Method Article

Wykorzystanie MouseWalker do ilościowego określenia dysfunkcji lokomotorycznej w mysim modelu urazu rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczono eksperymentalny potok do ilościowego opisu wzorca lokomotorycznego swobodnie chodzących myszy za pomocą zestawu narzędzi MouseWalker (MW), począwszy od wstępnych nagrań wideo i śledzenia, a skończywszy na analizie po kwantyfikacji. W celu wykazania użyteczności systemu MW wykorzystano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonywanie złożonych i wysoce skoordynowanych programów motorycznych, takich jak chodzenie i bieganie, zależy od rytmicznej aktywacji obwodów rdzeniowych i nadrdzeniowych. Po urazie rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym komunikacja z obwodami nadrzędnymi jest upośledzona. To z kolei prowadzi do utraty koordynacji, przy ograniczonym potencjale regeneracyjnym. W związku z tym, aby lepiej ocenić stopień powrotu do zdrowia po podaniu leków lub terapii, konieczne jest opracowanie nowych, bardziej szczegółowych i dokładnych narzędzi do ilościowego określania chodu, koordynacji kończyn i innych drobnych aspektów zachowania lokomotorycznego w zwierzęcych modelach uszkodzenia rdzenia kręgowego. Na przestrzeni lat opracowano kilka testów do ilościowej oceny zachowań gryzoni podczas swobodnego chodzenia; Jednak zwykle brakuje im bezpośrednich pomiarów związanych ze strategiami chodu krokowego, wzorcami śladów stóp i koordynacją. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, udostępniono zaktualizowaną wersję MouseWalker, która łączy w sobie chodnik z całkowitym wewnętrznym odbiciem (fTIR) z oprogramowaniem do śledzenia i kwantyfikacji. Ten system o otwartym kodzie źródłowym został przystosowany do wyodrębniania kilku graficznych wyników i parametrów kinematycznych, a zestaw narzędzi do post-kwantyfikacji może służyć do analizy dostarczonych danych wyjściowych. Manuskrypt ten pokazuje również, w jaki sposób ta metoda, w połączeniu z już ustalonymi testami behawioralnymi, ilościowo opisuje deficyty lokomotoryczne po urazie rdzenia kręgowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywna koordynacja czterech kończyn nie jest unikalna dla czworonogów. Koordynacja kończyn przednich i tylnych u ludzi pozostaje ważna dla wykonania kilku zadań, takich jak pływanie i zmiany prędkości podczas chodzenia1. Różne kinematyki kończyn2 i program motoryczny1,3,4, a także proprioceptywne obwody sprzężenia zwrotnego5, są zachowane między ludźmi a innymi ssakami i powinny być brane pod uwagę przy analizie opcji terapeutycznych zaburzeń motorycznych, takich jak uraz rdzenia kręgowego (SCI)6,7,8.

Aby móc chodzić, kilka połączeń kręgosłupa z kończyn przednich i tylnych musi być odpowiednio połączonych i rytmicznie aktywowanych, co wymaga danych wejściowych z mózgu i informacji zwrotnych z systemu somatosensorycznego2,9,10. Kulminacją tych połączeń są centralne generatory wzorców (CPG), które znajdują się odpowiednio na poziomie szyjnym i lędźwiowym kończyn przednich i tylnych1,9,10. Często, po SCI, zakłócenie połączeń neuronalnych i powstanie hamującej blizny glejowej12 ograniczają odzyskiwanie funkcji lokomotorycznych, a wyniki wahają się od całkowitego paraliżu do ograniczonej funkcji grupy kończyn w zależności od ciężkości urazu. Narzędzia do precyzyjnego ilościowego określania funkcji lokomotorycznych po SCI mają kluczowe znaczenie dla monitorowania powrotu do zdrowia i oceny efektów leczenia lub innych interwencji klinicznych6.

Standardowym testem metrycznym dla mysich modeli kontuzji SCI jest skala myszy Basso (BMS)13,14, nieparametryczny wynik, który uwzględnia stabilność tułowia, pozycję ogona, krok podeszwowy i koordynację kończyn przednich i tylnych kończyn na otwartym polu. Mimo że BMS jest niezwykle niezawodny w większości przypadków, wymaga co najmniej dwóch doświadczonych oceniających, aby obserwować wszystkie kąty ruchu zwierząt w celu uwzględnienia naturalnej zmienności i zmniejszenia stronniczości.

