Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza rdzenia drzewa za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65208

⸱

22 września 2023

 , 
1Forest Is Life, TERRA Teaching and Research Centre, Gembloux Agro Bio-Tech, University of Liège, 2UGent-Woodlab, Laboratory of Wood Technology, Department of Environment, Ghent University, 3UGent Centre for X-ray Tomography (UGCT)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy, jak przetwarzać rdzenie drzew za pomocą łańcucha narzędzi do tomografii komputerowej rentgenowskiej. Z wyjątkiem ekstrakcji chemicznej do niektórych celów, nie jest wymagana dalsza fizyczna obróbka laboratoryjna. Łańcuch narzędzi może być używany do szacowania biomasy, do uzyskiwania danych MXD/szerokości słojów drzew, a także do uzyskiwania ilościowych danych dotyczących anatomii drewna.

Streszczenie

Przedstawiono łańcuch narzędzi do tomografii komputerowej rentgenowskiej (CT) w celu uzyskania szerokości słojów drzew (TRW), maksymalnej gęstości drewna późnego (MXD), innych parametrów gęstości i danych ilościowych dotyczących anatomii drewna (QWA) bez potrzeby pracochłonnej obróbki powierzchni lub fizycznego przygotowania próbki. Nacisk kładziony jest na rdzenie inkrementacyjne i procedury skanowania w rozdzielczościach od 60 μm do 4 μm. Zdefiniowano trzy skale, w których należy przyjrzeć się drewnu: (i) skala międzypierścieniowa, (ii) skala słojów, tj. skala słojów drzew i skala densytometryczna, a także (iii) skala anatomiczna, przy czym ta ostatnia zbliża się do konwencjonalnej jakości cienkiego przekroju. Specjalnie zaprojektowane uchwyty na próbki dla każdej z tych wag umożliwiają wysokowydajne skanowanie wielu rdzeni inkrementacyjnych. Opracowano szereg procedur programowych specjalnie w celu skutecznego przetwarzania trójwymiarowych obrazów rentgenowskich rdzeni drzew za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej do TRW i densytometrii. W tej pracy pokrótce wyjaśniono podstawowe zasady tomografii komputerowej, które są potrzebne do prawidłowego zrozumienia protokołu. Protokół jest przedstawiony dla niektórych znanych gatunków, które są powszechnie stosowane w dendrochronologii. Połączenie przybliżonych szacunków zagęszczenia, danych TRW i MXD, a także ilościowych danych anatomicznych, pozwala nam poszerzyć i pogłębić aktualne analizy pod kątem rekonstrukcji klimatu czy reakcji drzew, a także dalej rozwijać dziedzinę dendroekologii/klimatologii i archeologii.

Wprowadzenie

Gęstość drewna jest łatwą do pomiaru zmienną1, która odzwierciedla zarówno właściwości anatomiczne, jak i chemiczne drewna2. W szacowaniu nadziemnej biomasy gęstość drewna jest istotną zmienną wagową 3,4,5, którą mnoży się przez wymiary drzewa oraz współczynnik reprezentujący zawartość węgla w drewnie. Gęstość drewna jest ściśle powiązana z właściwościami mechanicznymi drewna konstrukcyjnego6 i odzwierciedla historię życiową drzewa7.

Gęstość ściany komórkowej wynosi w przybliżeniu 1500 kg/m³ i jest uważana za dość stałą8, jednak należy również uwzględnić zmienność gęstości ścian komórkowych w obrębie jednego przyrostu rocznego8,9. Komórki zdrewniałe (zazwyczaj cewki u iglastych oraz naczynia, miąższ i włókna u liściastych) są zróżnicowane pod względem orientacji i kształtu, a grubość ich ścian oraz wielkość światła komórki są zmienne10. W związku z tym gęstość drewna różni się między drzewami, w obrębie jednego drzewa (osiowo i poprzecznie) oraz w krótkich odstępach wewnątrz jednego przyrostu rocznego11,12. W wielu przypadkach zmienność gęstości drewna w skali pierścienia wyznacza również granicę przyrostu rocznego13. Gęstość drewna i ostatecznie frakcje tkankowe są generowane i w niniejszej pracy szeroko podzielone na trzy kategorie (tj. trzy różne skale rozdzielczości), w zależności od celu badania (Rysunek 1), zgodnie z poniższym opisem.

Skala międzyringowa: Poprzez pomiar fragmentów drewna uzyskuje się pojedynczą wartość dla danej próbki. Można to osiągnąć metodą zanurzeniową w wodzie lub geometrycznie14. W ten sposób można wyznaczyć ogólną biomasę lub technologiczne zmienne drewna. Aby uwzględnić zmienność od rdzenia do kory, fragmenty drewna te można dalej podzielić na bloki, które są mierzone ręcznie w celu uzyskania informacji o strategii historii życia15. Przy zastosowaniu niskorozdzielczej tomografii komputerowej (CT) promieni X, takiej jak w skanerach medycznych17,18, dane TRW dla pierścieni średnich i szerokich mogą być efektywnie pozyskiwane z wielu próbek18,19,20. Jest to również skala, która może być wykorzystana do oceny biomasy od rdzenia do kory zarówno w drzewach strefy umiarkowanej, jak i tropikalnych4,22, przy rozdzielczościach zazwyczaj mieszczących się w zakresie od 50 µm do 200 µm.

Skala słoja: Drewno jest zapisem przeszłych warunków środowiskowych. Najlepiej znanym parametrem jest szerokość słoja drzewa (TRW), jednak w przypadku rekonstrukcji temperatur globalnych wykazano, że zapisy maksymalnej gęstości drewna późnego (MXD) stanowią lepszy wskaźnik temperatury22. MXD jest zmienną łatwą do pomiaru23 oraz wskaźnikiem grubości ścian komórkowych i rozmiaru komórek w ostatnich komórkach słoja drzewa; w obrębie górnej granicy lasu oraz w regionach borealnych jest ona dodatnio skorelowana z sezonową temperaturą powietrza24: im cieplejsze i dłuższe są lata, tym silniejsza zachodzi lignifikacja ścian komórkowych, co zwiększa gęstość tych ostatnich komórek. Tradycyjne pomiary, takie jak metoda zanurzeniowa i geometryczna, są mniej dokładne przy określaniu gęstości na poziomie słoja. Wcześniejsza praca opracowała łańcuch narzędziowy wykorzystujący filmy rentgenowskie do analizy cienkich przekrojów próbek25. Zainicjowało to rewolucję zarówno w leśnictwie, jak i później w paleoklimatologii15,18, definiując maksymalną gęstość drewna późnego (MXD), czyli szczytową wartość gęstości często występującą na końcu słoja, jako wskaźnik temperatury letniej. Podstawowa zasada polega na tym, że próbki są piłowane (do grubości około 1,2 mm do 7 mm13) tak, aby były idealnie równoległe do kierunku osiowego, a następnie próbka jest kładziona na czułym filmie wystawionym na działanie źródła promieni rentgenowskich. Następnie filmy radiograficzne są odczytywane za pomocą źródła światła, które wykrywa intensywność i zapisuje profile oraz roczne parametry słojów drzewa. Narzędzia te wymagają jednak znacznej ilości przygotowania próbek i pracy ręcznej. Ostatnio opracowano bardziej zestandaryzowaną metodę dla tomografii komputerowej (CT) rentgenowskiej lub opartą na zamontowanych rdzeniach26. Rozdzielczość w tym przypadku mieści się w przedziale od 10 µm do 20 µm. W tej skali mierzone jest również TRW, szczególnie w przypadku słojów o mniejszych wymiarach.

Skala anatomiczna: W tej skali (rozdzielczość < 4 µm) średnie poziomy gęstości stają się mniej istotne, ponieważ wizualizowane są główne cechy anatomiczne, a ich szerokość i proporcje mogą być mierzone. Zazwyczaj odbywa się to poprzez wykonywanie mikrosekcji, wysokorozdzielczych skanów optycznych lub skanów µ-CT. Gdy konieczna jest wizualizacja ultrastruktury ścian komórkowych, najczęściej stosowaną metodą jest skaningowa mikroskopia elektronowa27. W skali anatomicznej widoczne stają się poszczególne frakcje tkanek, co pozwala na wyznaczenie parametrów fizjologicznych na podstawie obrazów. Na podstawie indywidualnych parametrów anatomicznych oraz gęstości ścian komórkowych drewna można wyznaczyć gęstość anatomiczną w celu porównania jej z konwencjonalnymi metodami szacowania gęstości drewna24.

