Artykuł metodologiczny

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65213

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Streszczenie

Przechwytywanie konformacji chromosomów (3C) to potężne narzędzie, które stworzyło rodzinę podobnych technik (np. Hi-C, 4C i 5C, określanych tutaj jako techniki 3C), które dostarczają szczegółowych informacji o trójwymiarowej organizacji chromatyny. Techniki 3C zostały wykorzystane w szerokim zakresie badań, od monitorowania zmian w organizacji chromatyny w komórkach nowotworowych po identyfikację kontaktów wzmacniających z promotorami genów. Podczas gdy wiele badań wykorzystujących te techniki zadaje duże pytania dotyczące całego genomu ze skomplikowanymi typami próbek (tj. analiza pojedynczych komórek), często zapomina się, że techniki 3C są oparte na podstawowych metodach biologii molekularnej, które mają zastosowanie w szerokim zakresie badań. Odpowiadając na ściśle skoncentrowane pytania dotyczące organizacji chromatyny, ta najnowocześniejsza technika może być wykorzystana do zwiększenia doświadczenia w laboratoriach badawczych i dydaktycznych na studiach licencjackich. W niniejszym artykule przedstawiono protokół 3C oraz przedstawiono adaptacje i punkty nacisku do wdrożenia głównie w instytucjach licencjackich w badaniach licencjackich i doświadczeniach dydaktycznych.

Wprowadzenie

Genom organizmu zawiera nie tylko wszystkie geny niezbędne do funkcjonowania, ale także wszystkie instrukcje, jak i kiedy ich używać. To sprawia, że regulacja dostępu do genomu jest jedną z najważniejszych funkcji komórki. Istnieje wiele mechanizmów kontrolujących funkcję genów; jednak na poziomie podstawowym regulacja genów sprowadza się do zdolności regulatorowych czynników transkrypcyjnych (trans-czynników) do wiązania się z ich specyficznymi sekwencjami DNA (sekwencje cis-regulatorowe). Nie jest to wrodzona zdolność; Zamiast tego jest regulowany przez organizację/strukturę genomu w jądrze, która kontroluje dostępność/ekspozycję sekwencji regulatorowych CIS na czynniki trans1,2,3. Jeśli trans-faktory nie mogą znaleźć swoich sekwencji cis-regulatorowych, to trans-faktory nie mogą wykonywać swoich zadań regulacyjnych. To sprawiło, że zrozumienie, w jaki sposób genomy są zorganizowane w jądrze, stało się ważnym źródłem badań.

Powszechnie przyjmuje się, że podczas interfazy, eukariotyczne chromosomy w jądrze zajmują swoją własną domenę zakotwiczoną w blaszce jądrowej i macierzy jądrowej (Rysunek 1), co sprawia, że chromosom bardziej przypomina kawałek pizzy, a nie makaron na talerzu spaghetti. Chromosomy są częściowo skondensowane przez interakcje białko-DNA (chromatyna), które skręcają i zapętlają części chromosomu. Dzięki mikroskopii elektronowej, trójwymiarowej hybrydyzacji in situ fluorescencji DNA (FISH) i technikom znakowania DNA (tj. fluorescencyjnej i sztucznej metylacji DNA) stwierdzono, że nieaktywne domeny chromatyny są ciasno upakowane wzdłuż obwodu jądra komórkowego4,5,6, podczas gdy fragmenty aktywnej, mniej skondensowanej chromatyny znajdują się we wnętrzu jądra7, 8,9,10. Eksperymenty te zapewniają szerokokątny obraz dynamiki chromosomów, ale niewiele robią, aby uchwycić zmiany zachodzące lokalnie wokół promotorów genów obserwowanych w badaniach DNase11,12 i nucleosome13,14,15 badań.

Kluczem do odblokowania dynamiki chromatyny o wyższej rozdzielczości było opracowanie techniki mapowania chromosomów 3D, 3C. Sama technika 3C składa się z czterech głównych etapów: sieciowania chromatyny, trawienia chromatyny przez enzymy restrykcyjne, ligacji chromatyny i oczyszczania DNA (Rysunek 2). Nowe sztuczne fragmenty DNA wygenerowane w tym procesie mogą być następnie scharakteryzowane, aby ujawnić ścisły fizyczny związek między liniowo odległymi fragmentami DNA16. Technika 3C stała się podstawą do stworzenia wielu technik spin-off, które wykorzystują początkowe etapy 3C do zadawania szerszych pytań dotyczących całego genomu (np. Hi-C, 4C, ChIP-C). Ta rodzina technik 3C pozwoliła ustalić, że chromosomy są zorganizowane w wiele odrębnych jednostek zwanych domenami powiązanymi topologicznie (TAD). TAD są kodowane w genomie i są definiowane przez pętle chromatyny otoczone niezapętlonymi granicami16,17,18,19. Granice TAD są utrzymywane przez dwa ewolucyjnie konserwatywne i wszechobecne czynniki, w tym czynnik wiążący CCCT (CTCF) i spójność, które zapobiegają interakcji pętli w obrębie oddzielnych TAD16,20. Pętle są zapośredniczone przez interakcję trans-czynników z ich sekwencjami regulatorowymi, a także CTCF i kohesion21.

Chociaż wiele badań wykorzystujących technologie 3C zadaje szerokie pytania dotyczące całego genomu i stosuje skomplikowane techniki pobierania próbek, formułowanie techniki 3C opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej. To sprawia, że 3C jest intrygujące do wdrożenia zarówno w laboratoriach badawczych na studiach licencjackich, jak i dydaktycznych. Technika 3C może być stosowana w przypadku mniejszych, skoncentrowanych pytań i jest z natury elastyczna w skalowaniu w górę lub w dół (pojedyncze geny22, chromosomes16, i/lub genomes18) w zależności od ostrości i kierunku zadawanych pytań. Technika ta została również zastosowana w szerokiej gamie systemów modelowych7,16,19,23 i udowodniono, że jej zastosowanie jest wszechstronne. To sprawia, że 3C jest doskonałą techniką dla studentów studiów licencjackich, ponieważ studenci mogą zdobyć doświadczenie w typowych technikach biologii molekularnej, jednocześnie zdobywając cenne doświadczenie w odpowiadaniu na skierowane pytania.

