Artykuł metodologiczny

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

DOI:

10.3791/65213

⸱

12 maja 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Biomedical Sciences, Bryant University, 2Center of Health and Behavioral Sciences, Bryant University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przechwytywanie konformacji chromosomów (3C) to potężne narzędzie, które stworzyło rodzinę podobnych technik (np. Hi-C, 4C i 5C, określanych tutaj jako techniki 3C), które dostarczają szczegółowych informacji o trójwymiarowej organizacji chromatyny. Techniki 3C zostały wykorzystane w szerokim zakresie badań, od monitorowania zmian w organizacji chromatyny w komórkach nowotworowych po identyfikację kontaktów wzmacniających z promotorami genów. Podczas gdy wiele badań wykorzystujących te techniki zadaje duże pytania dotyczące całego genomu ze skomplikowanymi typami próbek (tj. analiza pojedynczych komórek), często zapomina się, że techniki 3C są oparte na podstawowych metodach biologii molekularnej, które mają zastosowanie w szerokim zakresie badań. Odpowiadając na ściśle skoncentrowane pytania dotyczące organizacji chromatyny, ta najnowocześniejsza technika może być wykorzystana do zwiększenia doświadczenia w laboratoriach badawczych i dydaktycznych na studiach licencjackich. W niniejszym artykule przedstawiono protokół 3C oraz przedstawiono adaptacje i punkty nacisku do wdrożenia głównie w instytucjach licencjackich w badaniach licencjackich i doświadczeniach dydaktycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom organizmu zawiera nie tylko wszystkie geny niezbędne do funkcjonowania, ale także wszystkie instrukcje, jak i kiedy ich używać. To sprawia, że regulacja dostępu do genomu jest jedną z najważniejszych funkcji komórki. Istnieje wiele mechanizmów kontrolujących funkcję genów; jednak na poziomie podstawowym regulacja genów sprowadza się do zdolności regulatorowych czynników transkrypcyjnych (trans-czynników) do wiązania się z ich specyficznymi sekwencjami DNA (sekwencje cis-regulatorowe). Nie jest to wrodzona zdolność; Zamiast tego jest regulowany przez organizację/strukturę genomu w jądrze, która kontroluje dostępność/ekspozycję sekwencji regulatorowych CIS na czynniki trans1,2,3. Jeśli trans-faktory nie mogą znaleźć swoich sekwencji cis-regulatorowych, to trans-faktory nie mogą wykonywać swoich zadań regulacyjnych. To sprawiło, że zrozumienie, w jaki sposób genomy są zorganizowane w jądrze, stało się ważnym źródłem badań.

Powszechnie przyjmuje się, że podczas interfazy, eukariotyczne chromosomy w jądrze zajmują swoją własną domenę zakotwiczoną w blaszce jądrowej i macierzy jądrowej (Rysunek 1), co sprawia, że chromosom bardziej przypomina kawałek pizzy, a nie makaron na talerzu spaghetti. Chromosomy są częściowo skondensowane przez interakcje białko-DNA (chromatyna), które skręcają i zapętlają części chromosomu. Dzięki mikroskopii elektronowej, trójwymiarowej hybrydyzacji in situ fluorescencji DNA (FISH) i technikom znakowania DNA (tj. fluorescencyjnej i sztucznej metylacji DNA) stwierdzono, że nieaktywne domeny chromatyny są ciasno upakowane wzdłuż obwodu jądra komórkowego4,5,6, podczas gdy fragmenty aktywnej, mniej skondensowanej chromatyny znajdują się we wnętrzu jądra7, 8,9,10. Eksperymenty te zapewniają szerokokątny obraz dynamiki chromosomów, ale niewiele robią, aby uchwycić zmiany zachodzące lokalnie wokół promotorów genów obserwowanych w badaniach DNase11,12 i nucleosome13,14,15 badań.

Kluczem do odblokowania dynamiki chromatyny o wyższej rozdzielczości było opracowanie techniki mapowania chromosomów 3D, 3C. Sama technika 3C składa się z czterech głównych etapów: sieciowania chromatyny, trawienia chromatyny przez enzymy restrykcyjne, ligacji chromatyny i oczyszczania DNA (Rysunek 2). Nowe sztuczne fragmenty DNA wygenerowane w tym procesie mogą być następnie scharakteryzowane, aby ujawnić ścisły fizyczny związek między liniowo odległymi fragmentami DNA16. Technika 3C stała się podstawą do stworzenia wielu technik spin-off, które wykorzystują początkowe etapy 3C do zadawania szerszych pytań dotyczących całego genomu (np. Hi-C, 4C, ChIP-C). Ta rodzina technik 3C pozwoliła ustalić, że chromosomy są zorganizowane w wiele odrębnych jednostek zwanych domenami powiązanymi topologicznie (TAD). TAD są kodowane w genomie i są definiowane przez pętle chromatyny otoczone niezapętlonymi granicami16,17,18,19. Granice TAD są utrzymywane przez dwa ewolucyjnie konserwatywne i wszechobecne czynniki, w tym czynnik wiążący CCCT (CTCF) i spójność, które zapobiegają interakcji pętli w obrębie oddzielnych TAD16,20. Pętle są zapośredniczone przez interakcję trans-czynników z ich sekwencjami regulatorowymi, a także CTCF i kohesion21.

Chociaż wiele badań wykorzystujących technologie 3C zadaje szerokie pytania dotyczące całego genomu i stosuje skomplikowane techniki pobierania próbek, formułowanie techniki 3C opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej. To sprawia, że 3C jest intrygujące do wdrożenia zarówno w laboratoriach badawczych na studiach licencjackich, jak i dydaktycznych. Technika 3C może być stosowana w przypadku mniejszych, skoncentrowanych pytań i jest z natury elastyczna w skalowaniu w górę lub w dół (pojedyncze geny22, chromosomes16, i/lub genomes18) w zależności od ostrości i kierunku zadawanych pytań. Technika ta została również zastosowana w szerokiej gamie systemów modelowych7,16,19,23 i udowodniono, że jej zastosowanie jest wszechstronne. To sprawia, że 3C jest doskonałą techniką dla studentów studiów licencjackich, ponieważ studenci mogą zdobyć doświadczenie w typowych technikach biologii molekularnej, jednocześnie zdobywając cenne doświadczenie w odpowiadaniu na skierowane pytania.

