Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65211

⸱

10 marca 2023

 ,  ,  ,  , 
1National High-Throughput Crystallization Center, Hauptman-Woodward Medical Research Institute, 2Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, The State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Streszczenie

Krystalografia rentgenowska jest najczęściej stosowaną techniką do rozpoznawania struktur makromolekularnych, ale kluczowy etap krystalizacji białka w uporządkowaną siatkę podatną na dyfrakcję pozostaje wyzwaniem. Krystalizacja biomolekuł jest w dużej mierze zdefiniowana eksperymentalnie, a proces ten może być pracochłonny i niebezpieczny dla badaczy w instytucjach o ograniczonych zasobach. W Narodowym Centrum Krystalizacji o Wysokiej Przepustowości (HTX) wdrożono wysoce powtarzalne metody ułatwiające wzrost kryształów, w tym zautomatyzowaną, wysokowydajną 1536-dołkową konfigurację mikrowsadów pod olejem, zaprojektowaną do pobierania próbek w szerokim zakresie parametrów krystalizacji. Płytki są monitorowane przy użyciu najnowocześniejszych metod obrazowania w ciągu 6 tygodni, aby zapewnić wgląd we wzrost kryształów, a także dokładnie rozróżnić cenne trafienia kryształów. Co więcej, wdrożenie wyszkolonego algorytmu oceniania opartego na sztucznej inteligencji do identyfikacji uderzeń kryształów, w połączeniu z przyjaznym dla użytkownika interfejsem typu open source do przeglądania obrazów eksperymentalnych, usprawnia proces analizy obrazów wzrostu kryształów. W tym miejscu opisano kluczowe procedury i oprzyrządowanie do przygotowania koktajli i płytek krystalizacyjnych, obrazowania płytek i identyfikacji trafień w sposób zapewniający powtarzalność i zwiększający prawdopodobieństwo udanej krystalizacji.

Wprowadzenie

Nawet w epoce ogromnego postępu w metodach biologii strukturalnej, krystalografia rentgenowska nadal jest niezawodną i popularną metodą generowania wysokiej jakości modeli strukturalnych makromolekuł. Ponad 85% wszystkich trójwymiarowych modeli strukturalnych zdeponowanych w Banku Danych o Białkach (PDB) pochodzi z metod strukturalnych opartych na kryształach (stan na styczeń 2023 r.). 1 Ponadto, krystalografia rentgenowska pozostaje niezbędna do rozwiązywania struktur białko-ligand, kluczowy składnik procesu odkrywania i rozwoju leków2. Pomimo tego, że krystalizacja białek pozostaje dominującą techniką biologii strukturalnej od ponad pół wieku, metody przewidywania prawdopodobieństwa krystalizacji na podstawie właściwości fizycznych3 lub sequence4,5 są wciąż w powijakach.

Przewidywanie warunków krystalizacji jest jeszcze bardziej niejasne; poczyniono ograniczone postępy w przewidywaniu prawdopodobnych warunków krystalizacji nawet dla białek modelowych6,7. Inne badania miały na celu zidentyfikowanie warunków krystalizacji w oparciu o homologię białek i warunki wydobyte z klasy PDB8,9,10. Moc predykcyjna, którą można znaleźć w PDB, jest jednak ograniczona, ponieważ deponowane są tylko końcowe, udane warunki krystalizacji, co z konieczności pomija często obszerne eksperymenty optymalizacyjne wymagane do precyzyjnego dostrojenia wzrostu kryształów. Co więcej, w wielu wpisach PDB brakuje metadanych zawierających te szczegóły, w tym formuły koktajli, format krystalizacji, temperaturę i czas do krystalizacji11,12. Dlatego w przypadku wielu interesujących białek najbardziej dostępnym sposobem określenia warunków krystalizacji jest eksperymentalne wykorzystanie jak największej liczby warunków w szerokim zakresie możliwości chemicznych.

Kilka podejść, aby badanie przesiewowe krystalizacji było jak najbardziej owocne i dokładne, zostało zbadanych z doskonałym skutkiem, w tym rzadkie matryce13, niepełne przesiewanie czynnikowe14, dodatki15,16, seeding17 i czynniki nukleujące18. Narodowe Centrum HTX w Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) opracowało wydajną linię do badań przesiewowych krystalizacji przy użyciu podejścia mikrobatch-under-oil19, która wykorzystuje zautomatyzowane metody obsługi cieczy i obrazowania w celu usprawnienia identyfikacji początkowych warunków krystalizacji przy użyciu stosunkowo minimalnych objętości próbek i koktajli (Rysunek 1). Zestaw 1 536 unikalnych koktajli opiera się na warunkach, które wcześniej uznano za sprzyjające wzrostowi kryształów białek i zostały zaprojektowane tak, aby były zróżnicowane chemicznie w celu pobrania próbki z szerokiego zakresu możliwych warunków krystalizacji20,21,22. Szerokie próbkowanie warunków krystalizacji zwiększa prawdopodobieństwo zaobserwowania jednego lub więcej przewodów krystalizacyjnych.

W literaturze pojawiło się niewiele formalnych analiz dotyczących tego, ile warunków jest potrzebnych do przeprowadzenia badań przesiewowych. Jedno z badań koncentrowało się na układzie próbkowania różnych ekranów i wykazało, że losowe próbkowanie komponentów (podobne do niekompletnej silni) stanowiło najbardziej dokładną i wydajną metodę próbkowania23. Inne badanie przesiewowe wykazało, że było wiele przypadków, w których bardzo dokładne badanie 1536 próbek dało tylko pojedynczy kryształ hit24, a niedawne badanie wykazało, że większość komercyjnych ekranów zaniża przestrzeń krystalizacji, o której wiadomo, że jest związana z hitami przesiewowymi25. Nie wszystkie przewody krystalizacyjne dadzą kryształ o jakości dyfrakcyjnej odpowiedni do zbierania danych ze względu na nieodłączny nieporządek w krysztale, ograniczenia dyfrakcyjne lub wady kryształu; W związku z tym zarzucenie szerszej sieci na warunki ma dodatkową korzyść w postaci dostarczenia alternatywnych form kryształów do optymalizacji.