Dzięki udoskonalonym technikomycinania i oprogramowaniu do analizy obrazów29,30, rozwój dendroanatomii30 pozwolił na uzyskanie dokładniejszych zapisów drewna, zarówno w celu ściślejszej oceny MXD u iglaków, jak i pomiaru wielu zmiennych anatomicznych w drzewach liściastych. Na tej skali mierzone są rzeczywiste parametry anatomiczne, które następnie odnosi się do parametrów środowiskowych31. Poziom ten można uzyskać również za pomocą µCT32,33.

Ponieważ drewno jest z natury higroskopijne i anizotropowe, gęstość drewna musi być starannie zdefiniowana, a warunki pomiaru muszą zostać określone jako: po wysuszeniu w piecu, zakondycjonowane (zazwyczaj przy 12% zawartości wilgoci) lub świeże (takie, jakie było w momencie ścinki w lesie)34. W przypadku dużych próbek i do celów technicznych gęstość drewna definiuje się jako stosunek masy do objętości w określonych warunkach. Wartość gęstości drewna jest jednak silnie zależna od skali pomiaru; na przykład gęstość drewna może podwoić się w przekroju od rdzenia do kory, a w skali przyrostów (w przypadku drzew iglastych) przejście od drewna wczesnego do późnego również skutkuje znacznym wzrostem gęstości, z maksimum na granicy przyrostu.

W niniejszym materiale przedstawiono protokół skanowania rentgenowskiego CT próbek przyrostowych w celu pomiaru cech w trzech wspomnianych skalach (Rysunek 1). Dzięki elastycznej konfiguracji, współczesne osiągnięcia w technice X-ray CT pozwalają na objęcie większości tych skal. Ostateczny protokół skanowania będzie zależał od założonych celów badawczych.

Kluczowym czynnikiem ograniczającym (który jest nierozerwalnie związany ze skalowalną naturą gęstości drewna i drewna w ogóle) jest rozdzielczość oraz czas niezbędny do skanowania. Przykłady demonstrują, jak: (i) uzyskać profile gęstości drewna w skali pierścieni drzew dla szacowania biomasy w Terminalia superba z basenu Konga, (ii) uzyskać zapisy gęstości cedru Clanwilliam (Widdringtonia cedarbergensis) w oparciu o skanowanie spiralne w systemie HECTOR35 oraz (iii) zmierzyć parametry naczyń w dębie bezszypułkowym przy użyciu systemu Nanowood. Oba skanery należą do zestawu urządzeń w Centrum Tomografii Rentgenowskiej UGent (UGCT,

Schemat workflow analizy drzewa; szacowanie biomasy, TRW, MXD; skanowanie 3D, przetwarzanie programowe.
Rysunek 1: Ogólny schemat decyzyjny metodologii dla tomografii komputerowej (CT) wykonanej promieniami rentgenowskimi. Wiersze wskazują kolejne kroki, począwszy od celu badawczego, aż po końcowy format danych. Białe pola oznaczają etapy istotne dla tego łańcucha narzędzi. Pola wyszarzone to kroki, które można wykonać za pomocą innego oprogramowania lub pakietów języka R, takich jak dplr47 i Treeclim48 do analizy słojów drzewa, a także ROXAS44 oraz ImageJ42 lub innych (komercyjnych) aplikacji do wyznaczania parametrów anatomicznych drewna na podstawie obrazów CT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badania drewna przy użyciu X-CT
Konfiguracja skanera: Standardowy skaner tomografii komputerowej rentgenowskiej składa się z lampy rentgenowskiej, detektora promieniowania X, stołu obrotowego oraz zestawu silników do przesuwania stołu obrotowego, a w większości przypadków również detektora, w przód i w tył (Rycina 2).

Układ tomografii rentgenowskiej, stół obrotowy, detektor, droga wiązki, SOD, SDD, schemat procesu obrazowania.
Rysunek 2. System skanujący HECTOR. System35, z zaznaczoną odległością źródło-detektor (SDD) oraz odległością źródło-obiekt (SOD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Większość systemów laboratoryjnych posiada geometrię wiązki stożkowej, co oznacza, że wytwarzane promienie rentgenowskie są rozproszone z okna wyjściowego lampy w kształcie stożka. Implikuje to, że poprzez zmianę odległości między obiektem a lampą (SOD = Source-Object-Distance) oraz między detektorem a lampą (SDD = Source-Detector-Distance) kontrolowane jest powiększenie (patrz: omówienie rozdzielczości). Ze względu na przenikalność promieni rentgenowskich przechodzą one przez obiekt, a intensywność wiązki tłumionej jest funkcją energii wiązki promieniowania, składu chemicznego obiektu (liczby atomowej obecnych pierwiastków) oraz gęstości materiału. Przy stałym spektrum energii i stałym składzie materiałowym drewna, tłumienie wiązki promieni rentgenowskich jest silnie zależne od gęstości materiału, co wyjaśnia jego zastosowanie w densytometrii. Tłumienie (lub transmitancję) można wyrazić za pomocą prawa Beera-Lamberta:

Równanie wykładniczego tłumienia \(I_d = I_0 e^{-\mu d}\) na schemacie radiograficznym.

gdzie I0 to padający wiązka promieniowania rentgenowskiego, która zanika wykładniczo do wiązki transmitowanej Id podczas propagacji przez materiał na dystansie d. Liniowy współczynnik osłabienia µ zależy od szeregu oddziaływań z materiałem obiektu. Projekcje są zatem zapisami wiązki transmitowanej.

W praktyce obiekt montuje się na stole obrotowym, wybiera odpowiednie SOD i SDD oraz określa odpowiednią moc (zależnie od rozmiaru, gęstości i składu obiektu), a następnie obiekt obraca się o 360°, wykonując podczas tego obrotu wiele projekcji. Projekcje te służą następnie do rekonstrukcji struktury wewnętrznej obiektu. Dostępnych jest kilka algorytmów rekonstrukcyjnych, z których najczęściej stosowane wciąż opierają się na opracowanych przed dziesiątkami lat ramach analitycznych, bazujących na transformacji Radona i twierdzeniu o przekroju Fouriera. Po więcej szczegółów czytelnika odsyłamy do literatury specjalistycznej36.

Problem rozdzielczości, objętości danych i wielkości próbki: Rozdzielczość jest kluczowym parametrem w tomografii komputerowej (CT) promieni rentgenowskich. W systemach o geometrii odwróconej lub geometrii wiązki równoległej, takich jak linie synchrotronowe, istotne są inne uwarunkowania. Niniejszy protokół dotyczy wyłącznie standardowego laboratoryjnego skanowania CT promieni rentgenowskich z geometrią wiązki stożkowej. W tym przypadku kluczowe są pojęcia powiększenia, rozmiaru piksela detektora i rozmiaru plamki. Powiększenie definiuje się jako stosunek SDD/SOD. Kolejnym czynnikiem wpływającym na rozdzielczość jest rozmiar piksela detektora: im mniejszy rozmiar piksela, tym wyższa rozdzielczość, jednak w większości przypadków pole widzenia (FoV) jest również bezpośrednio powiązane z rozmiarem piksela i rozmiarem detektora (mniejszy rozmiar piksela oznacza mniejsze FoV przy tej samej liczbie pikseli). Ponadto istotny jest rozmiar plamki wiązki promieni rentgenowskich: im większy rozmiar plamki, tym niższa rozdzielczość, co oznacza mniejszą widoczność szczegółów.

Ważne jest, aby zaznaczyć, że można uzyskać rozdzielczość wyższą niż ta możliwa zgodnie z wyżej wymienionymi ograniczeniami, dlatego lepiej jest używać terminu rozmiar woksela (woksel to piksel objętościowy) zamiast rozdzielczości. Ponadto istnieją inne czynniki, takie jak ostrość detektora, które dodatkowo ograniczają rzeczywistą rozdzielczość, z jaką skanowany jest obiekt. Jedynie właściwa kalibracja systemu, z wykorzystaniem uznanych wzorców, dostarcza wiarygodnej odpowiedzi.

W większości przypadków rozmiar woksela, przy którym można zeskanować obiekt, jest ograniczony przede wszystkim przez wielkość samego obiektu. Oznacza to, że im większy jest obiekt, tym mniejszy będzie rozmiar woksela. Jeśli obiekt nie mieści się w polu widzenia (FoV) detektora dla określonego rozmiaru woksela, można go zmniejszyć, na przykład poprzez ograniczenie powiększenia.