Prezentowany tutaj jest dostosowany protokół do przygotowania biblioteki 3C na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów24,25,26,27. Protokół ten został zoptymalizowany dla około 1 × 107 komórek, chociaż wygenerował biblioteki 3C z zaledwie 1 × 105 komórek. Protokół ten okazał się wszechstronny i został wykorzystany do generowania bibliotek 3C z zarodków danio pręgowanego, linii komórkowych danio pręgowanego i młodych dorosłych (YA) Caenorhabditis elegans (glisty). Protokół powinien być również odpowiedni dla linii komórkowych ssaków oraz, po dalszym dostosowaniu, drożdży.

Celem tych adaptacji jest uczynienie 3C bardziej dostępnym dla studentów. Dołożono wszelkich starań, aby stosować techniki podobne do tych, które można osiągnąć w laboratorium dydaktycznym na studiach licencjackich. Technika 3C zapewnia studentom wiele możliwości uczenia się, aby nauczyć się podstawowych technik biologii molekularnej, które przyniosą korzyści ich rozwojowi na ławce, w klasie i w ich staraniach po ukończeniu studiów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt podkładu

UWAGA: Narzędzia do projektowania podkładów 3C są dostępne online28. Alternatywnie, niestandardowe podkłady mogą być zaprojektowane przez studentów (patrz poniżej).

  1. Identyfikacja lokalizacji podkładu
    1. Otwórz przeglądarkę genomu UCSC (http://genome.ucsc.edu/), wybierz badany organizm i wyszukaj region genomu, który ma być oceniany za pomocą 3C.
    2. W następnym oknie aktywuj ścieżkę enzymatyczną w zakładce Mapowanie i sekwencjonowanie pod przeglądarką, klikając Restr Enzymes.
    3. Wprowadź enzym(y) restrykcyjny(e), który ma być użyty, i ustaw tryb wyświetlania na pakowanie. Kliknij Prześlij.
    4. W polu Variation and Repeats (Wariacja) i RepeatRepeats (Powtórzenia) upewnij się, że parametr RepeatMasker jest ustawiony na wartość dense.
    5. Korzystając z witryn z ograniczeniami jako przewodników, zidentyfikuj interesujące miejsca, które nie znajdują się w zamaskowanych powtarzających się regionach (czarne paski). Podświetl 300 par zasad (bp) otaczających zarówno górną, jak i dolną sekwencję otaczającą miejsce ograniczenia, klikając pozycję (najwyższa ścieżka) i przeciągając na żądaną długość (~600 pz).
    6. Zwolnij przycisk myszy, a pojawi się wyskakujące okienko. Zanotuj lokalizację genomu, kliknij Powiększ i pozwól, aby przeglądarka ponownie dostosowała się do wyboru.
    7. Najedź kursorem myszy na kartę Widok na górnej wstążce przeglądarki, a następnie z menu rozwijanego wybierz pozycję DNA.
    8. Pozostaw opcję domyślną, zwróć uwagę na oznaczenie zamaskowanych sekwencji (istnieje możliwość uczynienia ich N). Kliknij pobierz DNA.
    9. Podświetlona sekwencja zostanie wyświetlona w oknie. Skopiuj i wklej tę sekwencję do Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
    10. Korzystając z domyślnych ustawień Primer3, wygeneruj podkłady, klikając Wybierz podkłady.
    11. W wynikach zwróć uwagę na lokalizację enzymu restrykcyjnego i wybierz startery, które tworzą produkt PCR o gęstości 200-500 pz z miejscem restrykcji znajdującym się pośrodku.
    12. Wykonując te kroki, zaprojektuj startery testowe 1 kilobase (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb i 20 kb z miejsca (miejsc) zainteresowania.
    13. Aby zaprojektować startery sterujące wejściem, powtórz te kroki dla miejsca oddalonego o 1-2 kB od miejsca zainteresowania, które nie ma miejsca ograniczenia, co oznacza, że nigdy nie jest cięte.
  2. Walidacja starterów funkcjonalnych
    1. Aby zweryfikować funkcjonalność startera, należy skonfigurować reakcje PCR przy użyciu miareczkowanych stężeń starterów i oczyszczonego genomowego DNA. Za pomocą środków ilościowych lub półilościowych określ, czy startery tworzą oczekiwany produkt.
    2. Przeprojektuj startery, które nie przejdą walidacji.

2. Dzień 1

UWAGA: Protokół może być wstrzymany (zamrożony w temperaturze -20 °C) po usieciowaniu chromatyny i po zebraniu jąder. Kroki trwają średnio 5-6 godzin ze studentami.