Format eksperymentów z krystalizacją białek również ma wpływ na sukces ekranu. Dyfuzja pary wodnej jest najczęściej używaną konfiguracją do zastosowań krystalizacji o wysokiej przepustowości i jest wykorzystywana w najnowocześniejszych centrach krystalizacji, w tym w wysokoprzepustowych centrach przesiewowych EMBL Hamburg i Institut Pasteur26,27,28. Centrum HTX stosuje metodę mikrowsadów pod olejem; Chociaż jest rzadziej stosowana, jest to solidna metoda, która minimalizuje zużycie próbek i koktajli krystalizacyjnych20,21,22. Jedną z zalet metody mikroporcjowania pod olejem, szczególnie w przypadku stosowania oleju parafinowego o wysokiej lepkości, jest to, że podczas eksperymentu w kropli zachodzi tylko niewielkie parowanie, co oznacza, że stężenie równowagi osiąga się po zmieszaniu kropli. Jeśli zaobserwuje się pozytywne wyniki krystalizacji w metodzie mikropartii pod olejem, odtworzenie tych warunków jest zwykle prostsze niż w układach dyfuzji parowej, w których krystalizacja zachodzi w pewnym nieokreślonym punkcie podczas równowagi między kroplą krystalizacji a zbiornikiem. Powtarzalność trafień jest pożądana w przypadku wysokoprzepustowych podejść do krystalizacji, które wytwarzają zbyt małe kryształy białek, które zwykle muszą być zoptymalizowane pod kątem eksperymentów rentgenowskich na monokryształach.

Wysokoprzepustowy ekran krystalizacji dla rozpuszczalnych białek składa się z koktajli, które są przygotowywane we własnym zakresie, gotowych ekranów komercyjnych i modyfikowanych wewnętrznie ekranów komercyjnych22. Koktajle zostały początkowo opracowane przy użyciu niekompletnej strategii czynnikowej przy użyciu wcześniej udanych koktajli krystalizacji20. Odczynniki w sitku, które są dostępne na rynku, obejmują tablice polimerów, sole krystalizacyjne, PEG i kombinacje jonów oraz ekrany, które wykorzystują rzadkie matryce i niekompletne podejścia czynnikowe. Istnieją również odczynniki, które są modyfikowane przed włączeniem do ekranu: sito dodatków, sito pH i buforu, sito dodatków do cieczy jonowych i sito polimerowe.

Moc znanych warunków i strategii krystalizacji została wykorzystana w 1 536 koktajlach krystalizacji, wraz z korzyściami płynącymi z systemu mikrobatch-under-oil do wygenerowania rurociągu, który wykorzystuje zautomatyzowane przetwarzanie cieczy, automatyczne obrazowanie jasnego pola i nieliniowe obrazowanie kryształów chiralnych drugiego rzędu (SONICC). Automatyzacja zarówno obsługi cieczy, jak i obrazowania zapewnia korzyści w postaci mniejszej liczby godzin pracy w laboratorium w stanie mokrym i większej powtarzalności. Wysoka przepustowość zautomatyzowanych badań przesiewowych krystalizacji wymaga automatyzacji procesu monitorowania wzrostu kryształów. Postępy te osiągnięto dzięki najnowocześniejszym technologiom obrazowania, które pomagają w identyfikacji dodatnich uderzeń kryształów. Zarówno standardowe obrazowanie płytek w jasnym polu, jak i metody wielofotonowe w celu poprawy detekcji, są stosowane za pośrednictwem systemu obrazowania kryształów z SONICC (Rysunek 2). SONICC łączy mikroskopię drugiej generacji harmonicznej (SHG)29 mikroskopia i ultrafioletowa dwufotonowa fluorescencja wzbudzona (UV-TPEF)30 mikroskopia do wykrywania bardzo małych kryształów, a także tych przesłoniętych przez osad. Obrazowanie SONICC informuje o tym, czy studzienki zawierają białko (poprzez UV-TPEF) i kryształy (poprzez SHG). Oprócz pozytywnej identyfikacji kryształów białkowych, dodatkowe informacje można również uzyskać za pomocą najnowocześniejszych metod obrazowania. Obrazowanie wyłącznie koktajlowe przed dodaniem próbki służy jako kontrola ujemna; Obrazy te mogą zidentyfikować wygląd odwiertu przed dodaniem próbki, w tym pod względem kryształów soli i szczątków. Dodatkowo, obrazowanie SHG i UV-TPEF pomaga odróżnić kryształy białka od kryształów soli i może być wykorzystane do wizualizacji materiału skompleksowanego białko-kwas nukleinowy31.

Eksperymenty z krystalizacją o wysokiej przepustowości, poddawane wielokrotnemu monitorowaniu za pomocą obrazowania, skutkują bardzo dużą ilością obrazów wymagających zbadania. Zautomatyzowane metody oceniania kryształów zostały opracowane w celu zmniejszenia obciążenia użytkownika i zwiększenia prawdopodobieństwa identyfikacji pozytywnych trafień kryształów. Centrum HTX brało udział w opracowaniu algorytmu punktacji MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO), wyszkolonej architektury głębokiej konwolucyjnej sieci neuronowej opracowanej przez konsorcjum partnerów akademickich, non-profit, rządowych i przemysłowych w celu klasyfikowania obrazów studni jasnego pola32. Algorytm został przeszkolony na prawie pół miliona obrazów w jasnym polu pochodzących z eksperymentów krystalizacji przeprowadzonych przez wiele instytucji przy użyciu różnych metod krystalizacji i różnych kamer. Algorytm generuje wynik probabilistyczny wskazujący, czy dany obraz należy do czterech możliwych klas obrazów: "kryształ", "przezroczysty", "wytrącić" i "inny". Dokładność klasyfikacji MARCO wynosi 94,5%. Wykrywanie kryształów jest dodatkowo ulepszone dzięki oprogramowaniu, które implementuje algorytm i zapewnia graficzny interfejs użytkownika (GUI) do dostępnego i prostego przeglądania obrazu, z możliwością oceniania z obsługą sztucznej inteligencji32,33. Graficzny interfejs użytkownika MARCO Polo został zaprojektowany tak, aby bezproblemowo współpracował z konfiguracją systemu obrazowania i zarządzania danymi w HTX Center w celu identyfikacji trafień na ekranie 1,536 dołków, przy zaangażowaniu człowieka w celu zbadania wyników posortowanych list. Dodatkowo, jako oprogramowanie typu open source dostępne w serwisie GitHub, graficzny interfejs użytkownika jest łatwo dostępny do modyfikacji w celu odzwierciedlenia specyficznych potrzeb innych grup laboratoryjnych.

Tutaj opisany jest proces przygotowania wysokoprzepustowego eksperymentu z mikropartiami pod olejem, wykorzystujący zrobotyzowaną obsługę płynów do dostarczania zarówno koktajlu, jak i białka. Centrum HTX posiada unikalny zestaw oprzyrządowania i zasobów, których nie można znaleźć w innych instytucjach, w celu świadczenia usług przesiewowych i zasobów edukacyjnych dla zainteresowanych użytkowników. Zademonstrowanie metod i możliwości wysokoprzepustowych technik wykorzystujących robotykę umożliwi społeczności zdobycie wiedzy na temat dostępnych technologii i podejmowanie decyzji dotyczących własnych wysiłków związanych z określaniem konstrukcji.