Inne testy również zostały opracowane do ilościowej oceny sprawności motorycznej po SCI. Należą do nich test rotarod, który mierzy czas spędzony na obracającym się cylindrze15; drabina pozioma, która mierzy liczbę pominiętych poręczy i dodatnich chwytów drabiny16,17; oraz test chodzenia po belce, który mierzy czas, jaki zwierzę zajmuje i liczbę niepowodzeń, jakie popełnia podczas przekraczania wąskiej belki18. Pomimo tego, że odzwierciedla kombinację deficytów motorycznych, żaden z tych testów nie dostarcza bezpośrednich informacji lokomotorycznych na temat koordynacji kończyn przednich i tylnych.

Aby dokładniej i dokładniej analizować zachowanie podczas chodzenia, opracowano inne testy do rekonstrukcji cykli kroków i strategii chodu. Jednym z przykładów jest test odcisków stóp, w którym wytatuowane łapy zwierzęcia rysują wzór na arkuszu białego papieru19. Chociaż jest prosty w wykonaniu, wyodrębnianie parametrów kinematycznych, takich jak długość kroku, jest kłopotliwe i niedokładne. Co więcej, brak parametrów dynamicznych, takich jak czas trwania cyklu kroków lub koordynacja w czasie nóg, ogranicza jego zastosowania; Rzeczywiście, te dynamiczne parametry można uzyskać tylko poprzez analizę klatka po klatce filmów gryzoni przechodzących przez przezroczystą powierzchnię. W badaniach SCI naukowcy przeanalizowali zachowanie podczas chodzenia z boku za pomocą bieżni, w tym zrekonstruowali cykl kroków i zmierzyli zmiany kątowe każdego stawu nogi4,20,21. Mimo że to podejście może być niezwykle pouczające6, nadal koncentruje się na określonym zestawie kończyn i brakuje w nim dodatkowych funkcji chodu, takich jak koordynacja.

Aby wypełnić te luki, Hamers i współpracownicy opracowali test ilościowy oparty na optycznym czujniku dotykowym wykorzystującym sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (fTIR)22. W tej metodzie światło rozchodzi się przez szkło poprzez wewnętrzne odbicie, ulega rozproszeniu po naciśnięciu łapy, a na koniec jest rejestrowane przez szybką kamerę. Niedawno udostępniono wersję tej metody o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MouseWalker, która łączy w sobie chodnik fTIR z pakietem oprogramowania do śledzenia i kwantyfikacji23. Korzystając z tej metody, użytkownik może wyodrębnić duży zestaw parametrów ilościowych, w tym wzorce kroków, przestrzennych i chodu, ułożenie odcisków stóp i koordynację kończyn przednich i tylnych, a także wyniki wizualne, takie jak wzorce odcisków stóp (naśladujące test łapy z tuszem6) lub fazy postawy względem osi ciała. Co ważne, ze względu na jego open-source'owy charakter, nowe parametry można wyodrębnić poprzez aktualizację pakietu skryptów MATLAB.

Tutaj zaktualizowano poprzednio opublikowany zestaw systemu MouseWalker23. Dostępny jest opis sposobu konfiguracji, wraz ze wszystkimi krokami wymaganymi do osiągnięcia najlepszej jakości wideo, warunkami śledzenia i pozyskiwaniem parametrów. Udostępniono również dodatkowe narzędzia do analizy ilościowej w celu usprawnienia analizy wyjściowego zestawu danych MouseWalker (MW). Wreszcie, przydatność tego narzędzia wykazano poprzez uzyskanie wymiernych wartości ogólnej sprawności lokomotorycznej, w szczególności cykli krokowych i koordynacji kończyn przednich i tylnych, w kontekście urazu rdzenia kręgowego (SCI).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z obsługą, chirurgią i opieką pooperacyjną zostały zatwierdzone przez Wewnętrzny Komitet Molekularny Instituto de Medicina (ORBEA) i Portugalską Komisję Etyki Zwierząt (DGAV) zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej (Dyrektywa 2010/63/UE) i portugalskim prawem o opiece nad zwierzętami (DL 113/2013) na podstawie licencji 0421/000/000/2022. Do niniejszego badania wykorzystano samice myszy C57Bl/6J w wieku 9 tygodni. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę zwierząt i zmniejszyć cierpienie zwierząt wykorzystanych w badaniu. Skrypt MATLAB i samodzielna wersja oprogramowania MW są open-source i są dostępne pod adresem GitHub
repozytorium (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Chociaż oprogramowanie MW zostało opracowane w MATLAB R2012b, zostało przystosowane do działania w MATLAB R2022b. Rysunek 1 ilustruje przebieg analizy MW.