Czas skanowania oraz objętość danych są istotnymi czynnikami przy wyborze pożądanej wielkości woksela. Generalnie mniejsza wielkość woksela oznacza chęć uzyskania większej szczegółowości, mniejszą próbkę lub mniejszą liczbę próbek, które można zeskanować jednocześnie, a także wydłuża czas pomiaru i zwiększa objętość gromadzonych danych. Rozważmy następujący przykład teoretyczny: jeśli za pomocą określonego systemu mikro-CT można jednorazowo zeskanować próbkę o wymiarach 10 cm x 10 cm x 10 cm z rozdzielczością 50 µm i chcielibyśmy zeskanować tę samą objętość z rozdzielczością 10 µm, to objętość mieszcząca się w polu widzenia (FoV) wynosiłaby jedynie 2 cm x 2 cm x 2 cm, zakładając, że jest to fizycznie możliwe. Oznacza to, że do pokrycia całej objętości potrzeba byłoby 125 skanów (5³ = 5-krotnie wyższa rozdzielczość, co skaluje się do potęgi trzeciej ze względu na wolumetryczny charakter techniki obrazowania), a objętość danych wzrosłaby analogicznie. Oczywiście jest to jedynie eksperyment myślowy i należy wziąć pod uwagę znacznie więcej czynników niż tylko rozdzielczość. Po więcej informacji czytelnik może zapoznać się z przeglądem możliwości skanowania37.

Elastyczność urządzeń do skanowania obiektów drewnianych: W ostatniej dekadzie wiele firm dostarczyło systemy CT rentgenowskiego o konstrukcji podobnej do HECTOR35. Przegląd kilku systemów CT, ocenianych szczególnie pod kątem rozdzielczości czasowej, przedstawiono w38.

Ogólnie rzecz biorąc, elastyczność i łatwość obsługi systemów tomografii komputerowej rentgenowskiej (X-ray CT) uległy znacznej poprawie. Wiele systemów umożliwia skanowanie szerokiej gamy obiektów, co ma miejsce również w przypadku systemów w UGCT. Poniższy protokół został zaprezentowany dla systemu HECTOR, który nadaje się do analizy słojów drzew. Protokół ten jest jednak aktualny dla każdego innego dostępnego systemu, o ile pozwalają na to rozdzielczość i format danych.

Systemy te umożliwiają skanowanie różnorodnych obiektów. Kilka zdjęć różnych drewnianych obiektów zeskanowanych za pomocą systemu HECTOR przedstawiono na Rysunku 3. To właśnie ta elastyczność obejmuje trzy skale przedstawione na Rysunku 1, od rozdzielczości niskiej do bardzo wysokiej.

Układ doświadczalny do tomografii komputerowej (CT); obejmuje skrzypce, drewniane cylindry oraz systemy obrazowania rentgenowskiego.
Rysunek 3Przykłady konfiguracji skanowania. (A) dziennik, (B) wiolonczela49, (C) uchwyty na próbki (typ 1) z rdzeniami drzewnymi do skanowania seryjnego i (D) uchwyt do próbek typu 2 z rdzeniami przyrostowymi do skanowania helikoidalnego, zamontowany na stole obrotowym urządzenia HECTOR. Aby wyświetlić większą wersję tej figury, kliknij tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek rdzeniowych

  1. Pobierz próbkę z drzewa za pomocą świdra Presslera. Zapoznaj się z literaturą dotyczącą ręcznego pobierania rdzeni z drzew39. Niniejszy proces jest przedstawiony dla rdzeni o średnicy 5,15 mm.
  2. Umieść nieklejone rdzenie z drzewa w papierowych słomkach o średnicy 6 mm lub w innym odbiorniku, który nie wymaga użycia kleju. Nie przyklejaj rdzeni do drewnianego podłoża. Jeśli rdzenie zostały już zamocowane, odmontuj je za pomocą skalpela/piły lub rozpuszczalnika, zależnie od rodzaju zastosowanego kleju.
  3. Unikaj zawijania ich w plastikowe rurki; staraj się najpierw je wysuszyć, aby zapobiec rozwojowi pleśni i rozkładowi grzybowemu.
  4. Do opisywania papierowych słomek używaj ołówka, ponieważ proces ekstrakcji może spowodować wyblaknięcie napisów wykonanych markerem.
    UWAGA: Niniejszy proces jest odpowiedni również dla rdzeni o średnicy 4 mm. Można wykorzystać rdzenie już zamocowane i wyszlifowane, jednak muszą one zostać najpierw odmontowane. W przypadku drewna archeologicznego lub reliktowego, na potrzeby skanowania należy przygotować próbkę o rozmiarze rdzenia (poprzez piłowanie/zredukowanie rozmiaru).

2. Przygotowanie rdzenia przed skanowaniem

  1. Przeprowadź ekstrakcję Soxhleta etanolen/toluenem, etanolem lub acetonem40 przez co najmniej 24 h (Rycina 4A,B). Jest to niezbędne, aby uzyskać objętość drewna wolną od żywic w celu dokładnego obliczenia gęstości (żywica tłumi sygnał, Rycina 4C13, 41).
    1. Przygotuj roztwór 1000 mL etanolu z 427 mL toluenu (zgodnie np. z ASTM D 1107 - 96), czysty etanol lub aceton. Wiele uczelni dysponuje szklarniami laboratoryjnymi, które mogą wykonać przystosowaną wersję aparatury Soxhleta dla rdzeni drzewnych (Rycina 4B).
    2. Napełnij kolbę okrągłodenną rozpuszczalnikiem, a następnie umieść próbki w słomkach w stalowym uchwycie w aparaturze Soxhleta z chłodnicą na grzałce laboratoryjnej. Zapewnij co najmniej 6 cykli syfonowania na h.
      UWAGA: Do chłodzenia najlepiej zastosować zamknięty obieg wody (lub jakikolwiek inny nowoczesny system chłodzenia). W takim przypadku pompa wodna cyrkuluje wodę, przechowywaną w zbiorniku o pojemności 100 L z tabletkami z chlorem (aby zapobiec rozwojowi glonów), z przepływem 120 L/h (zależnie od wielkości aparatury Soxhleta oraz ciepła dostarczanego przez element grzejny). Do chłodzenia wody w zbiorniku 100 L stosuje się chłodnicę powietrzną. Aby ograniczyć zużycie rozpuszczalnika, wolną przestrzeń w aparaturze Soxhleta można wypełnić kuleczkami szklanymi.
    3. Regularnie sprawdzaj temperaturę i liczbę cykli syfonowania. Susz rdzenie pod wyciągiem chemicznym (zgodnie z zasadami BHP laboratorium), aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika, lub umieść suszarkę pod wyciągiem chemicznym.
  2. Susz rdzenie przez 24 h w suszarce (103.5 °C) pod wentylacją wyciągową, a następnie przeprowadź kąpiel w gorącej wodzie (90 °C) lub ekstrakcję Soxhleta gorącą wodą przez 24 h zgodnie z powyższym opisem.
    1. Przechowuj próbki w papierowych słomkach w stalowych uchwytach na próbki. Ponownie susz w suszarce przez 24 h w temperaturze 103.5 °C, a następnie poddaj kondycjonowaniu do 60% wilgotności względnej (RH) przed skanowaniem.
      UWAGA: W tym przypadku wybrano wartość 60%, ponieważ odpowiada ona w przybliżeniu średnim warunkom wilgotności względnej w pomieszczeniu do skanowania tomografią komputerową (CT) z użyciem promieniowania rentgenowskiego. Można również stosować próbki wysuszone w suszarce. Najważniejszym czynnikiem jest to, aby wszystkie próbki były skanowane w tych samych warunkach.
    2. W przypadku, gdy ekstrakcja wodna uszkodzi papierowe słomki, umieść rdzenie drzewne w nowych papierowych słomkach o średnicy 6 mm21. Zarówno rdzenie o średnicy 5.15 mm, jak i 4 mm można umieścić w słomkach 6 mm.
    3. Upewnij się, że cała papierowa słomka jest wypełniona drewnem. Zawiń oba końce słomki i odetnij nadmiar. Ułatwia to wkładanie słomek do uchwytu cylindrycznego.
    4. Upewnij się, że strona kambium (kory) jest wyraźnie zaznaczona na rdzeniu, ponieważ programy CoreProcessor i RingIndicator zakładają, że strona kory znajduje się na dole. Usuń odpryski oraz rdzenie z pęknięciami, ponieważ są one trudne w obróbce.

