Artykuł metodologiczny

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

DOI:

10.3791/65206

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kropelki lipidów (LDs) to wyspecjalizowane organelle, które pośredniczą w magazynowaniu lipidów i odgrywają bardzo ważną rolę w tłumieniu lipotoksyczności i zapobieganiu dysfunkcji spowodowanych przez wolne kwasy tłuszczowe (FA). Wątroba, ze względu na swoją kluczową rolę w metabolizmie tłuszczów w organizmie, jest stale zagrożona przez wewnątrzkomórkowe gromadzenie LD w postaci stłuszczenia wątroby zarówno mikropęcherzykowego, jak i makropęcherzykowego. Charakterystyka histologiczna LD jest zwykle oparta na rozpuszczalnych w tłuszczach barwnikach diazowych, takich jak barwienie czerwienią olejową O (ORO), ale szereg wad konsekwentnie utrudnia stosowanie tej analizy z próbkami wątroby. Ostatnio lipofilowe fluorofory 493/503 stały się popularne do wizualizacji i lokalizacji LD ze względu na ich szybkie pobieranie i akumulację w neutralnym rdzeniu kropli lipidów. Mimo że większość zastosowań jest dobrze opisana w hodowlach komórkowych, istnieje mniej dowodów na niezawodne stosowanie lipofilowych sond fluoroforowych jako narzędzia do obrazowania LD w próbkach tkanek. W niniejszym dokumencie proponujemy zoptymalizowany protokół oparty na dipyrrometenach boru (BODIPY) 493/503 do oceny LD w próbkach wątroby z modelu zwierzęcego stłuszczenia wątroby wywołanego dietą wysokotłuszczową (HFD). Protokół ten obejmuje przygotowanie próbki wątroby, sekcję tkanek, barwienie BODIPY 493/503, akwizycję obrazu i analizę danych. Wykazujemy zwiększoną liczbę, intensywność, stosunek powierzchni i średnicę LD w wątrobie po karmieniu HFD. Za pomocą projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D udało się zaobserwować pełną zawartość obojętnych lipidów w rdzeniu LD, które wyglądały jak prawie kuliste kropelki. Ponadto za pomocą fluoroforu BODIPY 493/503 udało nam się wyróżnić mikropęcherzyki (1 μm < d ≤ 3 μm), pęcherzyki pośrednie (3 μm < d ≤ 9 μm) oraz makropęcherzyki (d > 9 μm), co pozwoliło na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 jest niezawodnym i prostym narzędziem do charakterystyki LD w wątrobie i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kropelki lipidów (LDs), klasycznie postrzegane jako magazyny energii, są wyspecjalizowanymi organellami komórkowymi, które pośredniczą w magazynowaniu lipidów i zawierają hydrofobowy neutralny rdzeń lipidowy, który zawiera głównie estry cholesterolu i trójglicerydy (TG), otoczone monowarstwą fosfolipidową1,2,3.

LD biogeneza zachodzi w retikulum endoplazmatycznym (ER), zaczynając od syntezy triacyloglicerolu (TAG) i estrów steroli. Neutralne lipidy są dyfundowane między listkami dwuwarstwy ER w niskich stężeniach, ale łączą się w soczewki olejowe, które rosną i pączkują w prawie kuliste kropelki z błony ER, gdy ich stężenie wewnątrzkomórkowe wzrasta4. Następnie białka z dwuwarstwy ER i cytozolu, w szczególności rodzina białek perylipiny (PLIN), przemieszczają się na powierzchnie LD, aby ułatwić pączkowanie5,6,7,8,9.

Poprzez syntezę nowych kwasów tłuszczowych i fuzję lub koalescencję LD, LD rosną do różnych rozmiarów. W związku z tym rozmiar i liczba LD różnią się znacznie w zależności od typu komórek. Małe kropelki (o średnicy 300-800 nm), które są znane jako początkowe LD (iLD), mogą być tworzone przez prawie wszystkie komórki4. Później w tworzeniu LD większość komórek jest w stanie przekształcić niektóre iLD w większe rozszerzające się LD (eLD o średnicy >1 μm). Jednak tylko określone typy komórek, takie jak adipocyty i hepatocyty, mają zdolność do tworzenia gigantycznych lub przerośniętych LD (o średnicy do kilkudziesięciu mikronów)4,10.

