / mCherry. Liczne czerwone komórki U-118 rozproszyły się ze sferoid i zaatakowały wycinek mózgu we wszystkich kierunkach, podczas gdy zielone GSC nie rozproszyły się i pozostały w centralnych miejscach sferoid. Panele E i F pokazują preparat plastrów ex vivo z czerwonymi sferoidami U-118/L1LE/mCherry, również oznaczonymi dalekoczerwonym barwnikiem membranowym DiD (pokazanym jako niebieski). Po utrwaleniu plasterek został wybarwiony immunologicznie na lamininę w kolorze zielonym. Znacznik DiD był widoczny w czerwonych krwinkach jako punktowe barwienie (strzałki) i był widoczny nawet w komórkach, które rozproszyły się od sferoid wzdłuż naczyń krwionośnych. Barwienie przeciwjądrowe za pomocą bisbenzimidu nie jest pokazane na tym rysunku, aby inne barwienie było wyraźniej widoczne. Podziałka = 100 μm (E,F). Skróty: GBM = glejak; GSC = komórki macierzyste GBM; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podłoże/roztwór	Kompozycja
Nośniki GSC	1:1 mieszanina DMEM/F12, 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 15 mM buforu HEPES, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny (długopis/paciorkowiec), 2% suplementu B27 bez witaminy A i 2,5 μg/ml heparyny.
Nośniki GBM	DMEM (wysoki poziom glukozy), 10% FBS, długopis/paciorkowiec i 2 mM L-glutamina.
Bufor utrwalający	2% PFA w 0,1 M buforze kakodylanu sodu
Podłoże do zatapiania	3,5% agaru i 8% sacharozy w PBS
PBSTG powiedział:	0,1% Triton X-100 + 5% normalna surowica kozia (NGS) w PBS
Pożywka do hodowli komórkowych U-118 MG	DMEM + 10% FBS + długopis/paciorkowiec + L-glutamina
Pożywka hodowlana Brain Slice	50% MEM + 25% HBSS + 25% Surowica końska + B27 + długopis/paciorkowiec + L-glut + 15 mM bufor HEPES
wibracyjny krajalnica do tkanek do krojenia	Średni 199 + pen/strep + 15 mM bufor HEPES

Tabela 1: Skład nośników i używanych w tym protokole.

Rysunek uzupełniający 1: Wstrzyknięcie do tektum optycznego E5.(A) Po wycięciu otworu w skorupce jajka nad przestrzenią powietrzną i zwilżeniu błony przestrzeni powietrznej solą fizjologiczną lub pożywką, membranę usuwa się drobnymi kleszkami. (B) Aby wstrzyknąć komórki do tektum optycznego, owodnia jest ściskana i przytrzymywana cienkimi kleszczami, aby ustawić głowę tak, aby osłona optyczna była dostępna. Następnie mikropipetę wprowadza się do osłony optycznej i komórki są poddawane ciśnieniu wstrzykiwane do niego. (C) Po wstrzyknięciu komórek, kilka kropli roztworu ampicyliny dodaje się na zarodek za pomocą strzykawki i cienkiej igły. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Sekcja obszarów mózgu E15. (A) Po dekapitacji, głowę zarodka E15 umieszcza się w naczyniu ze sterylnym roztworem CMF. (B) Skóra pokrywająca mózg jest następnie usuwana za pomocą cienkich kleszczy. (C) Dwie kości czaszki są następnie usuwane z dwóch półkul przodomózgowia (FB). (D) Opona twarda tkanki łącznej jest następnie delikatnie usuwana z otoczenia przodomózgowia (FB), tektum nerwu wzrokowego i móżdżku. (E) Cały mózg jest następnie usuwany z głowy poprzez delikatne wyjęcie go z jamy mózgowej od spodu za pomocą zakrzywionych kleszczy. (F) Pokazano widok grzbietowy całego usuniętego mózgu z przodomózgowiem (FB), tektum wzrokowym (OT) i móżdżkiem (CB). (G) Izolowany mózg jest następnie preparowany na przodomózgowie (FB), tektum wzrokowe (OT) półkule i móżdżek (CB) za pomocą cienkich nożyczek. (H) Delikatna tkanka łączna pia jest następnie łatwo usuwana z półkul teki wzrokowej (OT) za pomocą cienkich kleszczy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Osadzanie i krojenie tektum optycznego E15 oraz rozmieszczenie sferoid komórkowych. (A) Jedna półkula tektum optycznego jest zanurzana w agarozie o niskiej temperaturze topnienia za pomocą zakrzywionych kleszczy. (B) Po stwardnieniu agarozy na lodzie, blok zawierający tectum optyczne jest przycinany i przyklejany do cokołu ze stali nierdzewnej w naczyniu/tacy do krojenia. (C) Po wyschnięciu kleju naczynie/taca do krojenia jest umieszczana w uchwycie wibrującej krajalnicy do tkanek i napełniana zimnym środkiem do krojenia. Plastry