Prezentowany tutaj jest dostosowany protokół do przygotowania biblioteki 3C na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów24,25,26,27. Protokół ten został zoptymalizowany dla około 1 × 107 komórek, chociaż wygenerował biblioteki 3C z zaledwie 1 × 105 komórek. Protokół ten okazał się wszechstronny i został wykorzystany do generowania bibliotek 3C z zarodków danio pręgowanego, linii komórkowych danio pręgowanego i młodych dorosłych (YA) Caenorhabditis elegans (glisty). Protokół powinien być również odpowiedni dla linii komórkowych ssaków oraz, po dalszym dostosowaniu, drożdży.

Celem tych adaptacji jest uczynienie 3C bardziej dostępnym dla studentów. Dołożono wszelkich starań, aby stosować techniki podobne do tych, które można osiągnąć w laboratorium dydaktycznym na studiach licencjackich. Technika 3C zapewnia studentom wiele możliwości uczenia się, aby nauczyć się podstawowych technik biologii molekularnej, które przyniosą korzyści ich rozwojowi na ławce, w klasie i w ich staraniach po ukończeniu studiów.

Protokół

1. Projektowanie starterów

UWAGA: Narzędzia do projektowania starterów 3C są dostępne online28. Alternatywnie, studenci mogą zaprojektować własne startery (patrz poniżej).

  1. Identyfikacja lokalizacji starterów
    1. Otwórz UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), wybierz badany organizm i wyszukaj region genomu, który ma zostać poddany analizie metodą 3C.
    2. W następnym oknie aktywuj ścieżkę enzymów w zakładce Mapping and Sequencing poniżej przeglądarki, klikając Restr Enzymes.
    3. Wprowadź enzymy restrykcyjne, które mają zostać użyte, i ustaw tryb wyświetlania (display mode) na pack. Kliknij Submit.
    4. W sekcji Variation and Repeats upewnij się, że opcja RepeatMasker jest ustawiona na dense.
    5. Wykorzystując miejsca restrykcyjne jako punkty odniesienia, zidentyfikuj interesujące miejsca, które nie znajdują się w zamaskowanych regionach powtórzeń (czarne paski). Zaznacz 300 par zasad (bp) flankujących sekwencję zarówno powyżej (upstream), jak i poniżej (downstream) miejsca restrykcyjnego, klikając w pozycję (najwyższa ścieżka) i przeciągając do pożądanej długości (~600 bp).
    6. Puść przycisk myszy; pojawi się okno pop-up. Zanotuj lokalizację genomiczną, kliknij Zoom in i poczekaj, aż przeglądarka dostosuje widok do zaznaczenia.
    7. Najedź kursorem na zakładkę View na górnej wstążce przeglądarki i z menu rozwijanego wybierz DNA.
    8. Pozostaw opcję domyślną, zwróć uwagę na oznaczenie sekwencji zamaskowanych (istnieje opcja zamiany ich na N's). Kliknij get DNA.
    9. Zaznaczona sekwencja zostanie wyświetlona w oknie. Skopiuj i wklej tę sekwencję do programu Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
    10. Korzystając z domyślnych ustawień Primer3, wygeneruj startery, klikając Pick primers.
    11. W wynikach zwróć uwagę na położenie enzymu restrykcyjnego i wybierz startery, które tworzą produkt PCR o długości 200-500 bp z miejscem restrykcyjnym znajdującym się w środku.
    12. Postępując zgodnie z tymi krokami, zaprojektuj startery testowe w odległości 1 kilobazy (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb i 20 kb od interesującego miejsca (miejsc).
    13. Aby zaprojektować startery do kontroli wejściowej (input control), powtórz te kroki dla miejsca oddalonego o 1-2 kb od miejsca zainteresowania, które nie posiada miejsca restrykcyjnego, co oznacza, że nigdy nie jest przecinane.
  2. Funkcjonalna walidacja starterów
    1. Aby zwalidować funkcjonalność starterów, przygotuj reakcje PCR, stosując miareczkowane stężenia starterów i oczyszczone DNA genomiczne. Metodami ilościowymi lub półilościowymi określ, czy startery tworzą oczekiwany produkt.
    2. Zaprojektuj ponownie startery, które nie przeszły walidacji.

2. Dzień 1

UWAGA: Protokół można przerwać (zamrażając próbki w temperaturze −20 °C) po sieciowaniu chromatyny oraz po zebraniu jąder komórkowych. Kroki te zajmują średnio 5-6 h w przypadku studentów studiów licencjackich.