  1. Kolekcja jąder C. elegans dla młodych dorosłych (YA) (na podstawie Han et al.29)
    1. Sieciowanie chromatyny
      1. Zbierz 5 000 robaków YA w 30 ml pożywki M9 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i wiruj z prędkością 400 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Umyj granulat robaka jeszcze 3 razy za pomocą M9, aby usunąć bakterie.
      3. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad robaka w 47,3 ml M9 zawierającym 2,7 ml 37% formaldehydu (2% końcowego) i inkubować z mieszaniem (kołysaniem lub nutowaniem) przez 30 minut w temperaturze RT.
        UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się ostrożnie i pracować pod wyciągiem z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny PPE, odpowiednie rękawice i ochrona oczu). Formaldehyd jest substancją drażniącą, która wpływa na oczy, nos, gardło i płuca.
      4. Obracaj robaki w temperaturze 400 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
      5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad robaka w 50 ml 1 M glicyny. Obracaj robaki w temperaturze 400 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Pobieranie jąder
      1. Zawiesić osad robaka w 6 ml schłodzonego buforu NP (50 mM HEPES przy pH 7,5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Tween 20, 0,2 mM DTT, 0,5 mM spermidyna, 0,25 mM spermina, 1x kompletny inhibitor proteazy).
      2. Przenieść zawiesinę ślimakową do luźno przylegającego 7 ml pojemnika do odbijania lodu. Odbić próbkę 15 razy i przytrzymać na lodzie przez 5 minut.
      3. Przenieść zawiesinę ślimakową do ciasno przylegającego 7 ml pojemnika do odbijania lodu. Odbić próbkę 20 razy i przytrzymać na lodzie przez 5 minut.
      4. Przenieść zawiesinę robaka do czystej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać bufor NP do łącznie 10 ml (około 4 ml).
      5. Wirować zawiesinę robaka na wysokim poziomie przez 30 s. Inkubować próbkę na lodzie przez 5 minut.
      6. Powtórz poprzedni krok.
      7. Obracać zawiesinę ślimakową o stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      8. Przenieść supernatant do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
      9. Sprawdź, czy w próbce nie ma resztek robaków. Wizualizuj 10 μl próbki za pomocą mikroskopu świetlnego. Jeżeli obecne są szczątki robaków, należy obracać próbkę w temperaturze 2 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić osad w świeżym 10 ml buforu NP i ponownie wirować próbkę w temperaturze 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad, sprawdzić, czy w supernatancie nie ma resztek robaków i powtarzać tak długo, aż próbka będzie wolna od resztek robaków.
        UWAGA: Alternatywnie, resztki robaków można również usunąć, przecedzając próbkę przez sitko do komórek 40 μm (6x), a następnie przez sitko do komórek 20 μm (6x).
      10. Jeśli próbka jest wolna od resztek robaków, pobrać 5 μl próbki, dodać 5 μl zielonej metylowej pyroniny (jądra będą niebieskie) i policzyć jądra za pomocą hemocytometru.
      11. Wirować próbkę z prędkością 2 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
      12. Usunąć supernatant, umieścić próbki na lodzie i kontynuować; alternatywnie zamrozić jądra i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Trawienie chromatyny
    1. Zawiesić jądra w 450 μl czystej wody. Przenieść jądra do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Do usieciowanej próbki dodać 60 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego DpnII i dobrze wymieszać.
      UWAGA: Można użyć innych enzymów restrykcyjnych, które nadal tną usieciowane DNA.
    3. Dodać 15 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu przepuszczalności jąder i inkubować z mieszaniem (kołysaniem lub nutowaniem) w temperaturze 37 °C przez 1 h,
      UWAGA: SDS jest drażniący i jest toksyczny w przypadku spożycia lub wchłonięcia przez skórę. Obchodź się z nimi ostrożnie i używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, odpowiednie rękawice i ochrona oczu).
    4. Ugasić SDS przez dodanie 75 μl 20% Triton X-100 i inkubację z mieszaniem w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    5. Pobrać 10 μl z próbki jako niestrawioną kontrolę. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Dodać 400 j. DpnII i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc z mieszaniem.

3. Dzień 2

UWAGA: Średnio ukończenie tych kroków zajmuje studentom 5 godzin.

  1. Trawienie chromatyny
    1. Dodać dodatkowe 200 j. DpnII i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z mieszaniem, aby zapewnić całkowite roztrawienie usieciowanej próbki.
    2. Pobrać 10 μl porcji z próbek jako kontrolę trawienia.
    3. Enzym restrykcyjny należy inaktywować termicznie poprzez inkubację próbki przez 20 minut w temperaturze 65 °C (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Przejdź do kroku 2.1.3.
    4. Jeżeli enzym nie może być inaktywowany przez ciepło, dodać 80 μl 10% SDS i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 65 °C. Następnie dodaj 375 μl 20% Triton X-100 i wymieszaj, mieszając. Inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przejść do etapu 2.2.
  2. Ligacja chromatyny
    1. Przenieść próbkę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dostosować objętość próbki do 5,7 ml za pomocą cząsteczkowegoH2Oi wymieszać przez wirowanie.
    2. Dodaj 700 μl 10x buforu T4 Ligase i wymieszaj, mieszając.
    3. Dodaj 60 U ligazy DNA T4 i wymieszaj, mieszając.
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.

4. Dzień 3

UWAGA: Średnio studentom zajmuje to 15-30 minut, aby wykonać te kroki. Po całonocnej inkubacji próbki można zamrozić.

  1. Trawienie białek i odwrotne sieciowanie
    1. Dodać 30 μl proteinazy K (10 mg/ml) do próbki 3C i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z mieszaniem. Dodać 5 μl proteinazy K (10 mg/ml) do kontroli niestrawionej i trawienia, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez noc z mieszaniem.

5. Dzień 4

UWAGA: Średnio ukończenie tych kroków zajmuje studentom 4-5 godzin.

  1. Oczyszczanie biblioteki 3C
    1. Dodać 30 μl RNazy A (10 mg/ml) do próbki 3C i zamieszać do wymieszania. Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 7 ml chloroformu fenolowego do próbki i wymieszać przez wstrząsanie.
      UWAGA: Chloroform fenolowy działa drażniąco na skórę i oczy i może powodować oparzenia, jeśli kontakt nie jest leczony. Chloroform fenolowy powinien być stosowany w dygestoriach z odpowiednią ochroną oczu i rękawicami (nitryl).
    3. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 3,270 × g w temperaturze pokojowej. Zebrać fazę wodną i przenieść do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać równe objętości chloroformu i wymieszać próbkę przez wstrząsanie.
    4. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 3,270 × g w temperaturze pokojowej. Zebrać fazę wodną i przenieść do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 7,5 mlH2Oklasy cząsteczkowej, 35 ml 100% etanolu i (opcjonalnie) 7 μl glikogenu (1 mg/ml). Wymieszać przez wytrząsanie i inkubować w temperaturze -80 °C aż do zamrożenia próbki.
      UWAGA: Zamrożenie próbki może zająć 1 godzinę lub dłużej. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
      1. Podczas gdy próbka 3C zamarza, oczyść próbki kontrolne. Do próbek kontrolnych dostosuj objętość do 500 μl za pomocą wody molekularnej i dodaj 2 μl mieszaniny RNazy A (10 mg / ml), przesuwając probówkę.
      2. Krótko obrócić, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Inkubować próbki przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
      3. Do próbek kontrolnych dodać 1 ml chloroformu fenolowego i wymieszać, potrząsając probówkami. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 3,270 × g w temperaturze pokojowej. Zebrać fazę wodną z próbek kontrolnych i umieścić w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      4. Dodać równe objętości chloroformu i wymieszać próbkę przez wstrząsanie. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 3,270 × g w temperaturze pokojowej. Zebrać fazę wodną z próbek kontrolnych i umieścić w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      5. Dodać 1 ml 100% etanolu i 2 μl glikogenu (1 mg/ml). Wymieszać przez wytrząsanie i inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 minut.
      6. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 3,270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 750 μl schłodzonego 70% etanolu.
      7. Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 3,270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć próbki na powietrzu. Zawiesić osad w 50 μl cząsteczkowegoH2O. Zamrażać lub kontynuować do kroku 6.
    5. Odwirować próbkę przez 60 minut w temperaturze 3,270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 10 ml schłodzonego 70% etanolu. Rozbij i rozbij osad DNA, potrząsając próbką w celu wymieszania.
    6. Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 3 270 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i pozostawić próbkę do częściowego wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 150 μl 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), pipetując w górę i w dół. To jest "Biblioteka 3C"."
      UWAGA: Zamrozić próbkę lub przejść do analizy.

