Przepływ pracy w celu optymalizacji formułowania nanocząstek lipidowych (LNP) przy użyciu zaprojektowanych eksperymentów z procesem mieszaniny i samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia podejście do optymalizacji receptur w stosunku do czynników badania mieszanego, ciągłego i kategorycznego, które minimalizuje subiektywne wybory w konstrukcji eksperymentalnego projektu. W fazie analizy stosowana jest skuteczna i łatwa w użyciu procedura modelowania dopasowania.

Streszczenie

Prezentujemy podejście do optymalizacji preparatów nanocząsteczek lipidowych (LNP) w stylu Quality by Design (QbD), mające na celu zaoferowanie naukowcom przystępnego przepływu pracy. Nieodłączne ograniczenie w tych badaniach, w których proporcje molowe lipidów jonizowalnych, pomocniczych i PEG muszą sumować się do 100%, wymaga specjalistycznych metod projektowania i analizy, aby dostosować się do tego ograniczenia mieszaniny. Koncentrując się na czynnikach lipidowych i procesowych, które są powszechnie stosowane w optymalizacji projektu LNP, zapewniamy kroki, które pozwalają uniknąć wielu trudności, które tradycyjnie pojawiają się w projektowaniu i analizie eksperymentów z procesem mieszania, stosując projekty wypełniające przestrzeń i wykorzystując niedawno opracowane ramy statystyczne samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM). Oprócz tworzenia optymalnych receptur, przepływ pracy tworzy również graficzne podsumowania dopasowanych modeli statystycznych, które upraszczają interpretację wyników. Nowo zidentyfikowane preparaty kandydujące są oceniane za pomocą serii potwierdzających i opcjonalnie mogą być przeprowadzane w kontekście bardziej kompleksowego badania drugiej fazy.

Wprowadzenie

Formulacje nanocząsteczek lipidowych (LNP) dla systemów dostarczania genów in vivo zazwyczaj obejmują cztery składniki lipidowe z kategorii lipidów jonizowalnych, pomocniczych oraz lipidów PEG^1,2,3. Niezależnie od tego, czy lipidy te są badane pojedynczo, czy jednocześnie z innymi czynnikami niebędącymi składnikami mieszaniny, eksperymenty dla tych formulacji wymagają zastosowania planów doświadczalnych typu „mieszanina”, ponieważ w przypadku danej formulacji kandydującej zwiększenie lub zmniejszenie stosunku dowolnego z lipidów nieuchronnie prowadzi do odpowiadającego zmniejszenia lub zwiększenia sumy stosunków pozostałych trzech lipidów.

W ramach ilustracji przyjmijmy, że optymalizujemy formulację LNP, która obecnie opiera się na stałej recepturze traktowanej jako punkt odniesienia. Celem jest maksymalizacja aktywności LNP, przy jednoczesnym dążeniu do zminimalizowania średniej wielkości cząsteczek. Czynnikami badania, które są zmieniane w eksperymencie, są stosunki molowe czterech składnikowych lipidów (jonizowalnego, cholesterolu, DOPE, PEG), stosunek N:P, szybkość przepływu oraz rodzaj lipidu jonizowalnego. Lipidy jonizowalne i pomocnicze (w tym cholesterol) mogą zmieniać się w szerszym zakresie stosunku molowego, 10-60%, niż PEG, który w tej ilustracji będzie zmieniany w zakresie 1-5%. Receptura formulacji odniesienia oraz zakresy pozostałych czynników wraz z ich granularnością zaokrąglania zostały określone w Supplementary File 1. W tym przykładzie naukowcy są w stanie przeprowadzić 23 uruchomienia (unikalne serie cząsteczek) w ciągu jednego dnia i chcieliby przyjąć tę liczbę jako wielkość próby, o ile spełnia ona wymagania minimalne. Symulowane wyniki dla tego eksperymentu znajdują się w Supplementary File 2 oraz Supplementary File 3.

Rampado i Peer⁴ opublikowali niedawno artykuł przeglądowy na temat planowania eksperymentów w celu optymalizacji systemów dostarczania leków opartych na nanocząsteczkach. Kauffman i wsp.⁵ rozważali badania optymalizacji LNP z wykorzystaniem ułamkowych planów czynnikowych oraz definitywnych planów przesiewowych⁶; jednak tego typu plany nie mogą uwzględniać ograniczeń mieszaniny bez uciekania się do nieefektywnych „zmiennych słabych” (slack variables)⁷ i zazwyczaj nie są stosowane w obecności czynników mieszaninowych^7,8. Zamiast tego, w eksperymentach dotyczących procesów mieszania tradycyjnie stosuje się „plany optymalne”, które są w stanie włączyć ograniczenia mieszaniny⁹. Plany te są ukierunkowane na określoną przez użytkownika funkcję czynników badania i są optymalne (w jednym z kilku możliwych znaczeń) tylko wtedy, gdy funkcja ta oddaje rzeczywistą zależność między czynnikami badania a odpowiedziami. Należy zauważyć, że w tekście istnieje rozróżnienie między „planami optymalnymi” a „optymalnymi kandydatami na formulacje”, gdzie te drugie odnoszą się do najlepszych formulacji zidentyfikowanych przez model statystyczny. Plany optymalne wiążą się z trzema głównymi wadami w przypadku eksperymentów dotyczących procesów mieszania. Po pierwsze, jeśli naukowiec nie przewidzi interakcji czynników badania podczas określania modelu docelowego, wynikający z tego model będzie obarczony błędem i może wskazać gorsze formulacje kandydackie. Po drugie, plany optymalne lokują większość serii pomiarowych na zewnętrznej granicy przestrzeni czynników. W badaniach LNP może to prowadzić do dużej liczby utraconych serii, jeśli cząstki nie tworzą się prawidłowo przy skrajnych wartościach lipidów lub ustawień procesu. Po trzecie, naukowcy często preferują przeprowadzanie serii doświadczalnych wewnątrz przestrzeni czynników, aby uzyskać niezależny od modelu obraz powierzchni odpowiedzi i bezpośrednio obserwować proces w wcześniej niezbadanych obszarach przestrzeni czynników.

Alternatywną zasadą projektowania jest dążenie do uzyskania w przybliżeniu równomiernego pokrycia (ograniczonej mieszaniną) przestrzeni czynników za pomocą projektu wypełniającego przestrzeń¹⁰. Projekty te poświęcają część wydajności eksperymentalnej w stosunku do projektów optymalnych⁹ (przy założeniu, że cała przestrzeń czynników prowadzi do poprawnych formulacji), ale oferują w zamian kilka korzyści przydatnych w tej aplikacji. Projekt wypełniający przestrzeń nie przyjmuje żadnych założeń a priori dotyczących struktury powierzchni odpowiedzi, co zapewnia elastyczność w wychwytywaniu nieprzewidzianych zależności między badanymi czynnikami. Upraszcza to również generowanie projektu, ponieważ nie wymaga podejmowania decyzji o tym, które wyrazy regresji dodać lub usunąć w miarę dostosowywania pożądanej liczby prób. W przypadku, gdy niektóre punkty projektu (receptury) prowadzą do nieudanych formulacji, projekty wypełniające przestrzeń umożliwiają modelowanie granicy niepowodzeń w odniesieniu do badanych czynników, wspierając jednocześnie modele statystyczne dla odpowiedzi badania w odniesieniu do udanych kombinacji czynników. Wreszcie, wewnętrzne pokrycie przestrzeni czynników pozwala na niezależną od modelu graficzną eksplorację powierzchni odpowiedzi.