Protokół

1. Przygotowanie lub zakup koktajli dla szesnastu 96-studniowych bloków głębinowych

  1. Przygotuj koktajle chemiczne wytwarzane we własnym zakresie, dozując je do 96-dołkowych bloków studni głębinowej (DW). Użyj zrobotyzowanej maszyny do obsługi cieczy, aby dozować i mieszać roztwory podstawowe soli,, polimerów i wody.
  2. Przygotuj zmodyfikowane we własnym zakresie koktajle chemiczne za pomocą zrobotyzowanej ładowarki do cieczy lub pipety wielokanałowej, aby dodać dodatkowe składniki do 96-dołkowych sit blokowych DW, które zostały zakupione na rynku.
  3. Kup dostępne na rynku bloki DW.
  4. Przechowuj oznakowane 96-dołkowe bloki DW w temperaturze -20 °C przez 12-18 miesięcy.
    UWAGA: Koktajle przygotowane w kroku 1.1. oraz 1.2. napełnij 10/16 96-dołkowe bloki DW i 5/16 96-dołkowe bloki DW są używane zgodnie z zakupem. Jeden 96-dołkowy blok DW w sicie jest ustawiany w momencie dozowania płytki 1,536-dołkowej, aby uniknąć wytrącania się sita dodatku (patrz sekcja 3).

2. Dozowanie koktajli do 384-dołkowych talerzy

  1. Rozmrozić 96-dołkowe bloki DW w temperaturze 4 °C przez noc. Doprowadzić do temperatury pokojowej (20-23 °C) przed rozpoczęciem przygotowania płytek 384-dołkowych.
    UWAGA: Temperatura pokojowa jest odpowiednia do przygotowania talerzy koktajlowych. Głównym problemem przy przygotowywaniu tych talerzy jest unikanie osadów, które mogą zatykać urządzenia do obsługi płynów i prowadzić do nieprzewidywalnych zmian stężeń składników koktajlu.
  2. W razie potrzeby dokładnie wymieszaj bloki przez odwrócenie, aby rozpuścić uporczywy nieprzezroczysty osad. Jeśli którakolwiek ze studzienek zawiera osad, podgrzej bloki do 30 °C, aby się rozpuściły.
  3. Dostarczyć 50 μl roztworu koktajlowego z czterech 96-dołkowych bloków DW na jedną płytkę 384-dołkową za pomocą robota do obsługi cieczy wyposażonego w 96-strzykawkową głowicę lub pipetor. Cztery 96-dołkowe bloki DW są wybijane w płytce 384-dołkowej tak, że ćwiartki są wypełnione (np. A1 z 96-DW1 do A1 z 384-płytki1, A1 z 96-DW2 do B1 z 384-płytki1 itd.) (Rysunek 3).
  4. Dostarcz 15 z 16 96-dołkowych bloków DW do 384-dołkowych płytek w celu przechowywania.
  5. Płytki 384-dołkowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy w celu wykorzystania ich do przygotowania płytek 1,536-dołkowych.

3. Przygotowanie płytek 1,536-dołkowych z olejem i koktajlami krystalizacji

  1. Dostarczyć 5 μl oleju parafinowego do każdego dołka na płytce 1 536-dołkowej za pomocą zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy z możliwością powolnego zasysania i dostarczania. Płyty olejowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Rozmrozić 384-dołkowe płytki z sekcji 2 w temperaturze 4 °C przez noc. Odwróć płytki, aby wymieszać roztwory i rozpuścić osad. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C w celu rozpuszczenia uporczywych osadów.
  3. Aby przygotować składniki sita dodatków, należy użyć końcowego 96-dołkowego bloku DW zawierającego 0,1 M HEPES pH 6,8, 30% PEG3350 do wymieszania z dostępnym na rynku sitkiem dodatków za pomocą robota do obsługi cieczy lub pipety wielokanałowej.
  4. Przygotować roztwory sitowe dodatków, dozując mieszaninę 1:1 buforowanego roztworu PEG3350 przygotowanego w kroku 3.3 i sita z dodatkiem do końcowej objętości 50 μl na odpowiedniej płytce 384-dołkowej.
  5. Użyj robota do obsługi cieczy wyposażonego w strzykawkę lub głowicę pipetora 384, aby dostarczyć 200 nl roztworu koktajlowego do każdej studzienki na 1,536-dołkowej płytce. Wybij cztery płytki 384-dołkowe w płytce 1,536-dołkowej, tak aby ćwiartki zostały wypełnione (np. A1 z płytki 384-dołkowej1 do A1 z płytki 1,536-dołkowej, A2 z 384-płytki1 do A3 z 1,536-dołkowej itp.) (Rysunek 3).
  6. Odwirować płytki w temperaturze 150 × g przez 5 minut, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.

4. Przesyłanie próbek

  1. Aby przesłać próbkę, wyślij wiadomość e-mail z informacją o rezerwacji przed upływem terminu rezerwacji na nadchodzący pokaz. Należy podać liczbę eksperymentów przesiewowych, nazwę, kierownika projektu i instytucję, a także wszelkie specjalne wymagania dotyczące obchodzenia się z próbką. Badania przesiewowe są przeprowadzane mniej więcej raz w miesiącu, co daje 12 serii rocznie.
  2. Wypełnij formularz zgłoszeniowy próbki przed wysłaniem próbki.
    1. W przypadku nowych użytkowników wybierz hasło, które będzie używane do pobierania obrazów krystalizacji w sekcji 7.
    2. W przypadku ustalonych użytkowników użyj istniejącego hasła lub zmień hasło na tym etapie.
  3. Prześlij próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że makrocząsteczka jest jednorodna i odpowiednio skoncentrowana, aby promować krystalizację. Użyj testu wstępnej krystalizacji, zwykle składającego się z siarczanu amonu lub PEG 4,000, aby zbadać odpowiednie stężenie próbki, obserwując, czy badane stężenia próbki skutkują wyraźnymi kroplami lub wytrąceniem się osadu34.
    UWAGA: Odpowiednie testy jakości, które można przeprowadzić przed przesłaniem próbki w celu sprawdzenia czystości i jednorodności, obejmują między innymi SDS-PAGE, filtrację żelową i dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). Na krystalizację może mieć wpływ obecność nawet drobnych zanieczyszczeń. Objętość próbki wynosząca 500 μl jest obecnie wymagana do ustawienia jednej płytki 1,536-dołkowej. Trwają testy mające na celu zmniejszenie wymaganej objętości próbki.
    1. Unikaj stosowania stężeń buforowych większych niż 50 mM, a także fosforanów, które mogą krystalizować w sicie.
    2. Należy unikać nadmiernej ilości środków rozpuszczających, w tym glicerolu o stężeniu większym niż 10% w/v.
  4. Zapakuj próbkę, aby bezpiecznie utrzymać odpowiednią temperaturę, używając suchego lodu, mokrego lodu lub wkładów chłodzących w szczelnie zamkniętym pojemniku.
  5. Wyślij próbkę z priorytetem w nocy od poniedziałku do środy podczas przebiegu.
  6. Wyślij e-mailem numer śledzenia po wysłaniu próbki.