Ekstrakcja rozpuszczalnikowa, proces suszenia, schemat zestawu z wyposażeniem laboratoryjnym, porównanie wyników ekstrakcji.
Rycina 4. Przepływ pracy dla ekstrakcji i suszenia rdzeni przed skanowaniem. (A) Rdzenie przyrostowe w papierowych słomkach są najpierw umieszczane w kąpieli wodnej, a następnie w gorącej mieszaninie etanolu i toluenu w aparacie Soxhleta przez 24 h, po czym są suszone, ponownie umieszczane w kąpieli wodnej przez 24 h, ponownie suszone w temperaturze 103.5 °C, a następnie kondycjonowane przed skanowaniem. (B) Zdjęcia zmodyfikowanego zestawu Soxhleta na Uniwersytecie w Gandawie. Kilka zmodyfikowanych aparatów Soxhleta jest połączonych szeregowo. Zwróć uwagę na folię aluminiową i rurki izolacyjne, które utrzymują rozpuszczalnik lub mieszaninę rozpuszczalników w temperaturze wystarczającej do ekstrakcji. (C) Przykład powierzchni rdzenia przyrostowego z Pinus longaeva przed i po ekstrakcji. Żywice i inne substancje ekstrakcyjne maskują rzeczywisty sygnał gęstości ze względu na tłumienie promieni Rentgena. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Skanowanie rdzenia

  1. Wybierz odpowiedni typ uchwytu na próbki (Rysunek 5>) zgodnie z opisem poniżej, w zależności od celu badań przedstawionego na Rysunku 1.
    1. Do pomiarów w skali między pierścieniami należy użyć uchwytu typu 1 – tektury i perforowanej gąbki florystycznej.
    2. Do danych MXD należy użyć uchwytu typu 2 – plastikowego uchwytu na próbki, który mieści 6 rdzeni o długości 1-15 cm i średnicy 3 cm.
    3. Do celów dendroanatomicznych należy użyć uchwytu typu 3, który polega na prostym związaniu ze sobą papierowych słomek.
  2. Umieść rdzenie drzew w papierowych słomkach w uchwycie na próbki i wypełnij szablon arkusza kalkulacyjnego, który można pobrać ze strony https://dendrochronomics.ugent.be/#software. Każdy numer odpowiada konkretnej pozycji w uchwycie na próbki.
  3. Skanowanie w pracowni mikro-tomografii komputerowej (µCT): skonsultuj się z ekspertem od tomografii komputerowej w celu ustalenia odpowiednich ustawień i protokołu skanowania. W przypadku skanera użytego w niniejszym protokole, patrz37.
  4. Rekonstrukcja zeskanowanych obrazów: skonsultuj się z ekspertem od tomografii komputerowej w celu doboru odpowiednich ustawień rekonstrukcji lub skorzystaj z ustawień dołączonych do tomografu (pakiet oprogramowania tomografu komputerowego). W kwestii parametrów rekonstrukcji dla tego protokołu, patrz37.

Schemat równowagi statycznej z uchwytami do włókien; obrazy mikroskopowe; analiza rozmieszczenia włókien.
Rycina 5. Typy uchwytów na próbki i rozdzielczość. Projekt trzech głównych typów uchwytów, które odpowiadają (A) skali między pierścieniami, (B) skali pierścieni drzewa oraz (C) skali anatomicznej. Ze względu na wynikowy rozmiar, liczba próbek zmniejsza się wraz ze wzrostem wymaganej rozdzielczości. Odpowiednie rendery 3D dla (D) skali między pierścieniami (uchwyt 1), (E) szerokości pierścienia i MXD (uchwyt typu 2) oraz (F) parametrów anatomicznych (uchwyt typu 3). Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Pozyskanie danych TRW, danych o gęstości oraz danych anatomicznych