Aby zwizualizować podprzestrzeń czynników mieszaniny w eksperymencie nad procesem mieszania, stosuje się specjalistyczne trójkątne „wykresy ternarne”. Rysunek 1 uzasadnia takie zastosowanie: w sześcianie punktów, w którym trzy składniki mogą przyjmować wartości od 0 do 1, na czerwono zaznaczono punkty spełniające warunek, zgodnie z którym suma składników równa się 1. Ograniczenie dotyczące mieszaniny trzech składników redukuje dopuszczalną przestrzeń czynników do postaci trójkąta. W zastosowaniach dotyczących LNP z czterema składnikami mieszaniny tworzymy sześć różnych wykresów ternarnych, aby przedstawić przestrzeń czynników, wykreślając po dwa lipidy jednocześnie względem osi „Inne”, która reprezentuje sumę pozostałych lipidów.

Rycina 1: Trójkątne obszary czynników. Na wykresie wypełniającym przestrzeń wewnątrz sześcianu małe szare kropki reprezentują formulacje, które są niezgodne z ograniczeniem mieszaniny. Większe czerwone punkty znajdują się na trójkącie wpisanym w sześcian i reprezentują formulacje, dla których ograniczenie mieszaniny jest spełnione. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Oprócz czynników dotyczących mieszaniny lipidów często występują jeden lub więcej ciągłych czynników procesowych, takich jak stosunek N:P, stężenie buforu lub szybkość przepływu. Mogą występować również czynniki kategoryczne, takie jak rodzaj lipidu jonizowalnego, rodzaj lipidu pomocniczego lub rodzaj buforu. Celem jest znalezienie formulacji (mieszaniny lipidów i ustawień czynników procesowych), która maksymalizuje określony miernik skuteczności i/lub poprawia charakterystykę fizykochemiczną, np. poprzez minimalizację wielkości cząsteczek i PDI (indeksu polidyspersyjności), maksymalizację procentu enkapsulacji oraz minimalizację skutków ubocznych – takich jak utrata masy ciała – w badaniach in vivo. Nawet w przypadku rozpoczęcia pracy od rozsądnej receptury wzorcowej, może pojawić się potrzeba ponownej optymalizacji w związku ze zmianą ładunku genetycznego lub przy rozważeniu zmian w czynnikach procesowych bądź rodzajach lipidów.

Cornell⁷ dostarcza definitywnego opracowania na temat aspektów statystycznych eksperymentów z mieszaninami i procesami mieszania, natomiast Myers i wsp.⁹ przedstawiają doskonałe podsumowanie najistotniejszych zagadnień projektowania i analizy mieszanin w celu optymalizacji. Prace te mogą jednak obciążać naukowców nadmiarem szczegółów statystycznych i specjalistycznej terminologii. Nowoczesne oprogramowanie do planowania i analizy eksperymentów stanowi solidne rozwiązanie, które w wystarczającym stopniu wspiera większość problemów optymalizacji LNP bez konieczności odwoływania się do odpowiedniej teorii. Chociaż bardziej skomplikowane lub priorytetowe badania wciąż będą zyskiwać na współpracy ze statystykiem i mogą wymagać zastosowania projektów optymalnych zamiast projektów wypełniających przestrzeń, naszym celem jest zwiększenie komfortu pracy naukowców i zachęcenie do optymalizacji formulacji LNP bez uciekania się do nieefektywnego testowania jednego czynnika na raz (OFAT)¹¹ lub zwykłego zadowolenia się pierwszą formulacją, która spełnia specyfikację.

W niniejszym artykule przedstawiono schemat postępowania z wykorzystaniem oprogramowania statystycznego w celu optymalizacji ogólnego problemu formulacji LNP, omawiając kwestie projektowania i analizy w kolejności, w jakiej będą one występować. W rzeczywistości metoda ta sprawdzi się w przypadku ogólnych problemów optymalizacyjnych i nie ogranicza się jedynie do LNP. W toku prac omówiono kilka powszechnie pojawiających się pytań oraz przedstawiono rekomendacje oparte na doświadczeniu i wynikach symulacji¹². Niedawno opracowane ramy samowalidujących się modeli zespołowych (SVEM)¹³ znacznie ulepszyły podatne na błędy podejście do analizy wyników eksperymentów z mieszaninami i procesami, a my wykorzystujemy to podejście, aby zaproponować uproszczoną strategię optymalizacji formulacji. Choć schemat ten został skonstruowany w sposób ogólny, który można by zrealizować przy użyciu innych pakietów oprogramowania, JMP 17 Pro jest wyjątkowy dzięki oferowaniu SVEM wraz z narzędziami do podsumowania graficznego, które okazały się niezbędne do uproszczenia w przeciwnym razie zawiłej analizy eksperymentów z mieszaninami i procesami. W związku z tym w protokole zamieszczono również instrukcje specyficzne dla oprogramowania JMP.

SVEM wykorzystuje te same podstawy modelu regresji liniowej co podejście tradycyjne, ale pozwala uniknąć żmudnych modyfikacji wymaganych do dopasowania „pełnego modelu” efektów kandydackich poprzez zastosowanie podejścia opartego na selekcji w przód lub selekcji z karą (Lasso). Dodatkowo SVEM zapewnia lepsze dopasowanie „modelu zredukowanego”, co minimalizuje ryzyko włączenia szumu (wariancji procesowej i analitycznej) występującego w danych. Metoda ta działa poprzez uśrednianie modeli predykcyjnych wynikających z wielokrotnego ponownego ważenia relatywnego znaczenia każdego uruchomienia w modelu^{13,14,15,16,17,18}. SVEM dostarcza ramy modelowania eksperymentów procesowo-mieszaninowych, które są łatwiejsze w implementacji niż tradycyjna regresja jednorazowa i pozwalają na uzyskanie lepszej jakości kandydatów na optymalną formulację^12,13. Szczegóły matematyczne SVEM wykraczają poza zakres niniejszej pracy, a nawet pobieżne streszczenie wykraczające poza odpowiedni przegląd literatury mogłoby odciągnąć uwagę od głównej zalety tej metody w tym zastosowaniu: umożliwia ona praktykom prostą, solidną i dokładną procedurę typu „kliknij i uruchom”.

Przedstawiony schemat postępowania jest zgodny z podejściem Quality by Design (QbD)¹⁹ w rozwoju produktów farmaceutycznych²⁰. Wynikiem badania będzie zrozumienie funkcjonalnej zależności łączącej atrybuty materiałów i parametry procesu z krytycznymi atrybutami jakości (CQAs)²¹. Daniel i wsp.²² omawiają wykorzystanie ram QbD specjalnie w produkcji platform RNA: nasz schemat postępowania mógłby zostać wykorzystany jako narzędzie w ramach tego podejścia.

Protokół

Eksperyment opisany w sekcji Reprezentatywne wyniki został przeprowadzony zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, a procedury wykonano według wytycznych ustalonych przez naszą Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC). Samice myszy Balb/C w wieku 6-8 tygodni zostały pozyskane z drogi komercyjnej. Zwierzęta otrzymywały standardową karmę i wodę ad libitum oraz były utrzymywane w standardowych warunkach przy 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, w temperaturze 65-75 °F (~18-23 °C) i wilgotności 40-60%.