1. Konfiguracja urządzenia MouseWalker (MW)

  1. Zmontuj aparaturę MW zgodnie z wcześniejszym opisem23, lub dostosuj do specyficznych potrzeb projektu eksperymentalnego (zobacz Tabelę materiałów i Rysunek Uzupełniający 1, aby uzyskać więcej informacji na temat konfiguracji).
    UWAGA: Arenę spacerową można poszerzyć, aby pomieścić większe zwierzęta, takie jak szczury.
  2. Sprawdź, czy pleksi, po której chodzą zwierzęta, jest czysta i wolna od zadrapań. Używaj gładkiej ściereczki do czyszczenia i zminimalizuj użycie rozpuszczalników organicznych, takich jak amoniak lub etanol w wysokich stężeniach, które mogą uszkodzić pleksi (3% nadtlenek wodoru, 7% etanol, lub zalecany jest dowolny kompatybilny i odpowiedni środek dezynfekujący do pleksi). W razie potrzeby wymień pleksi.
  3. Ustaw szybką kamerę z jasnym obiektywem i dużą przysłoną (tj. mniejszymi wartościami przysłony), aby uchwycić dużą ilość światła, ponieważ pomaga to rejestrować sygnały fTIR (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Obiektyw nie powinien generować zniekształceń optycznych, szczególnie na krawędziach obrazu. Zniekształcenia optyczne można przetestować, rejestrując znany wzór (np. paski lub kwadraty), a następnie mierząc rozmiar bloków na ImageJ/FIJI24 (użyj narzędzia linii, a następnie kliknij Analizuj > Zmierz). Na przykład kwadrat o rozmiarze 1 cm powinien mieć takie same wymiary w pikselach zarówno na środku obrazu, jak i na krawędziach. Odchylenia powinny być mniejsze niż 5%.
  4. Zapal wielokolorowy pasek świetlny LED z tła kasetonu.
  5. Zapal białą taśmę świetlną LED z kasetonu świetlnego chodnika.
    UWAGA: Można również użyć kolorowej diody LED25, aby ułatwić rozróżnienie footprintu/ciała/tła.
  6. Przy wyłączonych światłach w pomieszczeniu sprawdź natężenie światła w tle, w kasecie świetlnej i chodniku. W razie potrzeby wyreguluj intensywność za pomocą potencjometru lub półprzezroczystego tworzywa sztucznego. Należy je zoptymalizować tak, aby intensywność pikseli wzrastała w następującej kolejności: ciało zwierzęcia < tło < ślady stóp.
    1. Aby sprawdzić intensywność pikseli ciała/tła/śladów ciała zwierzęcia, otwórz sekwencję obrazów na ImageJ/FIJI24 i kliknij Analizuj > mierz. Sygnał śladu stopy nie powinien być przesycony, ponieważ uniemożliwi to zdefiniowanie granic śladu (tj. palców u nóg i opuszków stóp) (Rysunek uzupełniający 2).
  7. Dostosuj kontrast obrazu chodnika w oprogramowaniu do nagrywania wideo. Kontrast można regulować na dwa sposoby: przyciemniając lub zwiększając oświetlenie na taśmie LED lub regulując przysłonę obiektywu aparatu.
  8. Ustaw soczewkę prawidłowo, aby znajdowała się na tej samej wysokości i w środku lustra odbijającego 45° i prostopadle (90°) do chodnika. Spowoduje to wygenerowanie stale proporcjonalnego obrazu wzdłuż chodnika po lewej i prawej stronie.
    UWAGA: Unikaj zmiany pozycji kamery (odległości, wysokości i orientacji) podczas wielu sesji nagrywania. W razie potrzeby zaznacz podłogę, na której należy umieścić statyw. Pozwoli to zachować cechy obrazu.
  9. Ustaw ostrość obiektywu na powierzchni pleksi. Można to sprawdzić za pomocą nieuszkadzającego przedmiotu dotykającego powierzchni pleksi.
    UWAGA: Przy niższych wartościach przysłony obiektywu głębia ostrości zmniejszy się, co utrudni ustawianie ostrości.
  10. Upewnij się, że wszystkie ustawienia pozostają niezmienione podczas testu, ponieważ mogą one zmienić intensywność pikseli nagranych filmów.