  1. Izolacja jąder komórkowych z młodych dorosłych (YA) C. elegans (adaptacja z Han et al.29)
    1. Sieciowanie chromatyny
      1. Zebrać 5 000 nicieni YA w 30 mL medium M9 do probówki stożkowej o pojemności 50 mL i wirować przy 400 × g przez 2 min w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Przemyć osad z nicieni jeszcze 3x medium M9 w celu usunięcia bakterii.
      3. Usunąć nadsącz, zawiesić osad z nicieni w 47,3 mL medium M9 zawierającego 2,7 mL 37% formaldehydu (stężenie końcowe 2%) i inkubować z mieszaniem (na kołysarce lub rotorze nutacyjnym) przez 30 min w RT.
        UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się ostrożnie; pracę należy prowadzić pod dygestorium, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE – fartuch laboratoryjny, odpowiednie rękawiczki i ochronę oczu). Formaldehyd jest substancją drażniącą, która wpływa na oczy, nos, gardło i płuca.
      4. Wirować nicienie przy 400 × g przez 2 min w RT.
      5. Usunąć nadsącz i zawiesić osad z nicieni w 50 mL 1 M glicyny. Wirować nicienie przy 400 × g przez 2 min w RT.
    2. Izolacja jąder
      1. Zawiesić osad z nicieni w 6 mL schłodzonego buforu NP (50 mM HEPES o pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidyny, 0,25 mM sperminy, 1x kompletny inhibitor proteaz).
      2. Przenieść zawiesinę z nicieni do homogenizatora Dounce z luźnym dopasowaniem (7 mL) na lód. Homogenizować próbkę 15x i pozostawić na lodzie przez 5 min.
      3. Przenieść zawiesinę z nicieni do homogenizatora Dounce z ciasnym dopasowaniem (7 mL) na lód. Homogenizować próbkę 20x i pozostawić na lodzie przez 5 min.
      4. Przenieść zawiesinę z nicieni do czystej probówki stożkowej o pojemności 15 mL i dodać bufor NP do uzyskania całkowitej objętości 10 mL (około 4 mL).
      5. Mieszać zawiesinę z nicieni w vortexie na wysokich obrotach przez 30 s. Inkubować próbkę na lodzie przez 5 min.
      6. Powtórzyć poprzedni krok.
      7. Wirować zawiesinę z nicieni przy 100 × g przez 5 min w 4 °C.
      8. Przenieść nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
      9. Sprawdzić próbkę pod kątem obecności resztek nicieni. Obejrzeć 10 µL próbki pod mikroskopem świetlnym. Jeśli obecne są resztki nicieni, wirować próbkę przy 2 000 × g przez 5 min w 4 °C, zawiesić osad w 10 mL świeżego buforu NP i ponownie wirować próbkę przy 100 × g przez 5 min w 4 °C. Odrzucić osad, sprawdzić nadsącz pod kątem obecności resztek nicieni i powtarzać czynność do czasu uzyskania próbki wolnej od resztek nicieni.
        UWAGA: Alternatywnie resztki nicieni można usunąć, przeciskając próbkę przez sito komórkowe 40 µm (6x), a następnie przez sito komórkowe 20 µm (6x).
      10. Jeśli próbka jest wolna od resztek nicieni, pobrać 5 µL próbki, dodać 5 µL zieleni metylowej z pyroniną (jądra będą niebieskie) i policzyć jądra za pomocą hemocytometru.
      11. Wirować próbkę przy 2 000 × g przez 5 min w 4 °C
      12. Usunąć nadsącz, umieścić próbki na lodzie i kontynuować procedurę; alternatywnie można gwałtownie zamrozić jądra i przechowywać je w −80 °C.
  2. Trawienie chromatyny
    1. Zawiesić jądra w 450 µL czystej wody. Przenieść jądra do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
    2. Do próbki sieciowanej dodać 60 µL 10x buforu do enzymu restrykcyjnego DpnII i dokładnie wymieszać.
      ​UWAGA: Można użyć innych enzymów restrykcyjnych, które nadal przecinają sieciowane DNA.
    3. Dodać 15 µL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu permeabilizacji jąder i inkubować z mieszaniem (na kołysarce lub rotorze nutacyjnym) w 37 °C przez 1 h.
      ​UWAGA: SDS jest substancją drażniącą i toksyczną w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę. Należy z nim obchodzić się ostrożnie i stosować odpowiednie PPE (fartuch laboratoryjny, odpowiednie rękawiczki i ochronę oczu).
    4. Zneutralizować SDS, dodając 75 µL 20% Triton X-100 i inkubując z mieszaniem w 37 °C przez 1 h.
    5. Pobrać 10 µL próbki jako kontrolę nietrawioną. Przechowywać w 4 °C.
    6. Dodać 400 U DpnII i inkubować w 37 °C przez noc z mieszaniem.

3. Dzień 2

UWAGA: Średnio studenci studiów licencjackich potrzebują 5 h na wykonanie tych kroków.

  1. Trawienie chromatyny
    1. Dodać dodatkowe 200 U enzymu DpnII i inkubować próbki przez 4 h w temperaturze 37 °C z mieszaniem, aby zapewnić całkowite trawienie próbki sieciowanej.
    2. Pobrać 10 µL z próbek jako kontrolę trawienia.
    3. Inaktywować termicznie enzym restrykcyjny, inkubując próbkę przez 20 min w temperaturze 65 °C (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Przejść do kroku 2.1.3.
    4. Jeśli enzymu nie można inaktywować termicznie, dodać 80 µL 10% SDS i inkubować próbkę przez 30 min w temperaturze 65 °C. Następnie dodać 375 µL 20% Triton X-100 i wymieszać przez delikatne potrząsanie. Inkubować próbkę przez 1 h w temperaturze 37 °C i przejść do kroku 2.2.
  2. Ligacja chromatyny
    1. Przenieść próbkę do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mL, uzupełnić objętość próbki do 5,7 mL wodą H2O klasy molekularnej i wymieszać przez delikatne potrząsanie.
    2. Dodać 700 µL 10x buforu T4 Ligase i wymieszać przez delikatne potrząsanie.
    3. Dodać 60 U T4 DNA Ligazy i wymieszać przez delikatne potrząsanie.
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.

4. Dzień 3

UWAGA: Średnio studenci potrzebują od 15 do 30 min na wykonanie tych kroków. Po inkubacji nocnej próbki można zamrozić.

  1. Trawienie białek i odwrócenie sieciowania
    1. Do próbki 3C dodać 30 µL proteinazy K (10 mg/mL) i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z mieszaniem. Do próby kontrolnej nietrawionej oraz kontroli trawienia dodać 5 µL proteinazy K (10 mg/mL) i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z mieszaniem.

5. Dzień 4

UWAGA: Średnio studenci potrzebują 4-5 h na wykonanie tych kroków.