1. Rejestracja celu badania, odpowiedzi i czynników

UWAGA: W całym niniejszym protokole do projektowania i analizy eksperymentu wykorzystano oprogramowanie JMP 17 Pro. Można zastosować równoważne oprogramowanie, postępując zgodnie z podobnymi krokami. Przykłady i dalsze instrukcje do wszystkich etapów opisanych w Sekcji 1 znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.

1. Podsumuj cel eksperymentu w dokumencie opatrzonym datą.
2. Wymień główne odpowiedzi (CQAs), które będą mierzone podczas eksperymentu.
3. Wymień wszelkie odpowiedzi wtórne (np. ograniczenia w zakresie właściwości fizykochemicznych), które mogą być mierzone.
4. Wymień parametry procesu, które mogą być powiązane z odpowiedziami, w tym te, które są najistotniejsze dla celu badania.
5. Jeśli badanie będzie trwało kilka dni, uwzględnij kategoryczny czynnik „blokowania” (blocking) dla Dnia.
   UWAGA: Pozwala to zrównoważyć ustawienia czynników w poszczególnych dniach, aby zapobiec myleniu przesunięć średniej procesu na poziomie dziennym z czynnikami badania.
6. Wybierz czynniki, które będą zmieniane oraz te, które pozostaną stałe podczas badania.
   UWAGA: Do wyboru najbardziej istotnego podzbioru czynników należy użyć narzędzi priorytetyzacji ryzyka, takich jak analiza rodzajów i skutków błędów (FMEA)²⁰ (Rysunek 2). Zazwyczaj wszystkie lipidy powinny być zmienne; jednak w niektórych przypadkach z ograniczeniami budżetowymi uzasadnione jest ustalenie stałego stosunku PEG.
7. Określ zakresy dla czynników zmiennych oraz odpowiednią precyzję dziesiętną dla każdego z nich.
8. Ustal wielkość projektu badania (liczbę unikalnych partii cząsteczek), korzystając z heurystyk minimum i maksimum. Ręcznie dołączone serie kontrolne (benchmark) nie wliczają się do liczby serii zalecanej przez heurystyki.
   UWAGA: Poniższe heurystyki zakładają, że odpowiedzi są ciągłe. Heurystyka minimum zakłada, że w razie potrzeby możliwe będzie przeprowadzenie badania uzupełniającego, oprócz serii potwierdzających dla kandydatów na optymalne formulacje. Jeśli możliwe będzie przeprowadzenie jedynie serii potwierdzających, lepiej zaplanować liczbę serii wynikającą z heurystyki maksimum. W przypadku binarnych odpowiedzi głównych należy skonsultować się ze statystykiem w celu określenia odpowiedniej liczby serii.
   1. Heurystyka minimum: Przeznacz trzy serie na każdy czynnik mieszaniny, dwie na każdy ciągły czynnik procesu i jedną na każdy poziom każdego czynnika kategorycznego.
      UWAGA: Dla badania z czterema czynnikami lipidowymi, dwoma ciągłymi i jedną trójstopniową kategoryczną zmienną procesową, daje to sugestię (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 serii wypełniających przestrzeń. Dodaj kolejne serie, jeśli niektóre mogą nie udać się z powodu problemów z formulacją lub pomiarem.
   2. Heurystyka maksimum: Uruchom oprogramowanie do budowania projektów optymalnych i wprowadź wymagane parametry dla drugiego rzędu (w tym efekty główne, interakcje dwukierunkowe między wszystkimi efektami oraz efekty kwadratowe dla ciągłych czynników procesu). Oblicz minimalną liczbę serii zgodnie z algorytmem oprogramowania. Do wyniku uzyskanego z oprogramowania dodaj 1, aby zdefiniować heurystykę maksimum.
      UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące wykonania tych kroków znajdują się w Pliku uzupełniającym 1. Przykładowy przypadek z czterema czynnikami lipidowymi, dwoma ciągłymi i jedną trójstopniową kategoryczną zmienną procesową, prowadzi do zalecanej liczby 34 serii (33 z rekomendacji oprogramowania + 1). Wszelkie dodatkowe serie prawdopodobnie lepiej wykorzystać do potwierdzeń lub badań uzupełniających.

Rysunek 2: Diagram przyczyn i skutków. Diagram przedstawia typowe czynniki w problemie optymalizacji formulacji LNP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Tworzenie tablicy projektowej z wykorzystaniem projektu wypełniającego przestrzeń