2. Akwizycja wideo

  1. Upewnij się, że myszy są zaznajomione z pomieszczeniem i aparaturą przed badaniem. Zaoszczędź co najmniej 1 dzień na przyzwyczajenie (dzień 0). Aby uniknąć nadmiernego treningu, wykonaj test MW w innym dniu niż pozostałe testy behawioralne (najlepiej dzień później).
  2. W oprogramowaniu do nagrywania wideo upewnij się, że widoczne jest co najmniej 50 cm chodnika.
  3. Dostosuj ustawienia nagrywania, aby obciąć region chodnika. Zmniejszy to rozmiar wideo i zoptymalizuje pozyskiwanie wideo.
  4. Zrób zdjęcie lub krótki film zwykłej linijki przed każdą sesją. Liczba pikseli na centymetr zostanie później wykorzystana w "oknie ustawień" do kalibracji filmów.
  5. Rozpocznij nagrywanie wideo i umieść zwierzę na krawędzi chodnika, chwytając podstawę ogona, aby uniknąć obrażeń. Upewnij się, że zwierzęta przesuwają się do przodu do skrajnej krawędzi platformy. Wykonuj nagrania wideo z co najmniej 100 klatkami na sekundę, aby zapewnić płynne przejścia chodu.
    1. W razie potrzeby zmotywuj zwierzęta do ruchu, delikatnie stukając w ścianę chodnika lub pstrykając/klaszcząc palcami. Unikaj jednak fizycznego szturchnięcia, ponieważ może to wpłynąć na wyniki.
    2. Zapisuj filmy bezpośrednio jako sekwencje obrazów w formacie TIFF (z kompresją LZW), JPEG lub PNG. W przypadku, gdy kamera nagrywa jako plik RAW MOV, przekonwertuj filmy na sekwencje obrazów, otwierając plik w ImageJ/FIJI24 i klikając File > Save as > Image sequence (lub za pomocą innego oprogramowania, takiego jak LosslessCut25).
      UWAGA: Większość zwierząt zaczyna chodzić natychmiast po umieszczeniu ich na chodniku; Dlatego zaleca się rozpoczęcie akwizycji wideo przed umieszczeniem zwierzęcia.

3. Przygotowanie filmów do oprogramowania śledzącego MW

  1. Sfilmuj wystarczająco dużo pełnych przebiegów każdej myszy z osobna. Liczba zwierząt do sfilmowania w danym warunku oraz liczba pełnych serii muszą być ustalone zgodnie z każdym planem doświadczalnym. Pełny bieg ma miejsce, gdy mysz przechodzi pełne 50 cm chodnika bez dłuższych zatrzymań (w tym eksperymencie wybrano trzy pełne biegi).
    UWAGA: W zależności od oprogramowania do akwizycji obrazów, może być konieczne przycięcie filmów do najmniejszego zwrotu z inwestycji. Zwiększy to szybkość śledzenia i generowania danych wyjściowych.
  2. W ImageJ/FIJI24 wybierz klatki, w których znajduje się mysz na ekranie, klikając Image > Stack > Tools > Create a substack. Śledzenie na MW wymaga, aby głowa i ogon były widoczne we wszystkich ramkach. Możliwe jest jednak wykonanie kilku substacków z jednego nagrania wideo, które później będą reprezentować każdy przebieg.
  3. Zapisz każdy podstos osobno w różnych folderach, klikając Plik > Zapisz jako >sekwencję obrazu. Później oprogramowanie MW automatycznie tworzy podfolder w każdym katalogu za każdym razem, gdy rozpoczyna się analiza przebiegu.

