Przepływ pracy w celu optymalizacji formułowania nanocząstek lipidowych (LNP) przy użyciu zaprojektowanych eksperymentów z procesem mieszaniny i samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)

Summary

Ten protokół zapewnia podejście do optymalizacji receptur w stosunku do czynników badania mieszanego, ciągłego i kategorycznego, które minimalizuje subiektywne wybory w konstrukcji eksperymentalnego projektu. W fazie analizy stosowana jest skuteczna i łatwa w użyciu procedura modelowania dopasowania.

Abstract

Prezentujemy podejście do optymalizacji preparatów nanocząsteczek lipidowych (LNP) w stylu Quality by Design (QbD), mające na celu zaoferowanie naukowcom przystępnego przepływu pracy. Nieodłączne ograniczenie w tych badaniach, w których proporcje molowe lipidów jonizowalnych, pomocniczych i PEG muszą sumować się do 100%, wymaga specjalistycznych metod projektowania i analizy, aby dostosować się do tego ograniczenia mieszaniny. Koncentrując się na czynnikach lipidowych i procesowych, które są powszechnie stosowane w optymalizacji projektu LNP, zapewniamy kroki, które pozwalają uniknąć wielu trudności, które tradycyjnie pojawiają się w projektowaniu i analizie eksperymentów z procesem mieszania, stosując projekty wypełniające przestrzeń i wykorzystując niedawno opracowane ramy statystyczne samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM). Oprócz tworzenia optymalnych receptur, przepływ pracy tworzy również graficzne podsumowania dopasowanych modeli statystycznych, które upraszczają interpretację wyników. Nowo zidentyfikowane preparaty kandydujące są oceniane za pomocą serii potwierdzających i opcjonalnie mogą być przeprowadzane w kontekście bardziej kompleksowego badania drugiej fazy.

Introduction

Preparaty nanocząsteczek lipidowych (LNP) dla systemów dostarczania genów in vivo zazwyczaj zawierają cztery składniki lipidów z kategorii lipidów jonizowalnych, pomocniczych i PEG^1,2,3. Niezależnie od tego, czy lipidy te są badane samodzielnie, czy jednocześnie z innymi czynnikami niebędącymi mieszaniną, eksperymenty dla tych preparatów wymagają projektów "mieszanin", ponieważ - biorąc pod uwagę proponowaną formułę - zwiększenie lub zmniejszenie stosunku któregokolwiek z lipidów nieuchronnie prowadzi do odpowiedniego spadku lub wzrostu sumy stosunków pozostałych trzech lipidów.

Dla ilustracji przypuszcza się, że optymalizujemy formułę LNP, która obecnie korzysta z ustalonej receptury, która będzie traktowana jako punkt odniesienia. Celem jest maksymalizacja siły działania LNP, przy jednoczesnym wtórnym dążeniu do zminimalizowania średniej wielkości cząstek. Czynniki badane, które są zróżnicowane w eksperymencie, to stosunki molowe czterech lipidów składowych (jonizowalnych, cholesterolu, DOPE, PEG), stosunek N:P, szybkość przepływu i typ lipidów jonizowalnych. Lipidy jonizowalne i pomocnicze (w tym cholesterol) mogą zmieniać się w szerszym zakresie stosunku molowego, 10-60%, niż PEG, który będzie się wahał od 1 do 5% na tej ilustracji. Receptura wzorca i zakresy pozostałych czynników oraz stopień ich zaokrąglenia są określone w pliku uzupełniającym 1. W tym przykładzie naukowcy są w stanie wykonać 23 serie (unikalne partie cząstek) w ciągu jednego dnia i chcieliby użyć tego jako wielkości próbki, jeśli spełnia ona minimalne wymagania. Symulowane wyniki tego eksperymentu znajdują się w pliku uzupełniającym 2 i pliku uzupełniającym 3.

Rampado i Peer⁴ opublikowali niedawno artykuł przeglądowy na temat eksperymentów projektowanych w celu optymalizacji systemów dostarczania leków opartych na nanocząsteczkach. Kauffman et al.⁵ rozważali badania optymalizacyjne LNP przy użyciu ułamkowych czynników i ostatecznych projektów przesiewowych⁶; Jednak tego typu projekty nie mogą dostosować się do ograniczenia mieszanki bez uciekania się do nieefektywnych "zmiennych zapasu czasu"⁷ i nie są zwykle używane, gdy występują czynniki mieszanki7^,8. Zamiast tego, "optymalne projekty" zdolne do uwzględnienia ograniczenia mieszaniny są tradycyjnie używane do eksperymentów z procesem mieszania⁹. Projekty te są ukierunkowane na określoną przez użytkownika funkcję badanych czynników i są optymalne (w jednym z wielu możliwych znaczeń) tylko wtedy, gdy funkcja ta ujmuje prawdziwy związek między badanymi czynnikami a odpowiedziami. Należy zauważyć, że w tekście istnieje rozróżnienie między "optymalnymi projektami" a "optymalnymi kandydatami na receptury", przy czym te ostatnie odnoszą się do najlepszych receptur zidentyfikowanych przez model statystyczny. Optymalne projekty mają trzy główne wady w eksperymentach z procesem mieszania. Po pierwsze, jeśli naukowiec nie przewidzi interakcji czynników badania podczas określania modelu docelowego, wówczas uzyskany model będzie tendencyjny i może wytworzyć gorsze preparaty kandydujące. Po drugie, optymalne projekty umieszczają większość przebiegów na zewnętrznej granicy przestrzeni czynnika. W badaniach LNP może to prowadzić do dużej liczby utraconych przebiegów, jeśli cząstki nie tworzą się prawidłowo w jakichkolwiek ekstremalnych ustawieniach lipidów lub procesu. Po trzecie, naukowcy często wolą przeprowadzać eksperymenty we wnętrzu przestrzeni czynników, aby uzyskać niezależne od modelu wyczucie powierzchni odpowiedzi i obserwować proces bezpośrednio w wcześniej niezbadanych obszarach przestrzeni czynników.

Alternatywną zasadą projektowania jest dążenie do przybliżonego równomiernego pokrycia przestrzeni czynnika (ograniczonego przez mieszankę) za pomocą projektu wypełniającego przestrzeń¹⁰. Projekty te poświęcają pewną wydajność eksperymentalną w stosunku do projektów optymalnych⁹ (zakładając, że cała przestrzeń czynników prowadzi do prawidłowych formuł), ale oferują kilka korzyści w kompromisie, które są przydatne w tym zastosowaniu. Projekt wypełniający przestrzeń nie przyjmuje żadnych apriorycznych założeń dotyczących struktury powierzchni odpowiedzi; Daje to elastyczność w wychwytywaniu nieprzewidzianych zależności między badanymi czynnikami. Usprawnia to również generowanie projektu, ponieważ nie wymaga podejmowania decyzji o tym, które warunki regresji dodać lub usunąć w miarę dostosowywania żądanego rozmiaru przebiegu. Gdy niektóre punkty projektowe (receptury) prowadzą do nieudanych receptur, projekty wypełniające przestrzeń umożliwiają modelowanie granicy niepowodzenia nad czynnikami badania, jednocześnie wspierając modele statystyczne dla odpowiedzi badania na udane kombinacje czynników. Wreszcie, wewnętrzne pokrycie przestrzeni czynników pozwala na niezależną od modelu graficzną eksplorację powierzchni odpowiedzi.