5. Przykładowe ustawienie na przygotowanych płytkach 1,536-dołkowych

  1. Rozpakować próbki i natychmiast przeprowadzić inkubację w temperaturze żądanej przez użytkownika.
  2. Po rozmrożeniu odwirować próbkę o masie 10 000 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Obserwuj wzrokowo próbkę, aby zidentyfikować opady, kolor i stan próbki przed ustawieniem.
  3. Podgrzać płytkę 1,536-dołkową do temperatury 23 °C i odwirować przy 150 × g przez 5 minut. Zobrazować płytkę zawierającą tylko koktajl, wykorzystując obrazowanie w jasnym polu jako kontrolę negatywną.
    UWAGA: Wszystkie płytki są obrazowane za pomocą obrazowania w jasnym polu przed ustawieniem próbki, co umożliwia identyfikację studzienek, w których znajdują się już kryształy lub zanieczyszczenia przed dodaniem próbki jako kontrola ujemna. Ponadto umożliwia identyfikację studzienek, do których nie został dostarczony koktajl krystalizujący. Podgrzanie płyty do temperatury pokojowej eliminuje kondensację pary wodnej na powierzchni płyty, co prowadzi do uzyskania wyraźnych obrazów.
  4. Dozować 200 nl próbki do każdego dołka w płytce 1,536-dołkowej za pomocą robota do obsługi cieczy. Odwirować płytkę o masie 150 × g, a płytki inkubować w temperaturze 4 °C, 14 °C lub 23 °C.
    UWAGA: Eksperymenty z mikropartiami pod olejem można skonfigurować ręcznie, dozując białko i koktajl pod żądanym olejem. Zaleca się jednak stosowanie nie mniej niż 1 μl każdego białka i koktajlu, aby osiągnąć powtarzalne rezultaty.

6. Monitoruj płytki 1,536-dołkowe pod kątem tworzenia kryształów

  1. Po dodaniu próbki do płytek 1,536-dołkowych, obraz z obrazowaniem w jasnym polu w dniu 1 i tygodniu 1, tygodniu 2, tygodniu 3, tygodniu 4 i tygodniu 6.
  2. Wykonać obrazowanie SONICC za pomocą SHG i UV-TPEF w 4-tygodniowym punkcie czasowym dla płytek inkubowanych w temperaturze 23 °C i w 6-tygodniowym punkcie czasowym dla płytek inkubowanych w temperaturze 14 °C lub 4 °C.
    UWAGA: Czas obrazowania SONICC jest zaplanowany na 4 i 6 tygodni dla wysokoprzepustowej płytki do mikrotestów 1,536, ponieważ zazwyczaj kryształy pojawiają się w tych punktach czasowych. W przypadku modyfikacji 96-dołkowej mikropartii w eksperymentach dyfuzji oleju lub pary, zaleca się wykonanie obrazowania SONICC wcześniej w oknie czasowym.
  3. Uzyskaj dostęp do obrazów eksperymentalnych, które zostały automatycznie przesłane na konto użytkownika za pomocą wewnętrznego systemu LIMS. Powiadom użytkowników za pośrednictwem automatycznego demona poczty e-mail htslab, że nastąpiło obrazowanie.