  1. Oczyszczanie biblioteki 3C
    1. Do próbki 3C dodać 30 µL RNazy A (10 mg/mL) i wymieszać przez delikatne kręcenie naczyniem. Inkubować próbkę przez 45 min w temperaturze 37 °C.
    2. Do próbki dodać 7 mL fenolo-chloroformu i wymieszać poprzez wstrząsanie.
      UWAGA: Fenolo-chloroform jest substancją drażniącą skórę i oczy i może powodować oparzenia, jeśli miejsce kontaktu nie zostanie poddane leczeniu. Fenolo-chloroformu należy używać w dygestorium, stosując odpowiednią ochronę oczu oraz rękawice (nitrylowe).
    3. Wirować próbkę przez 15 min przy 3 270 × g w temperaturze pokojowej (RT). Zebrać fazę wodną i przenieść ją do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać równą objętość chloroformu i wymieszać próbkę poprzez wstrząsanie.
    4. Wirować próbkę przez 15 min przy 3 270 × g w RT. Zebrać fazę wodną i przenieść ją do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Dodać 7,5 mL wody klasy molekularnej (H2O), 35 mL 100% etanolu oraz (opcjonalnie) 7 µL glikogenu (1 mg/mL). Wymieszać poprzez wstrząsanie i inkubować w temperaturze −80 °C do czasu zamrożenia próbki.
      UWAGA: Zamrożenie próbki może zająć 1 h lub więcej. W tym miejscu można przerwać protokół.
      1. Podczas zamrażania próbki 3C, oczyścić próbki kontrolne. W przypadku próbek kontrolnych uzupełnić objętość do 500 µL za pomocą wody klasy molekularnej, dodać 2 µL RNazy A (10 mg/mL) i wymieszać poprzez energiczne potrząsanie probówką.
      2. Krótko wirować, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Inkubować próbki przez 45 min w temperaturze 37 °C.
      3. Do próbek kontrolnych dodać 1 mL fenolo-chloroformu i wymieszać poprzez wstrząsanie probówkami. Wirować próbkę przez 15 min przy 3 270 × g w RT. Zebrać fazę wodną z próbek kontrolnych i przenieść ją do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      4. Dodać równą objętość chloroformu i wymieszać próbkę poprzez wstrząsanie. Wirować próbkę przez 15 min przy 3 270 × g w RT. Zebrać fazę wodną z próbek kontrolnych i przenieść ją do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      5. Dodać 1 mL 100% etanolu i 2 µL glikogenu (1 mg/mL). Wymieszać poprzez wstrząsanie i inkubować w temperaturze −80 °C przez 30 min.
      6. Wirować próbkę przez 15 min przy 3 270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz i dodać 750 µL schłodzonego 70% etanolu.
      7. Wirować próbkę przez 10 min przy 3 270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz i wysuszyć próbki na powietrzu. Resuspender osad w 50 µL wody klasy molekularnej (H2O). Zamrozić lub przejść do kroku 6.
    5. Wirować próbkę przez 60 min przy 3 270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz i dodać 10 mL schłodzonego 70% etanolu. Rozbić osad DNA poprzez wstrząsanie próbki w celu wymieszania.
    6. Wirować próbkę przez 30 min przy 3 270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz i pozwolić próbce częściowo wyschnąć na powietrzu w RT. Resuspender osad w 150 µL 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Jest to „biblioteka 3C”.
      ​UWAGA: Zamrozić próbkę lub przejść do analizy.

6. Dzień 5

UWAGA: Średnio studenci potrzebują od 1 do 2 h na wykonanie tych kroków.