Aby zobrazować podprzestrzeń czynnika mieszaniny w eksperymencie z procesem mieszania, używane są wyspecjalizowane trójkątne "wykresy trójskładnikowe". Rysunek 1 motywuje to użycie: w sześcianie punktów, gdzie każdy z trzech składników może mieć zakres od 0 do 1, punkty, które spełniają ograniczenie, że suma składników jest równa 1, są podświetlone na czerwono. Ograniczenie mieszaniny dla trzech składników redukuje możliwą przestrzeń czynników do trójkąta. W zastosowaniach LNP z czterema składnikami mieszaniny tworzymy sześć różnych wykresów trójskładnikowych, aby reprezentować przestrzeń czynników, wykreślając dwa lipidy jednocześnie na osi "Inne", która reprezentuje sumę innych lipidów.

Rysunek 1: Trójkątne regiony czynnika. Na wykresie wypełniającym przestrzeń w module małe szare kropki reprezentują formuły, które są niespójne z ograniczeniem mieszaniny. Większe czerwone punkty leżą na trójkącie wpisanym w sześcian i reprezentują preparaty, dla których spełnione jest ograniczenie mieszaniny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oprócz czynników mieszaniny lipidów, często występuje jeden lub więcej czynników ciągłego procesu, takich jak stosunek N:P, stężenie bufora lub szybkość przepływu. Mogą być obecne czynniki kategoryczne, takie jak jonizowalny typ lipidów, typ lipidów pomocniczych lub typ buforowy. Celem jest znalezienie preparatu (mieszaniny lipidów i ustawień dla czynników procesowych), który maksymalizuje pewną miarę siły działania i/lub poprawia właściwości fizykochemiczne, takie jak minimalizacja wielkości cząstek i PDI (wskaźnik polidyspersyjności), maksymalizacja procentowej enkapsulacji i minimalizacja skutków ubocznych - takich jak utrata masy ciała - w badaniach in vivo. Nawet jeśli zaczynasz od rozsądnej receptury wzorcowej, może pojawić się zainteresowanie ponowną optymalizacją, biorąc pod uwagę zmianę obciążenia genetycznego lub biorąc pod uwagę zmiany w czynnikach procesu lub typach lipidów.

Cornell⁷ dostarcza wyczerpujący tekst na temat statystycznych aspektów mieszanin i eksperymentów z procesem mieszania, a Myers et al.⁹ dostarcza doskonałego podsumowania najbardziej istotnych tematów dotyczących projektowania i analizy mieszanin do optymalizacji. Prace te mogą jednak przeciążać naukowców szczegółami statystycznymi i specjalistyczną terminologią. Nowoczesne oprogramowanie do projektowania i analizy eksperymentów zapewnia solidne rozwiązanie, które w wystarczającym stopniu obsłuży większość problemów optymalizacyjnych LNP bez konieczności odwoływania się do odpowiedniej teorii. Podczas gdy bardziej skomplikowane lub o wysokim priorytecie badania nadal będą korzystać ze współpracy ze statystykiem i mogą wykorzystywać optymalne, a nie wypełniające przestrzeń projekty, naszym celem jest poprawa poziomu komfortu naukowców i zachęcanie do optymalizacji preparatów LNP bez odwoływania się do nieefektywnych testów jednoczynnikowych na raz (OFAT)¹¹ lub po prostu zadowalania się pierwszą formułą, która spełnia specyfikacje.

W tym artykule przedstawiono przepływ pracy, który wykorzystuje oprogramowanie statystyczne do optymalizacji ogólnego problemu z formułowaniem LNP, rozwiązując problemy związane z projektowaniem i analizą w kolejności, w jakiej zostaną napotkane. W rzeczywistości metoda ta sprawdzi się w przypadku ogólnych problemów optymalizacyjnych i nie ogranicza się do LNP. Po drodze omówiono kilka często pojawiających się pytań i przedstawiono zalecenia, które są oparte na doświadczeniu i wynikach symulacji¹². Niedawno opracowana struktura samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)¹³ znacznie poprawiła skądinąd kruche podejście do analizy wyników eksperymentów z procesem mieszania i wykorzystujemy to podejście, aby zapewnić uproszczoną strategię optymalizacji receptur. Podczas gdy przepływ pracy jest skonstruowany w ogólny sposób, który można śledzić za pomocą innych pakietów oprogramowania, JMP 17 Pro jest wyjątkowy, ponieważ oferuje SVEM wraz z graficznymi narzędziami podsumowującymi, które uznaliśmy za niezbędne do uproszczenia tajemniczej analizy eksperymentów w procesie mieszania. W związku z tym w protokole znajdują się również instrukcje specyficzne dla JMP.

SVEM wykorzystuje ten sam model regresji liniowej, co tradycyjne podejście, ale pozwala nam uniknąć żmudnych modyfikacji, które są wymagane do dopasowania "pełnego modelu" efektów kandydujących, stosując albo selekcję do przodu, albo podejście bazowe z karą selekcji (Lasso). Ponadto SVEM zapewnia ulepszone dopasowanie "zredukowanego modelu", które minimalizuje możliwość uwzględnienia szumu (proces plus wariancja analityczna), który pojawia się w danych. Jego działanie polega na uśrednianiu przewidywanych modeli wynikających z wielokrotnego ważenia względnej ważności każdego przebiegu w modelu^{13,14,15,16,17,18}. SVEM zapewnia ramy do modelowania eksperymentów w procesie mieszania, które są zarówno łatwiejsze do wdrożenia niż tradycyjna regresja jednostrzałowa, jak i dają lepszej jakości optymalnych kandydatów na receptury^12,13. Matematyczne szczegóły SVEM wykraczają poza zakres tego artykułu i nawet pobieżne podsumowanie wykraczające poza odpowiedni przegląd literatury odwróciłoby uwagę od jego głównej zalety w tej aplikacji: umożliwia prostą, solidną i dokładną procedurę "kliknij, aby uruchomić" dla praktyków.

Prezentowany przepływ pracy jest zgodny z podejściem Quality by Design (QbD)¹⁹ do rozwoju farmaceutycznego²⁰. Wynikiem badania będzie zrozumienie zależności funkcjonalnej, która łączy atrybuty materiału i parametry procesu z krytycznymi atrybutami jakości (CQA)²¹. Daniel et al.²² dyskutują o użyciu frameworka QbD specjalnie do produkcji platformy RNA: nasz przepływ pracy może być używany jako narzędzie w tym frameworku.

Protocol

Eksperyment opisany w sekcji Reprezentatywne wyniki został przeprowadzony zgodnie z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez nasz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). 6-8 tygodniowe samice myszy Balb/C zostały pozyskane komercyjnie. Zwierzęta otrzymywały standardową karmę i wodę ad libitum i były trzymane w standardowych warunkach z 12-godzinnymi cyklami światła/ciemności, w temperaturze 65-75 °F (~18-23 °C) przy wilgotności 40-60%.