1. Otwórz program JMP i przejdź w pasku menu do DOE (planowanie eksperymentów) > Cel specjalny > Projekt wypełniający przestrzeń.
2. Wprowadź odpowiedzi z badania (patrz Plik uzupełniający 1).
3. Opcjonalnie: Dodaj kolumny dla dodatkowych odpowiedzi, wskazując poprzez kliknięcie, czy każda z nich ma być maksymalizowana, minimalizowana czy osiągać wartość docelową Dodaj odpowiedź.
   UWAGA: Ustawienia te można zmodyfikować w późniejszym czasie i nie wpływają one na projekt. Podobnie, po utworzeniu tabeli projektu można dodać dodatkowe kolumny na kolejne odpowiedzi.
4. Wprowadź czynniki badania oraz odpowiadające im zakresy. Użyj Mieszanina przycisk do dodawania czynników mieszaniny, the Ciągły przycisk dodawania czynników ciągłych lub Kategoryczny przycisk do dodawania czynników kategorycznych.
   UWAGA: W niniejszym badaniu przykładu zastosowano czynniki i zakresy przedstawione w Rycina 3w tym ułamowy stosunek molowy lipidów jonizowalnych (w zakresie od 0,1 do 0,6), ułamowy stosunek molowy lipidów pomocniczych (również od 0,1 do 0,6), ułamowy stosunek molowy cholesterolu (od 0,1 do 0,6), ułamowy stosunek molowy PEG (od 0,01 do 0,05) oraz typ lipidu jonizowalnego (który może być H101, H102 lub H103).
5. Wprowadź do programu wcześniej określoną liczbę powtórzeń dla projektu do Liczba powtórzeń dziedzina
6. Opcjonalnie: Zwiększyć Średnia wielkość klastra z domyślnej wartości 50 na 2000 za pomocą menu z czerwonym trójkątem obok Projekt wypełniający przestrzeń nagłówek oraz w Opcje zaawansowane podmenu
   UWAGA: Jest to ustawienie algorytmu wypełniania przestrzeni, które może prowadzić do nieco lepszej konstrukcji projektu kosztem dodatkowego czasu obliczeń.
7. Wygeneruj tabelę planu wypełniającego przestrzeń dla wybranych czynników i liczby prób. Kliknij Szybkie elastyczne napełnianie, a następnie kliknij Utwórz tabelę.
   UWAGA: Przedstawiono dwa pierwsze przebiegi z przykładowego projektu w Rycina 4.
8. Dodaj a Notatki kolumnę do tabeli w celu adnotacji wszystkich ręcznie utworzonych serii. Kliknij dwukrotnie pierwszy pusty nagłówek kolumny, aby dodać kolumnę, a następnie kliknij dwukrotnie nagłówek nowej kolumny, aby edytować jej nazwę.
9. Jeśli dotyczy, należy ręcznie wprowadzić poziomy kontrolne do tabeli projektu. Należy uwzględnić powtórzenie dla jednego z poziomów kontrolnych. Nazwę poziomu kontrolnego należy zaznaczyć w Uwagi ułożyć w kolumnie i oznaczyć kolorami wiersze z powtórzeniami referencyjnymi, aby ułatwić ich identyfikację na wykresie.
   1. Aby dodać nowy wiersz, należy dwukrotnie kliknąć nagłówek pierwszego pustego wiersza, a następnie wprowadzić ustawienia czynnika odniesienia. Powiel ten wiersz, aby utworzyć powtórzenie pomiaru odniesienia. Zaznacz oba wiersze i przejdź do Wiersze > Kolory w celu przypisania koloru do celów graficznych.
      UWAGA: Powtórzenie pozwala na uzyskanie niezależnej od modelu oceny wariancji procesu oraz wariancji analitycznej i dostarczy dodatkowych informacji w formie graficznej.
10. Jeśli jakiekolwiek próby kontrolne punktów odniesienia wykraczają poza zakres czynników badania, należy zaznaczyć to w "Uwagi" kolumna do późniejszego wykluczenia z analizy.
11. Zaokrąglij czynniki mieszaniny do odpowiedniej ziarnistości. Aby to zrobić,
    1. Zaznacz nagłówki kolumn dla czynników mieszaniny, kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z nagłówków kolumn i przejdź do Nowa kolumna formuły > Przekształć > Runda…wprowadź odpowiedni interwał zaokrąglania i kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    2. Upewnij się, że żadne wiersze nie są zaznaczone, klikając trójkąt w lewym górnym rogu na przecięciu nagłówków wierszy i kolumn.
    3. Skopiuj wartości z nowo utworzonych kolumn z zaokrąglonymi wartościami (Ctrl + C) i wklej (Ctrl + V) do oryginalnych kolumn z mieszaniną. Na koniec usuń tymczasowe kolumny z wartościami zaokrąglonymi.
12. Po zaokrągleniu proporcji lipidów należy zweryfikować, czy ich suma wynosi 100%, wybierając nagłówki kolumn dla czynników mieszaniny, klikając prawym przyciskiem myszy na jeden z nich i przechodząc do Nowa kolumna formuły > Połączyć > SumaJeśli suma w którymkolwiek wierszu nie jest równa 1, należy ręcznie skorygować jeden z czynników mieszaniny, upewniając się, że wartość czynnika pozostaje w określonym zakresie. Po dokonaniu korekt należy usunąć kolumnę z sumą.
13. Zastosuj tę samą procedurę, która została użyta do zaokrąglania czynników mieszaniny, aby zaokrąglić czynniki procesu do ich odpowiedniej ziarnistości.
14. Sformatuj kolumny z lipidami tak, aby wyświetlały się jako wartości procentowe z żądaną liczbą miejsc po przecinku: zaznacz nagłówki kolumn, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Standaryzacja atrybutów...W następnym oknie ustaw Format Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Procent i dostosuj liczbę miejsc po przecinku w razie potrzeby.
15. Jeśli dodawane są uruchomienia ręczne, np. pomiary referencyjne, należy ponownie zrandomizować kolejność wierszy w tabeli: dodaj nową kolumnę z wartościami losowymi (kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek ostatniej kolumny i wybierz Nowa kolumna formuły > Losowy > Rozkład normalny losowy). Posortuj tę kolumnę w kolejności rosnącej, klikając prawym przyciskiem myszy na jej nagłówku, a następnie usuń tę kolumnę.
16. Opcjonalnie: dodać Identyfikator serii kolumna. Wypełnij ją bieżącą datą, nazwą eksperymentu oraz numerem wiersza z tabeli.
    UWAGA: Patrz (Rysunek 5) jako przykład.
17. Wygeneruj wykresy trójskładnikowe w celu wizualizacji punktów planu w odniesieniu do czynników lipidowych (Rysunek 6). Należy również zbadać rozkład prób w zależności od czynników procesu (Rysunek 7wybierz Wykres > Wykres trójskładnikowyWybierz wyłącznie czynniki mieszaniny dla X, wykreślanie.
18. Aby zbadać rozkład w odniesieniu do czynników procesu, należy wybrać Analizuj > Rozprzestrzenianie i wprowadź parametry procesu dla Y, Kolumny.
    UWAGA: Specjalista ds. formulacji powinien potwierdzić wykonalność wszystkich serii badawczych. W przypadku stwierdzenia serii niewykonalnych należy zrestartować projekt, uwzględniając nowo zidentyfikowane ograniczenia.

Rysunek 3: Czynniki i zakresy badania. Zrzuty ekranu ustawień w oprogramowaniu eksperymentalnym są przydatne do odtworzenia konfiguracji badania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wstępne wyniki dla projektu wypełniania przestrzeni (space-filling design). Przedstawiono dwa pierwsze wiersze tabeli; ustawienia należy zaokrąglić do pożądanej precyzji, upewniając się jednocześnie, że suma ilości lipidów wynosi 1. Wartość odniesienia (benchmark) została dodana do tabeli ręcznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Sformatowana tabela badania. Poziomy czynników zostały zaokrąglone i sformatowane, a dodatkowo dodano kolumnę Run ID. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Punkty projektowe na wykresie trójskładnikowym. 23 formulacje przedstawiono jako funkcję odpowiadających im stosunków składników jonizowalnych, pomocniczych oraz „innych” (cholesterol+PEG). Zielony punkt w centrum reprezentuje referencyjny stosunek molowy 33:33:33:1 składnika jonizowalnego (H101):cholesterolu:składnika pomocniczego (DOPE):PEG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Rozkład czynników procesowych niebędących mieszaninami w eksperymencie. Histogramy przedstawiają rozmieszczenie serii eksperymentalnych w zależności od typu lipidu jonizowalnego, stosunku N:P oraz szybkości przepływu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Przeprowadzenie eksperymentu

1. Przeprowadź eksperyment w kolejności określonej w tabeli planu doświadczalnego. Zapisz odczyty w kolumnach wbudowanych w tabelę eksperymentalną.
2. Jeśli dla tej samej odpowiedzi przeprowadzono wiele analiz na identycznej partii formulacji, oblicz średnią z tych wyników w obrębie każdej partii. Dodaj do tabeli kolumnę dla każdego pomiaru analizy.
   1. Aby uzyskać średnią, zaznacz wszystkie powiązane kolumny, kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z wybranych nagłówków kolumn i wybierz New Formula Column > Combine > Average. Użyj tej kolumny Average do przyszłej analizy odpowiedzi.
      UWAGA: Bez ponownego rozpoczynania procedury przygotowania, powtórne pomiary analizy rejestrują jedynie wariancję analizy i nie stanowią niezależnych powtórzeń.
3. Każdy przypadek wytrącenia formulacji lub problemy z tolerancją in vivo (takie jak znaczna utrata masy ciała lub śmierć) udokumentuj za pomocą wskaźników binarnych (0/1) w nowej kolumnie dla każdego rodzaju problemu.