są następnie cięte nożem szafirowym z zanurzonego bloku tkanki. Pokrojone plastry będą unosić się w naczyniu/tacce i można je usunąć za pomocą szpatułki. (D) Pokrojone plastry są wyjmowane z naczynia/tacki i umieszczane bezpośrednio na wkładkach membranowych z leżącymi pod spodem pożywkami do hodowli plastrów w płytce wielodołkowej. (E) Po wyhodowaniu sferoid komórkowych na szalkach pokrytych poli-HEMA, sferoida jest usuwana z naczynia w minimalnej ilości pożywki za pomocą mikropipetora o pojemności 20 μl. (F) Wyizolowaną sferoidę umieszcza się następnie bezpośrednio na wycinku mózgu w minimalnym podłożu. (G) Jeśli sferoida spadnie z wycinka mózgu z powodu przepływu pożywki, Następnie można go wepchnąć z powrotem na plasterek mózgu za pomocą rzęsy przyklejonej do drewnianego aplikatora w sztyfcie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S1: Wideo z dużym powiększeniem objętości renderu małego guza GSC15-2 w E15. Certyfikaty GSC są zielone ze względu na wyrażenie GFP. Wideo odpowiada Rysunek 1C i pokazuje komórki GSC15-2. Film pokazuje obrót renderu objętościowego wygenerowanego ze stosu z osią Z przy użyciu obiektywu zanurzającego w oleju 60x. Jądra komórkowe wydają się białe z powodu barwienia bisbenzimidem, a niektóre wydają się czerwone z powodu barwienia immunologicznego Sox2. Należy pamiętać, że ze względu na "Alpha Blending" dla renderingów objętościowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kolory nie mieszają się tak, jak przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności, a najbardziej intensywny kolor dominuje i zasłania mniej intensywny kolor. Naczynia krwionośne są zabarwione na biało z powodu barwienia immunologicznego lamininy. Barwienie markera GSC integryną alfa-6 jest pokazane na niebiesko i pojawia się punktowo na zielonych powierzchniach GSC. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S2: Wideo z dużym powiększeniem objętości małego guza GSC16-4 w E15. Certyfikaty GSC są zielone ze względu na wyrażenie GFP. Wideo odpowiada Rysunek 1D i pokazuje komórki GSC16-4. Film pokazuje obrót renderu objętościowego wygenerowanego ze stosu z osią Z przy użyciu obiektywu zanurzającego w oleju 60x. Jądra komórkowe wydają się białe z powodu barwienia bisbenzimidem, a niektóre GSC wydają się czerwone z powodu barwienia immunologicznego gniazdyny. Należy pamiętać, że ze względu na "Alpha Blending" dla renderingów objętościowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kolory nie mieszają się tak, jak przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności, a najbardziej intensywny kolor dominuje i zasłania mniej intensywny kolor. Naczynia krwionośne są zabarwione na biało z powodu barwienia immunologicznego lamininy. Barwienie markera GSC integryną alfa-6 jest pokazane na niebiesko i pojawia się punktowo na zielonych powierzchniach GSC. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S3: Wideo z dużymi renderami objętościowymi małego guza GSC15-2 w E15. Certyfikaty GSC są zielone ze względu na wyrażenie GFP. Wideo odpowiada Rysunek 1E i pokazuje komórki GSC15-2. Film pokazuje obrót renderu objętościowego wygenerowanego ze stosu z osią Z przy użyciu obiektywu zanurzającego w oleju 60x. Jądra komórkowe wydają się białe z powodu barwienia bisbenzimidem, a niektóre wydają się czerwone z powodu barwienia immunologicznego Sox2. Należy pamiętać, że ze względu na "Alpha Blending" dla renderingów objętościowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kolory nie mieszają się tak, jak przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności, a najbardziej intensywny kolor dominuje i zasłania mniej intensywny kolor. Naczynia krwionośne są zabarwione na biało z powodu barwienia immunologicznego lamininy. Barwienie markera GSC integryną alfa-6 jest pokazane na niebiesko i pojawia się punktowo na zielonych powierzchniach GSC. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S4: Wideo z dużymi renderami objętościowymi małych guzów GSC16-4 w E15. Certyfikaty GSC są zielone ze względu na wyrażenie GFP. Wideo odpowiada Rysunek 1F i pokazuje komórki GSC16-4. Film pokazuje obrót renderu objętościowego wygenerowanego ze stosu z osią Z przy użyciu obiektywu zanurzającego w oleju 60x. Jądra komórkowe wydają się białe z powodu barwienia bisbenzimidem, a niektóre wydają się czerwone z powodu barwienia immunologicznego gniazdyny. Należy pamiętać, że ze względu na "Alpha Blending" dla renderingów objętościowych w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego, kolory nie mieszają się tak, jak przy użyciu projekcji o maksymalnej intensywności, a najbardziej intensywny kolor dominuje i zasłania mniej intensywny kolor. Naczynia krwionośne są zabarwione na biało z powodu barwienia immunologicznego lamininy. Barwienie markera GSC integryną alfa-6 jest pokazane na niebiesko i pojawia się punktowo na zielonych powierzchniach GSC. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S5: Wideo żywych komórek GBM w wycinku mózgu ex vivo. Wideo odpowiada Rysunek 5C i pokazuje szerokokątne obrazy fluorescencyjne sferoid komórek U-118/L1LE i inwazyjnych komórek podczas eksperymentu poklatkowego w celu monitorowania na żywo zachowania inwazji na wycinek ex vivo (przy użyciu obiektywu 20x na niestandardowym systemie mikroskopu poklatkowego). Komórki U-118 / L1LE wybarwiono barwnikiem membranowym DiD o barwie fluorescencyjnej dalekiej czerwieni. Zdjęcia zostały wykonane aparatem monochromatycznym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S6: Wideo żywych komórek GBM w wycinku mózgu ex vivo. Wideo odpowiada Rysunek 5D i pokazuje szerokokątne obrazy fluorescencyjne sferoid komórek U-118/L1LE i inwazyjnych komórek podczas eksperymentu poklatkowego w celu monitorowania na żywo zachowania inwazji na wycinek ex vivo (przy użyciu obiektywu 20x na niestandardowym systemie mikroskopu poklatkowego). Komórki zostały zobrazowane za pomocą ich czerwonej ekspresji mCherry. Zdjęcia zostały wykonane aparatem monochromatycznym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S7: Wideo z renderowaniem objętości obrazy konfokalnego 4D poklatkowego na żywo komórek GSC i GBM. Wideo odpowiada Rysunek 6A. Konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. Preparat składał się z wycinka mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118 / L1LE / mCherry i zielonych komórek GSC16-4 / GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinek mózgu był hodowany na wkładce membranowej w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej ELWD 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Render objętościowy został wygenerowany za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Wideo najlepiej obserwować, ręcznie przeciągając suwak postępu wideo w odtwarzaczu wideo w przód i w tył, aby obserwować ruch komórki, zamiast pozwalać odtwarzaczowi wideo na kontynuowanie z normalną niską prędkością. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S8: Wideo z renderowaniem objętości obrazy konfokalnego filmu poklatkowego 4D na żywo komórek GSC i GBM. Wideo odpowiada Rysunek 6B. Konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. Preparat składał się z wycinka mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118 / L1LE / mCherry i zielonych komórek GSC16-4 / GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinek mózgu był hodowany na wkładce membranowej w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej ELWD 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Render objętościowy został wygenerowany za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Wideo najlepiej obserwować, ręcznie przeciągając suwak postępu wideo w odtwarzaczu wideo w przód i w tył, aby obserwować ruch komórki, zamiast pozwalać odtwarzaczowi wideo na kontynuowanie z normalną niską prędkością. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S9: Wideo z renderowaniem objętości obrazy konfokalnego 4D poklatkowego na żywo komórek GSC i GBM. Wideo odpowiada Rysunek 6C. Konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. Preparat składał się z wycinka mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118 / L1LE / mCherry i zielonych komórek GSC16-4 / GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinek mózgu był hodowany na wkładce membranowej w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej ELWD 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Render objętościowy został wygenerowany za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Wideo najlepiej obserwować, ręcznie przeciągając suwak postępu wideo w odtwarzaczu wideo w przód i w tył, aby obserwować ruch komórki, zamiast pozwalać odtwarzaczowi wideo na kontynuowanie z normalną niską prędkością. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S10: Wideo z renderowaniem objętości obrazy konfokalnego 4D poklatkowego na żywo komórek GSC i GBM. Wideo odpowiada Rysunek 6D. Konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. Preparat składał się z wycinka mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118 / L1LE / mCherry i zielonych komórek GSC16-4 / GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinek mózgu był hodowany na wkładce membranowej w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej ELWD 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Render objętościowy został wygenerowany za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Wideo najlepiej obserwować, ręcznie przeciągając suwak postępu wideo w odtwarzaczu wideo w przód i w tył, aby obserwować ruch komórki, zamiast pozwalać odtwarzaczowi wideo na kontynuowanie z normalną niską prędkością. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S11: Wideo z renderowaniem objętości obrazy konfokalnego 4D poklatkowego na żywo GSC i komórek GBM. Wideo odpowiada Rysunek 6E. Konfokalne obrazy stosu z użyciem metody Z uzyskiwano w krokach co 10 μm co 10 minut przez okres 20 godzin. preparat zawierał wycinek mózgu z wszczepionymi sferoidami mieszanymi komórek czerwonych komórek U-118/L1LE/mCherry i zielonych komórek GSC16-4/GFP. Obrazy konfokalne wykonano, podczas gdy wycinek mózgu był hodowany na wkładce membranowej w 6-dołkowym plastikowym naczyniu do hodowli komórek przy użyciu soczewki obiektywowej ELWD 20x (0,45 NA), która zapewniała potrzebną dodatkową odległość roboczą. Render objętościowy został wygenerowany za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego "Alpha Blending", co daje pozorny efekt 3D. Skale mikronowe są wyświetlane wzdłuż krawędzi renderingu objętościowego. Wideo najlepiej obserwować, ręcznie przeciągając suwak postępu wideo w odtwarzaczu wideo w przód i w tył, aby obserwować ruch komórki, zamiast pozwalać odtwarzaczowi wideo na kontynuowanie z normalną niską prędkością. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole wstrzykiwania komórek do komory śródmózgowia (optic tectum) obejmują nieuszkadzanie naczyń krwionośnych w błonie kosmówkowo-omoczniowej w komórce jajowej lub otaczającej zarodek przed i podczas wstrzyknięcia, chociaż błonę owodniową bezpośrednio otaczającą zarodek można delikatnie pociągnąć i przytrzymać, aby ustawić głowę podczas wstrzykiwania komórek do śródmózgowia. Owodnia jest stosunkowo twarda i można ją ciągnąć cienkimi kleszczami, aby ustawić głowę i przytrzymać ją stabilnie jedną ręką, w celu wstrzyknięcia komórek drugą ręką do tektum wzrokowego, które jest dużą, okrągłą strukturą w środku mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, żywotność wstrzykniętych zarodków waha się od 25% do 75%, w zależności od nieznanych czynników, a praktycznie każdy zarodek, który przeżyje, zawiera co najmniej mały guz w tektum wzrokowym. Kluczowe kroki w generowaniu żywotnych wycinków mózgu obejmują osuszanie tkanki z nadmiaru płynu, tak aby agaroza przylegała do mózgu podczas krojenia oraz utrzymywanie tkanki i plastrów w niskiej temperaturze, dopóki nie zostaną umieszczone na wkładce membranowej. Ponieważ różne typy komórek tworzą sferoidy w różny sposób (pod względem szybkości i wielkości), gęstość komórek posianych na płytkach poli-HEMA oraz czas przed zbiorem sferoid powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek.