1. Rejestrowanie celu badania, odpowiedzi i czynników

UWAGA: W całym tym protokole, JMP 17 Pro jest używany do projektowania i analizy eksperymentu. Równoważne oprogramowanie można użyć po wykonaniu podobnych kroków. Przykłady i dalsze instrukcje dotyczące wszystkich kroków wykonanych w sekcji 1 znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

1. Podsumuj cel eksperymentu w dokumencie z datownikiem.
2. Wymień odpowiedzi podstawowe (CQA), które będą mierzone podczas eksperymentu.
3. Wymień wszelkie wtórne reakcje (np. dalsze ograniczenia właściwości fizykochemicznych), które mogą być mierzone.
4. Wymień parametry procesu, które mogą być powiązane z odpowiedziami, w tym te, które są najbardziej istotne dla celu badania.
5. Jeśli badanie będzie trwało przez wiele dni, uwzględnij kategoryczny czynnik "blokujący" w ciągu dnia.
   UWAGA: Równoważy to ustawienia czynników w ciągu dni, aby zapobiec pomyleniu zmian na poziomie dnia w średniej procesu z czynnikami badania.
6. Wybierz czynniki, które mają być zróżnicowane i te, które mają być utrzymywane na stałym poziomie podczas badania.
   UWAGA: Użyj narzędzi do priorytetyzacji ryzyka, takich jak analizy skutków trybu awarii²⁰, aby wybrać najbardziej odpowiedni podzbiór czynników (Rysunek 2). Zwykle wszystkie lipidy powinny się różnić; chociaż w niektórych przypadkach ograniczonych budżetowo rozsądne jest zablokowanie PEG na stałym współczynniku.
7. Ustal zakresy dla różnych czynników i odpowiednią dokładność dziesiętną dla każdego z nich.
8. Zdecyduj o wielkości projektu badania (liczbie unikalnych partii cząstek), korzystając z minimalnej i maksymalnej heurystyki. Ręcznie dołączone przebiegi kontrolnego testu porównawczego nie są wliczane do rozmiaru przebiegu zalecanego przez heurystykę.
   UWAGA: Poniższe heurystyki zakładają, że odpowiedzi są ciągłe. Minimalna heurystyka zakłada, że w razie potrzeby możliwe będzie przeprowadzenie badania uzupełniającego, a także przeprowadzenie przebiegów potwierdzających dla potencjalnych optymalnych preparatów. Jeśli możliwe będzie tylko wykonanie przebiegów potwierdzających, lepiej jest uwzględnić w budżecie liczbę przebiegów uzyskanych z maksymalnej heurystyki. W przypadku binarnych odpowiedzi podstawowych zwróć się o pomoc do statystyka w celu określenia odpowiedniej liczby przebiegów.
   1. Minimalna heurystyka: Przydziel trzy przebiegi na współczynnik mieszaniny, dwa na ciągły czynnik procesu i jeden na poziom każdego czynnika jakościowego.
      UWAGA: W przypadku badania z czterema czynnikami lipidowymi, dwoma ciągłymi i jedną trójdrożną zmienną kategoryczną procesu prowadzi to do sugestii (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 przebiegów wypełniających przestrzeń. Dodaj dodatkowe przebiegi, jeśli istnieje prawdopodobieństwo, że niektóre z nich zakończą się niepowodzeniem z powodu problemów z formułowaniem lub pomiarem.
   2. Maksymalna heurystyka: Uruchom oprogramowanie do tworzenia optymalnych projektów i wprowadź wymagane parametry dla drugiego rzędu (w tym efekty główne, dwukierunkowe interakcje między wszystkimi efektami i efekty kwadratowe dla ciągłych czynników procesu). Oblicz minimalny rozmiar serii zgodnie z algorytmem oprogramowania. Dodaj 1 do wyniku uzyskanego z oprogramowania, aby zdefiniować maksymalną heurystykę.
      UWAGA: Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 1, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące wykonywania tych kroków. Przykładowy przypadek z czterema czynnikami lipidowymi, dwiema ciągłymi i jedną trójdrożną kategoryczną zmienną procesową, prowadzi do zalecanej wielkości serii 34 (33 z zalecenia oprogramowania + 1). Wszelkie przebiegi wykraczające poza ten zakres byłyby prawdopodobnie lepiej wykorzystane do badań potwierdzających lub uzupełniających.

Rysunek 2: Diagram przyczynowo-skutkowy. Diagram przedstawia typowe czynniki powodujące problem z optymalizacją receptury LNP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Tworzenie tabeli projektowej z projektem wypełniającym przestrzeń

1. Otwórz JMP i przejdź na pasku menu do DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Wprowadź odpowiedzi udzielone w ramach badania (patrz plik uzupełniający 1).
3. Opcjonalnie: Dodaj kolumny dla dodatkowych odpowiedzi, wskazując, czy każda z nich ma być maksymalizowana, zminimalizowana czy ukierunkowana, klikając Dodaj odpowiedź.
   UWAGA: Ustawienia te mogą być później modyfikowane i nie mają wpływu na projekt. Podobnie, po utworzeniu tabeli projektu można dodać dodatkowe kolumny dla dodatkowych odpowiedzi.
4. Wprowadź czynniki badania i odpowiadające im zakresy. Użyj przycisku Mieszanina, aby dodać czynniki mieszania, przycisku Ciągłe, aby dodać czynniki ciągłe, lub przycisku Kategorialny, aby dodać czynniki kategorii.
   UWAGA: W tym przykładowym badaniu wykorzystano czynniki i zakresy zilustrowane w Rysunek 3, które obejmują stosunek molowy do jonizacji (w zakresie od 0,1 do 0,6), stosunek molowy pomocnika (również między 0,1 a 0,6), stosunek molowy cholesterolu (od 0,1 do 0,6), stosunek molowy PEG (od 0,01 do 0,05) oraz typ lipidu jonizowalnego (który może być H101, H102 lub H103).
5. Wprowadź wstępnie określoną liczbę przebiegów dla projektu w polu Liczba przebiegów.
6. Opcjonalnie: Zwiększ średni rozmiar klastra z domyślnego 50 do 2000 za pomocą menu z czerwonym trójkątem obok nagłówka Projekt wypełnienia przestrzeni i w podmenu Opcje zaawansowane.
   UWAGA: Jest to ustawienie algorytmu wypełniania przestrzeni, które może prowadzić do nieco lepszej konstrukcji projektu kosztem dodatkowego czasu obliczeniowego.
7. Wygeneruj tabelę obliczeniową wypełniającą przestrzeń dla wybranych czynników i wielkości serii. Kliknij opcję Szybkie elastyczne wypełnianie, a następnie kliknij opcję Utwórz tabelę.
   UWAGA: Pierwsze dwa przebiegi z przykładowego projektu są pokazane w Rysunek 4.
8. Dodaj kolumnę Uwagi do tabeli, aby dodawać adnotacje do wszystkich ręcznie utworzonych przebiegów. Kliknij dwukrotnie pierwszy pusty nagłówek kolumny, aby dodać kolumnę, a następnie kliknij dwukrotnie nagłówek nowej kolumny, aby edytować nazwę.
9. W razie potrzeby ręcznie włącz przebiegi kontrolne testów porównawczych do tabeli konfiguracji. Należy dołączyć replikację dla jednego z kontrolnych wskaźników porównawczych. Zaznacz nazwę testu porównawczego w kolumnie Uwagi i oznacz kolorami wiersze replikacji testu porównawczego, aby ułatwić identyfikację wykresu.
   1. Dodaj nowy wiersz, klikając dwukrotnie pierwszy pusty nagłówek wiersza i wprowadź ustawienia współczynnika odniesienia. Zduplikuj ten wiersz, aby utworzyć replikę testu porównawczego. Zaznacz oba wiersze i przejdź do sekcji Wiersze > Kolory, aby przypisać kolor do celów graficznych.
      UWAGA: Duplikata zapewnia niezależne od modelu oszacowanie procesu wraz z wariancją analityczną i zapewni dodatkowy wgląd graficzny.
10. Jeśli jakiekolwiek przebiegi kontrolne testu porównawczego wykraczają poza zakres czynników badania, należy to zaznaczyć w kolumnie "Uwagi" w celu przyszłego wykluczenia z analizy.
11. Zaokrąglić czynniki mieszaniny do odpowiedniej granulacji. Aby to zrobić,
    1. Wyróżnij nagłówki kolumn współczynników mieszania, kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z nagłówków kolumn i przejdź do pozycji Nowa kolumna formuły > Przekształć > zaokrąglij..., wprowadź prawidłowy interwał zaokrąglania i kliknij przycisk OK.
    2. Upewnij się, że nie są zaznaczone żadne wiersze, klikając dolny trójkąt na przecięciu nagłówków wierszy i kolumn.
    3. Skopiuj wartości z nowo utworzonych zaokrąglonych kolumn (Ctrl + C) i wklej (Ctrl + V) do oryginalnych kolumn mieszaniny. Na koniec usuń tymczasowe kolumny z zaokrąglonymi wartościami.
12. Po zaokrągleniu proporcji lipidów sprawdź, czy ich suma wynosi 100%, wybierając nagłówki kolumn dla czynników mieszaniny, klikając jeden z nich prawym przyciskiem myszy i przechodząc do Nowa kolumna formuły > Połącz > sumy. Jeśli suma dowolnego wiersza nie jest równa 1, ręcznie dostosuj jeden ze współczynników mieszania, upewniając się, że ustawienie współczynnika pozostaje w zakresie współczynnika. Usuń kolumnę sumy po dokonaniu korekt.
13. Należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, co przy zaokrąglaniu współczynników mieszaniny, aby zaokrąglić czynniki procesu do ich odpowiedniej ziarnistości.
14. Sformatuj kolumny lipidowe tak, aby były wyświetlane jako wartości procentowe z żądaną liczbą miejsc po przecinku: wybierz nagłówki kolumn, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Standaryzuj atrybuty.... W następnym oknie ustaw Format na Procent i dostosuj liczbę miejsc dziesiętnych zgodnie z potrzebami.
15. Jeśli dodawane są przebiegi ręczne, takie jak testy porównawcze, ponownie losowo zlosuj kolejność wierszy tabeli: dodaj nową kolumnę z losowymi wartościami (kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek ostatniej kolumny i wybierz pozycję Nowa kolumna formuły > Losowa > Normalna). Posortuj tę kolumnę w kolejności rosnącej, klikając prawym przyciskiem myszy jej nagłówek kolumny, a następnie usuń kolumnę.
16. Opcjonalnie: dodaj kolumnę Identyfikator uruchomienia. Wypełnij go bieżącą datą, nazwą eksperymentu i numerem wiersza z tabeli.
    UWAGA: Zobacz (Rysunek 5) dla przykładu.
17. Wygeneruj wykresy trójskładnikowe, aby zwizualizować punkty projektowe nad czynnikami lipidowymi (Rysunek 6). Sprawdź również rozkład przebiegów dla czynników procesu (Rysunek 7): wybierz Wykres > Wykres trójskładnikowy. Zaznacz tylko współczynniki mieszaniny dla X, Kreślenie.
18. Aby sprawdzić rozkład czynników procesowych, wybierz opcję Analizuj > rozkład i wprowadź czynniki procesu dla Y, Kolumny.
    UWAGA: Naukowiec zajmujący się formulacją powinien potwierdzić wykonalność wszystkich serii. Jeśli istnieją niewykonalne przebiegi, uruchom ponownie projekt, biorąc pod uwagę nowo odkryte ograniczenia.