  1. Rozpoczęcie pracy z oprogramowaniem.
    1. Aby uzyskać wartości gęstości (uchwyty typu 1 i 2), zainstaluj następujące trzy pakiety oprogramowania: (i) CoreProcessor, (ii) RingIndicator oraz (iii) narzędzia CoreComparison z
    2. Ponieważ narzędzia te zostały stworzone w MATLAB, zainstaluj odpowiednie środowisko uruchomieniowe kompilatora MATLAB (MCR), dostępne pod adresem: http://nl.mathworks.com/products/compiler/mcr/. Obecnie wymagana wersja to MATLAB2022B. MCR jest bezpłatny, podobnie jak 3 pakiety oprogramowania.
    3. Obok folderu z zrekonstruowanymi wolumenami utwórz nowy pusty folder na pliki MAT (format plików MATLAB przechowujący zmienne itp.), np. matfiles_useful_name_sample_holder; jest to konieczne do przechowywania parametrów tymczasowych.
    4. Upewnij się, że arkusz kalkulacyjny znajduje się w folderze z zrekonstruowanymi wolumenami, aby móc uzupełnić dane o próbkach w późniejszym etapie.
  2. Przetwarzanie wstępne wolumenów rdzeni za pomocą CoreProcessor.
    UWAGA: W przypadku danych anatomicznych o wysokiej rozdzielczości następujące kroki przetwarzania nie są konieczne (Rycina 1); po uzyskaniu zrekonstruowanych wolumenów należy zapoznać się z wytycznymi ImageJ dla obrazów 3D42. Segmentację można przeprowadzić za pomocą wtyczki Weka43, na przykład do wskazywania naczyń na poszczególnych przekrojach12, lub w wtyczkach programowych takich jak ROXAS44.
    1. Przygotowanie ekstrakcji rdzeni: Przygotuj zautomatyzowaną ekstrakcję rdzeni przyrostowych (w zależności od skali między pierścieniami Rycina 6A lub skali pierścienia Rycina 6B) zgodnie z poniższym opisem.
      1. Wybierz folder z zrekonstruowanymi plikami (16-bitowe przekroje TIFF) oraz plik arkusza kalkulacyjnego (XrayForm.xlsx).
      2. Wybierz pusty folder z punktu 4.1.3. Jest to folder, w którym CoreProcessor utworzy plik MAT, który zostanie wykorzystany w punkcie 4.2.2 do masowej ekstrakcji rdzeni.
      3. Wybierz nowo utworzony pusty folder plików MAT lub, jeśli nie został on utworzony, wybierz dowolny inny folder. Wolumen zostanie załadowany i pojawi się podłużny przekrój cylindra; sprawdź kilka przekrojów poziomych, aby upewnić się, że wszystkie rdzenie i referencje zostały prawidłowo zamontowane w cylindrze.
      4. Klikaj od dołu do góry, aby wybrać przekroje do oceny tego stanu. Przekroje te zostaną wykorzystane w następnym kroku, dlatego klikaj przez całą długość. Wskaż referencje ciemne (powietrze) i białe (Rycina 6) tyle razy, ile wskazano w pliku arkusza. Po każdym wyborze kliknij dwukrotnie.
      5. W przypadku uchwytu do próbek 1 sprawdź wieloekran z 9 przekrojami, wygenerowany przez materiał referencyjny, aby sprawdzić, czy obliczenia gęstości zostały wykonane na drewnie (a nie na papierowej słomce lub innym materiale niedrewnym). Jest to niezbędne dla prawidłowej konwersji na rzeczywiste wartości gęstości drewna.
      6. W nowym oknie pop-up wybierz każdy rdzeń osobno, rysując wokół niego okrąg/elipsę. Wykonaj etykietowanie na podstawie informacji z pliku arkusza, sprawdzając poprawność nazwy. Przestrzegaj kolejności wypełniania szablonu. Wszystkie informacje są przechowywane w pliku MAT, który zostanie wykorzystany w następnym kroku do jednoczesnej ekstrakcji wszystkich rdzeni.
    2. Kliknij Mass Core Extraction, aby przeprowadzić ekstrakcję wszystkich rdzeni w danym cylindrze (wskażanych w punkcie 4.2.1.2), pod warunkiem, że metadane i pliki arkusza znajdują się w tym samym folderze.
      UWAGA: Podczas korzystania z funkcji masowej ekstrakcji rdzeni (Mass core extraction), wszystkie rdzenie zostaną wyekstrahowane zgodnie z etykietowaniem użytkownika (przechowywanym w folderze plików mat). W wyniku tej operacji zostanie utworzony nowy folder o nazwie Extracted, zawierający wszystkie oddzielne rdzenie. Jeśli w pierwszym kroku przygotowano wiele uchwytów do próbek i wszystkie pliki MAT są przechowywane w tym samym folderze, przetworzone zostaną wszystkie pliki MAT w tym folderze.
    3. W narzędziach CoreProcessor kliknij Manual Tg Correction, następnie wybierz folder Extracted, aby zapewnić prawidłową orientację płaszczyzny poprzecznej i promieniowej każdego wolumenu rdzenia, podobnie jak przy montowaniu fizycznych próbek w uchwycie przed szlifowaniem z zachowaniem widoczności płaszczyzny poprzecznej (Rycina 7B).
      1. Wyświetlane są niektóre przekroje, aby użytkownik mógł zobaczyć kierunek włókien. Na ostatnim wykresie (prawy dolny róg) sprawdź prezentowany przekrój i narysuj linię wskazującą kierunek włókien. Kliknij dwukrotnie, aby automatycznie obrócić rdzeń.
      2. Następnie pojawi się ekran, na którym należy wyciąć wolumen rdzenia (Rycina 7C), upewniając się, że prostokąt obejmuje całą średnicę rdzenia. Jest to konieczne, ponieważ punkt centralny prostokąta powinien znajdować się jak najbliżej osi rdzenia (dla prawidłowego wyrównania w module RingIndicator).
        UWAGA: W przypadku skanowania w wysokiej rozdzielczości wybierz na tym etapie tylko materiał wewnątrz rdzenia i użyj konwertera, aby przełączyć na uchwyt do próbek typu 2. Jest to szczególnie pomocne na przykład dla gatunków o porach pierścieniowych.
    4. Wykonaj następujące opcjonalne kroki w przypadku błędnie wyrównanych, odwróconych lub uszkodzonych rdzeni lub niekompatybilnych formatów obrazów.
      1. Korekcja nachylenia rdzenia (tylko dla uchwytu 1): Aby automatycznie skorygować nachylenie rdzenia (np. gdy rdzeń jest lekko pochylony w cylindrze; Rycina 7A). Jest to istotne dla późniejszych etapów. Wybierz folder Extracted utworzony w poprzednim kroku.
        UWAGA: Zazwyczaj nie jest to wymagane, jeśli posiadasz uchwyt do próbek typu 2 lub typu 3 (Rycina 5) lub gdy wszystkie próbki i uchwyty są ustawione idealnie pionowo.
      2. Odbicie wolumenów: W przypadku, gdy próbka nie została umieszczona stroną kory do dołu (kierunek rdzeń-kora nie biegnie od lewej do prawej), zmień kierunek poprzez odbicie rdzeni. Funkcja ta wymaga wskazania folderu i utworzy nowy folder.
      3. Łączenie rdzeni: Wirtualnie połącz duże części poszczególnych rdzeni. Celem nie jest idealne złączenie, lecz upewnienie się, że w razie potrzeby pojedyncze rdzenie znajdują się w tym samym wielostronicowym wolumenie TIFF. Użyj wskazania uszkodzonego rdzenia (patrz krok 4.3.4.9), aby zniwelować przerwy między fragmentami rdzenia.
      4. Konwerter: Jeśli wolumeny były modyfikowane w innym pakiecie oprogramowania i zostały zapisane poza narzędziami (np. w ImageJ), wykonaj ten krok, aby poprawnie ustawić informacje w nagłówku. Użyj tego kroku również dla 16-bitowych wielostronicowych wolumenów TIFF pochodzących z innego skanera CT oraz do korzystania z narzędzi RingIndicator.
        ​UWAGA: Wszystkie kolejne kroki służą do korekcji kierunku struktury, a finalnie do densytometrii i analizy przyrostów rocznych.
  3. Korygowanie kątów i wskazywanie pierścieni w RingIndicator.
    UWAGA: Następujące kroki w module RingIndicator muszą być wykonane chronologicznie: (i) wizualizacja płaszczyzny poprzecznej i promieniowej, (ii) korekcja struktury, (iii) tworzenie profilu gęstości oraz (iv) ręczne lub półautomatyczne wskazywanie pierścieni.
    1. Przeprowadź wizualizację płaszczyzny poprzecznej i promieniowej zgodnie z poniższym opisem.
      1. Aby zapoznać się z interfejsem GUI, otwórz narzędzia i wybierz wielostronicowy plik TIFF (ten, który został utworzony po ekstrakcji i korekcji tg, czyli z folderu o nazwie Tg corrected).
      2. Wybierz Half Thickness of Slice Image, aby wyświetlić średni obraz centralnych X przekrojów, gdzie X wynosi od 1 do 10 (1 oznacza brak uśredniania, czyli wyświetlenie tylko środkowego przekroju, a 10 oznacza obraz średni z 10 środkowych przekrojów).
        UWAGA: Uśrednianie może pomóc lepiej wyróżnić granice pierścieni i stłumić szumy; z drugiej strony może sprawić, że granice pierścieni będą mniej wyraźne, zwłaszcza gdy kąt włókien jest znaczny. Proszę dostosować tę wartość do potrzeb. Należy zaznaczyć, że służy to wyłącznie do wyświetlania, nie wpływa na podstawowy wolumen ani na końcowe obliczenia/wyniki.
      3. Przejrzyj graficzny interfejs użytkownika (GUI). GUI zawiera górną figurę z płaszczyzną poprzeczną rdzenia, dolną figurę z płaszczyzną promieniową rdzenia oraz menu (Rycina 8).
      4. Aby załadować nowy wolumen rdzenia, użyj funkcji Volume > Load Volume, aby wybrać nowy wielostronicowy plik TIFF w katalogu. Teraz użytkownik jest gotowy do wskazania kierunku struktury, aby następnie wskazać rzeczywiste pierścienie przyrostu.
    2. Korekcja struktury w celu ułatwienia automatycznego wskazywania pierścieni przyrostu.
      1. Klikaj ręcznie na obrazie, aby wstawić zielone paski do korekcji struktury. Zacznij od rdzenia (lub najstarszego dostępnego pierścienia) i zakończ na najnowszym pierścieniu. Wzdłuż rdzenia koryguj odchylenia strukturalne zarówno w płaszczyźnie poprzecznej, jak i promieniowej.
      2. Upewnij się, że prawidłowo wskazujesz kąt pierścienia i włókien, ponieważ wszystkie kolejne wskazania będą opierały się na kącie interpolowanym pomiędzy odpowiednimi punktami.
      3. Wstaw zielony pasek na jednej płaszczyźnie, a automatycznie zostanie wygenerowany pasek na drugiej płaszczyźnie. Po wstawieniu paska przesuń węzły (białe kwadraty) na końcach paska, aby zmienić kąt. Użyj środkowego węzła, aby zmienić pozycję paska. Dostosuj rozmiar węzłów dla łatwiejszej obsługi.
      4. Po każdym kroku upewnij się, że nacisnąłeś Data > Export oraz Rings > Export Rings, aby upewnić się, że wskazania pierścieni i włókien zostały zapisane w odpowiednich plikach .txt. Przez cały proces korekcji zawsze wykonuj te dwie czynności.
    3. Obliczanie profilu gęstości.
      1. Użyj funkcji Densitometry > Densitometry plot , aby obliczyć profil gęstości. Utwórz i narysuj profil gęstości, wybierając Overlay Plotting > Plot Density Profile, który może służyć jako nakładka na płaszczyznach rdzenia.
      2. Do obliczeń MXD określ procent (zalecane 20%, np. 20% oznacza, że uwzględniono tylko 20% najwyższych wartości gęstości), aby wykluczyć niższe wartości z kanałów żywicznych, drewna wczesnego itp. Dla średnich wartości gęstości użyj 100%. Dla gęstości minimalnej również użyj 100%.
    4. Wykonaj ręczne i/lub automatyczne wskazanie granic pierścieni, używając jednego kliknięcia lewym przyciskiem myszy na pierścień, zgodnie z poniższym opisem.
      UWAGA: Wstaw takie same zielone paski jak w kroku 4.3.2.1., tym razem użytkownik powinien robić to pierścień po pierścieniu (Rycina 9).
      1. Użyj Overlay Plotting > Plot Density Profile, aby zwizualizować profil gęstości na obrazie. Najlepiej wskazywać granicę pierścienia w połączeniu z tym profilem.
        UWAGA: Otwórz tyle instancji narzędzi, ile jest potrzebne, w połączeniu z narzędziami CoreComparison (patrz dalej).
      2. W przypadku wskazań automatycznych (zalecanych na przykład dla iglastych) użyj detekcji Auto > Max/Min/Inflection . Funkcja ta automatycznie wskaże granice pierścieni przyrostu na podstawie profilu densytometrycznego utworzonego w poprzednim kroku. W przypadku wskazań automatycznych (działa najlepiej dla borealnych drzew iglastych lub gatunków z wyraźnymi granicami pierścieni zdefiniowanymi przez profil gęstości) użyj detekcji Auto > Max/Min/Inflection. Funkcja ta automatycznie wskaże granice pierścieni przyrostu na podstawie profilu densytometrycznego utworzonego w poprzednim kroku.
      3. W zależności od gatunku (rozproszyste-porowe/pierścieniowe-porowe lub iglaste) użyj maksimum/minimum lub punktu przegięcia krzywej (zaraz po szczycie gęstości) jako kryterium granicy pierścienia przyrostu. Pierwszy parametr jest progiem dla funkcji szczytowej, drugi jest funkcją wygładzającą.
      4. Po wykonaniu automatycznych wskazań pierścieni przeprowadź automatyczne przesunięcie (z rozmiarem okna 1 piksel i zdefiniowaną przez użytkownika liczbą iteracji), upewniając się, że w wyniku tego przesunięcia wskazania pierścieni nie nakładają się na siebie, a następnie ponownie uruchom wykres densytometryczny.
      5. Zmień datę wycinki na rok, w którym pobrano rdzenie przyrostowe z żywych drzew lub jakąkolwiek inną odpowiednią datę. Domyślnie ustawiono rok 1900.
      6. W Overlay Plotting wybierz Plot Rings, a wyświetlone zostaną lata. Wybierz również płaszczyznę, na której mają być narysowane pierścienie i/lub profil gęstości.
      7. Gdy dwa rdzenie zostaną w pełni wskazane (np. z tego samego drzewa), wykonaj parowe porównania krzywych szerokości pierścieni rdzeni, otwierając narzędzia CoreComparison. Otwórz jedną instancję RingIndicator na każdy rdzeń i w razie potrzeby edytuj wskazania. Eksportuj je ponownie i stosuj to iteracyjne i interaktywne podejście, aby uzyskać dane wysokiej jakości. W następnym kroku (krok 4.4.1.) zrób to dla wszystkich rdzeni, aby wyeksportować zarówno dane TRW, jak i odpowiadające im wartości gęstości.
      8. Sprawdź pozycje podwójnych pierścieni w opcji Rings > Check Rings; sprawdzi to, czy jakiekolwiek wskazania znajdują się poza obrazami, a także czy pierścienie nakładają się na siebie, np. w przypadku dwukrotnego kliknięcia w tej samej pozycji.
      9. W przypadku rdzeni uszkodzonych, składających się z fragmentów, zacznij od rdzenia i wyznacz anomalie (powietrze z powodu uszkodzeń rdzenia, jasne plamy z powodu kieszeni żywicznych, zanieczyszczenia i części próchniejące) tak, jakby były to pierścienie, aby później je usunąć. Zakończ na granicy ostatniego utworzonego pierścienia przyrostu i wyeksportuj dane. Staraj się unikać uszkodzeń rdzeni podczas pobierania próbek (patrz krok 1.1. oraz39).
        UWAGA: Można wskazać zarówno brakujące, jak i uszkodzone pierścienie, patrz Rycina 10. Zdefiniowano dwa przypadki: jeden, w którym rdzeń pęka w połowie pierścienia, i drugi, w którym rdzeń pęka na granicy pierścienia. W pierwszym przypadku (Rycina 10A) wskaż przerwę, zanotuj numer tej przerwy, a następnie liczbę 1 i zamknij nawias. Wtedy program zsumuje dwie części pierścienia, aby uzyskać prawidłową wartość TRW. W drugim przypadku wskazany zostaje numer przerwy, a następnie liczba 2, a program pominie tę sekcję (Rycina 10B).
      10. Poprzez wskazywanie pierścieni i generowanie profili gęstości tworzonych jest kilka plików .txt i zapisywanych w tym samym folderze co wielostronicowe pliki TIFF; najważniejsze z nich wymieniono w Tabeli 1. Przechowuj te pliki .txt w tym samym folderze co obrazy TIFF, aby móc dalej przetwarzać je w module CoreComparison (krok 5.4).
        UWAGA: Do obliczania wartości gęstości w inny sposób na podstawie surowego profilu gęstości (na przykład szerokość drewna późnego w stosunku do szerokości drewna wczesnego45 lub inne wskaźniki nieobsługiwane przez narzędzia CoreComparison i CoreProcessor) użyj plików tekstowych zpos_corr oraz density_corr.
  4. Aby porównać serie TRW i wyeksportować dane za pomocą CoreComparison, wykonaj poniższe kroki.
    UWAGA: Podczas korzystania z tych narzędzi jednocześnie otwierane są dwa okna: moduł CoreComparison oraz moduł PatternMatching. CoreComparison zajmuje się datowaniem krzyżowym i eksportem danych TRW, natomiast moduł PatternMatching może być użyty do eksportu profili gęstości i wartości gęstości (MXD, gęstość minimalna (MND), gęstość średnia oraz 4 wartości kwartylowe). Głównym celem CoreComparison jest generowanie wartości TRW i wartości gęstości oraz uzyskanie przybliżonej oceny jakości datowania krzyżowego, z możliwością powiązania z RingIndicator w przypadku brakujących pierścieni lub błędnych wskazań.
    1. Wykonaj następujące kroki w celu datowania krzyżowego lub dopasowania wzorca szerokości pierścieni do innych serii.
      1. Po zakończeniu sekcji RingIndicator wybierz pliki tekstowe do porównania; otworzy się ekran z szerokościami pierścieni wraz z parametrami datowania krzyżowego lub parametrami statystycznymi, takimi jak Gleichlaüfigkeit (GLK)46 i/lub korelacja Spearmana między poszczególnymi seriami (Rycina 11).
      2. Aby wprowadzić zmiany we wskazaniach pierścieni (na przykład podczas datowania krzyżowego), ponownie otwórz RingIndicator, zaimportuj dane, wyeksportuj zmodyfikowane dane i pierścienie, a następnie użyj przycisku Refresh w module CoreComparison (patrz górny lewy róg), aby zobaczyć zmiany.
      3. Otwórz wiele instancji RingIndicator, aby wprowadzać zmiany w różnych seriach pierścieni przyrostu i korzystaj z wielu monitorów do tego celu.
      4. W menu GLK i CORR (Rycina 11) wykonaj serię czynności związanych z GLK, takich jak ustalanie progów dla wartości, eksport wartości GLK do arkusza kalkulacyjnego i ich ranking.
    2. Uzyskaj wartości TRW z CoreComparison zgodnie z poniższym opisem.
      1. Użyj funkcji rysowania i eksportu w CoreComparison, aby zmienić przesunięcie między krzywymi (większa wartość skutkuje mniejszym przesunięciem). Zwizualizuj dane TRW na wykresie, wybierając Plotting and Exporting > Ring width.
      2. Wyeksportuj dane TRW, klikając Plotting and Exporting > Export RW Data. Eksportuj szerokości pierścieni w formacie arkusza kalkulacyjnego lub w formacie Tucson.
    3. Uzyskaj profile gęstości z modułu PatternMatching zgodnie z poniższym opisem.
      1. Aby uzyskać profile gęstości w arkuszu kalkulacyjnym, przejdź do modułu PatternMatching, a po załadowaniu profili w menu Other wybierz Plotting > Export Corrected Density Profiles.
      2. Aby przetwarzać profile seryjnie lub oceniać dane różnymi metodami, użyj bezpośrednio plików .txt z Tabeli 1 (patrz krok 4.3.4.11).
    4. Uzyskaj wartości MXD, MND i inne wartości gęstości z modułu PatternMatching zgodnie z poniższym opisem.
      1. Aby uzyskać średnią gęstość, MXD, MND i dane kwartylowe dla każdego pierścienia przyrostu, użyj Other Plotting > Export Clustered Data. Wygenerowany zostanie arkusz kalkulacyjny, który znajdzie się w tym samym folderze co pliki TIFF.
      2. Zakładki w arkuszu kalkulacyjnym szczegółowo opisano w Tabeli 2. Wyeksportuj te zmienne pierścieni przyrostu do Rstudio lub innego oprogramowania w celu dalszej analizy.