LDs odgrywają bardzo ważną rolę w regulacji metabolizmu lipidów komórkowych, tłumieniu lipotoksyczności i zapobieganiu stresowi ER, dysfunkcji mitochondriów i ostatecznie śmierci komórek spowodowanej przez wolne kwasy tłuszczowe (FA)11,12,13,14. Co więcej, LD są również zaangażowane w regulację ekspresji genów, sekwestrację białek replikacji wirusa oraz transport i sygnalizację błonową15,16,17. Dlatego nieprawidłowa regulacja biogenezy LD jest cechą charakterystyczną chorób przewlekłych związanych z zespołem metabolicznym, otyłością, cukrzycą typu 2 (T2DM) i/lub miażdżycą, by wymienić tylko kilka18,19,20.

Wątroba, jako centrum metaboliczne, jest głównie odpowiedzialna za metabolizm lipidów poprzez przechowywanie i przetwarzanie lipidów, dlatego jest stale zagrożona lipotoksycznością21. Stłuszczenie wątroby (HS) jest powszechną cechą szeregu postępujących chorób wątroby i charakteryzuje się nadmiernym wewnątrzkomórkowym gromadzeniem lipidów w postaci cytozolowych LD, które ostatecznie mogą prowadzić do dysfunkcji metabolicznej wątroby, stanu zapalnego i zaawansowanych postaci niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby22,23,24,25. HS występuje, gdy szybkość utleniania i eksportu kwasów tłuszczowych w postaci trójglicerydów w lipoproteinach o bardzo niskiej gęstości (VLDL) jest niższa niż szybkość wychwytu kwasów tłuszczowych przez wątrobę z osocza i syntezy kwasów tłuszczowych de novo26. Nagromadzenie lipidów w wątrobie często występuje w dwóch formach - stłuszczeniu mikropęcherzykowym i makropęcherzykowym - które wykazują różne cechy cytoarchitektoniczne27. Zazwyczaj stłuszczenie mikropęcherzykowe charakteryzuje się obecnością małych LD rozproszonych po całym hepatocycie z jądrem umieszczonym centralnie, podczas gdy stłuszczenie makropęcherzykowe charakteryzuje się obecnością pojedynczego dużego LD, który zajmuje większą część hepatocytu, wypychając jądro na peryferię28,29. Warto zauważyć, że te dwa rodzaje stłuszczenia są często spotykane razem i pozostaje niejasne, w jaki sposób te dwa wzorce LD wpływają na patogenezę choroby, ponieważ dowody są nadal niespójne31,32,33,34. Jednak ten rodzaj analizy jest często stosowany jako "standard odniesienia" w badaniach przedklinicznych i klinicznych w celu zrozumienia dynamicznego zachowania LD i scharakteryzowania stłuszczenia wątroby29,34,35,36.

Biopsje wątroby, złoty standard w diagnozowaniu i ocenianiu HS, są rutynowo oceniane za pomocą histologicznej analizy hematoksyliny i eozyny (H&E), gdzie kropelki lipidów są oceniane jako niebarwione wakuole w wycinkach wątroby barwionych H&E37. Chociaż jest to dopuszczalne do oceny stłuszczenia makropęcherzyków, ten rodzaj barwienia generalnie zawęża ocenę stłuszczenia mikropęcherzyków38. Rozpuszczalne w tłuszczach barwniki diazowe, takie jak Oil Red O (ORO), są klasycznie łączone z mikroskopią jasnego pola w celu analizy wewnątrzkomórkowych zapasów lipidów, ale nadal mają one szereg wad: (i) użycie etanolu lub izopropanolu w procesie barwienia, co często powoduje zakłócenie natywnych LD i sporadyczne fuzje, mimo że komórki są unieruchomione39; (ii) czasochłonność, ponieważ roztwór ORO wymaga rozpuszczenia i filtrowania świeżego proszku ze względu na ograniczony okres przydatności do spożycia, co przyczynia się do mniej spójnych wyników; (iii) oraz fakt, że ORO barwi więcej niż tylko kropelki lipidów i często przeszacowuje stłuszczenie wątroby38.