Rysunek 3: Czynniki i zakresy badań. Zrzuty ekranu ustawień w oprogramowaniu eksperymentalnym są przydatne do odtworzenia konfiguracji badania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Początkowy wynik dla projektu wypełniającego przestrzeń. Pokazując pierwsze dwa wiersze tabeli, ustawienia należy zaokrąglić do żądanej precyzji, jednocześnie upewniając się, że ilości lipidów sumują się do 1. Test porównawczy został dodany do tabeli ręcznie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Sformatowana tabela do nauki. Poziomy czynników zostały zaokrąglone i sformatowane, a także dodano kolumnę Identyfikator uruchomienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Punkty projektowe na wykresie trójskładnikowym. 23 preparaty są pokazane jako funkcja odpowiednich proporcji Jonizowalny, Pomocniczy i "Inne" (Cholesterol + PEG). Zielony punkt w środku reprezentuje wzorcowy stosunek molowy 33:33:33:1 jonizowalny (H101):Cholesterol:Pomocnik (DOPE):P EG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Rozkład czynników procesowych niebędących mieszanką w eksperymencie. Histogramy pokazują, w jaki sposób przebiegi eksperymentalne są rozmieszczone w zależności od typu lipidów jonizowalnych, stosunku N:P i natężenia przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przeprowadzanie eksperymentu

1. Uruchom eksperyment w kolejności podanej w tabeli konfiguracji. Zapisz odczyty w kolumnach wbudowanych w tabelę eksperymentalną.
2. Jeżeli przeprowadza się wiele testów dla tej samej odpowiedzi na identycznej partii preparatu, należy obliczyć średnią dla tych wyników w każdej partii. Dodaj kolumnę dla każdego pomiaru testowego do tabeli.
   1. Aby uzyskać średnią, zaznacz wszystkie powiązane kolumny, kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z nagłówków wybranych kolumn i wybierz polecenie Nowa kolumna formuły > Połącz > średnią. Użyj tej kolumny Średnia do analizy przyszłych odpowiedzi.
      UWAGA: Bez rozpoczynania receptury od nowa, powtarzane pomiary testowe uwzględniają jedynie wariancję testu i nie stanowią niezależnych powtórzeń.
3. Wszelkie przypadki wytrącania się preparatu lub problemów z tolerancją in vivo (takich jak znaczna utrata masy ciała lub śmierć) należy dokumentować za pomocą wskaźników binarnych (0/1) w nowej kolumnie dla każdego rodzaju problemu.