Praca w tym miejscu nie została poddana formalnemu badaniu podłużnemu żywotności wycinków mózgu. Yang i wsp. użyli kultur wycinków mózgu zarodków piskląt podobnych do tych użytych tutaj i wykazali dobrą żywotność wycinków przez co najmniej 7 dni¹⁶. Wcześniejsze prace wykazały, że gdy tkanka OT była przechowywana w nieoptymalnym podłożu, w tkance pojawiło się wiele jąder piknotycznych , które nie wystąpiły w wycinkach w niniejszej pracy. Dodatkowo, gdy plastry degenerują się w nieoptymalnych warunkach, naczynia krwionośne rozpadają się i pojawiają się jako rzędy kulek lamininowo-dodatnich (nie pokazano). Tak więc, chociaż żywotność w tym przypadku nie została sprawdzona metodami takimi jak elektrofizjologia lub aktywna ekspresja kaspazy-3, nie pojawił się tutaj żaden ze wskaźników śmierci komórki, które zaobserwowano w nieoptymalnych warunkach hodowli.

OT został skoncentrowany w eksperymentach in vivo z guzem mózgu, ponieważ jest to najłatwiejszy do wstrzyknięcia region z największą komorą. W E5, czyli w ostatnim dniu, w którym zarodek jest wystarczająco mały, aby pozostać dostępny na wierzchu żółtka, należy wykonać wstrzyknięcia do komory, ponieważ wszystkie obszary mózgu są niczym więcej niż cienką strefą komorową. Niemniej jednak zastrzyki te z powodzeniem skutkują osadzonymi guzami z komórkami, które atakują miąższ mózgu. Czasami powstałe guzy znajdują się w przodomózgowiu lub móżdżku, ale nie jest to powszechne. Warstwy ex vivo tektum optycznego E15 zostały tutaj wykorzystane przede wszystkim do eksperymentów, tak aby wyniki wspólnej hodowli ex vivo można było skorelować z eksperymentami z iniekcjami in vivo . Jednak plastry przodomózgowia są również odpowiednie i mają większą powierzchnię i bardzo cienką komorę w porównaniu z tektum nerwu wzrokowego, co może sprawić, że przodomózgowie będzie bardziej odpowiednie dla kokultur ex vivo , które nie są skorelowane z zastrzykami in vivo .

Wykazano tutaj, że wstrzyknięcia in vivo , a następnie utrwalenie tkanki, wibracyjne cięcie fragmentatora tkanek i barwienie immunologiczne lamininy i innych markerów, dały w wyniku obrazy o wysokiej rozdzielczości komórek GBM i GSC w tkance mózgowej w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych. Możliwość określenia wzajemnych relacji między komórkami nowotworowymi a naczyniami krwionośnymi została znacznie ułatwiona dzięki tworzeniu renderów objętościowych 3D z z-stosów konfokalnych sekcji optycznych przy użyciu oprogramowania konfokalnego i instrukcji producenta. Możliwe było obrazowanie poklatkowe przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej komórek znakowanych GFP, mCherry i DiD; Jednak migrujące komórki, które znajdowały się w bliskiej odległości od wysoce fluorescencyjnych sferoid, były czasami przesłonięte przez "poświatę" sferoidy. Ten niepożądany efekt można nieco zminimalizować, ostrożnie dostosowując czasy naświetlania do zbierania obrazów szerokokątnych. Obrazowanie poklatkowe przy użyciu konfokalnych stosów z w czasie (4D) wyeliminowało nieostrą poświatę sferoid i zaowocowało ostro zarysowanymi migrującymi komórkami z ciemnym tłem. Nie zostało to opisane w protokole, ale zostało przeprowadzone podobnie do obrazowania poklatkowego w szerokim polu, które wykonano, gdy wycinki mózgu znajdowały się na przezroczystych wkładkach membranowych w 6-dołkowej plastikowej płytce. Chociaż konfokalne obrazowanie poklatkowe daje znacznie wyraźniejsze obrazy pojedynczych komórek i ich zachowania, wielopunktowy eksperyment poklatkowy zbierający stosy z 10 płaszczyznami z / punkt, w odstępach 10 minut w okresie 20 godzin, jest szerokim zastosowaniem galwanometrów z głowicą skanującą. Ponieważ może to znacznie skrócić żywotność galwanometrów, metoda ta jest stosowana rozsądnie.