W związku z tym, przepuszczalne dla komórek lipofilowe fluorofory, takie jak czerwień nilowa, zostały użyte zarówno w żywych, jak i stałych próbkach, aby przezwyciężyć niektóre z wyżej wymienionych ograniczeń. Jednak niespecyficzny charakter znakowania komórkowych organelli lipidowych wielokrotnie zawęża oceny LD40. Co więcej, właściwości spektralne czerwieni nilowej różnią się w zależności od polaryzacji środowiska, co często może prowadzić do przesunięć widmowych41.

Lipofilowa sonda fluorescencyjna 1,3,5,7,8-pentametylo-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (długość fali wzbudzenia: 480 nm; maksymalna emisja: 515 nm; BODIPY 493/503) wykazuje cechy hydrofobowości, które pozwalają na jego szybki wychwyt przez wewnątrzkomórkowe LD, kumuluje się w rdzeniu kropli lipidów, a następnie emituje jasnozieloną fluorescencję12. W przeciwieństwie do czerwieni nilowej, BODIPY 493/503 jest niewrażliwy na polaryzację otoczenia i wykazano, że jest bardziej selektywny, ponieważ wyświetla wysoką jasność do obrazowania LD. W celu barwienia neutralnych LD, barwnik ten może być stosowany w żywych lub utrwalonych komórkach i z powodzeniem łączony z innymi metodami barwienia i/lub etykietowania42. Kolejną zaletą barwnika jest to, że wymaga on niewielkiego wysiłku przy umieszczaniu w roztworze i jest stabilny, co eliminuje potrzebę świeżego przygotowywania go do każdego eksperymentu42. Mimo że sonda BODIPY 493/503 została z powodzeniem wykorzystana do wizualizacji lokalizacji i dynamiki LD w hodowlach komórkowych, niektóre doniesienia wykazały również niezawodne zastosowanie tego barwnika jako narzędzia do obrazowania LD w tkankach, w tym ludzkim mięśniu obszernym bocznym 43, szczurzym mięśniu płaszczkowatym42 oraz myszym jelicie44.

Niniejszym proponujemy zoptymalizowany protokół oparty na BODIPY 493/503 jako alternatywne podejście analityczne do oceny liczby LD, obszaru i średnicy w próbkach wątroby z modelu zwierzęcego stłuszczenia wątroby. Procedura ta obejmuje przygotowanie próbki wątroby, sekcję tkanek, warunki barwienia, akwizycję obrazu i analizę danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Organ ds. Dobrostanu Zwierząt Instytutu Badań Klinicznych i Biomedycznych w Coimbrze (iCBR) (ORBEA, #9/2018) i były zgodne z krajowymi i europejskimi dyrektywami dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz wytycznymi ARRIVE.

1. Projekt eksperymentalny

  1. 13-tygodniowe samce szczurów rasy Wistar trzymane są w parach w wentylowanych klatkach w kontrolowanych warunkach środowiskowych o temperaturze (22 °C ± 1 °C), wilgotności (50%-60%) i świetle (12 godzin cyklu jasnego-ciemnego) oraz z dostępem ad libitum do wody z kranu i standardowej karmy dla gryzoni.
  2. Po 2-tygodniowym okresie aklimatyzacji arbitralnie przypisz szczury do dwóch grup.
  3. Grupę kontrolną (CTRL, n = 6) i dietę wysokotłuszczową (HFD, n = 6) należy karmić odpowiednio standardową karmą i dietą wysokotłuszczową (45% kcal/tłuszcz) przez 24 tygodnie.
  4. Monitoruj masę ciała (BW) co tydzień. Rejestruj dzienne spożycie żywności i napojów na klatkę.