4. Analiza wyników eksperymentu

1. Wykreśl odczyty i zbadaj rozkłady odpowiedzi: otwórz Graph > Graph Builder i przeciągnij każdą odpowiedź do obszaru Y dla poszczególnych wykresów. Powtórz to dla wszystkich odpowiedzi.
2. Sprawdź względną odległość między oznaczonymi kolorami przebiegami replik, jeśli zostały uwzględnione. Pozwala to na zrozumienie całkowitej zmienności (procesowej i analitycznej) w benchmarku w porównaniu ze zmiennością wynikającą ze zmian ustawień czynników w całej przestrzeni czynników (Rysunek 8).
3. Określ, czy nieprzetworzona odpowiedź powinna być modelowana, czy zamiast tego należy użyć transformacji. W przypadku odpowiedzi, które są ograniczone do bycia pozytywnymi, ale nie są ograniczone powyżej (np. potencja), dopasuj zarówno rozkład normalny, jak i rozkład logarytmiczno-normalny do wyników eksperymentalnych. Jeśli rozkład logarytmiczno-normalny lepiej pasuje do niższego AICc (poprawione kryterium informacyjne Akaike), to wykonaj transformację logarytmiczną tej odpowiedzi.
   1. Przejdź do pozycji Analizuj > dystrybucji i wybierz odpowiedź dla kolumn Y, Kolumny. W wynikowym raporcie dystrybucji kliknij czerwony trójkąt obok nazwy odpowiedzi i wybierz z menu rozwijanego opcję Dopasowanie ciągłe > Dopasowanie normalne i Dopasowanie ciągłe > Dopasowanie lognormalne. W kolejnym raporcie Porównanie rozkładów sprawdź wartości AICc, aby upewnić się, który rozkład lepiej pasuje do odpowiedzi.
   2. Aby przeprowadzić przekształcenie dziennika, kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny odpowiedzi i wybierz polecenie Nowa kolumna formuły > Dziennik > Dziennik. Po skompilowaniu modelu i zapisaniu kolumny przewidywania na skali logarytmu przekształć odpowiedź z powrotem do oryginalnej skali, wybierając pozycję Nowa kolumna formuły > Log > Exp.
   3. W przypadku odpowiedzi proporcji ograniczonych między 0 a 1 porównaj dopasowanie rozkładu normalnego i beta. Jeśli rozkład beta ma niższą wartość AICc, wykonaj transformację logitową. W raporcie Dystrybucja odpowiedzi wybierz opcję Continuous Fit > Fit Normal i Continuous Fit > Beta (Dopasowanie ciągłe).
      1. W przypadku przekształcenia logit kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny odpowiedzi w tabeli danych, a następnie wybierz pozycję Nowa kolumna formuły > Specjalizacja > Logit. Po zbudowaniu modelu zapisz kolumnę przewidywania. Aby powrócić do oryginalnej skali, użyj nowej kolumny formuły > Specjalizacja > Logistic.
         UWAGA: Analiza SVEM oparta na regresji jest odporna na odchylenia od normy w rozkładzie odpowiedzi. Transformacje te mogą jednak prowadzić do łatwiejszej interpretacji wyników i lepszego dopasowania modeli.
4. Wykres przebiegów na wykresie trójskładnikowym. Pokoloruj punkty zgodnie z odpowiedziami (lub przekształconymi odpowiedziami, jeśli zastosowano transformację): otwórz Wykres > Wykres trójskładnikowy. Zaznacz tylko współczynniki mieszaniny dla X, Kreślenie. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny z wynikowych wykresów, wybierz pozycję Legenda wiersza, a następnie wybierz (przekształconą) kolumnę odpowiedzi.
   UWAGA: Kolorowanie punktów zgodnie z odpowiedziami daje niezależną od modelu wizualną perspektywę zachowania w odniesieniu do czynników mieszanych.
5. Usuń skrypt modelu wygenerowany przez projekt wypełniania przestrzeni.
6. Zbuduj niezależny model dla każdej odpowiedzi w funkcji badanych czynników, powtarzając następujące kroki dla każdej odpowiedzi.
   UWAGA: W przypadku wtórnej odpowiedzi binarnej (np. niepowodzenie formułowania lub śmierć myszy), należy również modelować tę odpowiedź. Zmień ustawienie rozkładu docelowego z Normalnego na Dwumianowy.
7. Skonstruuj "pełny" model zawierający wszystkie potencjalne efekty. Model ten powinien obejmować główne efekty każdego czynnika, oddziaływania dwu- i trójkierunkowe, wyrazy kwadratowe i częściowe sześcienne w czynnikach procesu oraz wyrazy sześcienne Scheffé dla czynników mieszaniny^23,24.
   UWAGA: Użyj tego samego zestawu potencjalnych efektów dla każdej odpowiedzi. Technika wyboru modelu SVEM pozwoli na niezależne udoskonalenie modeli dla każdej odpowiedzi, co może skutkować unikalnymi zredukowanymi modelami dla każdej z nich. Rysunek 9 ilustruje niektóre z tych potencjalnych efektów. Poniższe kroki podrzędne szczegółowo opisują ten proces.
   1. Wybierz opcję Analizuj > dopasuj model.
   2. Upewnij się, że czynniki blokujące (np. dzień) nie mogą wchodzić w interakcje z innymi czynnikami badania. Wybierz dowolne czynniki blokujące i kliknij przycisk Dodaj. Nie uwzględniaj tych czynników w żadnym z kolejnych podkroków.
      UWAGA: Czynniki blokujące są ważne do uwzględnienia w modelu, ale czynniki blokujące nie powinny wchodzić w interakcje z innymi czynnikami badania. Głównym celem czynników blokujących jest pomoc w kontrolowaniu zmienności eksperymentu i poprawa czułości eksperymentu.
   3. Podkreśl wszystkie czynniki badania. Zmodyfikuj wartość pola Stopień na 3 (domyślnie jest ustawiona na 2). Kliknij Silnia do stopnia.
      UWAGA: To działanie obejmuje efekty główne, a także dwu- i trzykierunkowe interakcje w modelu.
   4. W oknie wyboru należy wybrać tylko współczynniki niebędące mieszanką. Kliknij pozycję Makra > częściowy Cubic.
      UWAGA: To działanie wprowadza efekty kwadratowe dla czynników procesu ciągłego i ich interakcji z innymi czynnikami niebędącymi mieszaniną w modelu.
   5. Z listy wyboru należy wybrać tylko te współczynniki mieszania. Kliknij pozycję Makra > Scheffe Cubic. Wyłącz domyślną opcję No Intercept (patrz Rysunek 9).
      UWAGA: Uwzględnienie punktu przecięcia w modelu jest niezbędnym krokiem podczas korzystania z metod Lasso i jest również pomocne w kontekście wyboru do przodu. Tradycyjne ustawienie domyślne Brak przecięcia jest zwykle stosowane, ponieważ dopasowanie punktu przecięcia jednocześnie ze wszystkimi głównymi efektami mieszaniny, bez modyfikacji, takich jak podejście SVEM, nie jest możliwe przy użyciu zwykłej procedury regresji metodą najmniejszych kwadratów¹².
   6. Określ kolumnę odpowiedzi: podświetl kolumnę odpowiedzi i kliknij przycisk Y.
   7. Zmień ustawienie Osobowość na Regresja uogólniona. Pozostaw opcję Dystrybucja ustawiona na Normalna.
   8. Zapisz tę konfigurację modelu w tabeli danych w celu użycia z dodatkowymi odpowiedziami, klikając menu z czerwonym trójkątem obok pozycji Specyfikacja modelu i wybierając opcję Zapisz w tabeli danych.
8. Zastosuj metodę selekcji SVEM do przodu, aby dopasować ją do zredukowanego modelu, bez obowiązkowego uwzględniania głównych efektów współczynnika mieszanki, i zapisz kolumnę formuły predykcyjnej w tabeli danych.
   1. W oknie dialogowym Dopasuj model kliknij przycisk Uruchom.
   2. W polu Estimation Method (Metoda szacowania) wybierz opcję SVEM Forward Selection (Wybór SVEM do przodu).
   3. Rozwiń menu Zaawansowane elementy sterujące > Wymuś warunki i usuń zaznaczenie pól powiązanych z głównymi efektami mieszaniny. Tylko pole Przechwyć termin powinno pozostać zaznaczone. Rysunek 10 pokazuje domyślne ustawienia, w których wymuszane są główne efekty. Na tym etapie te pola muszą być odznaczone, aby umożliwić modelowi uwzględnienie lub wykluczenie tych efektów na podstawie procedury wyboru do przodu.
   4. Kliknij przycisk Przejdź, aby uruchomić procedurę SVEM Forward Selection (SVEM Forward Selection).
9. Wykreśl rzeczywiste odpowiedzi według przewidywanych odpowiedzi z modelu SVEM, aby zweryfikować rozsądną zdolność predykcyjną. (Rysunek 11). Kliknij czerwony trójkąt obok SVEM Forward Selection i wybierz Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Kliknij czerwony trójkąt obok pozycji SVEM Forward Selection i wybierz opcję Save Columns (Zapisz kolumny) > Zapisz formułę przewidywania, aby utworzyć nową kolumnę zawierającą formułę przewidywania w tabeli danych.
11. Opcjonalnie: Powtórz powyższe kroki, używając SVEM Lasso jako metody szacowania, aby określić, czy po wykonaniu kolejnych kroków sugerowana jest inna optymalna receptura. Jeśli tak, uruchom obie reguły jako przebiegi potwierdzenia (omówione w sekcji 5), aby zobaczyć, która z nich działa najlepiej w praktyce¹².
12. Powtórz kroki tworzenia modelu dla każdej odpowiedzi.
13. Po zapisaniu kolumn przewidywania dla wszystkich odpowiedzi w tabeli danych narysuj wykres śladów odpowiedzi dla wszystkich przewidywanych kolumn odpowiedzi przy użyciu platformy profilera: Wybierz pozycję Graph > Profiler, a następnie wybierz wszystkie kolumny przewidywania utworzone w poprzednim kroku dla Y, Formuła przewidywania, a następnie kliknij przycisk OK (Rysunek 12).
14. Zidentyfikuj potencjalne optymalne preparaty.
    1. Zdefiniuj "funkcję pożądania" dla każdej odpowiedzi, określając, czy odpowiedź powinna być zmaksymalizowana, zminimalizowana, czy dopasowana do celu. Ustaw wszystkie odpowiedzi podstawowe tak, aby używały wagi ważności 1,0, a wszystkie odpowiedzi pomocnicze tak, aby używały wagi ważności 0,2. Z menu czerwonego trójkąta Prediction Profiler wybierz Optymalizacja i atrakcyjność > Funkcje pożądania, a następnie Optymalizacja i atrakcyjność > Ustaw atrakcje. Wprowadź ustawienia w kolejnym windows.
       UWAGA: Ważne wagi są względne i subiektywne, dlatego warto sprawdzić wrażliwość połączonego optimum na zmiany tych wag w rozsądnym zakresie (np. od równego ważenia do ważenia 1:5).
    2. Wydaj polecenie profilerowi, aby znalazł optymalne ustawienia czynnika, które maksymalizują funkcję atrakcyjności (Rysunek 12): w profilerze wybierz Optymalizacja i atrakcyjność > Maksymalizuj atrakcyjność.
       UWAGA: Przewidywane wartości odpowiedzi u optymalnych kandydatów mogą zawyżać wartość odpowiedzi skośnych w prawo, takich jak potencja; Jednak przebiegi potwierdzające dostarczą dokładniejszych obserwacji tych kandydujących preparatów. Głównym celem jest >znalezienie optymalnej receptury (ustawień optymalnej receptury).
    3. Zapisz optymalne ustawienia czynnika i zanotuj ważne wagi używane dla każdej odpowiedzi: z menu Profiler predykcji wybierz Ustawienia czynnika > Zapamiętaj ustawienia.
15. Opcjonalnie: W przypadku czynników kategorycznych, takich jak typ lipidów jonizowalnych, znajdź warunkowo optymalne formuły dla każdego poziomu czynnika.
    1. Najpierw ustaw żądany poziom współczynnika w profilerze, a następnie przytrzymaj Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy wewnątrz wykresu tego czynnika i wybierz Zablokuj ustawienie czynników. Wybierz opcję Optymalizacja i atrakcyjność > Maksymalizuj atrakcyjność, aby znaleźć optimum warunkowe z tym współczynnikiem zablokowanym na bieżącym ustawieniu.
    2. Odblokuj ustawienia czynnika przed kontynuowaniem, korzystając z tego samego menu, które służy do blokowania ustawień czynnika.
16. Powtórz proces optymalizacji po dostosowaniu wag ważności odpowiedzi (za pomocą opcji Optymalizacja i atrakcyjność > Ustaw pożądane odpowiedzi), być może tylko optymalizując podstawowe odpowiedzi lub ustawiając niektóre z drugorzędnych odpowiedzi tak, aby miały większą lub mniejszą wagę ważności, lub ustawiając cel drugorzędnych odpowiedzi na Brak (Rysunek 13).
17. Zarejestruj nowego optymalnego kandydata (z menu Profiler predykcji wybierz Ustawienia czynnika > Zapamiętaj ustawienia).
18. Twórz graficzne podsumowania optymalnych regionów przestrzeni czynników: wygeneruj tabelę danych z 50 000 wierszy wypełnionych losowo wygenerowanymi ustawieniami czynników w dozwolonej przestrzeni czynników, wraz z odpowiednimi przewidywanymi wartościami z modelu zredukowanego dla każdej z odpowiedzi i wspólnej funkcji pożądania.
    1. W profilerze wybierz pozycję Wyjściowe tabela losowa. Ustaw liczbę przebiegów do symulacji? na 50 000 i kliknij przycisk OK .
       UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie nowej tabeli z przewidywanymi wartościami odpowiedzi dla każdego z 50 000 preparatów. Kolumna Atrakcyjność zależy od wag ważności odpowiedzi, które są dostępne, gdy jest zaznaczona opcja Wynikowa tabela losowa.
    2. W nowo utworzonej tabeli dodaj nową kolumnę, która oblicza percentyl kolumny Atrakcyjność. Użyj tej kolumny percentyla na wykresach trójskładnikowych zamiast nieprzetworzonej kolumny Atrakcyjność. Kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny Atrakcyjność i wybierz pozycję Nowa kolumna formuły > Dystrybucyjne > skumulowane prawdopodobieństwo, aby utworzyć nową kolumnę Skumulowane prawdopodobieństwo[Pożądanie].
    3. Wygeneruj grafikę opisaną w poniższych krokach. Wielokrotnie zmieniaj schemat kolorów grafiki, aby wyświetlić przewidywania dla każdej odpowiedzi i dla kolumny Skumulowane prawdopodobieństwo[Pożądanie].
    4. Skonstruuj wykresy trójskładnikowe dla czterech czynników lipidowych. W tabeli przejdź do sekcji Wykres > Wykres trójskładnikowy, wybierz współczynniki mieszaniny dla pola X, Kreślenie, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z wynikowych wykresów, wybierz pozycję Legenda wierszy, a następnie wybierz przewidywaną kolumnę odpowiedzi. Zmień listę rozwijaną Kolory na Jet.
       UWAGA: Wyświetla najlepsze i najgorsze regiony w odniesieniu do czynników lipidowych. Rysunek 14 pokazuje percentyle atrakcyjności połączenia przy rozważaniu maksymalizacji Potencji (ważność=1) i minimalizacji Rozmiaru (ważność=0,2), przy jednoczesnym uśrednieniu wszelkich czynników, które nie są pokazane na trójskładnikowych osiach wykresu. Rysunek 15 pokazuje przewidywany rozmiar surowca. Rozsądne jest również rozbicie tych wykresów warunkowo na inne czynniki, takie jak utworzenie odrębnego zestawu wykresów trójskładnikowych dla każdego typu lipidów jonizowalnych za pomocą lokalnego filtra danych (dostępnego w menu czerwonego trójkąta obok wykresu trójskładnikowego).
    5. Podobnie, użyj Graph > Graph Builder, aby wykreślić 50 000 punktów oznaczonych kolorami (reprezentujących unikalne formuły) w odniesieniu do czynników procesu niebędących mieszanką, indywidualnie lub łącznie, i wyszukać relacje między odpowiedziami a czynnikami (czynnikami). Szukaj ustawień współczynników, które przynoszą największą atrakcyjność. Zapoznaj się z różnymi kombinacjami czynników w grafice.
       UWAGA: Podczas kolorowania wykresów należy użyć opcji Skumulowane prawdopodobieństwo[Pożądanie], ale podczas wykreślania atrakcyjności na osi pionowej w stosunku do czynników procesu należy użyć kolumny surowej Atrakcyjności. Kolumnę Atrakcyjność można również umieścić na osi wizualizacji 3D Wykres > rozrzutu wraz z dwoma innymi czynnikami procesu do eksploracji wielowymiarowej. Rysunek 16 pokazuje łączną atrakcyjność wszystkich preparatów, które mogą być tworzone z każdym z trzech typów lipidów jonizowalnych. Najbardziej pożądane preparaty wykorzystują H102, przy czym H101 zapewnia pewne potencjalnie konkurencyjne alternatywy.
    6. Zapisz profiler i jego zapamiętane ustawienia z powrotem w tabeli danych. Kliknij czerwony trójkąt obok pozycji Profiler i wybierz pozycję Zapisz skrypt > w tabeli danych....