  1. Określanie jakości próbki przy użyciu krzywej standardowej startera kontrolnego
    1. Ilościowo określ stężenie DNA dla próbki 3C oraz wszystkich kontroli, a następnie dostosuj próbki do stężenia 30 µg/µL (jeśli stężenia na to pozwalają). Wykonaj czterokrotne dwukrotne rozcieńczenia seryjne próbek, co da pięć rozcieńczeń dla każdej próbki (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
      UWAGA: Jeśli ilościowe oznaczenie nie może zostać łatwo wykonane, rozcieńcz próbki seryjnie zgodnie z powyższymi wskazówkami i kontynuuj.
    2. Przygotuj reakcje PCR dla 3C, kontroli genomicznej oraz kontroli trawionej dla każdej rozcieńczonej próbki z użyciem starterów kontrolnych: 1 µL DNA, 10 µL 5x buforu reakcyjnego, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL 10 mM startera kontrolnego (mieszanina starterów forward i reverse), 1 µL polimerazy Taq oraz 36 µL wody.
    3. Zgodnie z instrukcją oprogramowania dedykowanego dla urządzenia do PCR, ustaw program PCR dla krzywej standardowej, stosując następujące warunki cykli: 30 s w 98 °C; 30 cykli: 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; inkubacja w 4 °C.
    4. Za pomocą oprogramowania wygeneruj krzywe standardowe dla próbek. Po wygenerowaniu krzywej przez oprogramowanie zanotuj wydajność PCR oraz wartość R2.
  2. Określanie stężenia DNA
    1. Aby określić stężenie DNA w próbkach 3C, porównaj je z próbką genomicznego DNA o znanym stężeniu. Rozcieńcz próbki do 30 ng/µL, a kontrolę genomiczną rozcieńcz seryjnie od 10 ng/µL do 0,01 ng/µL w dwukrotnych krokach, aby stworzyć krzywą standardową.
      UWAGA: Jeśli ilościowe oznaczenie nie może zostać łatwo wykonane, rozcieńcz próbkę 1:10 i kontynuuj.
    2. Przygotuj reakcje PCR dla 3C, kontroli genomicznej oraz kontroli trawionej dla każdej rozcieńczonej próbki z użyciem starterów kontrolnych: 1 µL DNA, 10 µL 5x buforu reakcyjnego, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL 10 mM startera kontrolnego (mieszanina starterów forward i reverse), 1 µL polimerazy Taq oraz 36 µL wody.
    3. Zgodnie z instrukcją oprogramowania dedykowanego dla urządzenia do PCR, ustaw program PCR dla krzywej standardowej, stosując następujące warunki cykli: 30 s w 98 °C; 30 cykli: 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; inkubacja w 4 °C.
    4. Za pomocą oprogramowania wygeneruj krzywe standardowe dla próbek, nanosząc próbki 3C na krzywą. Porównaj poziom zawartości próbki 3C z krzywą standardową stworzoną na podstawie reakcji genomicznego DNA o znanym stężeniu i dostosuj próbki 3C do stężenia 30 ng/µL.
  3. Określanie obecności lub braku oddziaływań chromatyny
    1. Przygotuj reakcje qPCR z 30 ng próbki 3C, próbki kontroli genomicznej oraz próbki kontroli trawionej: 1 µL DNA, 10 µL 5x buforu reakcyjnego, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL 10 mM startera (mieszanina starterów forward i reverse), 1 µL polimerazy Taq oraz 36 µL wody.
      UWAGA: Reakcje należy przygotować z użyciem startera kontrolnego, starterów testowych dla poszczególnych loci genomicznych oraz wybranych kombinacji starterów testowych (starter forward dla miejsca „a” i starter reverse dla miejsca „b”) wykorzystywanych do określania oddziaływań chromatyny (Rysunek 3).
    2. Zgodnie z instrukcją oprogramowania urządzenia do PCR, ustaw program PCR w następujący sposób: 30 s w 98 °C; 40 cykli: 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; inkubacja w 4 °C.
    3. Po przeprowadzeniu PCR przeanalizuj wykres amplifikacji. Upewnij się, że reakcje PCR wykazują amplifikację wykładniczą, z podwojeniem ilości produktu w każdym cyklu.
      UWAGA: Reakcje, które nie wykazują amplifikacji wykładniczej, nie mogą być poddane dalszej analizie.
    4. Zgodnie z instrukcją oprogramowania urządzenia do PCR, zdefiniuj próg (threshold) eksperymentu qPCR.
    5. Wyeksportuj wartości Ct dla wszystkich próbek.
    6. Określ wydajność trawienia, korzystając z wartości Ct startera testowego (TP) i startera kontrolnego (CP) z próbek kontroli nietrawionej (UC) i kontroli trawionej (DC) zgodnie z równaniem (1).
      Procent trawienia = 100 - figure-protocol-1     (1)
    7. Wartości te powinny mieścić się w zakresie 80%-90% trawienia. Zanotuj te wartości (Rysunek 4A).
    8. Określ względne oddziaływanie chromatyny, korzystając z wartości Ct kombinacji starterów testowych (TPC) i startera kontrolnego (CP) z próbek kontroli nietrawionej (UC) i próbek 3C (3C) zgodnie z równaniem (2).
      Oddziaływanie chromatyny = 100 - figure-protocol-2      (2)
    9. Przedstaw wartości dla każdej próbki na wykresie słupkowym dla każdej kombinacji starterów testowych.
    10. Porównaj sygnał z próbek 3C z próbkami kontrolnymi, aby ustalić, czy próbka 3C wykazuje wzbogacenie konkretnego oddziaływania chromatyny w stosunku do próbek kontrolnych. Próbki 3C wykazujące wzbogacenie względem kontroli można uznać za warunkowo pozytywne, co wymaga walidacji za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera (Rysunek 4B).
      UWAGA: Podczas analizy danych z wykresu należy pamiętać, że jeśli nie zastosowano „matrycy kontrolnej” (patrz dyskusja), nie można porównywać ilości między reakcjami (tzn. z jednego zestawu starterów do drugiego).
  4. Identyfikacja produktów 3C
    1. Przeprowadź elektroforezę produktów PCR na żelu agarozowym 1,5%.
    2. Zweryfikuj rozmiar produktów PCR na żelu, używając lampy UV lub systemu dokumentacji żeli.
      UWAGA: Dobrze przygotowane biblioteki 3C będą zawierać zróżnicowany zakres fragmentów DNA i pomimo wcześniejszej walidacji specyficzności starterów, reakcje PCR z bibliotek 3C mogą potencjalnie wykazać wiele prążków (Rysunek 5A). Nie uniemożliwia to analizy bibliotek 3C.
    3. Wytnij prążki produktów odpowiadające oczekiwanemu rozmiarowi fragmentu i przeprowadź ekstrakcję produktów PCR z żelu zgodnie z instrukcją zestawu komercyjnego lub poniższym protokołem domowym.
      OSTROŻNIE: Światło UV jest znanym kancerogenem, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby ograniczyć czas ekspozycji na promieniowanie UV. Należy stosować okulary chroniące przed UV, osłonę na próbki, rękawiczki oraz fartuch laboratoryjny.
      1. Aby zbudować domową kolumienkę do oczyszczania, zrób igłą otwór w dnie probówki 0,5 mL.
      2. Wciśnij niewielką ilość waty z kulki watowej na dno probówki 0,5 mL, wypełniając nie więcej niż połowę probówki.
      3. Umieść probówkę 0,5 mL w probówce 1,5 mL; upewnij się, że mniejsza probówka opiera się o krawędź większej probówki, a nie znajduje się wewnątrz niej.
      4. Ostrożnie potnij fragment żelu na mniejsze kawałki i umieść go w probówce 0,5 mL kolumienki.
      5. Umieść całość w zamrażarce w −20 °C na 5 min. Wirować przez 3 min przy 13 000 × g w temperaturze pokojowej (RT).
      6. Zachowaj probówkę 1,5 mL z wyekstrahowanym DNA w buforze, a probówkę 0,5 mL zawierającą pozostałości agarozy zutylizuj.
      7. Oczyszczone DNA można przekazać do sekwencjonowania metodą Sangera przy użyciu starterów forward i reverse dla fragmentu 3C.
    4. Identyfikacja kontaktów chromatyny za pomocą Blat
      1. Po zakończeniu sekwencjonowania określ, czy próbki spełniają standardy kontroli jakości wskazane w raporcie z sekwencjonowania.
      2. W przypadku sekwencji przechodzących kontrolę jakości (QC), otwórz pliki .seq i .ab1 (trace) w programie do edycji sekwencji, takim jak Another Plasmid Editor (ApE), sprawdź plik .ab1 pod kątem wyraźnych pików odczytu zasad i popraw błędnie odczytane piki w pliku .seq.
      3. Używając edytowanego pliku .seq, wyszukaj miejsce rozpoznawane przez DpnII. W zależności od wyniku sekwencjonowania powinno ono znajdować się w połowie raportowanej sekwencji.
      4. Aby ustalić, czy sekwencja jest oczekiwaną sekwencją docelową, zaznacz miejsce DpnII oraz dodatkowe 30-50 bp sekwencji powyżej (upstream), odpowiadającej starterowi forward loci genomicznych badanych w 3C. Przeprowadź wyszukiwanie Blat tej sekwencji w organizmie docelowym. Upewnij się, że loci genomiczne są zgodne z loci startera.
      5. Powtórz powyższy krok dla sekwencji startera reverse, upewniając się, że zwrócone locus genomiczne jest zgodne z locus startera reverse.

Wyniki

Niniejsza procedura pozwoli na przygotowanie jednej eksperymentalnej próbki 3C oraz dwóch próbek kontrolnych (nietrawionej i trawionej). Z wykorzystaniem tych trzech próbek przeprowadzono analizę qPCR. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono wydajność trawienia (równanie 1) i odnotowano ją (Tabela 1). Z przeprowadzonych obliczeń ustalono, że próbka 3C wykazała wydajność trawienia na poziomie około 88% (średnia z Tabeli 1) w siedmiu badanych loci genomowych.

Następnie próbki przetestowano pod kątem obecności dalekosiężnych kontaktów chromatyny między różnymi loci genomowymi, wykorzystując kombinacje starterów specyficznych dla danych loci (Tabela 2) oraz qPCR. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono obfitość produktów względem kontrolnego zestawu starterów (równanie 2) i przedstawiono je na wykresie w celu porównania (Rycina 4). Dane te wskazały, że 8 z 10 reakcji było warunkowo dodatnich w kierunku oddziaływań dalekosiężnych.