4. Śledzenie

  1. Otwórz program MATLAB, dodaj folder zawierający skrypt MW do katalogu roboczego i uruchom "MouseWalker.m" w głównym wierszu poleceń.
    UWAGA: Korzystanie z oprogramowania MW w MATLAB umożliwia śledzenie komunikatów o błędach na głównej konsoli MATLAB i wybranie żądanych danych wyjściowych (poprzez otwarcie głównego pliku skryptu "MouseEvaluate.m" i zmianę wyników na 1 lub 0: plik Excel, wykresy kroków, ślady postawy i wzorce chodu).
  2. Załaduj folder wideo jako "Katalog wejściowy". Można także wybrać folder wyjściowy; jednak nie jest to wymóg, ponieważ oprogramowanie MW automatycznie tworzy nowy folder o nazwie "Wyniki" w "Katalogu wejściowym".
  3. Za pomocą strzałek "<<", "<", ">>" i ">" sprawdź, czy wszystkie klatki wideo są poprawnie załadowane w oprogramowaniu MW.
  4. Przejdź do "Okna ustawień", w którym znajdują się wszystkie parametry kalibracji i progu. Ustawienia te mogą się zmieniać w zależności od intensywności pikseli tła i footprintów, a także od minimalnego rozmiaru bryły i footprintów oraz innych czynników (patrz przykład na rysunku uzupełniającym 2). Przetestuj efekt zmiany niektórych parametrów, klikając przycisk Podgląd.
    1. Użyj różnych stylów wydruku, w tym "bryła + stopy + ogon", "tylko bryła", "tylko stopy" i "tylko ogon", aby ułatwić rozróżnianie części bryły po dostosowaniu parametrów progowych.
    2. Skorzystaj z narzędzi na panelu po prawej stronie, aby dokonać pomiarów jasności lub rozmiaru (odpowiednio za pomocą przycisków "jasność" i "linijka"). Wszystkie ustawienia można zapisać jako "domyślne", o ile odległość kamery pozostaje taka sama.
  5. Po dostosowaniu parametrów progowych sprawdź, czy film jest gotowy do automatycznego śledzenia. Przejdź do pierwszej klatki i kliknij Auto, aby rozpocząć śledzenie. Ten krok można wykonać w czasie rzeczywistym i zajmuje to kilka minut, w zależności od rozmiaru wideo i wydajności komputera.
    1. Jeśli automatyczne śledzenie nieprawidłowo oznacza cechy ciała, anuluj automatyczne śledzenie, wprowadź nowe ustawienia i uruchom ponownie proces.
  6. Po zakończeniu śledzenia sprawdź, czy potrzebna jest ręczna korekta. Aby skorygować, użyj środkowego panelu, aby zaznaczyć lub odznaczyć i wskaż położenie śladów łap po prawej stronie przedniej (RF), prawej tylnej (RH), lewej przedniej (LF) i lewej tylnej (LH), głowie, nosie, tułowiu (podzielonych na dwa segmenty) i ogona (podzielonych na cztery segmenty). Zapisz zmiany, naciskając przycisk Zapisz.
    UWAGA: Wszystkie przyciski i większość poleceń ma skrót klawiszowy (szczegółowe informacje można znaleźć w powiązanej instrukcji23). Aby ułatwić przewijanie wideo i wykonywanie skrótów klawiaturowych, można użyć kontrolera sprzętowego z programowalnymi przyciskami i kołem wahadłowym, takiego jak Contour ShuttlePro V2.
  7. Kliknij Oceń, aby wygenerować pliki wyjściowe ze śledzonego wideo. W zależności od wybranego żądanego wyjścia (patrz krok 4.1), krok ten może potrwać kilka minut.
  8. Sprawdź, czy wszystkie graficzne wykresy danych wyjściowych są zapisane w folderze "Wyniki". Sprawdź dokładność śledzenia, sprawdzając niektóre graficzne wyjścia, takie jak "Ślady postawy", gdzie można sprawdzić, czy wszystkie pozycje łap są spójne.
    1. Jeśli zostanie zidentyfikowany błąd, ręcznie popraw śledzenie (jeśli to możliwe; w przeciwnym razie wyeliminuj folder "Wyniki" i ponownie wykonaj automatyczne śledzenie z nowymi ustawieniami) i ponownie kliknij polecenie Oceń.
  9. Sprawdź, czy wszystkie pomiary ilościowe wygenerowane przez oprogramowanie MW są zapisane w arkuszu kalkulacyjnym Excel i podsumowane w pozycji "1. Info_Sheet". Upewnij się, że opcje programu Excel dotyczące rozdzielania formuł są zgodne ze skryptem. Separatorem dziesiętnym musi być ",", a separatorem tysięcy musi być "; ".
  10. Użyj skryptu "MouseMultiEvaluate.m", aby zebrać pomiary ze wszystkich przebiegów do nowego pliku do analizy.
    1. Aby rozpocząć, wygeneruj plik .txt zawierający ścieżki folderów dla wszystkich filmów (np. "Videofiles.txt"). Upewnij się, że każda linia odpowiada pojedynczemu filmowi.
    2. Następnie wpisz "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" w wierszu poleceń. Plik Excela o nazwie "ResultSummary.xls" zostanie wygenerowany w katalogu roboczym (zobacz przykład w repozytorium GitHub).
      UWAGA: Rysunek 2 przedstawia graficzne dane wyjściowe uzyskane przez oprogramowanie MW z filmów jednego nagranego zwierzęcia.