Rysunek 8: Obserwowane odczyty mocy z eksperymentu. Punkty pokazują wartości potencji, które zaobserwowano w 23 biegach; Zreplikowane przebiegi testów porównawczych są wyświetlane na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Okno dialogowe oprogramowania do inicjowania analizy. Kandydujące efekty zostały wprowadzone wraz z docelową reakcją potencji, a opcja Brak przechwycenia została odznaczona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Dodatkowe okno dialogowe do określania opcji SVEM. Domyślnie główne efekty lipidowe są wymuszane w modelu. Ponieważ przechwycenie jest dołączone, zalecamy odznaczenie tych pól, aby nie wymuszać efektów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Rzeczywisty według przewidywanego wykresu. Na tym rysunku przedstawiono zaobserwowaną moc w stosunku do wartości przewidywanej dla każdej postaci przez model SVEM. Korelacja nie musi być tak silna, jak w tym przykładzie, ale oczekuje się, że korelacja będzie co najmniej umiarkowana i że nie ma wartości odstających. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Profiler predykcji. Dwa górne rzędy wykresów pokazują wycinki funkcji przewidywanej odpowiedzi w optymalnym sformułowaniu (określonym przez podejście SVEM). Dolny wiersz wykresów pokazuje ważoną "atrakcyjność" preparatu, która jest funkcją ostatniej kolumny wykresów, która pokazuje, że Potencja powinna być zmaksymalizowana, a Rozmiar zminimalizowany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Trzy optymalne propozycje receptur z SVEM-Forward Selection. Zmiana względnej wagi ważności odpowiedzi może prowadzić do różnych optymalnych formuł. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Wykresy trójskładnikowe dla percentyla atrakcyjności. Wykres przedstawia 50 000 preparatów oznaczonych kolorem według percentyla atrakcyjności, gdzie atrakcyjność jest ustawiona z wagą ważności 1,0 dla maksymalizacji siły działania i 0,2 dla minimalizacji rozmiaru, wykresy te pokazują, że optymalny region preparatów składa się z niższego procentu jonizowalnego lipidu i wyższego procentu PEG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Wykres trójskładnikowy dla przewidywanego rozmiaru. Wykres przedstawia przewidywania wielkości z modelu SVEM dla każdego z 50 000 preparatów. Rozmiar jest zminimalizowany przy wyższym procentowym odsetku lipidów pomocniczych i maksymalizowany przy niższym procentu pomocnika. Ponieważ inne czynniki różnią się swobodnie w 50 000 wykreślonych preparatów, oznacza to, że zależność ta utrzymuje się w zakresach innych czynników (PEG, natężenie przepływu itp.). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 16: Wykresy skrzypiec dla atrakcyjności preparatów zawierających trzy różne typy lipidów jonizowalnych. Każdy z 50 000 punktów reprezentuje unikalną formułę z całej dozwolonej przestrzeni czynników. Szczyty tych rozkładów są maksymalnymi wartościami pożądania, które są obliczane analitycznie za pomocą profilera predykcji. H102 ma największy pik i dzięki temu wytwarza optymalną formułę. Podejście SVEM do budowania modelu, który generuje te dane wyjściowe, automatycznie odfiltrowuje statystycznie nieistotne czynniki: celem tego wykresu jest rozważenie praktycznego znaczenia na wszystkich poziomach czynników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przebiega potwierdzenie