Reakcje PCR przeprowadzono następnie w żelu agarozowym. Oczekiwany produkt PCR dla ośmiu wyników dodatnich warunkowo oraz jednej reakcji ujemnej oczyszczono w żelu i przekazano do sekwencjonowania metodą Sangera. Wyniki dla reprezentatywnych reakcji dodatnich (niebieska strzałka, niebieska ramka) i ujemnych (czerwona strzałka, czerwona ramka) przedstawiono na (Rycina 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Struktura chromosomu w jądrze komórkowym. Hipotetyczna organizacja chromosomów wewnątrz jądra. (A) otoczka jądrowa, linie czarne; (B) lamina jądrowa, kolor pomarańczowy; (C) heterochromatyna, linie zagęszczone; (D) euchromatyna, luźne pętle. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat protokołu 3C. Odległe fragmenty liniowych chromosomów (niebieski, żółty i różowy) zostają zbliżone do siebie w obrębie jądra komórkowego poprzez pętle regulacyjne. (A) Struktury pętli są tworzone przy udziale czynników transkrypcyjnych (szare koło i czarna gwiazdka); oddziaływania te są utrwalane poprzez chemiczne sieciowanie. (B) Pętle są rozrywane poprzez trawienie enzymatyczne (czarne linie). (C) Odległe fragmenty chromatyny są ligowane ze sobą dzięki lepkim końcom powstałym w wyniku trawienia. (D) DNA zostaje oczyszczone z białek. (E) Sekwencja w obrębie fragmentów zostaje zidentyfikowana i zmapowana z powrotem do genomu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Schemat starterów 3C. Startery 3C są zaprojektowane wokół miejsc restrykcyjnych znajdujących się w różnych odległościach od interesującej lokalizacji genomicznej. Różowe strzałki reprezentują eksperymentalne zestawy starterów otaczające miejsce DpnII. Startery eksperymentalne można mieszać i łączyć w celu oceny zapętlenia chromatyny w danym regionie. Pomarańczowe startery reprezentują kontrolę negatywną bez miejsca DpnII. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywne dane qPCR dla eksperymentu 3C. Względna liczebność testowych zestawów starterów 3C. (A>) Wykres kontrolny pokazujący względną liczebność produktu w kontroli niepoddanej trawieniu (niebieski), kontroli poddanej trawieniu (szary) oraz próbce 3C (pomarańczowy). (B>) Eksperyment 3C; względna liczebność produktu z kombinacji starterów testowych w kontroli niepoddanej trawieniu (niebieski), kontroli poddanej trawieniu (szary) oraz próbce 3C (pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Wizualizacja produktów 3C qPCR. Góra: żel z produktami końcowymi qPCR dla wskazanych próbek. Dół: reprezentatywne pliki śladów sekwencjonowania metodą Sangera dla wskazanych reakcji. Próbka pomarańczowa jest przykładem wyniku fałszywie dodatniego (patrz Rysunek 4, r38/34), a próbka niebieska jest przykładem wyniku prawdziwie dodatniego ze wskazanym powyżej śladu miejscem cięcia DpnII. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Miejsce% trawienia
r886.98
r388.44
r3889.64
r3487.55
r3387.85
r1486.97
r4789.45

Tabela 1: Obliczona wydajność trawienia.

NazwaSekwencjaLoci genomiczne
r3 FWDACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACCchrX:11361475
r3 RVSTTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGCchrX:11361561
r38 FWDTTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCCchrX:5859700
r38 RVSAGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAGchrX:5859775
r34 FWDATTTGTGGATTGCGTGGAGACGchrX:5429702
r34 RVSAATAATCCTCTTAACAAACGTGGCCchrX:5429777
r33 FWDAAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAACchrX:6296704
r33 RVSTTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACGchrX:6296807
r14 FWDAATTATCGATTTTTCCATCGCGCAGchrX:8036367
r14 RVSATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTCchrX:8036427
r47 FWDATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTCchrX:9464939
r47 RVSAAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACACchrX:9465064
r8 FWDGAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTGchrX:11094257
r8 RVSTTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACCchrX:11094362
Starter kontrolny FWDCAATCGTCTCGCTCACTTGTCchrX:7608049
Primer kontrolny RVSGATGTGAGCAACAAGGCACCchrX:7608166

Tabela 2: Primery do reprezentacyjnego eksperymentu 3C.

Dyskusja

3C to potężna technika, która jest zakorzeniona w podstawowych technikach molekularnych. To właśnie ta podstawa podstawowych narzędzi sprawia, że 3C jest tak intrygującą techniką do wykorzystania w pracy ze studentami. Przy tak wielu ostatnich badaniach obserwujących dynamikę chromatyny w tak szerokiej skali, wykorzystanie tych wyników do opracowania wąsko ukierunkowanego eksperymentu na pojedynczym genie lub regionie genomu ma potencjał, aby stworzyć unikalny i wpływowy eksperyment w badaniach licencjackich. Często eksperymenty takie jak te są uważane za zbyt zaawansowane dla studentów, ale przy starannym planowaniu są one łatwo osiągalne. Ważne jest, aby pamiętać, że testy zaprojektowane do badania połączeń chromatyny przechwyconych przez bibliotekę 3C mogą się różnić od półilościowego PCR punktu końcowego do sekwencjonowania całego genomu. W rzeczywistości dane z pierwszego artykułu 3C16 zostały wygenerowane z qPCR. Ten szeroki zakres testów może być stosowany, ponieważ wszystkie technologie 3C wytwarzają ten sam produkt - bibliotekę fragmentów DNA reprezentujących połączenia 3D w jądrze.