4. Analiza wyników eksperymentu

1. Przedstaw odczyty na wykresach i zbadaj rozkłady odpowiedzi: otwórz Graph > Graph Builder i przeciągnij każdą odpowiedź do obszaru Y, aby utworzyć indywidualne wykresy. Powtórz tę czynność dla wszystkich odpowiedzi.
2. Zbadaj względną odległość między zakodowanymi kolorami powtórzeniami serii, jeśli takie zostały uwzględnione. Pozwala to na zrozumienie całkowitej zmienności (procesowej i analitycznej) w punkcie odniesienia w porównaniu do zmienności wynikającej ze zmian ustawień czynników w całej przestrzeni czynników (Rycina 8).
3. Określ, czy odpowiedź surowa powinna zostać zamodelowana, czy też należy zamiast tego zastosować transformację. Dla odpowiedzi ograniczonych do wartości dodatnich, ale nieograniczonych od góry (np. aktywność), dopasuj do wyników eksperymentalnych zarówno rozkład normalny, jak i lognormalny. Jeśli rozkład lognormalny pasuje lepiej, wykazując niższe AICc (skorygowane kryterium informacyjne Akaike), zastosuj transformację logarytmiczną tej odpowiedzi.
   1. Przejdź do Analyze > Distribution i wybierz odpowiedź dla Y, Columns. W powstałym raporcie rozkładu kliknij czerwony trójkąt obok nazwy odpowiedzi i z menu rozwijanego wybierz Continuous Fit > Fit Normal oraz Continuous Fit > Fit Lognormal. W następnym raporcie Compare Distributions sprawdź wartości AICc, aby ustalić, który rozkład lepiej pasuje do odpowiedzi.
   2. Aby wykonać transformację logarytmiczną, kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny odpowiedzi i wybierz New Formula Column > Log > Log. Po zbudowaniu modelu i zapisaniu kolumny przewidywań w skali logarytmicznej, przekształć odpowiedź z powrotem do skali pierwotnej, wybierając New Formula Column > Log > Exp.
   3. Dla odpowiedzi będących proporcjami ograniczonymi między 0 a 1, porównaj dopasowanie rozkładu normalnego i beta. Jeśli rozkład beta ma niższe AICc, wykonaj transformację logitową. W raporcie Distribution dla danej odpowiedzi wybierz Continuous Fit > Fit Normal oraz Continuous Fit > Fit Beta.
      1. W celu wykonania transformacji logitowej kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny odpowiedzi w tabeli danych i wybierz New Formula Column > Specialty > Logit. Po zbudowaniu modelu zapisz kolumnę przewidywań. Aby powrócić do skali pierwotnej, użyj New Formula Column > Specialty > Logistic.
         UWAGA: Analiza SVEM oparta na regresji jest odporna na odstępstwa od normalności rozkładu odpowiedzi. Jednakże transformacje te mogą ułatwić interpretację wyników i poprawić dopasowanie modeli.
4. Przedstaw serie na wykresie trójskładnikowym. Pokoloruj punkty zgodnie z odpowiedziami (lub przekształconymi odpowiedziami, jeśli zastosowano transformację): otwórz Graph > Ternary Plot. Wybierz tylko czynniki mieszanin dla X, Plotting. Kliknij prawym przyciskiem myszy na dowolnym z powstałych wykresów, wybierz Row Legend, a następnie wybierz kolumnę (przekształconej) odpowiedzi.
   UWAGA: Kolorowanie punktów zgodnie z odpowiedziami daje niezależny od modelu wizualny wgląd w zachowanie w relacji do czynników mieszaniny.
5. Usuń skrypt  Model wygenerowany przez Space-Filling Design. 
6. Zbuduj niezależny model dla każdej odpowiedzi jako funkcji czynników badania, powtarzając następujące kroki dla każdej odpowiedzi.
   UWAGA: W przypadku wtórnej odpowiedzi binarnej (np. niepowodzenie formulacji lub śmierć myszy), zamodeluj również tę odpowiedź. Zmień ustawienie docelowego rozkładu z Normal na Binomial.
7. Skonstruuj model „pełny” obejmujący wszystkie kandydackie efekty. Model ten powinien zawierać efekty główne każdego czynnika, interakcje dwu- i trójdrożne, wyrazy kwadratowe i częściowe sześciany dla czynników procesowych oraz sześciany Scheffé dla czynników mieszaniny^23,24.
   UWAGA: Użyj tego samego zestawu efektów kandydackich dla każdej odpowiedzi. Technika selekcji modelu SVEM niezależnie doprecyzuje modele dla każdej odpowiedzi, co może skutkować unikalnymi modelami zredukowanymi dla każdej z nich. Rycina 9 ilustruje niektóre z tych efektów kandydackich. Następujące podkroki szczegółowo opisują ten proces.
   1. Wybierz Analyze > Fit Model.
   2. Upewnij się, że czynniki blokujące (np. Day) nie mogą wchodzić w interakcje z innymi czynnikami badania. Wybierz dowolne czynniki blokujące i kliknij Add. Nie uwzględniaj tych czynników w żadnym z kolejnych podkroków.
      UWAGA: Czynniki blokujące są ważne do uwzględnienia w modelu, ale nie powinny wchodzić w interakcje z innymi czynnikami badania. Głównym celem czynników blokujących jest pomoc w kontrolowaniu zmienności eksperymentu i zwiększenie jego czułości.
   3. Zaznacz wszystkie czynniki badania. Zmień wartość w polu Degree na 3 (domyślnie ustawiona jest na 2). Kliknij Factorial to Degree.
      UWAGA: Czynność ta uwzględnia w modelu efekty główne oraz interakcje dwu- i trójdrożne.
   4. W oknie wyboru zaznacz tylko czynniki niebędące mieszaninami. Kliknij Macros > Partial Cubic.
      UWAGA: Czynność ta wprowadza do modelu efekty kwadratowe dla ciągłych czynników procesowych oraz ich interakcje z innymi czynnikami niebędącymi mieszaninami.
   5. Wybierz z listy tylko czynniki mieszaniny. Kliknij Macros > Scheffe Cubic. Dezaktywuj domyślną opcję No Intercept (patrz Rycina 9).
      UWAGA: Uwzględnienie wyrazu wolnego (intercept) w modelu jest niezbędnym krokiem przy stosowaniu metod Lasso i jest również pomocne w kontekście selekcji w przód (forward selection). Tradycyjne domyślne ustawienie No Intercept jest zazwyczaj stosowane, ponieważ dopasowanie wyrazu wolnego jednocześnie ze wszystkimi głównymi efektami mieszaniny, bez modyfikacji takich jak podejście SVEM, nie jest możliwe przy użyciu standardowej procedury regresji najmniejszych kwadratów¹².
   6. Określ kolumnę odpowiedzi: zaznacz kolumnę odpowiedzi i kliknij Y.
   7. Zmień ustawienie Personality na Generalized Regression. Pozostaw ustawienie Distribution na Normal.
   8. Zapisz tę konfigurację modelu w tabeli danych do użytku z dodatkowymi odpowiedziami, klikając menu czerwonego trójkąta obok Model Specification i wybierając Save to Data Table.
8. Zastosuj metodę selekcji w przód SVEM, aby dopasować model zredukowany, bez obowiązkowego uwzględniania głównych efektów czynnika mieszaniny, i zapisz kolumnę formuły przewidywań w tabeli danych.
   1. Z okna dialogowego Fit Model kliknij Run.
   2. Dla Estimation Method wybierz SVEM Forward Selection.
   3. Rozwiń menu Advanced Controls > Force Terms i odznacz pola powiązane z głównymi efektami mieszaniny. Tylko pole wyrazu Intercept powinno pozostać zaznaczone. Rycina 10 przedstawia domyślną konfigurację, w której efekty główne są wymuszone. W tym kroku pola te muszą zostać odznaczone, aby model mógł uwzględnić lub wykluczyć te efekty na podstawie procedury selekcji w przód.
   4. Kliknij Go, aby uruchomić procedurę SVEM Forward Selection.