6. Dzień 5

UWAGA: Średnio ukończenie tych kroków zajmuje studentom 1-2 godziny.

  1. Określanie jakości próbki przy użyciu krzywej wzorcowej startera kontrolnego
    1. Określić ilościowo stężenie DNA dla próbki 3C, jak również dla wszystkich prób kontrolnych, i dostosować próbki do 30 μg/μl (jeśli pozwalają na to stężenia). Próbki należy rozcieńczyć seryjnie dwukrotnie, czterokrotnie, co daje pięć rozcieńczeń dla każdej próbki (1x, 0,5x, 0,25x, 0,125x, 0,0625x).
      UWAGA: Jeśli nie można łatwo przeprowadzić oceny ilościowej, należy seryjnie rozcieńczyć próbki, jak wskazano powyżej, i kontynuować.
    2. Ustawić reakcje PCR dla 3C, kontroli genomowej i kontroli strawionej dla każdej rozcieńczonej próbki ze starterami kontrolnymi: 1 μL DNA, 10 μL 5x buforu reakcyjnego, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM startera kontrolnego (zmieszanego do przodu i do tyłu), 1 μL polimerazy Taq, i 36 μL wody.
    3. Postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania specyficznego dla maszyny do PCR, skonfiguruj standardowy program PCR krzywej, używając warunków cyklicznych w następujący sposób: 30 s w 98 °C; 30 cykli po 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; 4 °C podtrzymanie.
    4. Za pomocą oprogramowania wygeneruj standardowe krzywe dla próbek. Po wygenerowaniu krzywej przez oprogramowanie zwróć uwagę na wydajność PCR i wartość R2.
  2. Oznaczanie stężenia DNA
    1. Aby określić stężenie DNA w próbkach 3C, porównaj próbki z próbką genomowego DNA o znanym stężeniu. Rozcieńczyć próbki do 30 ng/μl i seryjnie rozcieńczyć kontrolę genomową od 10 ng/μL do 0,01 ng/μL w dwóch etapach, aby utworzyć krzywą wzorcową.
      UWAGA: Jeśli nie można łatwo przeprowadzić oceny ilościowej, rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10 i kontynuować.
    2. Ustawić reakcje PCR dla 3C, kontroli genomowej i kontroli strawionej dla każdej rozcieńczonej próbki za pomocą starterów kontrolnych: 1 μL DNA, 10 μL 5x buforu reakcyjnego, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 mM startera kontrolnego (zmieszanego do przodu i do tyłu), 1 μL polimerazy Taq, i 36 μL wody.
    3. Postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania specyficznego dla maszyny do PCR, skonfiguruj standardowy program PCR krzywej, używając warunków cyklicznych w następujący sposób: 30 s w 98 °C; 30 cykli po 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; 4 °C wstrzymanie.
    4. Korzystając z oprogramowania, wygeneruj standardowe krzywe dla próbek, wykreślając próbki 3C na krzywej. Porównaj położenie obfitości próbki 3C z krzywą wzorcową utworzoną w wyniku reakcji genomowego DNA o znanym stężeniu i dostosuj próbki 3C do 30 ng / μl.
  3. Określanie obecności lub braku interakcji chromatyny
    1. Skonfiguruj reakcje qPCR z 30 ng próbki 3C, genomową próbką kontrolną i strawioną próbką kontrolną: 1 μl DNA, 10 μl 5x buforu reakcyjnego, 1 μl 10 mM dNTP, 1 μl 10 mM startera (zmieszanego do przodu i do tyłu), 1 μl polimerazy Taq i 36 μl wody.
      UWAGA: Reakcje powinny być zaplanowane przy użyciu startera kontrolnego, starterów testowych dla poszczególnych loci genomowych oraz pożądanych kombinacji starterów testowych (miejsce "a" do przodu i miejsce "b" do tyłu) używane do określenia interakcji chromatyny (Rysunek 3).
    2. Postępując zgodnie z instrukcjami oprogramowania urządzenia do PCR, skonfiguruj program PCR w następujący sposób: 30 s w 98 °C; 40 cykli po 5 s w 98 °C, 5 s w 60 °C i 10 s w 72 °C; 1 min w 72 °C; 4 °C wstrzymanie.
    3. Po przeprowadzeniu PCR sprawdź wykres amplifikacji. Upewnij się, że reakcje PCR wykazują wykładniczą amplifikację, podwajając się co cykl.
      UWAGA: Reakcje, które nie wykazują wzmocnienia wykładniczego, nie mogą być dalej analizowane.
    4. Postępując zgodnie z instrukcjami dotyczącymi oprogramowania maszyny do PCR, zdefiniuj próg eksperymentu qPCR.
    5. Wyeksportuj wartości Ct dla wszystkich próbek.
    6. Oznaczyć wydajność mineralizacji przy użyciu wartości Ct startera testowego (TP) i startera kontrolnego (CP) z niestrawionych próbek kontrolnych (UC) i roztrawionych próbek kontrolnych (DC), stosując równanie (1).
      Procent strawiony = 100 - Równanie równowagi statycznej ΣFy=0 w postaci symbolicznej; pojęcie matematyczne; Użytek edukacyjny. (1)
    7. Wartości te powinny mieścić się w zakresie 80%-90% trawienia. Zapisz te wartości (Rysunek 4A).