Przedstawiono tutaj adaptację bardziej elastycznego i dostosowanego protokołu, który jest lepiej dopasowany do potrzeb naukowców na studiach licencjackich. Wymienione powyżej okresy pauzy oznaczają opóźnienia w nocy; Jednak przerwy te mogą rozciągać się na weekendy, a w przypadku komórek i jąder tygodni. Najważniejszą kwestią jest to, kiedy praca zostanie wykonana. Często w protokołach występują kroki, w których czas jest wrażliwy, gdy pauza nie jest opcją. Poza kilkoma punktami (dzień 1 i dzień 2) jest wiele miejsc, w których można się zatrzymać i zamrozić próbkę. Ma to kluczowe znaczenie podczas pracy ze studentami, gdzie harmonogramy i terminy prac laboratoryjnych muszą być elastyczne. Oprócz włączenia tych przystanków do protokołu, studenci są zachęcani do pracy w parach, a nawet w małych grupach po trzy lub cztery. Grupy dobrze sprawdzają się w tym protokole, ponieważ uczniowie mogą się nawzajem wspierać i tworzyć system koleżeński, aby wszyscy pracowali bezpiecznie. Praca w laboratorium jest również przyjemniejsza, gdy inni są zaangażowani. W grupach uczniowie mogą również pracować nad różnymi pytaniami dotyczącymi organizacji chromatyny, jednocześnie wykonując ten sam protokół. W ten sposób, nawet gdy uczniowie pracują nad oddzielnymi projektami, protokół łączy ich wysiłki i dzięki temu mogą się nawzajem wspierać.

Inne adaptacje mają na celu obejście faktu, że niektóre specjalistyczne narzędzia i sprzęt niekoniecznie można znaleźć we wszystkich instytucjach licencjackich. Do tych elementów wyposażenia należą między innymi termocyklery qPCR, systemy dokumentacji żeli i spektrometry nanoobjętościowe. Rzeczywiście, te elementy wyposażenia są wygodne, ale nie są wymagane. Tutaj klasyczna metoda 3C jest również opisana w części dotyczącej projektu podkładu; Wiąże się to z identyfikacją interesującego miejsca genomu, a następnie oceną innych loci genomowych pod kątem dalszych punktów kontaktowych chromatyny. Ta technika działa również dobrze, jeśli używany jest opublikowany zestaw danych, taki jak zestaw danych wykorzystujący Hi-C, w którym identyfikowane są znane dodatnie (łączące) i ujemne (niełączące) loci. Projektowanie eksperymentów z wykorzystaniem tych opublikowanych zestawów danych jest kolejną świetną adaptacją dla laboratoriów dydaktycznych, ponieważ szansa na pomyślną identyfikację połączeń chromatyny jest zwykle większa. Ponadto artykuł naukowy może być omawiany na zajęciach i może być używany jako odniesienie.

Protokół ten wykorzystuje zmodyfikowane podejście qPCR do wizualizacji tworzenia się produktu 3C. Kontrole mają zasadnicze znaczenie dla powodzenia techniki 3C. W każdym eksperymencie wykorzystuje się zarówno kontrolę próbki, jak i kontrolę startera, aby określić zakończenie procedury 3C. Kontrola próbki obejmuje kontrolę niestrawioną (genomowe DNA) i kontrolę strawioną. Niestrawiona kontrola określa sygnał wyjściowy dla zestawów starterów i jest używana z kontrolą trawienia usieciowanego w celu określenia wydajności trawienia. Oczekuje się, że nastąpi spadek produktu dla wszelkich starterów skierowanych przez miejsce ograniczenia. Porównanie tej wartości z niestrawioną kontrolą wskazuje na to, jak dobrze próbka została strawiona.

Startery do PCR obejmują starter kontrolny i startery testowe. Starter kontrolny to zestaw starterów, który znajduje się w pobliżu badanego regionu genomu i nie zawiera miejsca ograniczenia. Stanowi to punkt odniesienia do określenia obfitości testowych produktów PCR ze starterem. Startery testowe to startery do przodu i do tyłu, które otaczają miejsce restrykcyjne dla określonego interesującego miejsca genomu (ryc. 3). Reakcje z użyciem tych zestawów starterów są porównywane w celu określenia wydajności trawienia, ponieważ obfitość produktu powinna spaść, jeśli miejsce ograniczenia zostało przecięte. Określając organizację chromatyny, jeden starter testowy z jednego locus jest sparowany z innym starterem testowym z innego locus genomowego, aby określić, czy te dwa loci są blisko siebie w przestrzeni 3D. W takim przypadku oczekuje się, że produkt PCR zostanie znaleziony tylko przy użyciu próbki 3C jako szablonu.

Ważne jest, aby pamiętać, że nawet zwalidowane startery mają tendencję do zawodzenia (Rysunek 4: zestaw starterów r14). Ponadto produkty PCR są często identyfikowane w reakcjach kontrolnych oraz w reakcjach, w których nie przewiduje się połączenia chromatyny (takich jak strawiona kontrola, ponieważ nie jest ligowana). Te instancje są sekwencjonowane i albo nie przechodzą kontroli jakości Sangera, albo wracają bez zdefiniowanej sekwencji (rysunek 5). Dodatkowo, tradycyjne eksperymenty 3C generują "matrycę kontrolną", nieusieciowaną, strawioną i zligowaną próbkę DNA, która reprezentuje wszystkie możliwe zligowane fragmenty, które można wytworzyć przy danej ilości DNA. "Szablon kontrolny" odgrywa ważną rolę w porównywaniu intensywności sygnałów qPCR między dwoma loci genomowymi w celu określenia, czy sygnał reprezentuje prawdziwą interakcję, czy tylko losowe powiązanie. Stworzenie "matrycy kontrolnej" może być problematyczne, ponieważ duża część badanej chromatyny musi zostać wychwycona w postaci sztucznego chromosomu i przetworzona wraz z próbkami 3C. Zabezpieczenie takiego konstruktu może okazać się niewykonalne, a jego stworzenie może wykraczać poza ramy projektu semestralnego. Ze względu na te trudności sugerujemy użycie podkładu kontrolnego. Elementarz kontrolny nie zastępuje wszystkich funkcji "szablonu kontrolnego", ale nadal daje możliwość analizy danych w celu określenia "obecności" lub "nieobecności".