9. Przedstaw odpowiedzi rzeczywiste względem odpowiedzi przewidywanych przez model SVEM, aby zweryfikować rozsądną zdolność predykcyjną (Rycina 11). Kliknij czerwony trójkąt obok SVEM Forward Selection i wybierz Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Kliknij czerwony trójkąt obok SVEM Forward Selection i wybierz Save Columns > Save Prediction Formula, aby utworzyć w tabeli danych nową kolumnę zawierającą formułę przewidywań.
11. Opcjonalnie: Powtórz powyższe kroki, używając SVEM Lasso jako Estimation Method, aby sprawdzić, czy po wykonaniu kolejnych kroków zostanie zasugerowana inna optymalna receptura. Jeśli tak, przeprowadź obie receptury jako serie potwierdzające (omówione w sekcji 5), aby zobaczyć, która z nich sprawdza się najlepiej w praktyce¹².
12. Powtórz kroki budowania modelu dla każdej odpowiedzi.
13. Po zapisaniu w tabeli danych kolumn przewidywań dla wszystkich odpowiedzi, przedstaw przebiegi odpowiedzi dla wszystkich przewidywanych kolumn odpowiedzi za pomocą platformy Profiler: wybierz Graph > Profiler, zaznacz wszystkie kolumny przewidywań utworzone w poprzednim kroku dla Y, Prediction Formula i kliknij OK (Rycina 12).
14. Zidentyfikuj kandydatów na optymalną formulację.
    1. Zdefiniuj „funkcję pożądalności” (desirability function) dla każdej odpowiedzi, określając, czy odpowiedź powinna być maksymalizowana, minimalizowana, czy dopasowana do wartości docelowej. Dla odpowiedzi głównych ustaw wagę istotności na 1,0, a dla odpowiedzi wtórnych na 0,2. Z menu czerwonego trójkąta Prediction Profiler wybierz Optimization and Desirability > Desirability Functions, a następnie Optimization and Desirability > Set Desirabilities. Wprowadź ustawienia w kolejnych oknach.
       UWAGA: Wagi istotności są względne i subiektywne, dlatego warto sprawdzić czułość połączonego optimum na zmiany tych wag w rozsądnym zakresie (np. od równych wag do proporcji 1:5).
    2. Poleć Profilerowi znalezienie optymalnych ustawień czynników, które maksymalizują funkcję pożądalności (Rycina 12): z Profilera wybierz Optimization and Desirability > Maximize Desirability.
       UWAGA: Przewidywane wartości odpowiedzi dla optymalnych kandydatów mogą zawyżać wartość odpowiedzi o prawostronnym skośności, takich jak aktywność; jednakże serie potwierdzające dostarczą dokładniejszych obserwacji tych kandydackich formulacji. Głównym celem jest zlokalizowanie optymalnej formulacji (ustawień optymalnej receptury).
    3. Zapisz optymalne ustawienia czynników i odnotuj wagi istotności użyte dla każdej odpowiedzi: z menu Prediction Profiler wybierz Factor Settings > Remember Settings.
15. Opcjonalnie: Dla czynników kategorycznych, takich jak typ lipidu jonizowalnego, znajdź warunkowo optymalne formulacje dla każdego poziomu czynnika.
    1. Najpierw ustaw w profilerze pożądany poziom czynnika, następnie przytrzymaj klawisz Ctrl i kliknij lewym przyciskiem myszy wewnątrz wykresu tego czynnika i wybierz Lock Factors Setting. Wybierz Optimization and Desirability > Maximize Desirability , aby znaleźć warunkowe optimum przy zablokowanym aktualnym ustawieniu tego czynnika.
    2. Odblokuj ustawienia czynnika przed kontynuacją, korzystając z tego samego menu, którego użyto do blokowania.
16. Powtórz proces optymalizacji po dostosowaniu wag istotności odpowiedzi (używając Optimization and Desirability > Set Desirabilities), być może optymalizując tylko odpowiedź/odpowiedzi główne lub nadając niektórym odpowiedziom wtórnym większą lub mniejszą wagę istotności, lub ustawiając cel odpowiedzi wtórnych na None (Rycina 13).
17. Zapisz nowego optymalnego kandydata (z menu Prediction Profiler wybierz Factor Settings > Remember Settings.)
18. Utwórz graficzne podsumowania optymalnych obszarów przestrzeni czynników: wygeneruj tabelę danych z 50 000 wierszami wypełnionymi losowo wygenerowanymi ustawieniami czynników w dopuszczalnej przestrzeni czynników, wraz z odpowiadającymi im wartościami przewidywanymi z modelu zredukowanego dla każdej z odpowiedzi oraz wspólną funkcją pożądalności.
    1. W Profilerze wybierz Output Random Table. Ustaw How many runs to simulate? na 50 000 i kliknij OK.
       UWAGA: Tworzy to nową tabelę z przewidywanymi wartościami odpowiedzi dla każdej z 50 000 formulacji. Kolumna Desirability  zależy od wag istotności dla odpowiedzi, które są aktualnie ustawione podczas wyboru opcji Output Random Table.
    2. W nowo utworzonej tabeli dodaj nową kolumnę, która oblicza percentyl kolumny Desirability. Użyj tej kolumny percentylowej na wykresach trójskładnikowych zamiast surowej kolumny Desirability. Kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny Desirability i wybierz New Formula Column > Distributional > Cumulative Probability , aby utworzyć nową kolumnę Cumulative Probability[Desirability].
    3. Wygeneruj grafikę opisaną w następnych krokach. Wielokrotnie zmieniaj schemat kolorystyczny grafik, aby wyświetlić przewidywania dla każdej odpowiedzi oraz dla kolumny Cumulative Probability[Desirability].
    4. Skonstruuj wykresy trójskładnikowe dla czterech czynników lipidowych. W tabeli przejdź do Graph > Ternary Plot, wybierz czynniki mieszaniny dla X, Plotting i kliknij OK. Kliknij prawym przyciskiem myszy na jednym z powstałych wykresów, wybierz Row Legend, a następnie wybierz kolumnę przewidywanej odpowiedzi. Zmień rozwijaną listę Colors na Jet.
       UWAGA: Pozwala to na wyświetlenie obszarów o najlepszych i najgorszych wynikach w odniesieniu do czynników lipidowych. Rycina 14 pokazuje percentyle wspólnej pożądalności przy maksymalizacji Potency (istotność=1) i minimalizacji Size (istotność=0,2), przy uśrednianiu wszystkich czynników, które nie są pokazane na osiach wykresu trójskładnikowego. Rycina 15 pokazuje surowy przewidywany rozmiar. Właściwe jest również warunkowe rozbicie tych wykresów na inne czynniki, np. poprzez utworzenie odrębnego zestawu wykresów trójskładnikowych dla każdego typu lipidu jonizowalnego za pomocą Local Data Filter (dostępnego z menu czerwonego trójkąta obok Ternary Plot).
    5. Podobnie, użyj Graph > Graph Builder, aby nanieść 50 000 pokolorowanych punktów (reprezentujących unikalne formulacje) względem procesowych czynników niebędących mieszaninami, pojedynczo lub łącznie, i poszukać zależności między odpowiedzią/odpowiedziami a czynnikiem/czynnikami. Szukaj ustawień czynników, które dają najwyższą pożądalność. Eksploruj różne kombinacje czynników na grafikach.
       UWAGA: Przy kolorowaniu wykresów używaj Cumulative Probability[Desirability], ale przy przedstawianiu pożądalności na osi pionowej względem czynników procesowych używaj surowej kolumny Desirability. Kolumnę Desirability można również umieścić na osi wizualizacji Graph > Scatterplot 3D wraz z dwoma innymi czynnikami procesowymi do eksploracji wielowymiarowej. Rycina 16 pokazuje wspólną pożądalność wszystkich formulacji, które można utworzyć z każdym z trzech typów lipidów jonizowalnych. Najbardziej pożądane formulacje wykorzystują H102, przy czym H101 oferuje niektóre potencjalnie konkurencyjne alternatywy.
    6. Zapisz Profiler i jego zapamiętane ustawienia z powrotem w tabeli danych. Kliknij czerwony trójkąt obok Profiler i wybierz Save Script > To Data Table….