    8. Oznaczyć względną interakcję chromatyny za pomocą kombinacji starterów testowych (TPC) i wartości Ct startera kontrolnego (CP) z niestrawionych próbek kontrolnych (UC) i 3C (3C) za pomocą równania (2).
      Interakcja chromatyny = 100 - Wykres równania równowagi statycznej ΣFx=0, MA=0. (2)
    9. Wykreślić wartości dla każdej próbki na wykresie słupkowym dla każdej kombinacji starterów testowych.
    10. Porównaj sygnał próbek 3C z próbkami kontrolnymi, aby określić, czy próbka 3C ma wzbogacenie określonej interakcji chromatyny w stosunku do próbek kontrolnych. Próbki 3C, które wykazują wzbogacenie w stosunku do kontroli, można uznać za warunkowo dodatnie i wymagać walidacji przy użyciu sekwencjonowania Sangera (Rysunek 4B).
      UWAGA: Analizując dane z wykresu, należy pamiętać, że jeśli nie zostanie użyty "szablon kontrolny" (patrz dyskusja), nie można porównać obfitości między reakcjami (tj. z jednego zestawu starterów do następnego).
  4. Identyfikacja produktów 3C
    1. Uruchom produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym.
    2. Wizualizacja żelu pod kątem prawidłowego rozmiaru produktów PCR za pomocą pudełka na światło UV lub systemu dokumentacji żelu.
      UWAGA: Dobrze skonstruowane biblioteki 3C będą zawierały różnorodny zakres fragmentów DNA i pomimo wcześniejszej walidacji starterów pod kątem specyficzności, reakcje PCR z bibliotek 3C mogą potencjalnie zawierać wiele prążków (Figura 5A). Nie uniemożliwia to analizy bibliotek 3C.
    3. Usuń pasma produktu odpowiadające oczekiwanej wielkości fragmentu i wykonaj ekstrakcję żelową produktów PCR zgodnie z instrukcjami zestawu handlowego lub domowym protokołem opisanym poniżej.
      UWAGA: Światło UV jest znanym czynnikiem rakotwórczym i należy zachować szczególną ostrożność, aby ograniczyć czas ekspozycji na światło UV. Należy nosić okulary ochronne odporne na promieniowanie UV, osłonę próbki, rękawice i fartuch laboratoryjny.
      1. Aby skonstruować domowy wkład oczyszczający, przebij igłą otwór w dnie probówki o pojemności 0,5 ml.
      2. Umieść niewielką ilość bawełny z wacika na dnie probówki o pojemności 0,5 ml, wypełniając nie więcej niż połowę tubki.
      3. Umieść probówkę o pojemności 0,5 ml w probówce o pojemności 1,5 ml; upewnij się, że mniejsza probówka spoczywa na krawędzi większej probówki, a nie w probówce.
      4. Ostrożnie pokrój fragment żelu na mniejsze kawałki i umieść go w probówce o pojemności 0,5 ml wkładu.
      5. Umieść zestaw w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 5 minut. Kręć zestaw przez 3 minuty w temperaturze 13 000 × g przy temperaturze pokojowej.
      6. Probówkę o pojemności 1,5 ml z wyekstrahowanym DNA należy przechowywać w buforze, a probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą resztki agarozy należy wyrzucić.
      7. Oczyszczone DNA można wysłać do sekwencjonowania Sangera przy użyciu starterów do przodu i do tyłu dla fragmentu 3C.
    4. Identyfikacja kontaktów chromatyny za pomocą Blat
      1. Po zakończeniu sekwencjonowania należy określić, czy próbki spełniają normy kontroli jakości, jak wskazano w raporcie z sekwencjonowania.
      2. W przypadku sekwencji przechodzących przez QC otwórz pliki .seq i .ab1 (trace) w programie do edycji sekwencjonowania, takim jak Another Plasmid Editor (ApE), sprawdź plik .ab1 pod kątem wyraźnych pików wywołania bazy i edytuj piki błędnie wywołane w pliku .seq.
      3. Korzystając ze zmodyfikowanego pliku seq, wyszukaj witrynę DpnII. W zależności od wyniku sekwencji, powinien on znajdować się w połowie raportowanej sekwencji.
      4. Aby określić, czy sekwencja jest oczekiwaną sekwencją docelową, należy podkreślić miejsce DpnII i dodatkowe 30-50 pz sekwencji poprzedzającej odpowiadającej starterowi do przodu loci genomowych badanych na obecność 3C. Przeprowadzić wyszukiwanie Blat tej sekwencji w odniesieniu do gatunku docelowego. Upewnij się, że loci genomu są zgodne z loci startera.
      5. Powtórz powyższy krok dla odwrotnej sekwencji startera, upewniając się, że zwrócony locus genomowy jest zgodny z odwrotnym starterem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura wyprodukuje jedną eksperymentalną próbkę 3C i dwie próbki kontrolne (niestrawione i strawione). Korzystając z tych trzech próbek, przeprowadzono qPCR. Na podstawie tych wyników obliczono i zarejestrowano wydajność trawienia (równanie 1) (tabela 1). Na podstawie tych obliczeń ustalono, że próbka 3C miała około 88% wydajność trawienia (średnia z tabeli 1) w siedmiu testowanych loci genomowych.