7. Analiza obrazu

  1. Pobierz obrazy przesiewowe ze strony ftp HWI dla każdego .rar pliku.
    UWAGA: Obraz wyjściowy z ekranu 1,536 powoduje, że istnieje pewna liczba plików zawierających obrazy w jasnym polu, obrazy SHG i obrazy UV-TPEF. Każda metoda obrazowania lub punkt czasowy jest osobnym plikiem .rar. Każdy plik .rar, po rozpakowaniu, zawiera obraz z każdego dołka płytki 1536-dołkowej w określonym punkcie czasowym przy użyciu określonej metody obrazowania.
    1. Użyj klienta FileZilla lub innych opcji, aby uzyskać dostęp do danych ftp.
      UWAGA: Klient FileZilla jest zalecanym sposobem zarządzania dużym woluminem przesyłanych plików w celu zminimalizowania awarii obliczeniowych.
      1. Jeśli na komputerze użytkownika musi być zainstalowany klient FileZilla, pobierz oprogramowanie FileZilla.
      2. Jeśli klient FileZilla jest już zainstalowany lub jest w trakcie instalacji, kliknij ikonę FileZilla, aby otworzyć oprogramowanie.
      3. Zaloguj się do zdalnego serwera ftp z FileZilla, wprowadzając witrynę ftp hosta, nazwę użytkownika i hasło.
      4. Pobierz pliki .rar do żądanego katalogu.
  2. Użyj graficznego interfejsu użytkownika typu open source z obsługą sztucznej inteligencji, aby przeglądać, oceniać i analizować obrazy krystalizacji.
    UWAGA: Graficzny interfejs użytkownika może być używany w większości systemów operacyjnych Windows, Mac i Linux, a instrukcje pobierania dotyczące poszczególnych systemów operacyjnych znajdują się w witrynie GitHub. MARCO Polo to graficzny interfejs użytkownika o otwartym kodzie źródłowym, który zawiera metadane z wysokowydajnego ekranu krystalizacji 1,536 zaimplementowanego w HTX Center. Jest on dostępny do pobrania przez każdego z GitHub w celu modyfikacji w celu odzwierciedlenia specyficznych potrzeb innych grup laboratoryjnych.
    1. Otwórz plik .rar w graficznym interfejsie użytkownika po pobraniu pliku (patrz rysunek uzupełniający S1).
      1. Kliknij Importuj, wybierz Obrazy z menu rozwijanego, a następnie wybierz Z archiwum/katalogu Rar.
      2. Kliknij Przeglądaj w poszukiwaniu folderu w wyskakującym okienku, a następnie przejdź do folderu zawierającego obrazy.
      3. Wybierz żądane pliki i zaimportuj je do GUI, klikając Otwórz. Poczekaj, aż pliki pojawią się w oknie Wybrane ścieżki. Wybierz jeden lub więcej plików do pobrania do GUI i kliknij Importuj przebiegi.
    2. Wyświetl obraz dla pierwszego dołka w oknie przeglądarki pokazu slajdów w GUI, klikając symbol > po lewej stronie nazwy próbki, a następnie wybierając odpowiedni odczyt, klikając go dwukrotnie (odczyty są wymienione według daty i typu obrazu-jasne pole, UV-TPEF lub SHG).
    3. Powiększ obraz, zmieniając rozmiar całego okna. Pole Szczegóły obrazu zawiera informacje o obrazie, w tym informacje o ocenianiu (puste do momentu oceny odczytu). Pole Szczegóły koktajlu zawiera metadane dotyczące składników koktajlu.
    4. Przejdź do następnego dołka, klikając przycisk Dalej w panelu nawigacyjnym lub naciskając strzałki w prawo na klawiaturze. Przejdź do określonej studni, wprowadzając numer studni w oknie Według numeru studni.
    5. Wyświetl wszystkie odczyty (z tych zaimportowanych do GUI), zaznaczając pole Pokaż wszystkie daty.
    6. Wyświetl wszystkie widma (z tych zaimportowanych do GUI), zaznaczając pole Pokaż wszystkie widma. Kliknij przycisk Zamień widmo, aby wyświetlić każdy obraz widma z osobna.
  3. Oceń obrazy kryształów za pomocą algorytmu MARCO, najpierw podświetlając konkretny przebieg z listy po lewej stronie okna. Następnie kliknij przycisk Klasyfikuj wybrane uruchomienie. Wyświetl informacje o punktacji MARCO w oknie Szczegóły obrazu po ocenie odczytu obrazowania dla wszystkich 1 536 dołków.
    UWAGA: Klasyfikacja trwa zwykle od 2 do 5 minut, w zależności od szybkości komputera i dostępnej pamięci. Algorytm generuje wyniki, które klasyfikują zawartość do klas "kryształ", "przezroczysty", "wytrącić" lub "inne". Wartości liczbowe skojarzone z klasyfikacją każdego odwiertu odzwierciedlają prawdopodobieństwo, że odwiert zawiera obiekty tej klasy.
    1. Wyświetl podzbiór ocenianych obrazów, zaznaczając odpowiednie pola w panelu Filtrowanie obrazów i klikając przycisk Prześlij filtry. Na przykład wyświetl tylko obrazy sklasyfikowane przez MARCO jako kryształy, zaznaczając pola Kryształy i MARCO i klikając Prześlij filtry.
  4. Ręcznie nacinaj obrazy kryształów, aby wygenerować zestaw "oceniony przez człowieka". Przypisz punktację do studni, klikając odpowiedni przycisk ("kryształ", "wyczyść", "wytrącić" lub "inne" znajdują się w panelu Klasyfikacja na dole okna). Alternatywnie, użyj klawiatury numerycznej, aby przypisać wynik (1 = "kryształ", 2 = "czysty", 3 = "wytrącić", 4 = "inny"). Oznaczyć obraz zdobyty przez człowieka jako "ulubiony", zaznaczając opcję Ulubiony? pudełko.
    UWAGA: Wyświetlaj tylko obrazy sklasyfikowane przez człowieka jako kryształy, zaznaczając pola Kryształy i Człowiek i klikając Prześlij filtry. Kliknięcie pola Ulubione w panelu Filtrowanie jeszcze bardziej zawęża zwracane obrazy, zwracając tylko te obrazy kryształów zdobyte przez człowieka, które również są ulubionymi.
  5. Zakładka Podgląd blach służy do przeglądania wielu dołków jednocześnie. Na drugiej karcie Przeglądarka blach w panelu Sterowanie wybierz 16, 64 lub 96 obrazów z menu rozwijanego w sekcji Obrazy na płytę. Użyj karty Filtrowanie obrazów, aby wyszarzyć obrazy, które nie są interesujące. Zaznacz pole Zastosuj filtr, aby filtrować images.
    UWAGA: Na przykład, wybierz pola "człowiek" i "kryształ", a tylko te studnie, które zostały zdobyte jako kryształ przez człowieka, będą dobrze widoczne.
    1. Przejdź do zakładki Przeglądarka płyt, klikając przycisk Dalej, aby wyświetlić następny zestaw obrazów 16/64/96. Domyślnie obrazy oznaczone jako kryształy są czerwone, te oznaczone jako czyste są niebieskie, te oznaczone jako osad są zielone, a te oznaczone jako inne są pomarańczowe. Zmień kolory za pomocą menu rozwijanych.
    2. Wybierz informacje, które mają być wyświetlane na studzienkach, zaznaczając różne pola na karcie Etykiety.
    3. Kliknij Zapisz widok, aby zapisać plik obrazu bieżącego widoku.
    4. Kliknij Zamień widmo, aby przełączać się między obrazami jasnego pola, SHG i UV-TPEF dla obrazu wielodołkowego.
  6. Kliknij Eksportuj i wybierz odpowiedni typ pliku z menu rozwijanego, aby wyeksportować ocenione pliki do wykorzystania w innych programach.
    UWAGA: Pliki CSV (wartości rozdzielane przecinkami) są kompatybilne z programami do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, takimi jak Microsoft Excel czy Arkusze Google. Pliki JSON (JavaScript Object Notation) można otwierać za pomocą większości edytorów tekstu. PPTX (PowerPoint Presentation) może być używany do wyświetlania obrazów z Polo, w tym do porównania obrazów jasnego pola, UV-TPEF i SHG. Pliki są zapisywane w formacie .xtal w celu ponownego otwarcia w graficznym interfejsie użytkownika MARCO Polo.
    1. Zapisz plik w formacie .xtal, klikając pozycję Plik u góry strony, a następnie wybierając opcję Zapisz przebieg lub Zapisz uruchom jako. Podaj nazwę pliku i lokalizację katalogu.
    2. Otwórz pliki w formacie .xtal, klikając Importuj i wybierając Obrazy, a następnie Z zapisanego biegu. Wyszukaj odpowiednią lokalizację pliku, kliknij nazwę pliku, a następnie kliknij Otwórz.

Wyniki

Wyniki eksperymentu przesiewowego krystalizacji w płytkach 1536-dołkowych obejmują siedem kompletnych zestawów obrazów w polu jasnym, zebranych w dniu 0 (kontrola negatywna), dniu 1, tygodniu 1, tygodniu 2, tygodniu 3, tygodniu 4 oraz tygodniu 6 (Rysunek 4). Obrazy SONICC są gromadzone w punkcie czasowym 4 tygodni dla płytek inkubowanych w 23 °C oraz w punkcie czasowym 6 tygodni dla płytek inkubowanych w 4 °C lub 14 °C. Łącznie, po wysłaniu próbki, użytkownicy mogą spodziewać się przygotowania swoich płytek w ciągu 1 dnia od momentu dostarczenia. Obrazy będą przesyłane na bieżąco w miarę ich gromadzenia. Eksperyment przesiewowy krystalizacji kończy się po 6 tygodniach.