2. Przygotowanie próbki wątroby

  1. Rozwarstwienie wątroby
    1. Przygotuj pompę perystaltyczną: Przepuść 70% etanolu przez rurkę, podłącz igłę 27 G do końca wylotowego rurki i zalej rurkę lodowato zimnym (4 °C) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH ~ 7,4 ) (np. 200 obr./min na pompie perystaltycznej z rurką silikonową o średnicy wewnętrznej 1,6 mm, zestaw mini kroplówek dożylnych). Dostosuj do masy ciała (np. dla szczura o wadze 100-150 g użyj natężenia przepływu około 10-12 ml/min).
    2. Znieczulić szczura przez wstrzyknięcie dootrzewnowe przy użyciu protokołu znieczulenia (końcowe stężenie ketaminy = 75 mg/kg, a końcowe stężenie medetomidyny = 1 mg/kg).
      UWAGA: Upewnij się, że szczur jest całkowicie znieczulony przy użyciu metody reakcji na uszczypnięcie palca.
    3. Umieść szczura na tacy do wycinki.
    4. Dokładnie zdezynfekuj futro 70% etanolem i osusz je ręcznikiem papierowym.
    5. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery "U" przez skórę i rozetnij poniżej przepony. Następnie przetnij klatkę piersiową rostrycznie na krawędziach, aby odsłonić serce.
    6. Podczas pracy 1x PBS przełóż igłę przez lewą komorę do aorty wstępującej i zaciśnij. Następnie prawy przedsionek jest wycinany, aby umożliwić drenaż po rozpoczęciu perfuzji.
      UWAGA: Wątroba powinna zacząć blednąć, gdy krew zostanie zastąpiona PBS.
    7. Za pomocą nożyczek i kleszczy Dumonta ostrożnie usuń wątrobę i spłucz 1x PBS.
    8. Przenieś wątrobę na szalkę Petriego i zważ ją.
    9. Za pomocą skalpela pobrać próbki tkanki wątrobowej o grubości 5 mm od bocznej strony (1 cm od krawędzi) lewego płata wątroby w celu osadzania.
      UWAGA Pozostałą tkankę można przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Osadzanie tkanki wątroby
    1. Przygotuj pojemnik na suchy lód i odpowiednio oznacz krioformy identyfikatorem próbki i orientacją.
    2. Umieść kilka kropli matrycy do osadzania kriogenicznego na środku kriomoldu, aby uzyskać optymalną temperaturę cięcia (OCT).
    3. Upewnij się, że próbka tkanki jest prawidłowo zorientowana na przekrój poprzeczny.
      UWAGA: Upewnij się, że strona stykająca się z dolną częścią kriomoldu jest stroną, która zostanie podzielona na sekcje jako pierwsza.
    4. Ostrożnie upuść więcej OCT na kriomold, aż zostanie całkowicie pokryty. Staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby za pomocą zwykłych kleszczy usuń wszelkie bąbelki wewnątrz OCT.
    5. Szybko umieścić kriomold z próbką pokrytą OCT w pojemniku na suchy lód.
      UWAGA: Tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 lata.

3. Sekcja zamrożonych tkanek

  1. Wyregulować temperaturę kriostatu (komora: −21 °C; próbka: −18 °C) i włożyć nowe sterylne ostrze.
  2. Umieścić próbki w kriostacie na 30 minut, zanim temperatura się zrównoważy.
  3. Wykonaj pojedynczą warstwę OCT na krążku próbki, aby umożliwić przyleganie próbki. Poczekaj, aż OCT zamarznie i zamontuj próbkę tkanki w żądanej orientacji.
    UWAGA: Powierzchnia cięcia powinna być równoległa do ostrza. Aby zachować dobrą przyczepność, umieść ekstraktor ciepła na górze próbki. Poprzednie kroki można również wykonać w pojemniku na suchy lód z suchym lodem.
  4. Umieść próbkę w główce próbki i przytnij powierzchnię tkanki (kilka odcinków próbki tkanki o wielkości 30 μm).
  5. Gdy obszar zainteresowania będzie dostępny do przekroju, wytnij skrawki o grubości 12 μm i umieść je na oznakowanych szkiełkach mikroskopowych utrzymywanych w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Aby zebrać wycinek, powoli przesuwaj szkiełko w kierunku przekroju tkanki. Na każdym szkiełku mogą znajdować się dwa skrawki wątroby.
  6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy lub w temperaturze -80 °C przez okres do 3 lat.