5. Proces analizy danych kinematycznych

  1. Edytuj arkusz programu Excel wygenerowany w kroku 4.10, który zawiera dane do przetworzenia przy użyciu dostarczonych skryptów języka Python, zgodnie z poniższymi wymaganiami wstępnymi.
    1. W nagłówku pierwszej kolumny określ warunek eksperymentalny. Nazwij każdy wiersz po nazwie grupy/warunku (osoby z tych samych grup muszą mieć tę samą nazwę). Pierwsza grupa musi być linią kontrolną lub bazową (jest to obowiązkowe tylko w przypadku kreślenia mapy cieplnej w kroku 5.6).
    2. W drugiej kolumnie określ identyfikator zwierzęcia. Jest to obowiązkowe, chociaż informacje te nie będą wykorzystywane do generowania wykresów.
    3. W trzeciej kolumnie i kolejnych wybierz parametry silnika, które zostaną wykorzystane do analizy. Upewnij się, że pierwszy wiersz jest nazwą parametru (te nazwy pojawią się później na wykresach).
  2. Otwórz Anaconda Navigator i uruchom Spyder, aby otworzyć dostarczone skrypty Pythona.
    UWAGA: Wszystkie skrypty zostały opracowane w Pythonie 3.9.13, zostały wykonane za pomocą Spyder 5.2.2 w Anaconda Navigator 2.1.4 i są dostępne w Tabeli materiałów i repozytorium GitHub (gdzie dołączone są dodatkowe materiały, takie jak przykład wideo, przykładowy plik Excel i dokument FAQ). Możliwe jest wykonywanie skryptów poza Anaconda Navigator; Jednak ten graficzny interfejs użytkownika jest bardziej przyjazny dla użytkownika.
  3. Użyj opcji "Rawdata_PlotGenerator.py", aby wygenerować wykresy danych pierwotnych. Umożliwi to wizualizację każdego parametru w funkcji prędkości.
    1. Otwórz "Rawdata_PlotGenerator.py" w Spyder i uruchom kod, klikając przycisk Odtwórz.
    2. Wybierz plik programu Excel do analizy i nazwę arkusza w oknie automatycznym. Jeśli nazwa arkusza nie została zmieniona, wpisz "Arkusz1".
    3. Wykresy danych pierwotnych pojawią się w konsoli wykresu (prawy górny panel). Aby zapisać wykresy, kliknij przycisk Zapisz obraz lub Zapisz wszystkie obrazy w konsoli wykresu.
  4. Użyj skryptu "Residuals_DataAnalysis", aby obliczyć reszty do analizy danych. Ten skrypt wygeneruje plik CSV z obliczeniami reszt dla wszystkich parametrów silnika.
    UWAGA: Wiele mierzonych parametrów chodu wyodrębnionych przez MW zmienia się w zależności od prędkości (np. prędkość wymachu, długość kroku, czas trwania postawy, prostoliniowość postawy i wskaźniki chodu). W związku z tym zaleca się wykonanie najlepiej dopasowanego modelu regresji dla każdego pojedynczego parametru w funkcji prędkości dla eksperymentu bazowego, a następnie określenie wartości rezydualnych dla każdej grupy eksperymentalnej w odniesieniu do tego modelu regresji. Dane są następnie wyrażane jako różnica w stosunku do reszty znormalizowanej linii26.
    1. Otwórz "Residuals_DataAnalysis.py" w Spyder i uruchom kod, klikając przycisk Odtwórz.
    2. Wybierz plik programu Excel do analizy i nazwę arkusza w oknie automatycznym. Jeśli nazwa arkusza nie została zmieniona, wpisz "Arkusz1".
    3. Zapisz plik CSV w tym samym folderze, w którym znajdują się dane. Obowiązkowe jest, aby formant (lub linia bazowa) był pierwszą grupą w pliku programu Excel.
  5. Użyj skryptu "PCA_PlotGenerator.py", aby przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA).
    UWAGA: Ta nienadzorowana metoda redukcji wymiarowości służy do generowania bardziej zwięzłej reprezentacji27,28,29 danych (Rysunek 3A, B). Skrypt PCA zawiera następujące kroki. Dane są najpierw wstępnie przetwarzane przez centrowanie i skalowanie, po czym algorytm PCA oblicza macierz kowariancji w celu określenia korelacji między zmiennymi oraz obliczenia wektorów własnych i wartości własnych macierzy kowariancji w celu zidentyfikowania głównych składników. Pierwsze dwa lub trzy główne komponenty są wybierane do reprezentacji danych odpowiednio na wykresach 2D lub 3D. Każda kropka na wykresach odpowiada zwierzęciu i reprezentuje inną zmienną abstrakcyjną. Kropki oznaczone kolorami służą do rozróżnienia określonych grup. W związku z tym skupiska kropek odzwierciedlają podobne wzorce chodzenia wspólne dla odpowiednich osób.
    1. Otwórz "PCA_PlotGenerator.py" w Spyder i uruchom kod, klikając przycisk Odtwórz.