1. Przygotuj tabelę z listą optymalnych kandydatów zidentyfikowanych wcześniej (Rysunek 17).
   UWAGA: Wartości True Potency i True Size w Rysunek 17 są wypełniane za pomocą symulowanych funkcji generujących: w praktyce zostaną one uzyskane poprzez sformułowanie, a następnie zmierzenie wydajności tych receptur.
   1. Dołącz kontrolę porównawczą do zestawu kandydujących przebiegów, które zostaną sformułowane i zmierzone.
   2. Jeśli okaże się, że którakolwiek z formuł z eksperymentu daje pożądane wyniki, być może przewyższając wynik porównawczy, wybierz najlepszą do dodania do tabeli kandydatów i przetestuj ponownie wraz z nowymi preparatami.
      UWAGA: Ręcznie dodaj żądane przebiegi do tabeli kandydackiej lub użyj zapamiętanych ustawień okna profilera, jeśli te przebiegi pochodzą z poprzedniego eksperymentu. Zidentyfikuj numer wiersza przebiegu, przejdź do pozycji Prediction Profiler > Factor Settings > Ustaw na Dane w wierszu, a następnie wprowadź numer wiersza. Następnie wybierz pozycję Prediction Profiler > Factor Settings > Remember Settings i oznacz ją odpowiednio (np. "benchmark" lub "best run from the previous experiment").
   3. Kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę Zapamiętane ustawienia w profilerze i wybierz polecenie Zamień w tabeli danych.
      UWAGA: W zależności od priorytetu badania i budżetu rozważ przeprowadzenie powtórzeń dla każdego przebiegu potwierdzenia, zwłaszcza w przypadku wymiany testu porównawczego. Utwórz i przeanalizuj każdą formułę dwukrotnie, używając średniego wyniku do klasyfikacji. Należy zwrócić uwagę na kandydatów o szerokim zakresie odpowiedzi w dwóch powtórzeniach, ponieważ może to wskazywać na dużą wariancję procesu.
   4. Jeśli jest to konieczne ze względu na ograniczenia budżetowe, wybierz mniej spośród zidentyfikowanych kandydatów, aby dopasować je do budżetu eksperymentalnego lub wyeliminować zbędnych kandydatów.
2. Wykonaj przebiegi potwierdzające. Skonstruuj receptury i zbierz odczyty.
3. Należy sprawdzić spójność między wynikami z pierwotnego eksperymentu a wynikami z partii potwierdzającej w odniesieniu do testów porównawczych lub innych powtórzonych receptur. Jeśli występuje duża i nieoczekiwana zmiana, należy zastanowić się, co mogło przyczynić się do zmiany i czy jest możliwe, że miało to wpływ na wszystkie przebiegi z partii potwierdzenia.
4. Porównaj wydajność proponowanych optymalnych preparatów. Sprawdź, czy jacyś nowi kandydaci osiągnęli lepsze wyniki niż benchmark.
5. Opcjonalnie: Dodaj wynik przebiegów potwierdzających do tabeli eksperymentalnej i ponownie uruchom analizę w sekcji 4.
   UWAGA: Następny krok przepływu pracy zawiera instrukcje dotyczące konstruowania badania uzupełniającego wraz z tymi przebiegami, jeśli jest to pożądane.