Skan CT pokazujący porównanie gęstości materiałów; schemat z oznaczonymi obszarami rdzenia, referencyjnym i powietrza.
Rysunek 6. Wyznaczanie wartości gęstości drewna z wartości poziomów szarości. Przeliczanie wartości poziomów szarości obrazu na rzeczywiste szacunkowe wartości gęstości drewna poprzez kalibrację z materiałem referencyjnym. (A) Uchwyt na próbki 1, przy rozdzielczości 60 µm, pokazujący referencję powietrza, referencję białą oraz rdzeń. (B) Uchwyt na próbki, przy rozdzielczości 20 µm, gdzie również pokazano powietrze, referencję i rdzeń. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat analizy naprężeń ścinających z wektorami i kątami, ilustrujący deformację materiału.
Rysunek 7Kroki wstępnego przetwarzania trójwymiarowej objętości rdzenia. Kroki wstępnego przetwarzania trójwymiarowej objętości rdzenia przed wizualizacją i wyznaczeniem słoje drzewa.A) Korekcja nachylenia (osiowa), (B) korekcja styczna, przy czym szare paski wskazują kierunek włókien, (C) przycięcie objętości rdzenia w celu uzyskania objętości zawierającej wyłącznie woksle tkanki zdrewniałej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza erozji gleby; wykres z seriami danych, pokazujący zmiany czasowe od 2010 do 2014 r.
Rysunek 8. Zrzut ekranu rdzenia. Zrzut ekranu rdzenia (szerokość styczna około 3 mm, rozdzielczość µm) otwartego w narzędziu RingIndicator. Górny panel przedstawia widok poprzeczny, dolny panel widok promieniowy. Zielone paski wskazują oznaczenie struktury (w tym przypadku na granicy pierścienia), czerwona linia to profil gęstości. Żółte liczby oznaczają rok kalendarzowy, a niebieskie liczby ogólną numerację pierścienia (liczoną od pierwszego oznaczenia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat równowagi statycznej; analiza profilu gęstości; ilustracja wskazań pierścieni i przesunięć sił.
Rysunek 9. Wizualizacja wskazań pierścieni i profilu gęstości w module RingIndicator. Linie zielone to wskazania, linia czerwona to profil gęstości drewna. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy słojów drzewa; granice pęknięć, numeracja słojów dla lat wzrostu, badanie dendrochronologiczne.
Rysunek 10. Sposób postępowania z pęknięciami w rdzeniach. (A) Gdy pęknięcie występuje w środku słoja, ogólny numer słoja (licząc od rdzenia) zostanie oznaczony jako przerwa, a TRW zostanie obliczone poprzez zsumowanie szerokości obu części słoja. Parametry to 3 (numer słoja) oraz 1 (przypadek 1: pęknięcie w środku słoja)31. (B) Gdy pęknięcie występuje na granicy słojów, przerwa zostanie pominięta w obliczeniach TRW. Parametry to 3 (numer słoja) oraz 2 (przypadek 2: pęknięcie na granicy słojów)31. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres porównawczy szerokości słojów drzew z analizą danych GLK i CORR; wyniki badań dendrochronologicznych.
Rycina 11Zrzut ekranu modułu Core Comparison. Zrzut ekranu modułu porównywania rdzeni, w którym serie szerokości słoje są rozmieszczone pionowo w celu ułatwienia porównania wizualnego. Górny panel przedstawia szerokość słojów 4 rdzeni z Fagus sylvaticaw lewym dolnym panelu przedstawiono współczynnik równoległości (GLK), a w prawym dolnym panelu współczynnik korelacji Spearmana. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Nazwa pliku Wyjaśnienie
NAZWAPRÓBKI_gęstość.txtNekorygowane wartości gęstości dla całej długości obrazu, zatem niepoprawione pod kątem kąta pierścienia i włókien
NAZWA PRÓBKI _korelacja_gęstości.txt por. poprzedni tekst, ale z poprawionymi wartościami gęstości 
NAZWA PRÓBKI _ring-and-fibre.txt pozycje i kąty wskazania pierścienia i włókna
NAZWA PRÓBKI _zpos.txt położenie granic słoje drzewa w rdzeniu, bez korekty słojów i włókien
NAZWAPRÓBKI _zpos.corr.txt analogicznie jak w przypadku zpos, a następnie skorygowane o kąt pierścienia i włókna
NAZWANAZPROBKI _szerokośćpierścienia.txt obliczone szerokości słojów, z uwzględnieniem kąta słojów i kąta włókien