Następnie, próbki zostały przetestowane pod kątem obecności kontaktów chromatyny dalekiego zasięgu między różnymi loci genomowymi przy użyciu kombinacji starterów specyficznych dla loci (Tabela 2) i qPCR. Korzystając z tych wyników, obliczono obfitość produktów w stosunku do zestawu starterów kontrolnych (równanie 2) i przedstawiono na wykresie w celu porównania (Rysunek 4). Dane te wskazały, że 8 z 10 reakcji było warunkowo dodatnich dla interakcji dalekiego zasięgu.

Reakcje PCR zostały następnie przeprowadzone na żelu agarozowym. Oczekiwany produkt PCR dla ośmiu warunkowo dodatnich i jednej negatywnej reakcji został oczyszczony żelem i wysłany do sekwencjonowania Sangera. Pokazano wyniki dla reprezentatywnych reakcji pozytywnych (niebieska strzałka, niebieska ramka) i ujemnych (czerwona strzałka, czerwona ramka) (Rysunek 5).

Schemat fałdowania białek; Ilustruje zmiany struktury ze stanów rozwiniętych na zagięte za pomocą adnotacji.
Rysunek 1: Struktura chromosomu w jądrze. Hipotetyczna organizacja chromosomów wewnątrz jądra. (A) Otoczka jądrowa, czarne linie; (B) blaszka jądrowa, pomarańczowa; (C) heterochromatyna, linie zagęszczone; (D) euchromatyna, luźne pętle. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram skrzyżowania chromosomów; ilustruje rekombinację genetyczną, proces wymiany chromatyd.
Rysunek 2: Schemat protokołu 3C. Odległe części chromosomów liniowych (niebieskie, żółte i różowe) są zbliżane do siebie w jądrze za pomocą pętli regulacyjnych. (A) W strukturach pętli pośredniczą czynniki transkrypcyjne (szare kółko i gwiazda); Interakcje te są zachowywane dzięki chemicznemu sieciowaniu. (B) Pętle są przerywane przez trawienie enzymatyczne (czarne linie). (C) Odległe kawałki chromatyny są ligowane razem przez klejące się końce powstałe w wyniku trawienia. (D) DNA jest oczyszczane z białka. (E) Sekwencja w obrębie fragmentów jest identyfikowana i mapowana z powrotem do genomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram chromosomów, miejsca DpnII, dane RepeatMasker, mapowanie genów, analiza sekwencji genomowych.
Rysunek 3: Schemat podkładu 3C. Startery 3C są projektowane wokół miejsc restrykcyjnych w różnych odległościach od interesującej lokalizacji genomowej. Różowe strzałki reprezentują eksperymentalne zestawy starterów otaczające stanowisko DpnII. Eksperymentalne startery można mieszać i dopasowywać w celu oceny pętli chromatyny w regionie. Pomarańczowe startery reprezentują kontrolę ujemną bez miejsca DpnII. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe porównujące poziomy starterów testowych w niestrawionych i strawionych próbkach gDNA, wyniki 3C.
Rysunek 4: Reprezentatywne dane qPCR dla eksperymentu 3C. Względna obfitość zestawów starterów testowych 3C. (A) Wykres kontrolny przedstawiający względną obfitość produktu w niestrawionej próbce kontrolnej (niebieski), strawionej kontroli (szary) i próbce 3C (pomarańczowy). (B) Eksperyment 3C; względna obfitość produktu z kombinacji starterów testowych w próbce kontrolnej niestrawionej (kolor niebieski), kontrolnej strawionej (kolor szary) i próbce 3C (kolor pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wynik elektroforezy i sekwencjonowania; analiza fragmentów DNA; trawienie enzymatyczne; badania genetyczne.
Rysunek 5: Wizualizacja produktów 3C qPCR. Na wierzchu, żel z produktami końcowymi qPCR ze wskazanymi próbkami. Dolne, reprezentatywne pliki śladów sekwencji Sangera dla wskazanych reakcji. Pomarańczowa próbka jest przykładem wyniku fałszywie dodatniego (patrz Rysunek 4, r38/34), a niebieska próbka jest przykładem prawdziwie dodatniego wyniku z miejscem DpnII wskazanym powyżej śladu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
miejsce% trawienia
Czynnik R886,98
Czynnik R388,44
Czynnik R3889,64
Czynnik R3487,55
Czynnik R3387,85
Czynnik chłodniczy R1486,97
Czynnik R47Godzina 89,45

Tabela 1: Obliczona wydajność trawienia.

nazwaSekwencjaLoci genomowe
r3 Napęd na przódACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACCchrX:11361475
r3 Samochody kempingoweTTTCCTGAGCTCTCTCTCTTAACCATGTTTGCchrX:11361561
r38 Napęd na przódTTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCCchrX:5859700
Samochody kempingowe r38AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAGchrX:5859775
r34 Napęd na przódATTTGTGGATTGCGTGGAGACGchrX:5429702
Samochody kempingowe r34AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCCchrX:5429777
r33 Napęd na przódAAGAGTTGTCCAAAATAATTGAGCTAACchrX:6296704
Samochody kempingowe r33TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACGchrX:6296807
r14 Napęd na przódAATTATCGATTTTTCCATCGCGCAGchrX:8036367
Samochody kempingowe r14ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTCchrX:8036427
r47 Napęd na przódATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTCchrX:9464939
Samochody kempingowe r47AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACACchrX:9465064
r8 Napęd na przódGAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTGchrX:11094257
Samochody kempingowe r8TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACCchrX:11094362
Podkład kontrolny FWDCAATCGTCTCGCTCACTTGTCchrX:7608049
Podkład kontrolny RVSGATGTGAGCAACAGGCACCchrX:7608166

Tabela 2: Podstawy do reprezentatywnego eksperymentu 3C.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3C to potężna technika, która jest zakorzeniona w podstawowych technikach molekularnych. To właśnie ta podstawa podstawowych narzędzi sprawia, że 3C jest tak intrygującą techniką do wykorzystania w pracy ze studentami. Przy tak wielu ostatnich badaniach obserwujących dynamikę chromatyny w tak szerokiej skali, wykorzystanie tych wyników do opracowania wąsko ukierunkowanego eksperymentu na pojedynczym genie lub regionie genomu ma potencjał, aby stworzyć unikalny i wpływowy eksperyment w badaniach licencjackich. Często eksperymenty takie jak te są uważane za zbyt zaawansowane dla studentów, ale przy starannym planowaniu są one łatwo osiągalne. Ważne jest, aby pamiętać, że testy zaprojektowane do badania połączeń chromatyny przechwyconych przez bibliotekę 3C mogą się różnić od półilościowego PCR punktu końcowego do sekwencjonowania całego genomu. W rzeczywistości dane z pierwszego artykułu 3C16 zostały wygenerowane z qPCR. Ten szeroki zakres testów może być stosowany, ponieważ wszystkie technologie 3C wytwarzają ten sam produkt - bibliotekę fragmentów DNA reprezentujących połączenia 3D w jądrze.

Przedstawiono tutaj adaptację bardziej elastycznego i dostosowanego protokołu, który jest lepiej dopasowany do potrzeb naukowców na studiach licencjackich. Wymienione powyżej okresy pauzy oznaczają opóźnienia w nocy; Jednak przerwy te mogą rozciągać się na weekendy, a w przypadku komórek i jąder tygodni. Najważniejszą kwestią jest to, kiedy praca zostanie wykonana. Często w protokołach występują kroki, w których czas jest wrażliwy, gdy pauza nie jest opcją. Poza kilkoma punktami (dzień 1 i dzień 2) jest wiele miejsc, w których można się zatrzymać i zamrozić próbkę. Ma to kluczowe znaczenie podczas pracy ze studentami, gdzie harmonogramy i terminy prac laboratoryjnych muszą być elastyczne. Oprócz włączenia tych przystanków do protokołu, studenci są zachęcani do pracy w parach, a nawet w małych grupach po trzy lub cztery. Grupy dobrze sprawdzają się w tym protokole, ponieważ uczniowie mogą się nawzajem wspierać i tworzyć system koleżeński, aby wszyscy pracowali bezpiecznie. Praca w laboratorium jest również przyjemniejsza, gdy inni są zaangażowani. W grupach uczniowie mogą również pracować nad różnymi pytaniami dotyczącymi organizacji chromatyny, jednocześnie wykonując ten sam protokół. W ten sposób, nawet gdy uczniowie pracują nad oddzielnymi projektami, protokół łączy ich wysiłki i dzięki temu mogą się nawzajem wspierać.