Zastosowanie płytki 1536-dołkowej pozwala na przeprowadzenie wszystkich eksperymentów przesiewowych w obrębie jednej płytki, co ogranicza zużycie próbek oraz ułatwia obrazowanie i bezpośrednie porównanie różnych modalności obrazowania. Reprezentatywne wyniki przebiegu czasowego wzrostu kryształów dla pojedynczego warunku koktajlu przedstawiono na Rysunku 4. Zautomatyzowane obrazowanie płytki w trakcie trwania eksperymentu umożliwia identyfikację kryształów rosnących zarówno szybko, jak i powoli za pomocą obrazowania w polu jasnym. Obrazowanie UV-TPEF oraz SHG pozwala na wzajemną walidację wyników zaobserwowanych w polu jasnym i wskazuje, że obserwowane kryształy są odpowiednio białkowe i krystaliczne (Rysunek 5A,B). Ponadto obrazowanie SONICC umożliwia identyfikację kryształów, które są wizualnie przesłonięte przez osady lub filmy (Rysunek 5C) lub mikrokryształów, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pomylone z osadem (Rysunek 5D). W przypadku niektórych kryształów brak sygnału SHG nie jest dyskwalifikujący, ponieważ niektóre grupy punktowe nie generują sygnału SHG35,36, co obrazuje tetragonalny kryształ taumatyny na Rysunku 5C. I odwrotnie, należy spodziewać się braku sygnału UV-TPEF w przypadku białek pozbawionych reszt tryptofanu. Obserwacja sygnałów UV-TPEF i SHG ułatwia również identyfikację niebiałkowych kryształów soli, które są widoczne w polu jasnym i wykazują silny dodatni sygnał SHG, ale nie posiadają sygnału UV-TPEF (Rysunek 5E).

Analiza obrazów dla układu płytek jest usprawniona dzięki interfejsowi graficznemu MARCO Polo GUI, który integruje również transfer danych ftp z serwerów HWI (jako alternatywa dla przesyłania plików za pomocą FileZilla). MARCO Polo GUI umożliwia łatwą nawigację w celu przeglądania płytek i obrazów oraz przeprowadza komputerową ocenę obrazów przy użyciu algorytmu MARCO, dzięki czemu wyniki obrazowania mogą być szybko pobierane, przeglądane i analizowane w HTX Center. Algorytm oceny MARCO, zaimplementowany w MARCO Polo GUI, jest w stanie ocenić obrazy z całej płytki 1,536-dołkowej w czasie krótszym niż 5 min. Obrazy oznaczone przez algorytm MARCO jako krystaliczne mogą być następnie sortowane i wyświetlane przez Polo GUI. Ponieważ algorytm MARCO został zoptymalizowany pod kątem identyfikacji kryształów i minimalizacji wyników fałszywie ujemnych, aby nie pominąć żadnych pozytywnych trafień, ocena może prowadzić do wystąpienia wyników fałszywie dodatnich. Niemniej jednak, zdolność MARCO do ograniczenia zestawu obrazów wymagających zbadania poprzez skupienie uwagi na dołkach z wysokim prawdopodobieństwem zawierania kryształów, skutkuje znacznym zmniejszeniem obciążenia użytkowników przetwarzaniem danych. Wygodna implementacja algorytmu w przyjaznej dla użytkownika platformie przeglądania MARCO Polo, wraz z możliwością sortowania obrazów na podstawie wyników MARCO, znacznie usprawnia zdolność użytkownika do szybkiej analizy zestawu danych i dokładnego określenia trafień krystalicznych.

Schemat procesu krystalizacji białek; układ 1536-dołkowy z obrazowaniem, obsługą robotyczną i wzrostem kryształów.
Rycina 1: Schemat wysokoprzepustowego eksperymentu przesiewowego krystalizacji w układzie 1536-dołkowym, przeprowadzonego w Centrum HTX. (1) Na tym etapie do każdego dołka dodaje się 5 µL oleju parafinowego i 200 nL koktajlu (krok protokołu 3.1 oraz krok 3.5). Po prawej stronie przedstawiono ilustrację jednego dołka zawierającego tylko olej i koktajl oraz reprezentatywny obraz. (2) Próbki trafiają do Centrum HTX (krok protokołu 5.1). 3) Na tym etapie do każdego dołka dodaje się 200 nL próbki (krok protokołu 5.4). (4) Wszystkie 1536 dołków jest monitorowanych w czasie przy użyciu obrazowania w polu jasnym, 5) a także metod UV-TPEF i SHG (krok protokołu 6). 6) Interfejs GUI open-source oparty na AI jest wykorzystywany do przeglądania, oceny i analizy obrazów krystalizacji (krok protokołu 7). Skróty: HTX = wysokoprzepustowa krystalizacja; UV-TPEF = fluorescencja wzbudzana dwufotonowo w UV; SHG = generowanie drugiej harmonicznej; AI = sztuczna inteligencja; GUI = graficzny interfejs użytkownika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikropłytka z obrazami mikroskopowymi: widzialne, UV-TPEF, SHG dla analizy eksperymentów fotonicznych.
Rycina 2: Pojedyncze płytki 1536-dołkowe zawierające eksperymenty przesiewowe, obrazowane za pomocą mikroskopii w polu jasnym, UV-TPEF oraz SHG. Płytki 1536-dołkowe przedstawiono wraz z amerykańską monetą jedna centowa w celu zachowania skali (góra). Każdy eksperyment przesiewowy jest obrazowany raz przed przygotowaniem i sześć razy po dodaniu próbki za pomocą obrazowania w polu jasnym (łącznie siedem zestawów obrazów w polu jasnym, lewo). Płytki poddawane są obrazowaniu UV-TPEF (środek) i SHG (prawo) w 4. lub 6. tygodniu. Skróty: UV-TPEF = fluorescencja wzbudzana dwufotonowo w UV; SHG = generowanie drugiej harmonicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przepływu pracy w analizie wysokoprzepustowej; diagram przejścia z bloku 96-dołkowego na płytkę 384-dołkową, a następnie 1536-dołkową.
Rycina 3: Schemat przedstawiający sposób przygotowania płytek 1536-dołkowych. Szesnaście 96-dołkowych bloków DW służy do przygotowania czterech płytek 384-dołkowych, przy czym każdy kwadrant każdej płytki 384-dołkowej jest wypełniany poprzez dozowanie koktajli krystalizacyjnych. Cztery 96-dołkowe bloki DW wypełniają jedną płytkę 384-dołkową (środek). Cztery płytki 384-dołkowe służą do przygotowania pojedynczej płytki 1536-dołkowej (prawo). Skrót: DW = deep well. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4Mikroskopia w polu jasnym i SHG; proces krystalizacji w ciągu sześciu tygodni; analiza UV-TPEF w 4. tygodniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4">
Rycina 4: Reprezentatywny przebieg czasowy pojedynczej studzienki w eksperymencie przesiewowym w płytce 1536-dołkowej. Obrazy płytek wykonano przed przygotowaniem próbek (dzień 0), a następnie w polu jasnym w 1. dniu, 1. tygodniu, 2. tygodniu, 3. tygodniu, 4. tygodniu i 6. tygodniu. Płytki inkubowane w 23 °C obrazowano za pomocą SONICC w 4. tygodniu. Paski skali = 80 µm (pole jasne), 200 µm (SHG, UV-TPEF). Skróty: SONICC = obrazowanie nieliniowe drugiego rzędu kryształów chiralnych; UV-TPEF = fluorescencja wzbudzana dwufotonowo w UV; SHG = generowanie drugiej harmonicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia w polu jasnym, UV-TPEF i SHG próbek kryształów; charakterystyka optyczna i analiza spektralna.
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki obrazowania dla eksperymentów wysokoprzepustowego (HT) przesiewania 1536 kryształów. Przedstawiono wyniki obrazowania w polu jasnym, UV-TPEF i SHG dla pięciu przykładowych studzienek. (A,B) Kryształy białek obserwowane w polu jasnym, UV-TPEF i SHG są wyraźnie widoczne we wszystkich trzech trybach obrazowania. (C) Kryształ białka przesłonięty przez folię w obrazowaniu w polu jasnym jest widoczny w obrazowaniu UV-TPEF; kryształ nie jest obserwowany w obrazowaniu SHG ze względu na niezgodność grupy punktowej. (D) Przykład mikrokryształów zweryfikowanych za pomocą obrazowania UV-TPEF i SHG, które w innym przypadku mogłyby zostać uznane za osad. (E) Przykład kryształów soli, które wydają się krystaliczne w obrazowaniu w polu jasnym i SHG, ale nie wykazują sygnału UV-TPEF. Paski skali = 200 µm. Średnica studzienki = 0,9 mm. Skróty: UV-TPEF = fluorescencja wzbudzana dwufotonowo w UV; SHG = generowanie drugiej harmonicznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca S1: Otwieranie plików obrazów w programie MARCO Polo. Pliki obrazów można otwierać w interfejsie graficznym MARCO Polo, przechodząc do karty Import | Images na górnym pasku (a). Należy pamiętać, że pliki można również przesyłać za pomocą narzędzia From FTP bezpośrednio w MARCO Polo (a) lub za pomocą programu FileZilla, zgodnie z opisem w kroku 7.2 protokołu. Aby zaimportować pliki, które zostały już pobrane, należy wybrać Images | From Rar Archive/Directory. W wyświetlonym oknie wyskakującym należy wybrać Browse for Folder (b) i przejść do katalogu plików, w którym zapisane są obrazy płytek. Gdy pliki znajdą się w oknie Selected Paths (c), należy zaznaczyć plik i kliknąć Import Runs (d). Interfejs graficzny MARCO Polo zidentyfikuje odpowiednie metadane Cocktail File do zaimportowania wraz z obrazami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Metoda opisuje wysokowydajny proces przesiewowy krystalizacji białek, który wymaga zaledwie 500 μl próbki do 1 536 indywidualnych eksperymentów krystalizacji w formacie mikropartii pod olejem. Rurociąg opiera się na robotyce zajmującej się obsługą cieczy, która szybko i powtarzalnie wspomaga konfigurację eksperymentalną, a także na zasobach obliczeniowej analizy obrazu MARCO Polo, które są dostosowane do analizy obrazów płytek 1536-dołkowych przy użyciu algorytmu MARCO do identyfikacji i izolowania uderzeń kryształów.