    2. Wybierz plik programu Excel do analizy i nazwę arkusza w oknie automatycznym. Jeśli nazwa arkusza nie została zmieniona, wpisz "Arkusz1".
    3. Upewnij się, że wykresy PCA 2D i 3D są wyświetlane w konsoli wydruku (prawy górny panel). Każdy kolor reprezentuje inną grupę, a obok wykresu pojawia się legenda. Aby zapisać wykres, kliknij Zapisz obraz w konsoli wykresu.
  6. Użyj "Heatmap_PlotGenerator.py", aby wygenerować mapę cieplną. Upewnij się, że generator mapy cieplnej tworzy tabelę przedstawiającą różnice statystyczne między grupą bazową (lub grupą kontrolną) a innymi grupami dla każdego parametru motorycznego27 (Rysunek 4). Każda kolumna przedstawia jedną grupę, a każda linia odnosi się do określonego parametru motorycznego.
    UWAGA: Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya (dla rozkładów normalnych) lub ANOVA Kruskala-Wallisa, a następnie testu post hoc Dunna (dla rozkładów nienormalnych). Wartości odstające zostały wyłączone z analizy. Wartości P są reprezentowane przez kod kolorystyczny, przy czym czerwone i niebieskie odcienie wskazują odpowiednio wzrost lub spadek w stosunku do kontroli (lub linii bazowej). Odcień koloru reprezentuje istotność statystyczną, przy czym ciemniejsze kolory mają większe znaczenie, a jaśniejsze kolory mają mniejsze znaczenie. odpowiada P < 0,001; ** odpowiada P < 0,01; a * odpowiada P < 0,05. Kolor biały oznacza brak odchylenia.
    1. Otwórz "Heatmap_PlotGenerator.py" w Spyderze i uruchom kod, klikając przycisk Odtwórz.
    2. Wybierz plik programu Excel do analizy i nazwę arkusza w oknie automatycznym. Jeśli nazwa arkusza nie została zmieniona, wpisz "Arkusz1".
    3. W drugim oknie automatycznym wybierz typ danych: dane surowe lub dane resztkowe. Jeśli opcja nie jest wybrana, dane reszt są danymi domyślnymi.
    4. Mapa cieplna pojawi się w konsoli wykresu (prawy górny panel). Aby zapisać wykres, kliknij Zapisz obraz w konsoli wykresu.
      UWAGA: Obowiązkowe jest, aby formant (lub linia bazowa) był pierwszą grupą w pliku programu Excel.
  7. Użyj "Boxplots_PlotGenerator.py", aby wygenerować wykresy skrzynkowe. To narzędzie pozwoli na generowanie wykresów skrzynkowych, które reprezentują rozkład wartości dla wszystkich parametrów motorycznych dla każdej grupy (Rysunek 5, Rysunek 6 i Rysunek 7).
    UWAGA: Każde pole zawiera medianę jako środkową linię, a dolna i górna krawędź pól reprezentuje odpowiednio kwartyle 25% i 75%. Wąsy reprezentują zakres pełnego zestawu danych, z wyłączeniem wartości odstających. Wartości odstające definiuje się jako dowolną wartość, która jest 1,5-krotnością przedziału międzykwartylowego poniżej lub powyżej odpowiednio kwartyli 25% i 75%.
    1. Otwórz "Boxplots_PlotGenerator.py" w Spyder i uruchom kod, klikając przycisk Odtwórz.
    2. Wybierz plik programu Excel do analizy i nazwę arkusza w oknie automatycznym. Jeśli nazwa arkusza nie została zmieniona, wpisz "Arkusz1".
    3. W drugim oknie automatycznym wybierz typ danych: dane surowe lub dane resztkowe. Jeśli opcja nie jest wybrana, dane reszt są danymi domyślnymi.
    4. Wykresy skrzynkowe pojawią się w konsoli wydruku (prawy górny panel). Aby zapisać wykresy, kliknij przycisk Zapisz obraz lub Zapisz wszystkie obrazy w konsoli wykresu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowy system BMS opisuje deficyty motoryczne po SCI14. Ze względu na jego subiektywny charakter, inne testy ilościowe są zwykle wykonywane równolegle z BMS, aby uzyskać bardziej szczegółową i precyzyjną ocenę lokomocji. Jednak testy te nie pokazują konkretnych informacji na temat cykli krokowych, wzorców kroków i koordynacji kończyn przednich i tylnych, co jest niezwykle ważne w zrozumieniu, w jaki sposób obwody rdzeniowe zachowują funkcję i dostosowują się do niepełnego SCI. W tej sekcji po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym przypadku potencjał metody MouseWalker jest demonstrowany poprzez analizę zachowań lokomotorycznych po SCI. Dostarcza nowych informacji na temat konkretnych zmian w krokach, śladach stóp i wzorcach chodu, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte w innych standardowych testach. Oprócz dostarczenia zaktualizowanej wersji pakietu MW, narzędzia do analizy danych są również opisane za pomocą dostarczonych skryptów Pythona (patrz krok 5).