Inne adaptacje mają na celu obejście faktu, że niektóre specjalistyczne narzędzia i sprzęt niekoniecznie można znaleźć we wszystkich instytucjach licencjackich. Do tych elementów wyposażenia należą między innymi termocyklery qPCR, systemy dokumentacji żeli i spektrometry nanoobjętościowe. Rzeczywiście, te elementy wyposażenia są wygodne, ale nie są wymagane. Tutaj klasyczna metoda 3C jest również opisana w części dotyczącej projektu podkładu; Wiąże się to z identyfikacją interesującego miejsca genomu, a następnie oceną innych loci genomowych pod kątem dalszych punktów kontaktowych chromatyny. Ta technika działa również dobrze, jeśli używany jest opublikowany zestaw danych, taki jak zestaw danych wykorzystujący Hi-C, w którym identyfikowane są znane dodatnie (łączące) i ujemne (niełączące) loci. Projektowanie eksperymentów z wykorzystaniem tych opublikowanych zestawów danych jest kolejną świetną adaptacją dla laboratoriów dydaktycznych, ponieważ szansa na pomyślną identyfikację połączeń chromatyny jest zwykle większa. Ponadto artykuł naukowy może być omawiany na zajęciach i może być używany jako odniesienie.

Protokół ten wykorzystuje zmodyfikowane podejście qPCR do wizualizacji tworzenia się produktu 3C. Kontrole mają zasadnicze znaczenie dla powodzenia techniki 3C. W każdym eksperymencie wykorzystuje się zarówno kontrolę próbki, jak i kontrolę startera, aby określić zakończenie procedury 3C. Kontrola próbki obejmuje kontrolę niestrawioną (genomowe DNA) i kontrolę strawioną. Niestrawiona kontrola określa sygnał wyjściowy dla zestawów starterów i jest używana z kontrolą trawienia usieciowanego w celu określenia wydajności trawienia. Oczekuje się, że nastąpi spadek produktu dla wszelkich starterów skierowanych przez miejsce ograniczenia. Porównanie tej wartości z niestrawioną kontrolą wskazuje na to, jak dobrze próbka została strawiona.

Startery do PCR obejmują starter kontrolny i startery testowe. Starter kontrolny to zestaw starterów, który znajduje się w pobliżu badanego regionu genomu i nie zawiera miejsca ograniczenia. Stanowi to punkt odniesienia do określenia obfitości testowych produktów PCR ze starterem. Startery testowe to startery do przodu i do tyłu, które otaczają miejsce restrykcyjne dla określonego interesującego miejsca genomu (ryc. 3). Reakcje z użyciem tych zestawów starterów są porównywane w celu określenia wydajności trawienia, ponieważ obfitość produktu powinna spaść, jeśli miejsce ograniczenia zostało przecięte. Określając organizację chromatyny, jeden starter testowy z jednego locus jest sparowany z innym starterem testowym z innego locus genomowego, aby określić, czy te dwa loci są blisko siebie w przestrzeni 3D. W takim przypadku oczekuje się, że produkt PCR zostanie znaleziony tylko przy użyciu próbki 3C jako szablonu.

Ważne jest, aby pamiętać, że nawet zwalidowane startery mają tendencję do zawodzenia (Rysunek 4: zestaw starterów r14). Ponadto produkty PCR są często identyfikowane w reakcjach kontrolnych oraz w reakcjach, w których nie przewiduje się połączenia chromatyny (takich jak strawiona kontrola, ponieważ nie jest ligowana). Te instancje są sekwencjonowane i albo nie przechodzą kontroli jakości Sangera, albo wracają bez zdefiniowanej sekwencji (rysunek 5). Dodatkowo, tradycyjne eksperymenty 3C generują "matrycę kontrolną", nieusieciowaną, strawioną i zligowaną próbkę DNA, która reprezentuje wszystkie możliwe zligowane fragmenty, które można wytworzyć przy danej ilości DNA. "Szablon kontrolny" odgrywa ważną rolę w porównywaniu intensywności sygnałów qPCR między dwoma loci genomowymi w celu określenia, czy sygnał reprezentuje prawdziwą interakcję, czy tylko losowe powiązanie. Stworzenie "matrycy kontrolnej" może być problematyczne, ponieważ duża część badanej chromatyny musi zostać wychwycona w postaci sztucznego chromosomu i przetworzona wraz z próbkami 3C. Zabezpieczenie takiego konstruktu może okazać się niewykonalne, a jego stworzenie może wykraczać poza ramy projektu semestralnego. Ze względu na te trudności sugerujemy użycie podkładu kontrolnego. Elementarz kontrolny nie zastępuje wszystkich funkcji "szablonu kontrolnego", ale nadal daje możliwość analizy danych w celu określenia "obecności" lub "nieobecności".

Podczas wykonywania qPCR ważne jest użycie równych ilości próbki. Należy to ustalić, nawet w przypadku użycia nanospektrofotometru, takiego jak nanokropla, poprzez wygenerowanie krzywej wzorcowej z genomowego DNA o znanym stężeniu i dopasowanie próbek 3C do tej linii. Ilości te powinny być rejestrowane i wykorzystywane w kolejnych PCR. Ważna jest również jakość reakcji PCR. Ponieważ PCR przebiega w qPCR, obfitość produktu jest mierzona za pomocą fluorescencji i rejestrowana. To nagranie jest dostępne na wykresie amplifikacji. Po zakończeniu programu ważne jest, aby sprawdzić wykres amplifikacji i upewnić się, że reakcje (z wyjątkiem kontroli bez szablonu) mają trzy fazy: linię bazową, wykładniczą i fazę plateau/nasycenia. Ważne jest, aby sprawdzić, czy reakcje mają fazę wykładniczą, w szczególności w celu ustalenia progu (patrz poniżej). Dodatkowo, w przypadku próbek rozcieńczanych seryjnie, powinno nastąpić przesunięcie wartości Ct zgodne z rozcieńczeniem próbki (najwyższe stężenie będzie miało najniższe wartości Ct, podczas gdy najniższe stężenie będzie miało najwyższe wartości Ct). Próbki, które nie odzwierciedlają tej zmiany na wykresie amplifikacji, wymagają nowego rozcieńczenia lub wskazują na większy problem z tworzeniem się próbki 3C. Na koniec, podczas generowania krzywej wzorcowej, oprogramowanie PCR obliczy wydajność PCR i wartość R2 . Skuteczność PCR powinna być większa niż 90%, a wartość R2 powinna być większa niż 0,99. Jeśli którykolwiek z tych warunków nie jest spełniony, prawdopodobnie coś jest nie tak z próbką lub starterami PCR.