Podczas wykonywania qPCR ważne jest użycie równych ilości próbki. Należy to ustalić, nawet w przypadku użycia nanospektrofotometru, takiego jak nanokropla, poprzez wygenerowanie krzywej wzorcowej z genomowego DNA o znanym stężeniu i dopasowanie próbek 3C do tej linii. Ilości te powinny być rejestrowane i wykorzystywane w kolejnych PCR. Ważna jest również jakość reakcji PCR. Ponieważ PCR przebiega w qPCR, obfitość produktu jest mierzona za pomocą fluorescencji i rejestrowana. To nagranie jest dostępne na wykresie amplifikacji. Po zakończeniu programu ważne jest, aby sprawdzić wykres amplifikacji i upewnić się, że reakcje (z wyjątkiem kontroli bez szablonu) mają trzy fazy: linię bazową, wykładniczą i fazę plateau/nasycenia. Ważne jest, aby sprawdzić, czy reakcje mają fazę wykładniczą, w szczególności w celu ustalenia progu (patrz poniżej). Dodatkowo, w przypadku próbek rozcieńczanych seryjnie, powinno nastąpić przesunięcie wartości Ct zgodne z rozcieńczeniem próbki (najwyższe stężenie będzie miało najniższe wartości Ct, podczas gdy najniższe stężenie będzie miało najwyższe wartości Ct). Próbki, które nie odzwierciedlają tej zmiany na wykresie amplifikacji, wymagają nowego rozcieńczenia lub wskazują na większy problem z tworzeniem się próbki 3C. Na koniec, podczas generowania krzywej wzorcowej, oprogramowanie PCR obliczy wydajność PCR i wartość R2 . Skuteczność PCR powinna być większa niż 90%, a wartość R2 powinna być większa niż 0,99. Jeśli którykolwiek z tych warunków nie jest spełniony, prawdopodobnie coś jest nie tak z próbką lub starterami PCR.

Po qPCR procentowe trawienie i obecność oddziaływań 3C można obliczyć za pomocą qPCR Ct dla każdej reakcji. Aby je określić, najpierw należy ustalić próg dla reakcji PCR. Zwykle odbywa się to za pomocą oprogramowania dołączonego do maszyny qPCR. Ustawienie progu określi stężenie produktu PCR, który zostanie użyty do porównania wartości Ct próbki. Próg powinien przecinać krzywe amplifikacji reakcji PCR w wykładniczej fazie amplifikacji. Można porównywać tylko reakcje PCR z amplifikacją wykładniczą (w tym przypadku startery kontrolne i reakcje starterów testowych), ponieważ jest to jedyny sposób, aby upewnić się, że reakcje amplifikują DNA w tym samym tempie i można je wiernie porównać. Analizując wykresy 3C, reakcje warunkowo dodatnie są identyfikowane jako te, w których jest więcej produktu w porównaniu z próbkami kontrolnymi, kontrolą genomu i kontrolą trawienia (ryc. 4B). Próbki te muszą być jednak dalej walidowane przy użyciu sekwencjonowania Sangera po oczyszczeniu produktu PCR w żelu.

Po sekwencjonowaniu Sangera próbki, które przeszły kontrolę jakości, mogą być analizowane za pomocą Blat. Celem tej analizy jest ustalenie, czy próbka ma sekwencję obu docelowych loci genomowych flankujących miejsce restrykcyjne (DpnII w przypadku tego protokołu). Jeśli obie sekwencje zostaną zidentyfikowane, wówczas fragment 3C można uznać za zwalidowany. Jeśli wyniki Blat nie zwrócą oczekiwanej sekwencji, może to oznaczać, że jeden lub oba startery nie są optymalne, co skutkuje fałszywie dodatnim wynikiem qPCR. Pliki śledzenia dla próbek fałszywie dodatnich będą miały niezdefiniowane piki podstawowe, a raporty Seq będą zawierać głównie wywołania podstawowe "n".

Walidacja Sangera jest niezbędna, ponieważ możliwe są fałszywe alarmy z tworzenia sztucznego produktu PCR. Te fałszywie dodatnie wyniki można zidentyfikować, gdy produkty sekwencjonowania nie mają oczekiwanej sekwencji docelowej lub miejsca DpnII charakterystycznego dla właściwego fragmentu 3C (Figura 5). Sekwencjonowanie fragmentów PCR stanowi również kolejny punkt danych dla eksperymentu i uświadamia studentom, że technika 3C identyfikuje odległe loci genomu, które łączą się w przestrzeni 3D w jądrach.

Technika 3C zapewnia bogactwo podstawowych technik molekularnych dla studentów w elastycznej, prostej procedurze. Ta technika 3C jest również punktem wyjścia dla innych technik 3C, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Tego typu eksperymenty mogą zapoznać studentów z ważnymi aspektami bioinformatyki i są zakorzenione w podstawowych zasadach przedstawionych tutaj. Doświadczenie i zaangażowanie studentów są kluczem do ich sukcesu i rozwoju jako młodych naukowców. Zapewniając te możliwości, studenci mogą wzmocnić swoje zrozumienie podstawowych zasad, jednocześnie budując pewność siebie w radzeniu sobie z najnowocześniejszymi technikami i pytaniami.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103430 oraz Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37% Formaldehyd Millapore-SigmaF8775
100% etanolMillapore-SigmaE7023
CaCl2MP Biomedyczny215350280
chloroformMillapore-SigmaC0549
cOmkompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyMillapore-SigmaCOEDTAF-ROzmieszany do 50x w wodzie. Rozcieńczony do 1x w buforze sacharozy i buforze GB świeży
Ditiothreitol (DTT)Millapore-SigmaD06321 M zapas rozcieńczony do 500 &mikro; M w buforze sacharozy i buforze GB świeży
DpnIINEBR0543M
GlicerolMillapore-SigmaG9012
glicynaMillapore-SigmaG8898
glikogenMillapore-Sigma10901393001
HEPESMillapore-SigmaH3375
KClMillapore-SigmaP3911
KH2PO4Millapore-SigmaP5655
zielony metylowy pyronin   Millapore-SigmaHT70116
MgAc2Thermoscientific1222530
Na2HPO4Millapore-SigmaS5136
NaClMillapore-SigmaS9888
fenol-chloroform Millapore-SigmaP3803
PronaseMillapore-Sigma11459643001
Proteinaza KIBI ScientificIB05406
qPCR Gotowa mieszanka (Phire Taq itp.)Millapore-SigmaKCQS07
RNaza A Millapore-SigmaR6148
Octan soduMillapore-SigmaS2889
dodecylosiarczan sodu (SDS)Millapore-SigmaL3771
sacharozaMillapore-SigmaS0389
T4 Ligaza DNAPromegaM1804
Tris-HClMillapore-Sigma108319
Triton X-100Millapore-SigmaT9284
Trypsyna-EDTA Millapore-SigmaT4049

Bibliografia

  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92(2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Techniki 3Corganizacja chromatynyekspresja gen wsieciowanie chromatynytrawienie chromatynyligaza DNA T4analiza qPCRoczyszczanie w eluloci genomiczne
Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.