Rysunek 17: Tabela dziesięciu optymalnych kandydatów do uruchomienia jako przebiegi potwierdzenia. Rzeczywista Moc i Rzeczywisty Rozmiar zostały wypełnione na podstawie funkcji generujących symulację (bez żadnych dodatkowych procesów lub zmian analitycznych). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Opcjonalnie: Projektowanie badania uzupełniającego, które ma być prowadzone równolegle z przebiegami potwierdzającymi

1. Oceń potrzebę przeprowadzenia badania kontrolnego, biorąc pod uwagę następujące kryteria:
   1. Określ, czy optymalna formuła leży wzdłuż jednej z granic czynników i czy pożądane jest przeprowadzenie drugiego eksperymentu w celu rozszerzenia co najmniej jednego z zakresów czynników.
   2. Oceń, czy w początkowym eksperymencie użyto stosunkowo małego rozmiaru serii lub stosunkowo dużych zakresów czynników i czy istnieje potrzeba "powiększenia" zidentyfikowanego optymalnego regionu za pomocą dodatkowych przebiegów i zaktualizowanej analizy.
   3. Sprawdź, czy wprowadzany jest dodatkowy czynnik. Może to być poziom czynnika kategorycznego, takiego jak dodatkowy lipid ulegający jonizacji lub czynnik, który pozostał niezmienny w początkowym badaniu, na przykład stężenie buforu.
   4. Jeśli żaden z powyższych warunków nie jest spełniony, przejdź do kroku 7.
2. Przygotuj się do przeprowadzenia dodatkowych przebiegów eksperymentalnych, które mają być przeprowadzone równolegle z przebiegami potwierdzenia.
   1. Zdefiniuj limity czynników zapewniające częściowe pokrywanie się z regionem z badania początkowego. Jeżeli nie występuje pokrywanie się, należy zaprojektować nowe badanie.
   2. Opracuj nowe przebiegi eksperymentalne z projektem wypełniającym przestrzeń. Wybierz DOE > Specjalnego Przeznaczenia > Projektowanie wypełniania przestrzeni.
      UWAGA: Dla zaawansowanych użytkowników rozważ projekt optymalny dla D za pomocą >DOE > Custom Design.
   3. Po wygenerowaniu przebiegów wypełniających przestrzeń ręcznie włącz dwa lub trzy przebiegi z oryginalnego eksperymentu, które leżą w nowej przestrzeni czynników. Rozmieść te przebiegi losowo w tabeli eksperymentalnej, wykonując czynności opisane w sekcji 2, aby dodać wiersze, a następnie losowo ustawić kolejność wierszy.
      UWAGA: Zostaną one użyte do oszacowania wszelkich przesunięć w średnich odpowiedzi między blokami.
   4. Połącz przebiegi potwierdzenia i nowe przebiegi wypełniania spacji w jedną tabelę i losowo określ kolejność uruchamiania. Użyj opcji Tabele> połącz się, a następnie utwórz i posortuj według nowej kolumny losowej, aby losowo ustawić kolejność uruchamiania, zgodnie z opisem w sekcji 2.
3. Opracuj nowe receptury i zbierz wyniki.
4. Połącz nowe przebiegi eksperymentalne i wyniki z oryginalną tabelą danych eksperymentu, wprowadzając kolumnę identyfikatora eksperymentu, aby wskazać źródło każdego wyniku. Użyj opcji Tabele > Konkatenuj i wybierz opcję Utwórz kolumnę źródłową.
5. Sprawdź, czy właściwości kolumny dla każdego czynnika wyświetlają połączony zakres dla obu badań: kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny dla każdego czynnika i sprawdź zakresy właściwości Kodowanie i Mieszanina, jeśli są obecne.
6. Rozpocznij analizę wyników nowego eksperymentu.
   1. Uwzględnij kolumnę experiment-ID jako termin w modelu, który będzie służył jako czynnik blokujący. Upewnij się, że ten termin nie wchodzi w interakcje z czynnikami badania. Uruchom skrypt okna dialogowego Dopasuj model zapisany w tabeli w sekcji 4, wybierz kolumnę identyfikatora eksperymentu i kliknij przycisk Dodaj, aby dołączyć ją do listy potencjalnych efektów.
   2. Uruchom to okno dialogowe Dopasuj model w połączonej tabeli danych, aby wspólnie przeanalizować wyniki nowego eksperymentu i badania początkowego. Postępuj zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, aby generować zaktualizowane optymalne receptury i graficzne podsumowania.
   3. W celu walidacji niezależnie przeanalizuj wyniki nowego eksperymentu, wykluczając wyniki z początkowego eksperymentu. Oznacza to, że należy wykonać kroki opisane w sekcji 4 na nowej tabeli doświadczalnej.
   4. Upewnij się, że optymalne formuły zidentyfikowane przez te modele są ściśle zgodne z tymi, które zostały uznane we wspólnej analizie.
   5. Przejrzyj graficzne podsumowania, aby potwierdzić, że zarówno wspólne, jak i indywidualne analizy nowych wyników eksperymentalnych wykazują podobne zachowania powierzchni odpowiedzi (co oznacza, że istnieje podobny związek między odpowiedzią (odpowiedziami) a czynnikami).
   6. Porównaj połączone i indywidualne analizy nowych wyników z początkowym eksperymentem w celu uzyskania spójności. Użyj podobnych struktur wykresów do porównania i zbadaj zidentyfikowane optymalne recepty na różnice.

7. Dokumentowanie końcowych wniosków naukowych z badania

1. Jeśli w wyniku badania kontrola porównawcza zmieni się na nowo zidentyfikowaną recepturę, należy zarejestrować nowe ustawienie i określić pliki projektowe i analityczne, które rejestrują jego pochodzenie.
2. Zachowaj wszystkie tabele eksperymentalne i podsumowania analiz, najlepiej z nazwami plików oznaczonymi datą, do wykorzystania w przyszłości.

Results

To podejście zostało zweryfikowane w obu szeroko klasyfikowanych typach lipidów: klasycznych lipidach podobnych do MC3 i lipidoidach (np. C12-200), zazwyczaj wywodzących się z chemii kombinatorycznej. W porównaniu z wzorcową formułą LNP opracowaną przy użyciu metody jednego czynnika na raz (OFAT), kandydujące preparaty wygenerowane w ramach naszego przepływu pracy często wykazują 4- do 5-krotną poprawę siły działania w skali logarytmicznej, jak pokazano w odczytach lucyferazy wątroby myszy w Rysunek 1...

Discussion

Nowoczesne oprogramowanie do projektowania i analizy eksperymentów z udziałem mieszanin umożliwia naukowcom ulepszanie preparatów nanocząstek lipidowych w ustrukturyzowanym przepływie pracy, który pozwala uniknąć nieefektywnych eksperymentów OFAT. Niedawno opracowane podejście do modelowania SVEM eliminuje wiele tajemniczych modyfikacji regresji i strategii redukcji modelu, które wcześniej mogły rozpraszać naukowców zbędnymi rozważaniami statystycznymi. Po zebraniu wyników ramy analizy SVEM oferują podejście, które jest ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statystyczne Odkrycie LLC