Rycina 8: Odczyty mocy zaobserwowane podczas eksperymentu. Punkty przedstawiają wartości mocy zaobserwowane w 23 uruchomieniach; powtórzone uruchomienia referencyjne zaznaczono kolorem zielonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Dialog oprogramowania służący do zainicjowania analizy. Wprowadzono potencjalne efekty wraz z docelową odpowiedzią dotyczącą aktywności, a opcja No Intercept została odznaczona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Dodatkowe okno dialogowe do określania opcji SVEM. Domyślnie główne efekty lipidów są wymuszane w modelu. Ze względu na uwzględnienie punktu przecięcia (intercept), zalecamy odznaczenie tych pól, aby nie wymuszać tych efektów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 11: Wykres wartości rzeczywistych względem przewidywanych. Na wykresie przedstawiono obserwowaną Potency w zestawieniu z wartością przewidywaną dla każdej formulacji przez model SVEM. Korelacja nie musi być tak silna, jak w tym przykładzie, jednak oczekuje się wystąpienia co najmniej umiarkowanej korelacji oraz weryfikacji obecności wartości odstających. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 12: Profiler predykcji. Dwa górne rzędy wykresów przedstawiają przekroje funkcji odpowiedzi predykcyjnej dla optymalnej formulacji (zidentyfikowanej metodą SVEM). Dolny rząd wykresów przedstawia ważoną „pożądalność” (desirability) formulacji, która jest funkcją ostatniej kolumny wykresów, wskazującej, że aktywność (Potency) powinna być maksymalna, a rozmiar (Size) minimalny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 13: Trzy optymalne kandydaci na formulacje wyłonieni za pomocą SVEM-Forward Selection. Zmiana wag względnej istotności odpowiedzi może prowadzić do uzyskania różnych optymalnych formulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 14: Wykresy trójskładnikowe dla percentyla pożądalności. Wykres przedstawia 50 000 formulacji zakodowanych kolorami według percentyla pożądalności, gdzie pożądalność została ustalona z wagą istotności 1,0 dla maksymalizacji Potency oraz 0,2 dla minimalizacji rozmiaru; wykresy te pokazują, że optymalny obszar formulacji składa się z niższych wartości procentowych lipidów jonizowalnych i wyższych wartości procentowych PEG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Wykres trójskładnikowy dla przewidywanego rozmiaru. Wykres przedstawia przewidywania rozmiaru z modelu SVEM dla każdej z 50 000 formulacji. Rozmiar jest minimalizowany przy wyższych procentach lipidów pomocniczych i maksymalizowany przy niższych procentach lipidów pomocniczych. Ponieważ pozostałe czynniki zmieniają się swobodnie w obrębie 50 000 naniesionych na wykres formulacji, oznacza to, że zależność ta utrzymuje się w zakresach pozostałych czynników (PEG, szybkość przepływu itp.). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 16: Wykresy skrzypcowe przedstawiające pożądalność formulacji zawierających trzy różne typy lipidów jonizowalnych. Każdy z 50 000 punktów reprezentuje unikalną formulację z całej dopuszczalnej przestrzeni czynników. Szczyty tych rozkładów to maksymalne wartości pożądalności obliczone analitycznie za pomocą profilera predykcji. H102 posiada najwyższy szczyt i tym samym generuje optymalną formulację. Podejście SVEM do budowy modelu generującego te wyniki automatycznie odfiltrowuje czynniki nieistotne statystycznie; celem tego wykresu jest rozważenie istotności praktycznej w różnych poziomach czynników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Przebiegi potwierdzające

1. Przygotuj tabelę z listą optymalnych kandydatów zidentyfikowanych wcześniej (Rysunek 17).
   UWAGA: Wartości True Potency oraz True Size na Rysunku 17 zostały uzupełnione przy użyciu symulowanych funkcji generujących: w praktyce zostaną one uzyskane poprzez sporządzenie, a następnie zmierzenie wydajności tych receptur.
   1. Do zestawu serii kandydackich, które zostaną sporządzone i zmierzone, dołącz kontrolę referencyjną.
   2. Jeśli stwierdzono, że którakolwiek z formulacji z eksperymentu przyniosła pożądane wyniki, na przykład przewyższając wzorzec referencyjny, wybierz najlepszą z nich, dodaj do tabeli kandydatów i przetestuj ponownie wraz z nowymi formulacjami.
      UWAGA: Dodaj pożądane serie do tabeli kandydatów ręcznie lub skorzystaj z funkcji Remembered Settings w oknie Profiler, jeśli serie te pochodzą z poprzedniego eksperymentu. Zidentyfikuj numer wiersza serii, przejdź do Prediction Profiler > Factor Settings > Set to Data in Row i wprowadź numer wiersza. Następnie wybierz Prediction Profiler > Factor Settings > Remember Settings i odpowiednio je nazwij (np. „benchmark” lub „najlepsza seria z poprzedniego eksperymentu”).
   3. Kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę Remembered Settings w Profilerze i wybierz Make into Data Table.
      UWAGA: W zależności od priorytetów badania i budżetu, rozważ wykonanie powtórzeń dla każdej serii potwierdzającej, zwłaszcza w przypadku zastępowania wzorca referencyjnego. Przygotuj i przeanalizuj każdą formulację dwukrotnie, używając średniego wyniku do rankingu. Zwróć uwagę na kandydatów z szerokim zakresem odpowiedzi w dwóch powtórzeniach, ponieważ może to wskazywać na wysoką wariancję procesu.
   4. Jeśli jest to konieczne ze względu na ograniczenia budżetowe, dokonaj selekcji spośród zidentyfikowanych kandydatów, aby dostosować je do budżetu eksperymentalnego lub wyeliminować redundantnych kandydatów.
2. Przeprowadź serie potwierdzające. Sporządź formulacje i zbierz odczyty.
3. Sprawdź spójność między wynikami z oryginalnego eksperymentu a wynikami partii potwierdzającej dla wzorców referencyjnych lub innych powtórzonych receptur. Jeśli występuje duże i nieoczekiwane przesunięcie, zastanów się, co mogło do niego doprowadzić i czy możliwe jest, że wszystkie serie z partii potwierdzającej zostały dotknięte tym zjawiskiem.
4. Porównaj wydajność optymalnych formulacji kandydackich. Sprawdź, czy którykolwiek z nowych kandydatów przewyższył wzorzec referencyjny.
5. Opcjonalnie: Dodaj wyniki serii potwierdzających do tabeli eksperymentalnej i ponownie przeprowadź analizę opisaną w sekcji 4.
   UWAGA: Kolejny krok schematu postępowania zawiera instrukcje dotyczące konstrukcji badania uzupełniającego wraz z tymi seriami, jeśli jest to pożądane.