4. Barwienie BODIPY

  1. Rozmrażać szkiełka w systemie barwienia szkiełek w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  2. Umyć 1x PBS (3x po 5 min).
  3. Zakreśl sekcję warstwą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego.
  4. Przygotować 500 μg/ml roztworu podstawowego BODIPY 493/503: Rozpuścić 1 mg BODIPY 493/503 w 2 ml rozpuszczalnika (90% DMSO; 10% 1x PBS). Chronić przed światłem. Sonikować w kąpieli ultradźwiękowej przez 1 godzinę (9,5-10 W) w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 dni.
  5. Przygotować roztwór barwiący BODIPY (1 μg/ml), dodając 2 μl roztworu podstawowego BODIPY 493/503 i 0,1 μl roztworu podstawowego DAPI (5 mg/ml) do 997,9 μl 1x PBS.
  6. Inkubować szkiełka (75 μl/szkiełko) z BODIPY 493/503 (1 μg/ml) i DAPI (0,1 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 40 min.
    UWAGA: Trzymaj slajdy w ciemności od tego kroku.
  7. Umyj szkiełka 1x PBS (3x po 5 min każde).
  8. Zamontuj szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego, pozostaw do wyschnięcia na 30 minut i uszczelnij je lakierem do paznokci.
    UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania.

5. Kwantyfikacja lipidów

  1. Zmierz poziom cholesterolu całkowitego i TG w surowicy za pomocą automatycznej, zwalidowanej metody i sprzętu.
  2. Zmierz poziom TG w wątrobie za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego triglicerydów (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.

6. Akwizycja obrazu

  1. Umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopu konfokalnego ze skaningowym laserem.
  2. Do wizualizacji i akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową 20x (plan-apochromat: 20x/0,8).
  3. Aby uniknąć przesłuchów między BODIPY 493/503 a DAPI, użyj trybu skanowania sekwencyjnego (najlepszy sygnał) w oprogramowaniu konfokalnym.
  4. Wzbudzić BODIPY 593/503 za pomocą linii lasera argonowego 488 nm, a DAPI za pomocą linii laserowej 405 nm. Ustaw zakresy emisji na 493-589 nm dla BODIPY 493/503 i na 410-464 nm dla DAPI.
  5. Użyj następujących ustawień: otworek: 1 AU, rozdzielczość: 1 024 pikseli x 1 024 pikseli, głębia bitowa: 12, rozmiar piksela: 0,415 μm, tryb dwukierunkowy, prędkość skanowania: 7 (~1,58 μs/piksel dla obiektywu 20x), uśrednianie linii: 2x i zoom cyfrowy: 1,
    UWAGA: Wyżej wymienione parametry skanowania muszą być zoptymalizowane dla każdego używanego mikroskopu konfokalnego i obiektywu.
  6. Ustaw odpowiednio wzmocnienie i wzmocnienie cyfrowe, aby na wskaźniku zasięgu nie zostały wykryte żadne nasycone piksele.
    UWAGA: Skoryguj sygnał tła, dostosowując przesunięcie.
  7. Po prawidłowej identyfikacji LD uzyskaj obraz za pomocą kanałów BODIPY i DAPI.
    UWAGA: Wszystkie zdjęcia muszą być wykonane w tych samych warunkach (ekspozycja i ustawienia ogólne) dla każdego kanału koloru.
  8. Aby tworzyć obrazy o dużym zasięgu (Rysunek 2), zmień obiektyw na obiektyw a10x (plan-neofluarny: 10x/0,3).
  9. Wybierz tryb skanowania kafelków i utwórz mozaiki 5 na 5 obrazów.
    UWAGA: W tej pracy każda płytka miała 10% zachodzenia na siebie, aby odpowiednio scalić płytki do analizy.
  10. Aby utworzyć widoki 3D i ortogonalne (Rysunek 3A), umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i zmień obiektyw na soczewkę obiektywową 40x (plan-neofluar: 40x/1,30 oleju).
  11. Wybierz tryb Z-Stack i dostosowując płaszczyznę Z, zdefiniuj pierwszą i ostatnią pozycję do akwizycji za pomocą warstwy optycznej o optymalnej grubości (~0,5 μm), aby upewnić się, że wszystkie kropelki zostaną wychwycone.
    UWAGA: Aby przyspieszyć akwizycję obrazu i uniknąć wybielania, plasterek optyczny można dostosować do nieoptymalnego rozmiaru, zapewniając co najmniej 30% nadpróbkowania dla dobrej rekonstrukcji 3D.
  12. Wybierz moduł Orto i utwórz widoki ortogonalne.
  13. Uzyskuj obrazy 3D, wybierając moduł 3D po trybie renderowania przezroczystości za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego.