Mała objętość poszczególnych kropli przesiewowych (łącznie 400 nl przy stosunku 1:1 próbki do koktajlu) oznacza, że do zidentyfikowania pozytywnych warunków krystalizacji wymagane są bardzo małe objętości próbki. Te małe rozmiary kropli z konieczności wytwarzają małe kryształy, których nie można złowić za pomocą tradycyjnej pętli. Opracowano metody zbioru z 1 536 talerzy37; Dodatkowo, płytki z kryształami zostały wykorzystane bezpośrednio w źródłach synchrotronowych do zbierania danych in situ 38. Gdyby opracowano solidną metodę zbierania tych kryształów, postępy w technologii synchrotronowej i mikroogniskowane wiązki umożliwiłyby dalsze uzyskanie użytecznych zestawów danych. Dodatkowo, uzyskane kryształy mogą potencjalnie zostać wykorzystane jako zalążki do działań optymalizacyjnych.

Obrazowanie SONICC jest wyraźnie korzystne w identyfikacji zarówno małych kryształów białek, jak i kryształów białek ukrytych pod osadem. Pomimo tych zalet nie wszystkie typy próbek nadają się do obrazowania SHG i UV-TPEF. Na przykład białka z niewielką ilością aromatycznych reszt tryptofanu lub bez nich będą wykazywać niejednoznaczny sygnał UV-TPEF. Co więcej, kryształy w określonych grupach przestrzennych, w tym grupach centrosymetrycznych lub grupie punktowej 432, nie zostaną wykryte przez obrazowanie SHG. Próbki z fluoroforami czasami zakłócają sygnał SHG, powodując anulowanie sygnału lub zwiększenie intensywności, co oznacza, że wymagana jest dokładna interpretacja sygnałów SHG w przypadku białek zawierających metale i białek zawierających ugrupowania fluorescencyjne. Jednak w wielu przypadkach możliwe jest zracjonalizowanie braku sygnału SHG lub UV-TPEF, a brak tych sygnałów niekoniecznie powinien wykluczać obecność kryształu białka.