Po qPCR procentowe trawienie i obecność oddziaływań 3C można obliczyć za pomocą qPCR Ct dla każdej reakcji. Aby je określić, najpierw należy ustalić próg dla reakcji PCR. Zwykle odbywa się to za pomocą oprogramowania dołączonego do maszyny qPCR. Ustawienie progu określi stężenie produktu PCR, który zostanie użyty do porównania wartości Ct próbki. Próg powinien przecinać krzywe amplifikacji reakcji PCR w wykładniczej fazie amplifikacji. Można porównywać tylko reakcje PCR z amplifikacją wykładniczą (w tym przypadku startery kontrolne i reakcje starterów testowych), ponieważ jest to jedyny sposób, aby upewnić się, że reakcje amplifikują DNA w tym samym tempie i można je wiernie porównać. Analizując wykresy 3C, reakcje warunkowo dodatnie są identyfikowane jako te, w których jest więcej produktu w porównaniu z próbkami kontrolnymi, kontrolą genomu i kontrolą trawienia (ryc. 4B). Próbki te muszą być jednak dalej walidowane przy użyciu sekwencjonowania Sangera po oczyszczeniu produktu PCR w żelu.

Po sekwencjonowaniu Sangera próbki, które przeszły kontrolę jakości, mogą być analizowane za pomocą Blat. Celem tej analizy jest ustalenie, czy próbka ma sekwencję obu docelowych loci genomowych flankujących miejsce restrykcyjne (DpnII w przypadku tego protokołu). Jeśli obie sekwencje zostaną zidentyfikowane, wówczas fragment 3C można uznać za zwalidowany. Jeśli wyniki Blat nie zwrócą oczekiwanej sekwencji, może to oznaczać, że jeden lub oba startery nie są optymalne, co skutkuje fałszywie dodatnim wynikiem qPCR. Pliki śledzenia dla próbek fałszywie dodatnich będą miały niezdefiniowane piki podstawowe, a raporty Seq będą zawierać głównie wywołania podstawowe "n".

Walidacja Sangera jest niezbędna, ponieważ możliwe są fałszywe alarmy z tworzenia sztucznego produktu PCR. Te fałszywie dodatnie wyniki można zidentyfikować, gdy produkty sekwencjonowania nie mają oczekiwanej sekwencji docelowej lub miejsca DpnII charakterystycznego dla właściwego fragmentu 3C (Figura 5). Sekwencjonowanie fragmentów PCR stanowi również kolejny punkt danych dla eksperymentu i uświadamia studentom, że technika 3C identyfikuje odległe loci genomu, które łączą się w przestrzeni 3D w jądrach.

Technika 3C zapewnia bogactwo podstawowych technik molekularnych dla studentów w elastycznej, prostej procedurze. Ta technika 3C jest również punktem wyjścia dla innych technik 3C, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Tego typu eksperymenty mogą zapoznać studentów z ważnymi aspektami bioinformatyki i są zakorzenione w podstawowych zasadach przedstawionych tutaj. Doświadczenie i zaangażowanie studentów są kluczem do ich sukcesu i rozwoju jako młodych naukowców. Zapewniając te możliwości, studenci mogą wzmocnić swoje zrozumienie podstawowych zasad, jednocześnie budując pewność siebie w radzeniu sobie z najnowocześniejszymi technikami i pytaniami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103430 oraz Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37% Formaldehyd Millapore-SigmaF8775
100% etanolMillapore-SigmaE7023
CaCl2MP Biomedyczny215350280
chloroformMillapore-SigmaC0549
cOmkompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyMillapore-SigmaCOEDTAF-ROzmieszany do 50x w wodzie. Rozcieńczony do 1x w buforze sacharozy i buforze GB świeży
Ditiothreitol (DTT)Millapore-SigmaD06321 M zapas rozcieńczony do 500 &mikro; M w buforze sacharozy i buforze GB świeży
DpnIINEBR0543M
GlicerolMillapore-SigmaG9012
glicynaMillapore-SigmaG8898
glikogenMillapore-Sigma10901393001
HEPESMillapore-SigmaH3375
KClMillapore-SigmaP3911
KH2PO4Millapore-SigmaP5655
zielony metylowy pyronin   Millapore-SigmaHT70116
MgAc2Thermoscientific1222530
Na2HPO4Millapore-SigmaS5136
NaClMillapore-SigmaS9888
fenol-chloroform Millapore-SigmaP3803
PronaseMillapore-Sigma11459643001
Proteinaza KIBI ScientificIB05406
qPCR Gotowa mieszanka (Phire Taq itp.)Millapore-SigmaKCQS07
RNaza A Millapore-SigmaR6148
Octan soduMillapore-SigmaS2889
dodecylosiarczan sodu (SDS)Millapore-SigmaL3771
sacharozaMillapore-SigmaS0389
T4 Ligaza DNAPromegaM1804
Tris-HClMillapore-Sigma108319
Triton X-100Millapore-SigmaT9284
Trypsyna-EDTA Millapore-SigmaT4049

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. Chromatin architectural proteins. Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).
  2. Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92(2014).
  3. John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
  4. Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
  5. Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
  6. Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).
  7. Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
  8. Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
  9. Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
  10. Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
  11. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The role of chromatin during transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  12. Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
  13. Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
  14. Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
  15. Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
  16. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  17. van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
  18. Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
  19. Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
  20. Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
  21. Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
  22. Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
  23. Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).
  24. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  25. Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
  26. Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
  27. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  28. Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
  29. Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Techniki 3Corganizacja chromatynyekspresja gen wsieciowanie chromatynytrawienie chromatynyligaza DNA T4analiza qPCRoczyszczanie w eluloci genomiczne

Powiązane artykuły