Ponieważ MW generuje duży zbiór danych i zbiór para...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Laurze Tucker i Natasie Loncarevic za ich komentarze na temat manuskryptu i wsparcie udzielone przez Zakład Gryzoni Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe ze strony Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) dla L.S. i C.S.M. Prace te były wspierane przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 i UIDP/04462/2020) oraz LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) na rzecz C.S.M. L.S. było wspierane przez umowę z indywidualnym kierownikiem projektu CEEC (2021.02253.CEECIND). Projekt A.F.I. był wspierany przez stypendium doktoranckie z FCT (2020.08168.BD). Projekt A.M.M. otrzymał stypendium doktoranckie z FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. otrzymał stypendium podoktorskie z FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. otrzymał stypendium doktoranckie od FCT (SFRH/BD/138636/2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
45º Lustro 
2 profil aluminiowy (2 x 2 cm), wysokość 16 cm, 1 z każdej stronyprofil aluminiowy Misumi
2 (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 z każdej stronyaluminiowy Misumi
1 (2 x 2 cm), długość 83 cmMisumi
87 x 23 cm Ogólnydostawca szkła 
Wypełniacz z czarnego kartonu artykułów papierniczychUżyliśmy 2, jednego o wymiarach 69 x 6 cm, a drugiego o wymiarach 69 x 3 cm, aby ograniczyć odbicie od lustra
< mocny > Podświetlenie tła< / mocne>
pleksi 109 x 23 cm (grubość 0,9525 cm)Ogólny dostawca
2 boczne profile aluminiowe (4 x 4 cm), o długości 20 cm, po 1 z każdej stronyMisumi
wielokolorowa taśma LEDOgólny dostawca
biały nieprzezroczysty papier do pokrycia pleksyOgólny dostawca
fTIR Podstawa nośna i słupki
2 profil aluminiowy (4 x 4 cm), wysokość 100 cmMisumi
60 x 30 cm metryczna płyta stykowaEdmund Optics #54-641
M6 12 mmEdmund Optics 
Nakrętki sześciokątne M6 i waheryEdmund Optics 
Chodnik fTIR 
109 x 8,5 cm pleksy (1,2 cm grubości)Ogólny dostawca109 x 8,5 cm pleksi (1,2 cm grubości)
109 cm długości Aluminiowy kanał Base-U z grubymi fałdami o wysokości 1,6 cm x głębokości 1,9 cm (do trzymania pleksy)Ogólny dostawca
2 boczne profile aluminiowe (4 x 4 cm) o długości 20 cm, po 1 z każdej stronyMisumi
Wypełniacz z czarnego kartonu artykułów papierniczychużyliśmy 2 wypełniaczy z każdej strony, aby zakryć granice pleksy, unikając jasnych krawędzi
M6 12 mmEdmund Optics 
High Speed camera (na statywie)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CTo jest zalecenie. Wymagane jest nagrywanie co najmniej 100 klatek na sekundę
Infinite Horizon Impactor 
Impaktor Infinite Horizon Systemy precyzyjne i oprzyrządowanie, LLC.#0400
Obiektyw
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Ten obiektyw jest zalecany, jednak można użyć innego obiektywu. Upewnij się, że zawiera dużą aperturę (tj. mniejsze wartości przysłony), aby przechwytywać sygnały fTIR
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 projektu Spyder
Walkway wall 
2 duże akrylowe retagular o wymiarach 100 x 15 cmKażdy sklep
2 Trapezowe akrylowe boczne o długości 6-10 x wysokości 15 cmDowolny sklep
GitHub Materials
Nazwa folderuURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsSkrypt do tworzenia wykresów skrzynkowych
Dokumentyhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsDodatkowe dokumenty
Mapa cieplnahttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsSkrypt do tworzenia mapy cieplnej
Skrypt Matlathttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker skrypt matlab
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsSkrypt do wykonywania analizy głównych składowych
Wykresy surowych danychhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsSkrypt do tworzenia wykresów danych
pierwotnych Analiza reszthttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisKod do obliczania reszt na podstawie danych pierwotnych
profil Lustro Ogólny dostawca sprzętusprzętu artykułów piśmienniczych sprzętu sprzętuOgólny dostawca Współtwórcy spożywczy z brikolażem spożywczy z brikolażem

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MouseWalker SystemSpinal Cord InjuryLocomotor DysfunctionGait QuantificationMouse ModelMotor CoordinationKinematic AnalysisBehavioral AssaysOpen Source ToolsFootprint Patterns

Related Articles