Chociaż system zarodków piskląt jest bardzo odpowiedni zarówno do iniekcji in vivo , jak i eksperymentów z kokulturą ex vivo , które badają zachowanie komórek GBM, istnieje kilka ograniczeń tego systemu modelowego. Podobnie jak w przypadku każdego systemu ksenoprzeszczepu, środowiskiem, w którym wszczepiane są ludzkie komórki, nie jest ludzki mózg, ale zachowanie komórek GBM wydaje się naśladować to w modelach gryzoni i u ludzi. Po przeprowadzeniu eksperymentów in vivo z wstrzyknięciem E5, guzy zwykle mogą się tworzyć przez 10 dni, aż do E15. To zdecydowanie za mało czasu, aby zbadać wszystkie aspekty nowotworzenia i inwazji komórek. Jednak tutaj wykazano, że guzy lite tworzą się w miąższu mózgu, komórki oddziałują i przegrupowują się w obrębie guza, a znaczna inwazja mózgu następuje zarówno wzdłuż naczyń krwionośnych, jak i rozlanie w tym stosunkowo krótkim czasie. Innym ograniczeniem systemu zarodków piskląt in vivo jest to, że nie nadaje się on do leczenia farmakologicznego lub innego leczenia ze względu na duże żółtko i pozazarodkowy układ krążenia, który działa podczas rozwoju zarodka pisklęcia. Miejscowe leczenie płynnymi lekami skutkowałoby bardzo zmiennym i nieznanym stężeniem w mózgu z powodu dyfuzji z zarodka do znacznie większej masy żółtka. Podobnie, dożylne wstrzyknięcie leków do bardzo delikatnego pozaembrionalnego układu krążenia wyciekłoby lub rozlałoby się z naczyń krwionośnych, a także spowodowałoby nieznane stężenia w mózgu. Jest to jeden z głównych powodów, dla których przyjęto metodę hodowli warstwowej ex vivo - nie tylko po to, aby można było obserwować i śledzić zachowanie komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej, ale także po to, aby terapie, które odniosły sukces w zmianie zachowania komórek GBM w naczyniu⁴ , mogły być testowane w bardziej odpowiednim środowisku tkanki mózgowej.

Opracowanie ortotopowego systemu modelowania guza mózgu u zarodka pisklęcia jest postrzegane jako znaczące uzupełnienie systemów i narzędzi dostępnych do badania powstawania guza GBM i inwazyjnego zachowania komórek. Zapłodnione jaja kurze są prawdopodobnie łatwo dostępne na większości obszarów, są niedrogie w porównaniu z gryzoniami, nie ma kosztów opieki nad zwierzętami, zarodki są bardzo odporne i odporne na infekcje (tj. większość pracy wykonuje się na stole laboratoryjnym), zarodki są wysoce podatne na manipulację i mogą być hodowane w kulturze bez skorupy¹⁹, a zarodki piskląt nie są uważane za kręgowce, a zatem nie wymagają zatwierdzenia przez IACUC zgodnie z wytycznymi NIH (wymagania instytucjonalne może się różnić). Tak więc te liczne zalety sprawiają, że system zarodków piskląt jest bardzo atrakcyjny, jeśli ograniczy się pytania i eksperymenty do tych, które mieszczą się w jego ograniczeniach. Wiele badań na komórkach GBM zostało przeprowadzonych przez innych przy użyciu zarodka pisklęcia, ale prawie wyłącznie wykorzystywano błonę kosmówkowo-omocznikową (CAM) zarodka 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 i zawiązek kończyny 30, a nie mózg. Pojawiły się również doniesienia o wszczepieniu rdzeniaka zarodkowego do mózgu pisklęcia na E2³¹. Niewątpliwie, wykorzystanie zarodka pisklęcia jako ortotopowego systemu modelowego ksenoprzeszczepu, jak opisano tutaj, powinno przynieść wyniki, które są znacznie bardziej znaczące dla biologii ludzkiego guza GBM niż badania z użyciem CAM.