7. Analiza obrazów

  1. Przetwarzaj i analizuj obrazy jednopłaszczyznowe (20-krotne powiększenie) za pomocą CellProfiler (wersja 4.2.5).
    UWAGA: Rurociąg użyty w tej pracy został zaadaptowany z Adomshick et al.45.
  2. Kliknij moduł Obrazy w lewym górnym rogu okna CellProfiler i prześlij obrazy jako pliki .tiff.
  3. Użyj modułu NamesAndTypes, aby sortować obrazy barwione BODIPY (kropelki) i DAPI (jądra) na podstawie nazw plików. Analizę LD należy wykonywać tylko w przypadku obrazów wybarwionych metodą BODIPY.
  4. Aby rozpocząć konstruowanie potoku, kliknij Dostosuj moduły i wybierz moduł ColorToGray, aby przekonwertować obrazy na obrazy w skali szarości.
    UWAGA: Do identyfikacji obiektów wymagane są obrazy w skali szarości.
  5. Zidentyfikuj kropelki, korzystając z modułu IdentifyPrimaryObjects przy użyciu obrazu w skali szarości.
    UWAGA: Parametry w tym module muszą być dostosowane, aby uzyskać dobrą identyfikację LD. W tej pracy zdefiniowanie LD o rozmiarze od 6 do 300 pikseli i współczynniku korekcji progu 1,0 doprowadziło do najdokładniejszej identyfikacji.
  6. Aby zmierzyć intensywność pikseli zidentyfikowanych kropelek lipidów, dodaj moduł MeasureObjectIntensity.
  7. Dodaj dodatkowy moduł FilterObjects, aby upewnić się, że tylko najsilniejsze sygnały są określane ilościowo, podczas gdy sygnały mniej intensywne są wykluczane z końcowej analizy kropelek lipidów (minimalna intensywność: 0,15; maksymalna intensywność: 1 dowolna jednostka).
  8. Aby zmierzyć LD powiązane z danymi wyjściowymi, dodaj moduł MeasureObjectSizeShape.
  9. W tym momencie dodaj moduł OverlayOutlines, aby nałożyć zidentyfikowaną kroplę na oryginalny obraz, a tym samym upewnić się, że segmentacja wygląda dokładnie również na nieprzetworzonym obrazie.
    UWAGA: Jest to krok opcjonalny (kontrola jakości).
  10. Dodaj moduł ExportToSpreadsheet na końcu i kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym rogu.