Rycina 17: Tabela dziesięciu optymalnych kandydatów do przeprowadzenia analiz potwierdzających. Wartości True Potency oraz True Size zostały uzupełnione na podstawie funkcji generujących symulację (bez uwzględnienia zmienności procesu lub analitycznej). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

6. Opcjonalnie: Zaprojektowanie badania uzupełniającego do przeprowadzenia równolegle z uruchomieniami potwierdzającymi

1. Oceń potrzebę przeprowadzenia badania uzupełniającego, biorąc pod uwagę następujące kryteria:
   1. Ustal, czy optymalna formulacja znajduje się na jednej z granic czynników i czy pożądane jest przeprowadzenie drugiego eksperymentu w celu rozszerzenia zakresu przynajmniej jednego z czynników.
   2. Oceń, czy w pierwszym eksperymencie zastosowano stosunkowo małą liczbę prób lub stosunkowo szerokie zakresy czynników i czy istnieje potrzeba „przybliżenia” zidentyfikowanego regionu optymalnego poprzez dodatkowe próby i zaktualizowaną analizę.
   3. Sprawdź, czy wprowadzany jest dodatkowy czynnik. Może to być poziom czynnika kategorycznego, takiego jak dodatkowy lipid jonizowalny, lub czynnik, który w początkowym badaniu pozostawał stały, np. stężenie buforu.
   4. Jeśli żaden z powyższych warunków nie jest spełniony, przejdź do kroku 7.
2. Przygotuj dodatkowe serie eksperymentalne, które zostaną przeprowadzone równolegle z próbami potwierdzającymi.
   1. Zdefiniuj granice czynników, zapewniając częściowe pokrycie z regionem z początkowego badania. Jeśli nie ma pokrycia, należy zaprojektować nowe badanie.
   2. Opracuj nowe serie eksperymentalne z wykorzystaniem projektu wypełniania przestrzeni (space-filling design). Wybierz DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
      UWAGA: Dla zaawansowanych użytkowników zaleca się rozważenie projektu D-optymalnego poprzez DOE > Custom Design.
   3. Po wygenerowaniu prób wypełniania przestrzeni, ręcznie dołącz dwie lub trzy próby z oryginalnego eksperymentu, które mieszczą się w nowej przestrzeni czynników. Rozmieść te próby losowo w tabeli eksperymentalnej, korzystając z kroków opisanych w sekcji 2 w celu dodania wierszy, a następnie zrandomizuj kolejność wierszy.
      UWAGA: Zostaną one wykorzystane do oszacowania ewentualnego przesunięcia średnich odpowiedzi między blokami.
   4. Połącz próby potwierdzające i nowe próby wypełniania przestrzeni w jednej tabeli i zrandomizuj kolejność prób. Użyj funkcji Tables > Concatenate, a następnie utwórz nową kolumnę losową i posortuj według niej dane, aby zrandomizować kolejność prób, zgodnie z opisem w sekcji 2.
3. Przygotuj nowe receptury i zbierz wyniki.
4. Dołącz nowe serie eksperymentalne i wyniki do oryginalnej tabeli danych eksperymentalnych, wprowadzając kolumnę experiment-ID w celu wskazania źródła każdego wyniku. Użyj funkcji Tables > Concatenate i wybierz opcję Create Source Column.
5. Zweryfikuj, czy właściwości kolumn dla każdego czynnika wyświetlają łączny zakres dla obu badań: kliknij prawym przyciskiem myszy nagłówek kolumny każdego czynnika i sprawdź zakresy właściwości Coding oraz Mixture, jeśli są dostępne.
6. Rozpocznij analizę wyników nowego eksperymentu.
   1. Uwzględnij kolumnę experiment-ID jako składnik modelu, aby służyła jako czynnik blokujący. Upewnij się, że składnik ten nie oddziałuje z czynnikami badania. Uruchom skrypt okna dialogowego Fit Model zapisany w tabeli w sekcji 4, zaznacz kolumnę experiment-ID i kliknij Add, aby dodać ją do listy potencjalnych efektów.
   2. Uruchom to okno dialogowe Fit Model na połączonej tabeli danych, aby wspólnie przeanalizować wyniki z nowego eksperymentu i początkowego badania. Postępuj zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami w celu wygenerowania zaktualizowanych kandydatów na optymalną formulację oraz podsumowań graficznych.
   3. W celu walidacji przeprowadź niezależną analizę wyników z nowego eksperymentu, pomijając wyniki z eksperymentu początkowego. Oznacza to wykonanie kroków opisanych w sekcji 4 na nowej tabeli eksperymentalnej.
   4. Upewnij się, że optymalne formulacje zidentyfikowane przez te modele ściśle pokrywają się z tymi uznanymi w analizie wspólnej.
   5. Przejrzyj podsumowania graficzne, aby potwierdzić, że zarówno wspólna, jak i indywidualna analiza nowych wyników eksperymentalnych wykazują podobne zachowanie powierzchni odpowiedzi (co oznacza, że istnieje podobna zależność między odpowiedźmi a czynnikami).
   6. Porównaj połączoną i indywidualną analizę nowych wyników z początkowym eksperymentem pod kątem spójności. Do porównania zastosuj podobne struktury wykresów i zbadaj zidentyfikowane optymalne receptury pod kątem różnic.

7. Dokumentowanie końcowych wniosków naukowych badania

1. Jeśli w wyniku badania kontrola referencyjna zmieni się na nowo zidentyfikowaną recepturę, należy odnotować nowe ustawienie i wskazać pliki z projektem oraz analizą, w których zarejestrowano jej pochodzenie.
2. Należy zachować wszystkie tabele eksperymentalne i podsumowania analiz, najlepiej w plikach z datą w nazwie, do przyszłego wglądu.

Wyniki

Podejście to zostało zwalidowane dla obu szeroko sklasyfikowanych typów lipidów: lipidów klasycznych typu MC3 oraz lipidoidów (np. C12-200), pochodzących zazwyczaj z chemii kombinatorycznej. W porównaniu z referencyjną formulacją LNP opracowaną metodą jednego czynnika na raz (OFAT), formulacje kandydujące wygenerowane za pomocą naszego schematu działania często wykazują 4- do 5-krotny wzrost skuteczności w skali logarytmicznej, co pokazano na przykład w odczytach lucyferazy z wątroby mysiej na Rysunk...

Dyskusja

Nowoczesne oprogramowanie do projektowania i analizy eksperymentów z udziałem mieszanin umożliwia naukowcom ulepszanie preparatów nanocząstek lipidowych w ustrukturyzowanym przepływie pracy, który pozwala uniknąć nieefektywnych eksperymentów OFAT. Niedawno opracowane podejście do modelowania SVEM eliminuje wiele tajemniczych modyfikacji regresji i strategii redukcji modelu, które wcześniej mogły rozpraszać naukowców zbędnymi rozważaniami statystycznymi. Po zebraniu wyników ramy analizy SVEM oferują podejście, które jest ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
JMP Pro 17.1	JMP Statystyczne Odkrycie LLC