Format mikroporcji pod olejem stanowi alternatywę dla bardziej powszechnej metody dyfuzji parowej stosowanej w krystalografii o wysokiej przepustowości. Co ważne, format krystalizacji wpływa na identyfikację trafień39, co stanowi uzasadnienie dla stosowania różnych formatów krystalizacji w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych. Zautomatyzowane obrazowanie i metody wykorzystujące technologię SONICC pomagają w szybkiej identyfikacji kryształów białkowych przez cały 6-tygodniowy okres eksperymentu. Wreszcie, graficzny interfejs użytkownika MARCO Polo umożliwia użytkownikom szybką analizę obrazów z 1 536 warunków w celu zidentyfikowania obiecujących studni trafień do optymalizacji. Możliwości Centrum HTX, w tym wysokoprzepustowa konfiguracja eksperymentalna z wykorzystaniem robotyki, w połączeniu z najnowocześniejszymi narzędziami do obrazowania i obliczeń do analiz, stanowią duży wkład w społeczność biologii strukturalnej, umożliwiając naukowcom skuteczne zajęcie się głównym wąskim gardłem w pracach strukturalnych opartych na kryształach: znalezieniem warunków krystalizacji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność naszym użytkownikom za powierzenie nam swoich cennych próbek do badań kryształów, a także za dostarczenie krytycznych opinii i próśb, które pomogły nam udoskonalić i rozwinąć nasze zasoby, aby lepiej służyć społeczności biologii strukturalnej. Chcielibyśmy również podziękować Ethanowi Hollemanowi, dr Lisie J. Keefe i dr Erice Duguid, którzy kierowali rozwojem graficznego interfejsu użytkownika MARCO Polo. Chcielibyśmy podziękować kolegom z HWI za ich wsparcie i sugestie, a w szczególności dr Dianie CF Monteiro. Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony National Institutes of Health, R24GM141256.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1536 Well Imp@ct LBR LoBaseGreiner Bio-One790 801
Kwas octowyHampton ResearchHR2-853
Folia uszczelniająca AlumaSeal IIHampton ResearchHR8-069
Bromek amonuWymiary molekularneMD2-100-247
Chlorek amonuHampton ResearchHR2-691
Wodorotlenek amonuHampton ResearchHR2-855
Azotan amonuHampton ResearchHR2-665
Fosforan amonu dwuzasadowyHampton ResearchHR2-629
Fosforan amonu jednozasadowyHampton ResearchHR2-555
Siarczan amonuHampton ResearchHR2-541
Amon tiocyjanianWymiary molekularneMD2-100-301
Bicine pH 9,0Hampton ResearchHR2-723
Bis-tris propan pH 7,0Hampton ResearchHR2-993-08
Octan wapniaHampton ResearchHR2-567
Chlorek wapnia dwuwodnyHampton ResearchHR2-557
KAPSUŁKI pH 10,0Odczynniki Rigakunie podano
Folia ClearSealHampton ResearchHR4-521
Siarczan kobaltu siedmiowodnyWymiary molekularneMD2-100-42
Ekran kryształowy Ekran HTHampton ResearchHR2-130
Formulator Formulatrix
GlicerolHampton ResearchHR2-623
Robot do obsługi cieczy GryphonArt Robbins Instruments
HEPES pH 7.0Hampton ResearchHR2-902-03
HEPES pH 7.5Hampton ResearchHR2-902-08
HWI HTX Center próbka formularza zgłoszeniowegohttps://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/    
Kwas solnyHampton ResearchHR2-581
Indeks HT ekranHampton ResearchHR2-134
Ekran cieczy jonowejHampton ResearchHR2-214
Bromek lituWymiary molekularneMD2-100-312
Chlorek lituHampton ResearchHR2-631
Siarczan litu monohydratHampton ResearchHR2-545
Tetrahydrat octanu magnezuHampton ResearchHR2-561
Sześciowodny chlorek magnezuHampton ResearchHR2-559
Sześciowodny azotan magnezuHampton ResearchHR2-657
Siarczan magnezu siedmiowodnyHampton ResearchHR2-821
Tetrahydrat chlorku manganuMillipore Sigma63535-50G
Jednowodny siarczan manganuWymiary molekularneMD2-100-310
MARCO Polo GUI pobieraniehttps://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/
Robot do obsługi cieczy Matrix Platemate 2 x 3Thermo Scientific
MES pH 6.0Hampton ResearchHR2-943-09
Robot do obsługi cieczy na komarySPTLabtech
Olej parafinowy / biały olej mineralny Saybolt Lepkość 340-365 przy 100 & stopni; F Sigma AldrichPX0045-3
PEG 1000Hampton ResearchHR2-523
PEG 2000Hampton ResearchHR2-592
PEG 20000Hampton ResearchHR2-609
PEG 3350Hampton ResearchHR2-527
PEG 400Hampton ResearchHR2-603
PEG 4000Hampton ResearchHR2-529
PEG 6000Hampton ResearchHR2-533
PEG 8000Hampton ResearchHR2-535
PEG/Ion HTscreen Hampton ResearchHR2-139
PEGRx HTHampton ResearchHR2-086
Rezerwacjehtslab@hwi.buffalo.edu
Octan potasuHampton ResearchHR2-671
Bromek potasuHampton ResearchHR2-779
Węglan potasuWymiary molekularneMD2-100-311
Chlorek potasuHampton ResearchHR2-649
Azotan potasuHampton ResearchHR2-663
Fosforan potasu dwuzasadowyHampton ResearchHR2-635
Fosforan potasu jednozasadowyHampton ResearchHR2-553
Fosforan potasu trójzasadowyWymiary molekularneMD2-100-309
Tiocyjanian potasuHampton ResearchHR2-695
Rock Imager 1000 z SONICCFormulatrix
Rock Imager 54Formulatrix
Chlorek rubiduMillipore SigmaR2252-10G
Ekran SaltRx HTHampton ResearchHR2-136
Ekran Silver BulletsHampton ResearchHR2-096
Ekran pH SliceHampton ResearchHR2-070
Octan sodu pH 5,0Hampton ResearchHR2-933-15
Bromek soduHampton ResearchHR2-699
Chlorek soduHampton ResearchHR2-637
Cytrynian sodu pH 4,2Hampton ResearchHR2-935-01
Cytrynian sodu pH 5,6Hampton ResearchHR2-735
Wodorotlenek soduHampton ResearchHR2-583
Sód dwuwodny molibdenianWymiary molekularneMD2-100-207
Azotan soduHampton ResearchHR2-661
Fosforan sodu jednozasadowyHampton ResearchHR2-551
Tiosiarczan sodu pentahydratWymiary molekularneMD-100-307
StockOptions Ekran polimerowyHampton ResearchHR2-227
Tacsimate pH 7Hampton ResearchHR2-755
TAPS pH 9,0bioWORLD40121071
Tris pH 8Hampton ResearchHR2-900-11
Tris pH 8,5Hampton ResearchHR2-725
ViaFLO 384Integra
ViaFLO 384 384 głowica pipetara kanałowa (0,5-12,5 i mikro; L)głowica pipetowa Integra
ViaFLO 384 (300µ L)Integra
Dwuwodny octanHampton ResearchHR2-563
płyt 96-kanałowa

Bibliografia

  1. PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
  2. Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030(2020).
  3. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  4. Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
  5. Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
  6. George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
  7. Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
  8. Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
  9. Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
  10. Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95(2020).
  11. Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
  12. Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024(2020).
  13. Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
  14. Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
  15. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
  16. McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
  17. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  18. Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091(2007).
  19. Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  20. Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
  21. Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
  22. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
  23. Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
  24. Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
  25. Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
  26. Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
  27. Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451(2019).
  28. Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
  29. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
  30. Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
  31. Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
  32. Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883(2018).
  33. Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
  34. Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
  35. Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
  36. Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
  37. Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
  38. Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
  39. Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalografia rentgenowskap ytki do krystalizacjizautomatyzowane obrazowanierobot do obs ugi cieczybiologia strukturalnapunktacja oparta na sztucznej inteligencjimetoda mikrobatch pod warstw oleju
Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.