Tabela 1. Pliki tekstowe generowane przez RingIndicator. Lista plików tekstowych generowanych po zaznaczeniu pierścieni i eksporcie profilu gęstości w programie RingIndicator. Pliki te powinny znajdować się w tym samym folderze co plik .tiff, aby można było je otworzyć w module CoreComparison.

Zmienna słojów drzewaWyjaśnienie
Gęstość średnia średnia gęstość na słoje przyrostu
Maksymalna gęstość w oparciu o połowę wartości MXD, ale obliczony wyłącznie na podstawie drugiej połowy przyrostu rocznego, aby uniknąć włączenia wysokich wartości gęstości z poprzedniego roku.
Minimalna gęstość minimalna gęstość na słoje drzewa
Q1-Q4 wartości średnie i maksymalne dla każdego kwartylu wewnątrzrocznego profilu przyrostu pierścienia 

Tabela 2. Szczegóły arkusza kalkulacyjnego. Zmienne pierścieni drzewostanu, które są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego o nazwie export clustered data.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli celem jest oszacowanie biomasy lub przyrostu wzrostu drzewa dla wielu próbek, tj. w skali między pierścieniami (Rysunek 1), wówczas do skanowania próbek w celu uzyskania profili gęstości (patrz krok 5.4.3) oraz szacunków wzrostu drzewa stosuje się uchwyt do próbek 1 (Rysunek 5), np. w przypadku drzew szybkorosnących o dużym TRW, co pozwala na zastosowanie niższej rozdzielczości. Rysunek 12 przedstawia przykład trendów gęstości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Krytyczne kroki w ramach protokołu obejmują właściwe obchodzenie się z wiertarką inkrementacyjną w celu uzyskania wysokiej jakości rdzeni inkrementacyjnych (krok 1.1. i patrz39), aby uniknąć kawałków. Następnie ważne jest, aby rdzenie pozostały niezamontowane (ale patrz26), zarówno w celu włożenia do uchwytu próbki (rysunek 5, patrz21), jak i w celu prawidłowej ekstrakcji żywicy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy trzem anonimowym recenzentom za ich opinie i sugestie. Badania te zostały sfinansowane przez BOF Special Research Fund for JVdB (BOF Starting Grant BOF. STG.2018.0007.01), dla UGCT jako Centrum Wiedzy Specjalistycznej (BOF. EXP.2017.0007) oraz jako instrument podstawowy (BOF. COR.2022.008), autorzy dziękują również Fundacji Badawczej Flandrii (G019521N i G009720N) oraz Funduszowi Badań Przemysłowych UGent (IOF) za wsparcie finansowe infrastruktury poprzez grant IOF. APP.2021.0005 (projekt FaCT F2021/IOF-Equip/021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Słomki papierowe 6 mm http://artstraws.com/education/product/artstraws-thick-asst-cols/rdzeniowe
aluminiowe uchwyty
Norma ASTM ASTM D 1107 – 96
Tekturowe tuby pocztowehttps://www.rajapack.co.uk/envelopes-mailing-bags/postal-tubes/1-5-2mm-brown-cardboard-postal-tubes_PDT05623.html
Wiertarka kolumnowa
Sprzęt komputerowy do rekonstrukcji i analizyRTG TK
Chłodzenie 
Piec
etanolu 
Kolba pod soxhlet (2000 ml)
Pianka florystycznahttps://www.oasisfloral.eu/Uchwyt na próbkę typ 1
Koraliki szklane do wypełnienia pustej objętości Soxhleta w celu zaoszczędzenia rozpuszczalnika
Klej
Kąpiel w gorącej wodzie Ekstrakcja Soxhleta
Świdr przyrostowy https://haglofsweden.com/project/increment-borers/
Cylinder z tworzywa sztucznego Moonen i in. 2022 Uchwyt na próbkę typ 2
Butle z tworzywa sztucznego
Zbiornik
Dostosowany aparat soxhlet 
Toluen 
Pompa wodna 
Tomograf
rdzeniowedo suszenia https://www.memmert.com/products/water-baths/water-bath/#!filters=%7B%7D rentgenowski