Chociaż badania te dopiero zaczęły w pełni wykorzystywać system modelowy guza mózgu zarodka pisklęcia do badań nad ludzkimi komórkami GBM i zachowaniem GSC, istnieje nadzieja, że inni rozszerzą zastosowania i znajdą dalsze potencjalne zastosowania. Można sobie wyobrazić, że system ten nie tylko odkryje mechanizmy regulujące powstawanie guza GBM i zachowanie komórek, ale także umożliwi przedkliniczne testowanie określonych leków i substancji na komórkach konkretnych pacjentów. Na przykład, jeśli hodowle wycinków mózgu zostały ustawione z wyprzedzeniem, wówczas komórki nowotworowe, fragmenty chirurgicznych resekcji guza lub organoidy GBM pochodzące od pacjenta³² można by umieścić bezpośrednio w kokulturze ex vivo , a różne terapie można by ocenić w ciągu kilku dni. Podobnie, zdysocjowane komórki pacjenta mogą być wstrzykiwane bezpośrednio do śródmózgowia E5 in ovo , aby ocenić ich zdolność do tworzenia guzów i atakowania miąższu mózgu. W związku z tym istnieje nadzieja, że opisy metod i reprezentatywne wyniki ułatwią i zachęcą do zwiększonego wykorzystania tego wysoce niewykorzystanego systemu do badań nad rakiem mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dziurkacz do papieru o wymiarach kwadratowych 1 cm x 1 cm	Birabira	N/A
1 mm Dziurkacz do biopsji	Robbins Instruments	20335
6-dołkowa płytka (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9-calowe jednorazowe pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20C
15 ml probówki wirówkowe	Fisher Scientific	05-539-12
Płytka 24-dołkowa	Corning Costar	3526
50 ml probówki wirówkowe	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	do osadzania stałych mózgów
Alexafluor 488-sprzężony GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-sprzężony GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-146
Folia aluminiowa	ReynoldsWrap	N/A
Ampicillin	Sigma Aldrich	A-9518
antyintegryna alfa-6 przeciwciało monoklonalne GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
przeciwciało monoklonalne anty-L1CAM UJ127	Santa Cruz Biotechnology	SC-53386
antylaminina przeciwciało monoklonalne	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	3H11
anty-nestinowe przeciwciało monoklonalne 10c2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
przeciwciało monoklonalne anty-Sox2 E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 suplement bez witaminy A	GIBCO	17504-044
bisbenzimid (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	plama jądrowa
Inkubator do hodowli komórkowych	Forma		standardowy nawilżany inkubator CO2
Wirówka	Beckman Coulter
	Nikon Instruments	C2si +	Z wykonaną na zamówienie komorą inkubatora komórkowego
Mikroskop konfokalny soczewki obiektywowe	Nikon Instruments		Soczewki Plan Apo, z wyjątkiem S Obiektyw obiektywowy Plan Fluor ELWD 20x 0,45 NA do konfokalnego obrazowania poklatkowego
Oprogramowanie mikroskopu konfokalnego	Nikon Instruments	NIS Elements	Wersja 5.2
Zakrzywione forecepsy	Światowe instrumenty precyzyjne	504478
Zakrzywione nożyczki	Narzędzia
precyzyjnej Zakrzywiona szpatułka	Fisher Scientific	14-375-20
Klej cyjanoakrylowy	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270
DiD far red fluorescencyjny barwnik	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy Dulbecco:	inkubator jaj Sigma Aldrich	P5493-1L
	Humidaire
(grubość 10 mil / 254 i mikro; m)	Scotch	N/A
Etanol 200 proof	Decon Laboratories	2701
Szybki zielony barwnik FCF	Chemikalia badawcze awokado	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
	Fisher Scientific
Gauze	Dynarex	3353
Szklane kapilary do mikroiniekcji	World Precision Instruments	TW100-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP228-1	do mocowania pożywek
GSC (ludzkie komórki macierzyste glejaka)	Nie dotyczy		Wyizolowany z próbek GBM pacjenta w laboratorium Galileo w pożywce GSC, a następnie transdukowany wektorem lentiwirusowym kodującym GFP.  Użyte komórki znajdowały się między pasażem 10 a 30.
Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacytometr	Hausser scientific
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
Bufor HEPES	Sigma Aldrich	H0887
Surowica konia (HI)	Gibco	26050-088
Człowiek FGF-2	BioVision	4037-1000
Ludzki TGF-&alfa;	BioVision	4339-1000
Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą	Nikon Instruments	TMS	do rutynowego oglądania hodowanych komórek
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Film laboratoryjny	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pióro:Strep	Gemini Bio-products	400-110
Niskotopliwa agaroza	Fisher Scientific	BP1360	do osadzania żywych mózgów
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metalowy blok
Końcówki do mikropipet (20, 200, 1 000 i mikro; L)	Mikropipety Fisherbrand
(20, 200, 1,000 i mikro; L)
(grubość nr 1,5)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Normalna kozia surowica	Millipore Sigma	526-M
N-propyl galusan	Sigma Aldrich	P3130	do montażu mediów
Parafilm	Parafilm Paraformaldehyd
	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Ołówek
Zwykłe szkiełka mikroskopowe	Fisherbrand	12-550-A3
Plastikowa szalka Petriego 35 mm		Becton Dickinson
	Świat Precyzyjne Instrumenty	PV830
Poli(2-hydroksyetylometakrylan)  (poli-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
żyletka - dwukrawędziowa	PACE		do cięcia stałych plasterków mózgu
nóż szafirowy	Diamond Knives		do cięcia żywych plasterków mózgu
Skalpel	TruMed	1001
Bufor kakodylanu sodu 0,2 M pH 7,4	Mikroskopia elektronowa Sciences	11652
Komora na próbki do wibratom	wykonany na zamówienie
Stereofoniczny mikroskop preparacyjny	Instrumenty Nikon	SMZ1500	Wyposażony w epifluorescencyjne
proste forecepsy	Świat Precyzyjne instrumenty	500233
proste nożyczki	Narzędzia
o sacharozie	Mallinckrodt	7723
Fluorescencja poklatkowa mikroskop (fluorescencja szerokokątna)	Instrumenty Nikon	TE2000-E	Z wykonaną na zamówienie komorą inkubatora komórkowego (patrz Fotos et al., 2006)
Naczynie do hodowli tkankowych polistyren 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	do hodowli komórkowych
Naczynie do hodowli tkankowych polistyren 60 mm	Becton Dickinson	353004	do hodowli komórek
Pipeta transferowa	American Central Scientific Co.	FFP011
Przezroczysta taśma	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Trypsyna (0,25%) + 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG ludzka linia komórkowa GBM	ATCC	HTB-15	Komórki transdukowano wektorem lentiwirusowym kodującym całą sekwencję ektodomenową białka adhezyjnego L1CAM, a następnie wektorem lentiwirusowym pUltra-gorące kodowanie mCherry.  Numery przejazdów nie są znane.
Pompa próżniowa	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Wibracyjna krajalnica do tkanek	Vibratome	3000	do cięcia żywych i nieruchomych plastrów mózgu

Długopis do biopsji Mikroskop konfokalny do nauki Taśma izolacyjna Bibuła filtracyjna wibratomu Szkło nakrywkowe mikroskopu Gilson Pneumatyczna pompa pikopump 351008 Delaware do nauki