8. Analiza statystyczna

  1. Wyrazić wyniki jako średnią ± błąd standardowy średniej (S.E.M.) za pomocą dowolnej aplikacji do analizy statystycznej.
    UWAGA: W tym badaniu do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie GraphPad.
  2. Przeanalizuj rozkład wartości za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby ocenić znaczne odchylenia od normalności. Analizuj dane parametryczne za pomocą niesparowanego testu t-test Studenta.
    UWAGA: Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wykonanie tej techniki powinno skutkować wyraźnym zabarwieniem kropelek lipidów w celu jednoczesnej charakterystyki morfologii LD (kształt i gęstość rdzenia lipidowego na podstawie rekonstrukcji 3D) wraz z ich rozkładem przestrzennym, liczbą na całkowitą powierzchnię i średnią wielkością (ocenianą za pomocą opisanego powyżej rurociągu, Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oparty na fluorescencji protokół oceny LD opracowany w ramach projektu BODIPY 493/503 miał na celu opracowanie nowego podejścia do obrazowania do oceny stłuszczenia wątroby. Biorąc pod uwagę silną korelację między otyłością a stłuszczeniem wątroby, dieta wysokotłuszczowa w stylu zachodnim została wykorzystana do ustalenia zwierzęcego modelu stłuszczenia wątroby26. Znaczny wzrost zawartości TG w wątrobie został potwierdzony za pomocą ilościowego zestawu do kolorymetrycznego testu trójglicerydów, kt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Fundusze Krajowe i Europejskie za pośrednictwem Portugalskiej Fundacji Nauki i Technologii (FCT), Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (FEDER) oraz Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB), oraz POCI-01-0145-FEDER-007440. Autorzy pragną podziękować za wsparcie iLAB - Laboratorium Mikroskopii i Bioobrazowania, placówki Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu w Coimbrze i członka krajowej infrastruktury PPBI-Portugalska Platforma BioObrazowania (POCI-01-0145-FEDER-022122), a także wsparcie ze strony FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka silikonowa ID 1,6 mm, zestaw mini kroplówek IVFisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, Lyon, FrancjaD3922
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70% etanolHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Służy do projektowania figur
Automatyczny analizator Hitachi 717Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Niemcy8177-30-0010
Długopis barierowy (Liquid blocker super pap pen)Daido Sangyo Co., Ltd, Japon_
BladeLeica221052145Używany w kriostatu
Cell Profiler w wersji 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/Używany do analizy pozyskane obrazy
Szkiełka nakrywkoweMenzel-Glaser, Niemcy_
CryomoldsTissue-Tek_
Kriostat (w tym tarcza próbki i ekstraktor ciepła) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich, Lyon, FrancjaD-8418Służy do rozpuszczania produktu Bodipy w roztworze podstawowym o stężeniu 5 mg/ml. UWAGA: Toksyczny
i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia
. Manipulować w okapie oparowym
. Unikaj bezpośredniego kontaktu ze skórą.
Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne
.
Pojemnik na suchy lód (chłodziarka styropianowa)NovolabA26742
Kleszcze DumontFine Science Tools, Niemcy11295-10
Szklana szalka Petriego (H 25 mm, ø
150 mm)		Thermo Scientific150318Służy do ważenia wątroby po sekcji
GlicergelDAKO OmnisS303023
Oprogramowanie GraphPad Prism, wersja 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
Dieta wysokotłuszczowaEnvigo, Barcelona, HiszpaniaMD.08811
Ketamina (Nimatek  100 mg/mL)Dechra791/01/14DFVPTStosowany w końcowym stężeniu 75 mg/kg
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny  (Jednostka detekcyjna QUASAR; )Carl Zeiss, niemcyLSM 710 Mikroskop Axio Observer Z1
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTStosowany w końcowym stężeniu 1 mg/kg
IgłaBD mikrolance300635
nr 15 Sterylny skalpel ze stali węglowej
Ostrze		Swann-Morton205
Obiektywy 10x (Plan-Neofluar 10x/0,3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0,8) i 40x (Plan-Neofluar 40x/1,30 Oil)  Carl Zeiss, Niemcy
PędzleVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Służy do obsługi kriosekcji
Pompa perystaltyczna (Minipuls 3)Gilson1004170
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH ~ 7,4)Sigma-Aldrich, Lyon, FrancjaP3813
Rękojeść skalpela, 125 mm (5"), nr 3Swann-Morton0208
System barwienia szkiełek StainTraySimport ScientificM920
Dieta standardowa  Szkiełka mikroskopowe Mucedola4RF21
Superfrost PlusMenzel-Glaser, NiemcyJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT Nośniki montażoweVWR CHEMICALS361603E
Zestaw do prób kolorymetrycznych trójglicerydówCayman Chemical10010303
Kąpiel ultradźwiękowaBandelin Sonorex TK 52
Vannas spring Nożyczki - 3 mm
krawędź tnąca		Fine Science Tools, Niemcy15000-00
ZEN Czarne oprogramowanieZeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128(2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224(2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242(2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092(2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768(2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42(2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358(2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774(2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808(2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718(2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza kropli lipidowychbarwienie BODIPYrekonstrukcja 3Dmikroskopia konfokalnadieta wysokot uszczowatkanka w trobyobrazowanie fluorescencyjnest uszczenie makrowesykularneCell Profiler

Powiązane artykuły