Bibliografia

  1. Björklund, J., et al. The utility of bulk wood density for tree-ring research. Dendrochronologia. 69 (September), 125880(2021).
  2. Lachenbruch, B., Mcculloh, K. A. Traits, properties, and performance: How woody plants combine hydraulic and mechanical functions in a cell, tissue, or whole plant. New Phytologist. 204 (4), 747-764 (2014).
  3. Baker, T. R., et al. Variation in wood density determines spatial patterns in Amazonian forest biomass. Global Change Biology. 10 (5), 545-562 (2004).
  4. Bastin, J. F., et al. Wood specific gravity variations and biomass of central African tree species: The simple choice of the outer wood. PLoS ONE. 10 (11), 1-16 (2015).
  5. Chave, J., et al. Improved allometric models to estimate the aboveground biomass of tropical trees. Global Change Biology. 20 (10), 3177-3190 (2014).
  6. Chave, J., et al. Towards a worldwide wood economics spectrum. Ecology letters. 12, 351-366 (2009).
  7. Plourde, B. T., Boukili, V. K., Chazdon, R. L. Radial changes in wood specific gravity of tropical trees: inter- and intraspecific variation during secondary succession. Functional Ecology. 29 (1), 111-120 (2015).
  8. Decoux, V., Varcin, É, Leban, J. -M. Relationships between the intra-ring wood density assessed by X-ray densitometry and optical anatomical measurements in conifers. Consequences for the cell wall apparent density determination. Annals of Forest Science. 61, 251-262 (2004).
  9. Rathgeber, C. B. K., Decoux, V., Leban, J. M. Linking intra-tree-ring wood density variations and tracheid anatomical characteristics in Douglas fir (Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco). Annals of Forest Science. 63 (7), 699-706 (2006).
  10. Ziemińska, K., Butler, D. W., Gleason, S. M., Wright, I. J., Westoby, M. Fibre wall and lumen fractions drive wood density variation across 24 Australian angiosperms. AoB PLANTS. 5, plt046(2013).
  11. Ziemińska, K., Westoby, M., Wright, I. J. Broad anatomical variation within a narrow wood density range - A study of twig wood across 69 Australian angiosperms. PLoS ONE. 10 (4), 1-25 (2015).
  12. De Mil, T., et al. Wood density profiles and their corresponding tissue fractions in tropical angiosperm trees. Forests. 9 (12), 763(2018).
  13. Björklund, J., et al. Scientific Merits and Analytical Challenges of Tree-Ring Densitometry. Reviews of Geophysics. 57 (4), 1224-1264 (2019).
  14. Maniatis, D., Saint André, L., Temmerman, M., Malhi, Y., Beeckman, H. The potential of using xylarium wood samples for wood density calculations: A comparison of approaches for volume measurement. IForest. 4 (1), 150-159 (2011).
  15. Lehnebach, R., et al. Wood density variations of legume trees in French Guiana along the shade tolerance continuum: Heartwood effects on radial patterns and gradients. Forests. 10 (2), 1-22 (2019).
  16. Longuetaud, F., et al. Within-stem maps of wood density and water content for characterization of species: a case study on three hardwood and two softwood species. Annals of Forest Science. 73 (3), 601-614 (2016).
  17. Steffenrem, A., Kvaalen, H., Dalen, K. S., Høibø, O. A. A high-throughput X-ray-based method for measurements of relative wood density from unprepared increment cores from Picea abies. Scandinavian Journal of Forest Research. 29 (5), 506-514 (2014).
  18. Vannoppen, A., et al. Dendrochronologia Using X-ray CT based tree-ring width data for tree growth trend analysis. Dendrochronologia. 44, 66-75 (2017).
  19. Maes, S. L., et al. Evaluating the robustness of three ring-width measurement methods for growth release reconstruction. Dendrochronologia. 46 (May), 67-76 (2017).
  20. Van Den Berge, S., et al. Biomass increment and carbon sequestration in hedgerow-grown trees. Dendrochronologia. 70 (September), 125894(2021).
  21. De Mil, T., Vannoppen, A., Beeckman, H., Van Acker, J., Van den Bulcke, J. A field-to-desktop toolchain for X-ray CT densitometry enables tree ring analysis. Annals of Botany. 117 (7), 1187-1196 (2016).
  22. St. George, S., Esper, J. Concord and discord among Northern Hemisphere paleotemperature reconstructions from tree rings. Quaternary Science Reviews. 203, 278-281 (2018).
  23. Schweingruber, F., Fritts, H., Braker, O., Drew, L., Schar, E. The X-ray technique as applied to dendroclimatology. Tree-Ring Bulletin. 38, 61-91 (1978).
  24. Björklund, J., et al. Cell size and wall dimensions drive distinct variability of earlywood and latewood density in Northern Hemisphere conifers. New Phytologist. 216 (3), 728-740 (2017).
  25. Polge, H. Applications dans les domaines Technologique et Physiologique. Annales des sciences forestières. 23 (1), 215(1966).
  26. De Mil, T., et al. A lonely dot on the map: Exploring the climate signal in tree-ring density and stable isotopes of clanwilliam cedar, South Africa. Dendrochronologia. 69 (November 2020), 125879(2021).
  27. Jansen, S., et al. Preparation of wood specimens for transmitted light microscopy and scanning electron microscopy. Belgian Journal of Botany. 131 (1), 41-49 (1998).
  28. Gärtner, H., Nievergelt, D. The core-microtome: A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
  29. von Arx, G., Crivellaro, A., Prendin, A. L., Čufar, K., Carrer, M. Quantitative Wood Anatomy-Practical Guidelines. Frontiers in Plant Science. 7 (June), 781(2016).
  30. Seftigen, K., et al. Prospects for dendroanatomy in paleoclimatology -- a case study on Picea engelmannii from the Canadian Rockies. Climate of the Past. 18 (5), 1151-1168 (2022).
  31. Castagneri, D., Regev, L., Boaretto, E., Carrer, M. Xylem anatomical traits reveal different strategies of two Mediterranean oaks to cope with drought and warming. Environmental and Experimental Botany. 133 (October), 128-138 (2017).
  32. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. The New phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  33. Van den Bulcke, J., et al. X-ray tomography as a tool for detailed anatomical analysis. Annals of Forest Science. 66 (5), 508(2009).
  34. Williamson, G. B., Wiemann, M. C. Measuring wood specific gravity...Correctly. American journal of botany. 97 (3), 519-524 (2010).
  35. Masschaele, B., et al. HECTOR: A 240kV micro-CT setup optimized for research. Journal of Physics: Conference Series. 463 (1), 012012(2013).
  36. Kak, A. C., Slaney, M. Principles of Computerized Tomographic Imaging. , Society for Industrial and Applied Mathematics. (2001).
  37. Van Den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree ring research for earth system sciences. Annals of Botany. 124 (5), 837-847 (2019).
  38. Zwanenburg, E. A., Williams, M. A., Warnett, J. M. Review of high-speed imaging with lab-based x-ray computed tomography. Measurement Science and Technology. 33 (1), 012003(2022).
  39. Gärtner, H., Cherubini, P., Schneider, L., Lucchinetti, S. Advanced Workflow for Taking High-Quality Increment Cores - New Techniques and Devices. JoVE. (193), e64747(2023).
  40. Schweingruber, F. H., Fritts, H. C., Bräker, O. U. The X-ray technique as applied to dendroclimatology. Tree-Ring Bulletin. 38, (1978).
  41. Grabner, M., Wimmer, R., Gierlinger, N., Evans, R., Downes, G. M. Heartwood extractives in larch and effects on X-ray densitometry. Canadian Journal of Forest Research. 35 (12), 2781-2786 (2005).
  42. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  43. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  44. von Arx, G., Carrer, M. ROXAS - A new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
  45. Koubaa, A., Zhang, S. Y. T., Makni, S. Defining the transition from earlywood to latewood in black spruce based on intra-ring wood density profiles from X-ray densitometry. Annals of Forest Science. 59 (5-6), 511-518 (2002).
  46. Buras, A., Wilmking, M. Correcting the calculation of Gleichläufigkeit. Dendrochronologia. 34, 29-30 (2015).
  47. Bunn, A. G. Statistical and visual crossdating in R using the dplR library. Dendrochronologia. 28 (4), 251-258 (2010).
  48. Zang, C., Biondi, F. Treeclim: an R package for the numerical calibration of proxy-climate relationships. Ecography. (November 2014), 1-6 (2014).
  49. Van den Bulcke, J., et al. Nondestructive research on wooden musical instruments: From macro- to microscale imaging with lab-based X-ray CT systems. Journal of Cultural Heritage. 27, S78-S87 (2017).
  50. Helama, S., Vartiainen, M., Kolström, T., Meriläinen, J. Dendrochronological investigation of wood extractives. Wood Science and Technology. 44 (2), 335-351 (2010).
  51. Black, B. A., et al. The value of crossdating to retain high-frequency variability, climate signals, and extreme events in environmental proxies. Global Change Biology. 22 (7), 2582-2595 (2016).
  52. Hubau, W., et al. The persistence of carbon in the African forest understory. Nature plants. 5 (2), 133-140 (2019).
  53. Stoffel, M., Klinkmüller, M. 3D analysis of anatomical reactions in conifers after mechanical wounding: First qualitative insights from X-ray computed tomography. Trees - Structure and Function. 27 (6), 1805-1811 (2013).
  54. Van den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree-ring research for earth-system sciences. Annals of Botany. , 1-11 (2019).
  55. Ziaco, E., Biondi, F., Heinrich, I. Wood Cellular Dendroclimatology: Testing New Proxies in Great Basin Bristlecone Pine. Frontiers in Plant Science. 7 (October), 1-13 (2016).
  56. De Ridder, M., et al. High-resolution proxies for wood density variations in Terminalia superba. Annals of botany. 107 (2), 293-302 (2011).
  57. Resente, G., et al. Repeat! Artificial Intelligence for Quantitative Wood Anatomy. Frontiers in Plant Science. 12 (November), 1-14 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szerokość przyrostów rocznychmaksymalna gęstość późnego drewnaprofil gęstości drewnailościowa anatomia drewnaskanowanie wysokoprzepustowedendrochronologiaporównywanie rdzeniwskaźnik przyrostu
Analiza rdzenia drzewa za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.